第４

Ｏ卷 第２期 ２ＯＯ
９年５月　 委黛通泰　
Ｖｏ１
．４０　Ｎｏ．
２　Ｍａｙ，２ｏ０９　 Ｂｕｌ
ｌｅｔ
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Ｓｅｒ
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ＲＮＡ干扰技术和家蚕杆状病 毒表达 系统　

在 纤维素酶研究 中的应用前 景　

李兴华　，杨华军　，Ｂ．Ｒｏ
ｙ　，
Ｅ．Ｙ．
Ｐａｒ
ｋ　
２，江丽军　，王　丹　
，缪云根　
（
１．浙江大学 动物科学学院 浙江 杭州 ３１
ｏ０２９；２．日本静 冈大学 农学部应用生化系，日本 静 冈 ４２２
＿８５２
９）　

摘 要：植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、
最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种 ，
能有　
效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖 ，
进而发酵产生生物 乙醇 ，
从而解决农业 、
再 生能源以及环境污染　
等问题 。随着生物化学 、
分子生物学以及基 因工程等多种交叉学科的快速发展 ，
获得适合工业化的高活力 的纤维素酶指　
日可待 。ＲＮＡ干扰是利用双链 ＲＮＡ特异性地 降解相应序列 的 ｍＲＮＡ，
从而特异性地阻断相应基因 的表达 ，
是后基 因组　
时代 的一种强有力 的调控 目的基因表达 的实验工具 。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速 、
高效表 达外源基 因的技术手　
段，
目前该 系统 的发展和应用已经非常成熟。本 文综述 了纤维素酶 的特性 以及近年来国内外对纤维素酶 、
ＲＮＡ干扰和　
家蚕杆状病毒 表达系统的研究进展 ，
并对该两种实验技术手段在今 后纤维素酶研究 中的应用前景作 了预测和展望 。
　
关键词 ：纤维素酶 ；ＲＮＡ干扰 ；家蚕杆状病毒表达系统　
中 图分 类 号 ：Ｓ
　８８４
．５　 文 献 标识 码 ：Ａ　 文 章 编 号 ：０２
５８－４０
６９【
２０ｏ９
］Ｏ２
删 ５
＿０６
　

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收稿 日期 ：２
００９
—２—１
２　 修 回 日期 ：
２ｏ０
９—０３
—０４　
基 金项 目 ：浙 江省 科 技 计 划 重 点 项 目（
编号 ：
２０ｏ８
Ｃ２４
０ｌ】
）和 国 家“
８６３”
项 目（
编 号：
２ｏｏ８
ＡＡ１
０Ｚ１
３２及 ２ｏ０
６ＡＡｌ
ｏＡ１１
　
９）。
　
作者简 介 ：李兴华（１
９８３
一），
男，浙江桐 乡人 ，
博士研究 生，
主要 从事 家蚕蛋 白质组学、分子生物学及 纤维素酶研 究。
　
女通 讯 作 者 ：ｒ
ｎｊａ
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ｊｕ．
ｅｄｕ
．ｃｎ
　

的兽药生产 ＧＭＰ认证和兽药种类的许可 （
表１），
以　 效，并不等同于可以在生产上推广应用。利用学术刊　
及正常的生产、 检验和储运程序等要素。其中某一要　 物 中的部分结果 ，
混淆“
有效”与“可用 ”
两者 间的概　
素的缺乏，
或要素间的不吻合都属问题蚕药 。具有专　 念，
也是部分不法商人惯用的手段 。　
利号并不足于合法生产和推广该蚕药 ．也不足于证　 总之 ，蚕桑技术专业人员应通过 向广大蚕农推　
明其有效性 ，更不能说明其在养蚕 中推广应用的合　 荐合法蚕药和推广科学使用蚕药技术 ，不断提高蚕　
法性。此外 ，某种药物对某种病原微生物或病害有　 农控制养蚕流行病的技术和提高蚕茧生产水平。
　
 ６・
　 蚕 桑 通报 ２ｏｏ９年 第 ４０卷 第 ２期　
・

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纤维素是一种多糖 ，
是葡萄糖 以 ｐ一１
，４一糖苷键　 境污 染 ，缓解 或解 决石 化能源 短 缺乃 至枯竭所 带来　
结合的聚合物。它是世界上最丰富的可再生有机 自　 世界 性能源 危机 ，
以及粮 食 资源 紧张 、能源开 发与人　
然资源及生物界最重要的碳源物质 ，在 自然界 中的　 争粮 的突 出矛 盾 。
　
储量极 其丰富 。植 物通过 光合作用 ，
生产地球 上最 丰　
１ 纤 维素 酶 的特 性　
富、最廉价的纤维素资源。有资料表明 ， 全世界每年　
的植物干物质生成量高达 ｌ ５ｏ
０亿 ｔ，
其中纤维素及半　 自 ｌ９Ｏ６年 Ｓｅｉ
ｌｌ
ｉｅｒ
ｅ首 次 在 蜗 牛 的 消化 液 中发　
纤 维素 占总量 的 ５０％以上 ，这些 主要 以纤维 素和 半　 现纤维素 酶 以来 ．纤 维素 酶 的研 究就 受 到全世界 的　
纤维素形式存储的能源 ，相当于 ７×１ ０９
　ｔ煤或者大　 普遍关注。纤维素酶 （ ｃｅ
１ｌｕ
１ａｓ
ｅ）是指所有参与降解纤　
约 ２／３的世界所 需能源【
１
Ｊ。我 国每 年仅作物 秸秆 的纤　 维素最终被转化为葡萄糖的各种酶的总称 ，主要来　
维素产量就高达 ２亿 ｔ以上 ，其他人类活动产生的废　 自于真菌和细菌。它不是单种酶 ， 而是起协同作用的　
弃物 中也 含有 大 量 的纤维 素 ，
如 农业 废 物 （稻 草 、稻　 一

