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・ 870・ 中华外 科杂 志 2005年 7月第 43卷第 l

3期 Chi
nJSu ,Ju
ly2005,
Vo1
.43,
No.1


血 管外科 .

脱 细胞 血管基质 制备 和异体移植 的
实验研究
范恒华 张伯 勋 梁向党 汪爱媛 赵斌 崔雪梅 胡益 云 吴迪 周华 王岩

【摘要】 目的 研究建立无细胞血管基质制备 的新方法 ,


并探讨脱细胞血管异体移植 的可行
性。方法 采用不 同去垢剂 [1%Tr
it
onX一
100、1
%十二烷基磺酸钠(SDS)]多步骤对血管进行脱细胞
处理 。
并通过组织学 和力学观测 ,
建立 兔动脉血 管脱细胞 的方法 ;
并进行 脱细胞血 管的异体移植 。
结 果 经 低渗 溶 液 和去垢 剂 1
% Tr
it
onX一
100、1
%SDS等 多步 骤 处 理 ,
兔 胸 主 动 脉血 管 的 细 胞 基 本 脱
除,
细胞外基质保持完好,
血管 的弹性 、
韧性和力学强度仅轻度 降低 ;
用该法制备的兔颈动脉 (直径 约
2.
0mm)进行异体移植 ,
经 2个月观察 ,
全部通 畅。结论 经去垢 剂 Tr
it
onX一
100、
SDS加低 渗溶 液和
蛋 白酶 抑制 剂处 理 的多 步法 ,可 以脱 除血 管 的细 胞成 分 ,
细 胞外 基 质和 力学 特 性保 持 完好 ,
是 一 种较
好的方法 ;
用该法制备 的兔颈动脉(直径约 2.
0mm)进行异体移植 ,
初步取得成功。
【关键词 】 动脉 ; 移植 ,同种 ; 力学; 脱细胞; 血管基质

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celu
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异体血管移植 至今 未 能在 临床 应用 ,
关 键是 异 来,
学 者们认 识到抗原性存 在于组织 的细胞 内 ,
提出
体组织抗 原性排斥反应 的难题未能得 到解 决 。近年 脱 除细胞保 留细胞外 基质 的血管 ,可作 为血管替 代
物 【1
.2
J。血管脱 细胞 的方 法 ,
报 道不 少 H4。
,但我们

作 者单位 :1
0003
6北 京 ,
空军 总 医 院 骨科 (范 恒华 、
胡益云、

重复后 ,
未能得 到满 意 的结果 。故我 们 在文 献 的基
迪、
周华 );
解放 军 总医 院骨 科 (张 伯 勋 、
梁向党、
汪爱嫒、
赵斌、
崔雪 础上 ,
于20
04年 2月 至 20
05年 2月通 过 不 同种 类
梅、
王岩 ) 去垢剂和不 同浓度 的胰 蛋 白酶 ,
对 兔 胸 主动脉 的脱
通 讯 作者 :范恒 华 。
Ema
il:
fan
hhS@y
aho
o.e
om.
cn 细胞效果 比较后 ,
建立 了一种新 的脱细胞方法 ;
并用

Q2xvdWRWZXJzaW9uLQo?

005年 7月第 43卷第 l
3期 Chi
nJ

该方法处理兔 的颈动脉后 ,
进行异体移植 ,
初步取得 [
1-l
5],
摸索总结使用多步法进行脱细胞和动脉血管
了成功 ,
现报道如下 。 基质 的制备 。具体如下 :
无离 子水 1
2h-+1
%Tr
it
on
24h-+
PBs缓 冲液 洗 涤 3次 后 ,
无 离子 水 4 h-
+1%
材料与方法
SDS2
4 h。最后用 PBS洗 涤 3次后 ,
无离 子水 4 h,

、 试剂 和仪器 用含抗生素 的 Ha
nks溶 液漂洗 2次 ,
4h/次 (中间换

. 化 学 试 剂 : Tr
it
onX一
100 (t
-oc
tyl — 1次液体 )。上述 步 骤 完成 后 ,
取 出 血管 段 进行 大
ph
eno
xypo
lye
tho
xye
tha
no1
)分 析 纯 (美 国 Si
gma公 体、
组织学和一维 、
二维力学 观测 。
司 );
十二烷基磺 酸钠 (s o
dium d
odecy
lsu
lfa
te,SDS) 上述各步 中均加 人蛋 白酶抑制 剂 5 i

zmo
l/L苯
分析纯(上 海化 学试 剂公 司 ); 磷 酸 三丁酯 [(tri(n— 甲基磺 酸氟 、
抗 生素头孢 唑啉 钠 lmv

/n ̄和链霉 素

uty1
)pho
sph
ate,TnBP]分析纯 (北京 化学试 剂有 限 1
00 v

/ml,
每一步均在震荡器 中持续震荡 ,
室温 (
25
公 司);苯 甲基磺 酸 氟 (美 国 Me r
k公 司 );
羟 甲基 氨 ±2)℃ 。
基 甲烷 (
Tris)分析 纯 (美 国 Si
m a公 司 );
g 胰 蛋 白酶 颈动 脉脱细 胞血管 基质制 备完毕后 ,
采 用真空
和乙二胺 四 乙酸 (EDTA)分 析纯 (北京 化学试 剂 有 封装∞Co^
y射线辐照灭菌 ,
剂量 为 1
0kGy,
然后 4℃
限公 司)。 冷藏备用 。
2.实验 仪 器 :
THZ-
95型 台式 恒 温 震荡 培 养 箱 4.置备 后监测 :
(1)
形 态学 :
在 血管处理 的前 、
(北京军事 医学 科学 院实 验 仪器 厂研 制 ,
四环科 学 中、后,观察血 管 的大体 形态 、弹性 、
韧性 等 ,各取标
仪器厂 );日立 S-
450电子扫描显微镜 ;日本 Ol
ympu
s 本作切 片 ,
分别作 HE和 Va
nGies
on—
Wei
ger
t染色 ,