类 多组分 酶 系 ，故 而 又被 称为 纤维 素酶 系 （
ｃｅｌ
ｌｕ—
　
壳、花生壳、 玉米芯、 棉籽壳、 甘蔗渣等 ）、食品加工废　 ｌ
ａｓｅ
　ｓｙ
ｓｔｅｍ）。根据 纤维素 酶 的不 同功能 ，
可分 为三大　
物（果皮 、
果 渣 等 ）、木材废 物 （
木屑 、
树 皮 ）以及 城 市　 类：
（１）
葡 聚糖 内切 酶 （
ｅｎｄｏ
ｇｌｕｃａ
ｎａｓ
ｅ，ＥＣ　
３．２．１
．４，
　
废弃物 （
４０％ ～６０％固体废物是垃圾和废纸） 等。然　 来 自真菌简称 ＥＧ，
来 自细菌简称 Ｌｅ
ｎ），
以随机方式　
而，
这 些纤维 素资源并 没有得 到 充分有 效 的利用 ，
而　 作用于纤维素内部 的非结晶区 ，
随机水解 ｐ
—ｌ，４糖　
是绝大多数被烧掉 ，
这样不仅浪费 自然资源 ，
还带来　 苷键 ，
从纤维素链的内部将它裂开 ，产生大量带非还　
了严重的环境问题。随着石化燃料由短缺变枯竭 ， 能　 原性末端的纤维二糖 。它的作用对象为较长的无定　
源危机 已经 成为人类 面 临的共 同 问题 。 目前生 产 乙　 型纤维素链 ． 对末端的敏感性比中间键小 。分子量介　
醇等能源所用的原料主要是粮食 。物价上涨和粮食　 于 ２３～１４５
　ＫＤ之 间 ，
如 真菌 的异构酶 ＥＧ　
Ｉ为 ５４ＫＤ，
　
危机又威胁着人类的生存 。因此 ，寻找新 的能量来　 ＥＧ　
ＩＩＩ约 为 ４９．
８　ＫＤ，而纤维粘 菌 ＥＧ有 两种菌 的内　
源 。充分有效地开发和利用纤维素资源关 系到经济　 切 酶分子 量只有 ６
－３　ＫＤ；
（２）葡聚糖外切 酶（
ｃｅｌ
—　
的可持 续发 展乃至人类 的生存 问题 。
　 ｌ
ｏｂｉ
ｏ｝
Ｙｙ
ｄｒ０ｌ
ａｓｅ，
ＥＣ　
３．２．１
．９ｌ，
来 自真茵 简称 ｃＢＨ，
来　
纤维素与石化燃料不同，它的降解是 自然界十　 自细茵简称 Ｃｅ
ｘ），
作用于晶体纤维素 ，
能从纤维素分　
分重要的碳素循环过程 。在纤维素酶的催化条件下 ，
　 子的非还原性末端依次裂解 ｐ一１，４糖苷键 ，
逐个地　
纤维素可分解产生二糖或葡萄糖 。在好氧条件下 ，
纤　 释放出纤维二糖分子。分子量介于 ３８～１
１８　
ＫＤ之问，
　
维素最终被分解成二氧化碳 ；
在厌氧条件下 ，最终被　 如木霉的 ＣＢＨ有两种异构酶，
ｃＢＨ　
１分子量约为 ６６
　
转化成二氧化碳和甲烷 。因此 ，
如果能充分有效地利　 ＫＤ。
ｃＢＨⅡ约为 ５
３ＫＤ；
（３）
ｐ一葡萄糖苷酶 （
ｐ一１
，４一
　
用生物转化技术将各种废弃物中的纤维素转化成简　 ｇ
ｌｕｃ
０ｓｉ
ｄａｓ
ｅ，ＢＧ，
Ｅｃ　
３．２．１．２１）
，作用于纤维二糖和　
单糖 ，
再发酵产生乙醇等能源物质，
不仅可以变废为　 短链 的纤维 寡糖 ，生 成葡 萄糖 。分 子量 约为 ７６　
ＫＤ团。
　
宝 。而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环　 纤维素酶是高度复合的诱导酶 ，只有 当上述三种主　
 李兴华 ，
等 ：ＲＮＡ干扰技术和 家蚕杆状病毒表达 系统在纤维素酶研究 中的应用前景　 ・７ ・
　

要成分活性 比例恰当，
发挥高度协同作用时 ，
才能表　 ｐｅｒ
ｇｉｌ
ｌｕｓ
　ｎｉ
ｇｅｒ
）、血 红 栓 菌 （
１ｈｍｅｔ
ｅｓ　
ｓａｎ　 ｎｅａ）卧 孔　
现 出较高 的活 性 。
　 属（
Ｐｏｒ
ｉａ）、
绳状青霉 （
Ｐｅｎ
ｉｃｉ
ｌｌ
ｉｕｍ　
ｆｕｎｉ
ｃｕｌ
ｏｓｕ
ｍ）、
绿色　
纤维素酶在 自然界中的分布极为广泛 ，昆虫、细　 木霉 （
Ｔｒｉ
ｃｈ０
ｄｅ瑚ａ
　ｖｉ
ｒｉ
ｄｅ）
、里 氏木霉（
Ｔ．ｒ
ｅｅｓ
ｅｉ）
等 。其　
菌、
放线菌、真菌、动物体内等都能产生 。不 同来源的　 中。对纤维素作用较强的菌株多是木霉属（ Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅ卜　
纤维素酶 。
其结构和功能相差很大。纤维素酶的多形　 ｍａ
）、曲霉属（
Ａｓｐ
ｅｒｇ
ｉｌｌ
ｕｓ）
、青霉属 （
Ｐｅｎ
ｉｃｉ
ｌｌ
ｉｕｍ）、Ｐｅ
ｌ—　
式 、分子量差异 的主要原 因是多数真菌和少数细菌　 ｌ
ｉｅｎ
ｌａｌ
ｉａ属和枝顶孢霉属 （ Ａｃｒｅｍ０ｎｉ
ｕｍ）
的菌株 ，
特别　
的纤维素酶都有糖基化。糖基与蛋 白质之间以共价　 是绿色木霉（ Ｔｒ
ｉｃｈｏ
ｄｅ瑚ａ
　ｖｉ
ｒｉ
ｄｅ）及其近缘的菌株 。 　
键结合，
或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定　 在 ２０世纪 ７
Ｏ￣８
０年代 ，
以得到过量纤维素酶生　
程度上保护酶免受蛋 白酶 的水解。纤维素酶 由于糖　 产为主要 目的纤维素酶基 因克隆研究十分活跃 ，
在　
基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间有　 国内外已有约 ８０个组分的基因被克隆圈，
但表达 、
分　
差异。尽管不同来源纤维素酶分子量差别很大 ，
但其　 泌均很弱。近年来 ，随着生物技术 的发展 ，
人们 已经　
催化区的大小却基本一致 ，活性位点的三级结构都　 从 ４Ｏ多种细菌和数种真菌 中克隆得到纤维素酶的　
是保 守 的圈。
　 基因，
其中大多数的核苷酸序列 已被测定。大多数克　
对纤维素酶的序列及结构研究表 明，其分子普　 隆的纤维素酶基因能够在 Ｅ． ｃ
ｏｌｉ中表达，
并可检测其　
遍具有类似的结构 ，即由纤维素结合结构域（ ｃｅｕｕ—　 ＥＧ和 ＣＢＨ活力　。另外 ，
人们借助现代化分析技术　
ｌｏｓ
ｅ　ｂｉｎｄ
ｉｎｇ
　ｄｏ
ｍａｉ
ｎｓ，
ｃＢＤ）、催 化 结构 域 （ｃ
ａｔａ
ｌｙｔｉ
ｃ　 和方法 ，
如重组 ＤＮＡ、
电镜 和 ｘ射线扫描、作用位点　
ｄｏｍａｉｎｓ，
ＣＤ）和 连接桥 （１ｉ
ｎｋｅｒ）
三部 分组成 。ＣＢＤ 比　 修饰 和点诱变 、
局部蛋 白水解 、亲和色谱分离 、
在特　
Ｌｉ
ｎｋｅ
ｒ大 ，
但 比 ｃＤ小 ，可位于蛋 白的 Ｎ端或 ｃ端 。 　 性和配体结合研究方面的人工基质的采用等 ，已经　
如木霉 的 ＣＢＨＩ的 ＣＢＤ位 于 Ｎ端 ，
而 ＣＢＨＩ
Ｉ的 ＣＢＤ　 取得了较大进展 。迄今为止 ，
一级结构 已经被分析确　
位 于 Ｃ端 ；
ＣＤ分子 量 占整 个 蛋 白分 子 的 ７Ｏ％，不 同　 定的纤维素酶至少还有 ２ ０种罔。ｗｏ ｏｄ等在大肠杆菌　
纤 维素 酶 的 ＣＤ序列 不 同 ；
Ｌｉｎｋｅｒ长 度 为 ６—５９个 氨　 Ｅ．ｃｏｌｉ
　Ｋ０ｌ１中表 达 了 欧 氏菌 （
Ｅｒｗｉ
ｎｉａ
　Ｃｈｗｓ
ａｎｔ
ｌｌ
ｅｍｉ
　
基酸 。
介 于 ｃＢＤ和 ＣＤ之 间 ，
存在 的 可能性 是 为 了维　 Ｐ８６０２　
１）的葡 聚糖 内切 酶基 因 ，最终 得 到 的重 组纤 维　
持 ｃＢＤ和 ｃＤ分子的构像 以及 ｃＢＤ与底物结合时 ，
　 素酶在每升培养基 中可产生高达 ３ ２０ｏＩ
ｕ嘲 。
从嗜酸耐　
ＣＤ易于作用底 物 。　 热菌（
Ａｃｉ
ｄｏｔ
ｈｅ瑚 ｕｓ
　ｃｅ
ｌｌｕｌ
０ｌｙｔ
ｉｃｕｓ）中得 到 的一种热 稳　
纤维素酶属于诱导酶 ，
不 同的诱 导物 （
如槐糖 、
　 定 性 的 葡 聚 糖 内切 酶 Ｅ１被 表 达 在 Ａｍｂ
ｉｄｏ
ｐｉｓ
　
蔗糖、
纤维二糖 、
乳糖 、
半乳糖等 ）
均可诱导纤维素酶　 ｔ
ｈａｌｉ
ａｎａ的叶子 中，马铃薯以及烟草 中【 ，
　 。另外 ， 将　
表达 。但其诱导效果和诱导的菌种范围都不如纤维　 构 建 的编码 木糖 同化作 用和 戊糖 磷 酸化 途径 的操 纵　
素 。纤维素 不溶 于水 ，
不 能穿 透细胞 壁进入 细胞 。因　 子转人细 菌发酵单胞菌 （ ｚｙｍｏ
ｍｏｎａｓ
　ｍｏ
ｂｉｌ
ｉｓ）中，
可　
此，
人们推测 ，
可能产酶微生物本身先产少量纤维素　 以有 效地 将木 糖发 酵转化 成 乙醇 。
　
酶，
水解纤维素成可溶性二糖或多糖 ，
这些糖进入细　 除此之外 ，定点突变以及基因重排 （
ｇｅｎ
ｅ　ｓ
ｈｕ—　
胞，成为诱导物 ，
直接或 间接影响 ＤＮＡ结合蛋 白，
促　 ｎｉ
ｎｇ）技术也被应用到高 比活力纤维素酶的筛选 当　
使纤维素酶基因表达。纤维素的最终水解产物（ 葡萄　 中。例如 ：
在里氏木霉（ＴＩ
　
ｒｅｅ
ｓｅｉ
）中，
需要产生至少 １
４　
糖）是纤维素酶基 因表达 的抑制子。如何解除葡萄糖　 种酶协 同作用才能水解未经化学处理过的植物干物　
对纤维 素酶的抑 制 已经 成为一 个研究 热 点【
４
一。　 质 。为 了降低纤维素酶 的复杂性 ．将里 氏木霉 的　
ｃＢＨ１
、嗜酸耐热菌 的葡 聚糖 内切酶 ＥＩ以及 曲霉　
２ 纤 维 素酶 的研 究进 展　
（
Ａｓｐｅ
ｒｇｉ
ｌｌ
ｕｓ　
ｎｉｇ
ｅｒ）
的 Ｂ一葡萄糖苷 酶以 ９
Ｏ：９：
１（质量　
自然界 中广泛地存在着能 降解纤维素 的微生　 比）混合形成一个三元复合物 ， 此三元复合物在 ｌ ２０
　
物，它们种类繁多，
包括细菌、 真菌和放线菌等。细菌　 小时内水解预处理过的纤维素 的能力与里氏木霉中　
类有红黄纤维弧菌 （
ｃｅｌ
ｌｖｉ
ｂｒｉ
ｏ　
ｆｕｌ
、ｒ
ｕｓ）
、普通纤维弧菌　 纤维素酶体的水解能力相当。
为了提高此三元复合物　
（
ｃ．、
ｒ
ｕｌｇ
ａｒｉ
ｓ）等；
放 线菌类有 链霉 属 （
Ｓｔｒ
ｅｐｔ
ｏｍｙ
ｃｅｓ
）　 水解纤维素的活力 ，
利用定点突变的方法对葡聚糖 内　
ＱＭＢ８１
４、高温 放线 菌 属 （
　ｅｍｏ
ａｃｔ
ｉｎｏ
ｍｙｃ
ｅｔｅ
）和　 切酶 ＥＩ的活性位点进行修饰 ，结果与突变前 的三元　
，
Ｉ
１ｌ
ｌｅ
ｒｅｍｏ
ｍｏｎ
ｏｓｐ
ｏｒａ
　ｃｕ
ｒｖａ
ｔａ等；真菌类有黑曲霉 （
Ａｓ—
　 复合物相比， 其水解纤维素的活性提高了 ｌ２
　习 。
　
 ・　

８
　・　 蚕 桑通报 ２０ｏ９年 第 ４０卷 第 ２期　

总之 ，
随着分子生物学 、
遗传工程 的迅猛发展 ，
　 实较大程度地抑制了 ＨＩ
Ｖ的传播　：ＲＮＡ技术可以　
国内外均在尝试应用基 因工程技术来改造和构建高　 针对信号通路的多个基 因或者基 因族的共有序列来　
效纤维素降解菌 ，而且对特殊环境中的纤维素酶产　 同时抑制多个基因的表达 。从而能更有效地抑制肿　
生菌也发生了浓厚的兴趣 。这些菌具有独特的酶学　 瘤生长【
　：　
性质，扩大了纤维素酶的应用范围。此外 ，
一些特殊　 在 国内。
ＲＮＡｉ
技术应用上也取得了突飞猛进的　
环境 中的原核纤维素酶产生菌能产生单一组分的纤　 发展 。高福莲等人应用 ＲＮＡｉ技术分析 ｓｉＲＮＡ对　
维素酶 ，
除了便于分离纯化之外 ，
这些菌还是纤维索　 ＳＧＣ７
９０１
厂ｖｃＲ细胞 ｍｄ
ｒ１基因沉默效果的影响因素　
酶基因克隆的理想供体菌。
　 【
　；翟颖等人应用 ｓｉ
ＲＮＡ使 Ｈｅｃ１基因表达下调 ，
通　
过实时定量 ＰＣＲ检测 Ｈｅ
ｃ１　ｍＲＮＡ表达抑制率 ，
研　
３　ＲＮＡ 干 扰技 术 的研 究进 展　
究癌症高表达（Ｈｅ
ｃ１）
基因表达沉默对 胃癌细胞 ＡＧＳ 　
ＲＮＡ干扰（
ＲＮＡ　
ｉｎｔ
ｅ　ｒ
ｅｎｃ
ｅ。ＲＮＡｉ
）现象广泛存　 分裂周期及 细胞凋 亡 的影 响　 ；
李 继霞等人 利用　
在于真菌、植物和动物体 中，是生物体在进化过程中　 ＲＮＡ干扰效应 阻抑鼻咽癌细胞 ｂ
ｃｌ２
ｘＬ基 因表达和　
形 成 的一 种 内源 基 因表 达 的调控机 制 ．也 是一 种进　 诱导癌细胞凋亡的研究 ，体外转录合成的 ｓ ｉ
ＲＮＡ能　
化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的重要防御　 特异有效 地下调 ｂｃｌ
２ｘＬ基 因的表 达 。不 同序 列特异　
保护机制　。ＲＮＡｉ
指的是 内源性或外源性与内源靶　 性的 ｓ
ｉＲＮＡ下调 ｂｃｌ
２ｘＬ基 因表达 的能 力不 同 ．
瞬时　
基因的转录产物 ｍＲＮＡ编码区某段序列存在同源互　 转染 ｂｃ
ｌ２ｘ
Ｌ　ｓ
讯ＮＡ４能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并　
补 序歹Ⅱ的双链 ＲＮＡ（
ｄｏｕｂｌ
ｅ～ｓ
ｔｒａｎｄｅ
ｄ　ＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡ）．
　 诱导其凋亡 ， ｓｉ
ＲＮＡ不仅为基 因组功能分析提供 了　
在细胞内特异地降解该 ｍＲＮＡ．从而致使特异性的　 强有力 的工具 。而且为抗鼻咽癌基因治疗提供了新　
基 因有效封闭的过程 ，是一种序列特异性 的转录后　 的思路　。 　
基 因沉默 。该技术是近几年发展起来的新技术 。 被　 总之， ＲＮＡｉ已经在生命科学界成为了有力的工　
《
ｓｃｉｅ
ｎｃｅ
》杂志评为 ２
Ｏ０１年十大科技突破之一 ，
名列　 具，极 大地促 进 了人类揭 示生命 奥秘 的进 程 ，
为人类　
２００２年 十大科 学 之首 。 自 １９９８年美 国科 学 家 Ａｎ—　 解决许多世界性难题提供 了新的方法和技术手段。
　
ｄｒ
ｅｗ　
ｚ．Ｆｉ
ｒｅ和 Ｃｒ
ａｉｇ
　ｃ．
Ｍｅｌ
ｌ０首次发现该现象 以来 ，
　
４ 家蚕 杆 状 病 毒表 达 系统 的研 究进 展　
对 ＲＮＡｉ的研究取得 了巨大进展。 它的应用不仅加快　
了功能基 因组学领域的研究步伐，也推动了基因治　 昆 虫 杆 状 病毒 科 （
Ｂａｃ
ｕｌｏ
ｖｉｒ
ｉｄａ
ｅ）因包 埋 于 多 角　
疗等领域的研究。因此 ，
２０ｏ
６年诺贝尔生理学或医学　 体中的病毒粒子呈棒状而得名 。基 因组 由超螺旋的　
奖分别授予 了该两位科学家 ．以表彰他们发现了　 双链 ＤＮＡ组成 ，用作外源基因表达载体的杆状病　
ＲＮＡｉ现象。目前 ，ＲＮＡｉ技术作为一个强有力的反向　 毒 ．目前仅限于核型多角体病毒属 的核型多角体病　
遗传学工具 ， 不仅提供了高效 、 特异性 的抑制基因表　 毒。
　
达 的手 段 ，
而且 正成 为基 因功能研 究 、
抗 病毒 感染研 　 核型多角体病毒作为外源基因的表达载体的设　
究和基因治疗研究等方面的重要方法。
　 想最初是 由 Ｍｉ
ｌｌ
ｅｒ于 １９８１年提出。１ ９８３年 ｓ
ｍ汕 等　
国外学者对 此进行 了深入 的研究 。２ｏｏ３年 ，
　 人首次用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 （ ＡｃＭＮＰ Ｖ）
　
Ｋ啪 ａ
ｔｈ，Ｒ．
ｓ．
等人用 ＲＮＡｉ的方法研究了线虫 １６
７５７
　 在 Ｓｆ
９细胞 中成 功 地 表 达人 Ｂ一干 扰 素 阎，１９８５年　
个基因（
占线虫全基 因组基因总数 的 ８
６％）
的 ＲＮＡｉ
　 Ｍａ
ｅｄａ等人用家蚕核型多角体病毒 （
ＢｍＮＰ
Ｖ）在细　
表型，
共鉴定出 １
７２２个基因缺陷表型 ，
其中２
／３为首　 胞、
蚕体 中高水平地表达了 仅一干扰素　，
从而确证杆　
次发现。这是第一次用 ＲＮＡｉ技术大规模高通量研究　 状病毒表达系统 （Ｂａ
ｃｕ１
ｏｖｉ
Ｉ
１ｌｓ
　ｅｘ
ｐｒｅ
ｓｓｉ
ｏｎ　
ｖｅｃ
ｔｏｒ
　ｓｙ
ｓ—　
全基因组基 因的功能　 ：冷泉港研究 中心的 Ｌａ
ｓｓｕ
ｓ　 ｔ
ｅｍ，
ＢＥｖＳ）
表达外源基因的可行性与高效陛。 　
等人研究证明 ＲＮＡｉ
技术诱导哺乳动物细胞内的基　 该系统是真核表达系统之一 ，采用一个或多个　
因表达沉默 ，
适于研究基 因和蛋白的功能　；
Ｊａｃ
ｑｕｅ，
　 杆状病毒启动子，其 中最常用的是多角体蛋白基 因　
Ｊ
．Ｍ．
等人针对人的一些表面具有 ＨＩ
Ｖ识别受体的淋　 启动子和 Ｐ１
０蛋白基因启动子，将外源 目的基 因插　
巴细胞 ，
构建其表面受体基 因的 ｓ
ｉＲＮＡ，
利用 ＲＮＡｉ
　 入到启动子后 ，
获得重组病毒 ，
这种重组病毒在昆虫　
技术 。
抑制受体基 因的表达 ，
结果证 明 ＲＮＡｉ技术确　 细胞或虫体内复制的同时。
使外源基因得到表达。整　
 李兴华 ，
等：ＲＮＡ干扰技术和 家蚕杆状病毒表达 系统在纤维素酶研究中的应用前景　 ・９ ・
　

个系统由转移载体、
杆状病毒载体和宿主 （
培养细胞　 现在纤维素酶的应用 已扩展到食品发酵 、
医药 、
　
或虫体）
组成 。
　 纺织 、日用化工 、
造纸 、
工业洗涤、
烟草 、
石油开采、
废　
重组杆状病毒 的构建过程 大致可分为三步 进　 水处理及饲料等各个领域 ，但把地球上最丰富的可　
行：
将 目的基因插入到含有 Ａｍｐｒ
、复制起始点 ｏ
ｒｉ及　 再生资源——纤维素 ，用生物转化技术变为新能源　
多克隆位点的转移载体 中 ，
在大肠杆菌 Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中扩　 是人类 由来己久的愿望。随着地球石化能源的短缺　
增 。转移载体带有多角体蛋白启动子及用于同源重　 和枯竭的 日趋严峻 ，把这种愿望变为现实显得更为　
组的杆状病毒多角体蛋 白基 因两端 的侧翼序列 ；
通　 重要 。由于 目前纤维素酶 的研究还不能完全适应这　
过细胞内同源重组将 目的基因转移到杆状病毒基因　 样的需求 ，所 以寻找新的适于再生能源需要 的高催　
组的多角体蛋 白基因部位 ，
取代多角体蛋 白基 因；
筛　 化活性 ，
低成本 的纤维素酶 ，
必将成为这个领域的热　
选重组病毒并在昆虫培养细胞或虫体 内扩增 与表　 点问题。虽然 目前得到的纤维素酶 ，不管是来 自细　
达。
　 菌、真菌 、
植物还是动物的 ，
还不能使 乙醇代替汽油　
近年来 ．随着杆状病毒分子生物学研究的不断　 在经济上成为现实 ，但是随着对纤维素酶研究的不　
深入。以及各种新表达载体的开发 ，
ＢＥＶＳ已是一个　 断深入 ．
以及生物化学 、
分子生物学 、
生物信息学 、
结　
较为成熟的真核表达系统 。至今 已有近千种外源基　 构生物学 以及基 因工程等多种交叉学科 的快速发　
因在 ＢＥｖＳ系统得 到 表达 ，包 括病 毒基 因 、细菌 基　 展 ，获得适合工业生产的高比活力 的纤维素酶将不　
因、真菌基因、无脊椎动物基 因和人类基 因的产物 。
　 再是 可望 而不可 及 的了 。
　
并且 。
转移载体 、
重组病毒的构建与筛选技术也不断　 目前 ，纤维素的生物降解 主要由微生物——细　
得 到 了改进 和发展 。
　 菌和真菌完成。细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤　
在 昆虫杆 状病毒 表达 系统 中 ，以家蚕 杆状 病 毒　 维素酶 ，
这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱 ，　
表达系统更具优越性。利用家蚕表达外源重组蛋白　 长期以来没有得到足够的重视。但原核生物 的基 因　
不仅具有廉价 、方便 、
高效 的优点 ，
而且 翻译后加工　 一

般不含内含子 ，
可直接从基 因组 ＤＮＡ中克隆到 目　
也与天然蛋 白相似。李慧等利用 Ｂａ ｃ—
ｔｏ—
Ｂａｃ在昆虫　 的基因用于工程菌的构建。因此细菌纤维舅　 酶基因　
细胞 表 达 系统 中表达 出人 ＦＧＦ一９重组 蛋 白　 ：
段 宇　 的克隆，既利于研究纤维素酶基 因的多样性 ，也利于　
等利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中表达有生物学活　 高效纤维素酶基 因工程菌的构建 。随着 中性纤维素　
性 的 可 溶 性 分 泌 型 重 组 人 胰 岛 素 样 生 长 因 子 一１
　 酶和碱性纤维紊酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂　
（
ｒｈＩ
ＧＦ＿１
）嘲。Ｍ０
ｔｏｈａ
ｓｈｉ
等成功构建 了 ＢｍＮＰＶ穿梭　 工业 中的成 功应 用 ．以及 耐 热性 纤维 素 酶在燃 料酒　
载体和大肠杆菌 ＤＨ１ ０Ｂ转化株 ， 从 而首次使 ＢｍＮ— 　 精生产 中应用 。细菌纤维素酶制剂已显示出 良好的　
Ｐｖ穿梭载体系统成为可行陶： 缪云根等成功地构建　 应用性能和巨大的经济价值。真菌的纤维素酶基因　
了含 蜘 蛛 丝 基 因 的重 组 杆 状 病 毒 ｒ
Ｂａｃ
ｍｉｄ／
ＢｍＮＰｖ／
　 虽然含有 内含子 ，但是其纤维素酶活性明显高于细　
ｎａ
ｇ，蜘蛛丝蛋 白在家蚕 ＢｍＮ细胞和家蚕幼虫 中均　 菌。通过固体发酵和液体发酵 ，真茵在纤维素酶的生　
得到表达　，蠲：
岳万福等应用这种新型的 Ｂａ ｃ—ｔ
ｏ—Ｂａ
ｃ／　 产和应用上已受到了广泛的重视。
　
ＢｍＮＰＶ杆状病毒表达系统使得 Ｍｎ —ＳＯＤ在家蚕幼　 但是 ，
纤维素酶属于诱导酶 。产纤维素酶的细菌　
虫 内高效 表达 ，为生 产上 制取 超 氧 化物 歧 化酶　 和真菌只有在没有简单碳源 （
如葡萄糖等 ）存在 ，
而　
（
ＳＯＤ）
提供了良好的基础　。
　 只有以纤维素类物质为唯一碳源 的条件下才能分泌　
纤维素酶 ，
而且 ，
酶分解底物所产生的终产物（葡萄　
５ 前 景展 望　
糖）
达到一定浓度时 ，
又会反过来抑制细菌和真菌纤　
自然界中细菌、
真菌、
某些无脊椎动物 ．
直至高　 维素酶基因的表达。　
等植物中都有纤维素酶的存在 ，对其进行研究还具　 为了简便 、
快捷 、
高效地生产和利用纤维素酶 ．
　
有普遍 的生态意义。纤维素酶的特异性高，反应条件　 ＲＮＡ干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统的成熟和完　
比较温和 ，可避免化学转化所导致的环境污染 等 ，
是　 善无疑将是一个非常有力的工具 。通过 ＲＮＡｉ
。将酶　
将纤维素物质转化成简单糖 的关键 。在再生能源利　 发酵过程中葡萄糖达到一定浓度时抑制纤维素酶基　
用方 面具有很 广 阔的应 用前景 。
　 因转录和表达的蛋白因子 的基 因沉默掉 。从而解除　
 蚕 桑 通报 ２ｏ０９年 第 ４０卷 第 ２期　

葡萄糖对纤维素酶的抑制作用 ，延续该酶基因的转　 ［
１　
５】Ｋａ
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ｌＩ
，Ｒ．
Ｓ．ａ
ｎｄ　
Ｆｒａ
ｓｅｒ
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Ｇ．Ｓ
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ｎｃｔ
ｉｏ
ｎａ１
　ａ
Ｊ１ａ
ｌｙ—
　
录和表达 ；
通过家蚕杆状病毒表达系统 ，
快速、
高效　 ｓ
ｉｓ　
０ｆ　
ｔｌ
ｌｅ
　Ｃａ
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ｒｈａ
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ｔｉ
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ｌｅｇ
ａｎ８
　ｇｅ
ｎｏｍｅ
　ｕｓ
　ｇ　
ＲＮＡｉ忉．
　
Ｎａｔ
ｕｒｅ，２Ｏ０３，４２１（
６９２ｏ）
：２３１—
．２３７．
　
地表达和纯化高活力纤维素酶，并将其各种酶系按　
【
１　
６］Ｉ
Ｊａｓ
ｓｕｓ
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ｅｚ，Ｊ
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ｉｋ，Ｙ．Ｃｏ
Ｉｌ
ｆｉ
ｎｌｌ
ｉｎｇ
　
一

定的比例制成酶制剂，
应用前景十分广泛。
　 ｓ
ｐｅｃ击ｃ　 ０ｆ
　ＲＮＡｉ
　ｉ
ｎ　ｍａｍｍａ
ｈａｎ　
ｃｅｌ
ｌｓ【
Ｊ］．Ｓｃｉ
　ＳＴＫＥ，２ｏ０２，
　
总之， 纤维素酶的研究具有广泛而重要的意义 ．
　 ２ｏ０２（
１４７
）：ＰＬ１３．
　
利用 ＲＮＡ干拢技术和家蚕杆状病毒表达系统来进　 【
１７】Ｊ
ａｃｑｕｅ，Ｊ．
Ｍ．，
　 ｑｕ ｅ
ｓ，ｋ，Ｓ ｔ
ｅｖｅｎｓ
ｏｎ，Ｍ．Ｍ０ｄｕｌａｔ
ｉｏｎ
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ＨＩＶ一１　ｒ
ｅｐ１ｉ
ｃａｔ
ｉ０ｎ
　ｂｙ　ＲＮＡ ．
ｍｔｅｒ
ｆｅｒ
ｅｎｃ
ｅ册．Ｎａ
ｔｕｒｅ，２Ｏ０２，
　
行纤维素酶的生产和应用具有 良好广阔的前景。
　
４１
８（６８９６
）：４３
５—４３８．
　
【
１　
８］Ｃｉ
ｏｃａ
，Ｄ．　，Ａｏ ｌ
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，Ｙ．
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ｙｏｓ
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＇Ｋ．ＲＮＡ　
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参 考 文 献　
ｆ
ｕｎｃｔ
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ｌｌｗａｙ　ｗｉ
ｔｌｌ
　ｔＩ
ｌｅｒ
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ｉｅ　ｐ０ｔ
ｅｎｔ
ｉａｌ
　ｉｎ　ｈｕｍａ　
【
１】陈小坚．纤维素酶 的分子生物学研究及应用进展【
Ｊ］
．湖北　 ｍｙｅ
１ｏｉ
ｄ　１
ｅｕｋｅＩ
Ｉｌ
ｉａ　
ｃｅｕ　
ｌｉＩ
ｌｅｓ叨．Ｃａｎｃｅｒ
　Ｇｅｎｅ
　１１１
ｅｒ，２００３，１０　
民族学院学院（ 医学版）
，２０ｏ６
，２３
（４）
：４８
　１ ．
　 （
２）：ｌ
２弘ｌ
３３．
　
［
２］谢 占玲，吴 润．纤维素酶 的研究 进展【 Ｊ
］．草 业科 学，２０
０４，
　 ［
１　
９］高福莲，朱 晓燕 ，王峰等．ｓ
ｉＲＮＡ对ｓＧｃ７９
０ｌ厂
ｖｃＲ细胞　
２１（
４）
：７２　 ６．
　 ｍｄｒ
１基 因沉 默效果 的影响 因素叨．肿瘤 防治研究，２
ｏｏ６，
　
【
３】Ｓｍｎ
＇ ｏ　 Ｍ． １
．　 Ｃａｔ
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ｔｉｃ
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ｏｓｙ
ｌ　 ３３
（３）
：１５１
～ｌ５
５．　
ｔ瑚８ｆｅ
ｒｓ田．Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ．
，１９９０，
９ ０（
１　
２）
：１　
１７１
一ｌ　
１９２．
　 ［
２ｏ］翟颖，蔡劬，陈雪华等．Ｈｅ
ｃ１基因表达沉默对 胃癌细胞凋　
［
４］
　 ｋ ｅｎｓ
，　Ｍ．Ｃ．　ｒＩ
＇
｝ｌｅ
　ｔ砌ｓ ｃｒ
ｉｐｔ
ｉ０ｎａ
ｌ　
ａｃｔｉ
ｖａｔ
０ｒⅪｎＲ　ｒ
ｅｇｕｌ
ａｔｅ
ｓ　 亡及分裂周期的影响 田．上海交通大学学报 （ 医学版），
　
ｂ０
ｔｌ
ｌ　
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ｌｕｃａ
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）：８
５２～８
５５．
　
ｐｅ
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ｌｕｓ
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ｇｅｒＵ］．Ａｐｐ１　Ｅｎｖｉ
ｏｎ　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏ
ｌ，１９９
８，６４：３６１５—　 【
２１】李继霞，周克元 ，
蔡康荣等．利用ＲＮＡ干扰效应阻抑鼻 咽　
３６ｌ
９．　 癌细胞ｂｃ
ｈｃ【
基 因表达和诱导癌细胞凋亡的研究【 Ｊ
】．中华　
［
５］Ｓ
ｐｉｒ
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Ｂ．ｃｈ啪 ｅ
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０ｆ　 耳鼻咽喉科杂志，２ ｏ０
５，４Ｏ
（５）
：３４
７～３
５１．
　
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［
６］ 肖春玲，徐常新．
微生物纤维素酶的应用研究　．微生物学　 ｕ
ｌｏｖ
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杂 志 ，２ｏｏ２，２２（
２）：３３￣３５．
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２３】Ｍａｅｄａ
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［
７］敖维平，
杨正德．
饲料纤维素酶的研究进展与应用现状叨．
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贵州农业科学，２
Ｏｏ４
，３２
（４】
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￣７８．
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８】Ｓｉ
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２４］李慧，魏 刚，于永利．以ＢａｃＩ
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　 表达人ＦＧＦ．９叨．中国免疫学杂志，１ ９
９９，１
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ｒｅ—　 【
２５］段字，汪承亚，张志芳等．利用杆状 病毒 载体在家蚕幼虫　
ｃ０
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　 中高效表达人胰 岛素 样生 长因子一１ 的研究阴．中国生化　
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ａ　 药物杂志，２
ｏｏ１
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４～２７
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３）：
５４７－５５５．
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１４】高凤琴 ，
张丽莉．ＲＮＡ干扰 的研究进展【
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．陕西医学杂志，
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