光学显微镜及 图像分 析软 件 (I
mag
e—Pr
oPl
us5.
0); 下观察 。扫描电镜观察 内膜细胞脱除情况 。管壁制
美 国 MT
S-85
8力学实验机。 成切 片在显微镜 下测量厚度 。不 同溶液的细胞脱除
二、
实验方法 率(
% )通过切 片观察计 数细胞 ,
并利用如下公式进
1.
动物模型及血管采取 :健康新西兰大 白兔 2
0 行细胞脱除率计算 J:
只,
体重 2
.0—3.
0kg,
雌雄均可 。取其胸主动脉 ,

细胞 脱 除率 (% )=
径 约为 3
.5—4.
5mm,
主要用于脱细胞方法研究 ;
取 一

脱细胞处理后血
其颈 动脉 ,
直径约 为 2.
0 mm,
脱 细胞后用 于异体移 新鲜 动脉 的细胞数
植研究 。 (
2)力学 测试 :径 向拉伸实验 :
血管材料剪裁成
放 血处死 后 ,
无菌条件 下 ,
开胸显露并游离胸主 2
5.0mm×2.
5mm一3
5.0mm×3.
5ml
n大小 的材料
动脉 ,
取下 约 1
0em,
立 即置 人 含 肝素 的生 理 盐 水 片,
在 MTS一
858力 学 实 验机 上 作牵 拉 实 验 ,
参 照文
中,
冲洗排尽 内腔积血 ,
轻柔剥离其外层 的疏松结缔 献测量 和计算相 关数值 , 设 伸长 比为 、La
grng
a e应
组织 。取材全部 完成后 ,
将 所取标本置 人 PBS缓 冲 变 为 £、
Lag
rng
a e应力(MPa)为 T J
。二维爆破压 测
液中 ,放 人 一6
o℃冰箱 内保存 7d以上 。同法取 出 定:
将血管材料各分支及远近端结扎 ,
并经 近端插入
处理 双侧 颈动脉 。 连通 管接测压计 和加压 注人 装置 ,
然 后 以 3ml
/mi

2.实验设 计 :采 用 随机 单位 组 设计 资 料进 行 恒速注人生理盐水 , 记 录管壁 破裂 开始渗 水时 的压
每种处 理 因素 的处 理 。选 取 同 批 采 集 的 动脉 ,
从 力读 数 ,
即称为爆 破压 .3
J,每组测 量 1
O个样 本 ,

6o℃取出解冻 后 ,
人 4℃ 冰箱 置 2
4 h,
进行 实 验 , 均值 。
作为正常动脉(PBS
—A)对照 ;
取 出新鲜动脉 (2
0℃热 三、
体 内植人实验
缺血 <6h),
作 为新鲜动脉 (Fr
esh,
A)对 照 。每组测 颈动脉 异体移植 实验 ,
取 出上述制作 和备 用的
量1
O个样本 ,
取均值 。 兔颈动脉血管 ,
直径约 2
.0mm,
长约 2
.0~4.
0cm:

.脱 细胞方法 :(1)单 因素处理 :先将 不 同种 移植 手 术 前 ,
作 组 织 学 和 细菌 学 检 测 。选 取 5只
类 的 去 污 剂 (均 为 1% V/V,2
4 h)和 0.1
25% 、 2.
5~3.0kg兔 的一侧 颈 动脉 , 切 断 颈 动脉 造成 约
0.
25%的胰蛋 白酶 (含 EDTA0.
02% ,2h)
对兔胸 主 2.
0cm 的缺损 ,
将 准 备好 的脱 细 胞兔 颈 动脉 血管 ,
动脉进行单个 因素 的脱细 胞处理 ,
观 察大体 和镜 下 8
-0缝线缝 合移 植 于缺 损 中;另取 5只相 同条 件 的
形态及脱细 胞效 果 ,
并进行 一 维 力学 观测 。(2)综 兔,
用一侧 颈内静 脉移植 修复 对侧 有 同样 缺损 的颈
合多步法 :
在单 因素处理各条件 的基础上 ,
结合 文献 动脉作为 对照 。术后 给予 肌 肉注射 肝 素 (1
250 U/

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哗 盐娃盘盘 皇土 凿箍旦 L 盟J L 5 塑 —

d.
5d)聃I
头抱 唑啉钠(
02g
/d.3d);
拟于 1、
2,4个 表 I 水M泉什处理血管的力学特 ・
(…

月取材或探 查
、 统计学方 法
所有随机单他组 殳川资料数据均用 ± 表示 .
与 PBS—
A对麒 ,
采用 S
TAI
A70统 汁软件 .
先进行方
差 齐性 硷暄 ,
再用 q
lI索^差分析进行处理 .
方差
不齐政用社 l
检骑; 同卦川同的曲两 比较 j
_
IjSc
hefe
法 (阿I
町比较值 S d厦 P ); o 05

结 果

单闻素处 的脱 i

胞效果
I 组织 学 : : 种 类的 去污 剂和不 同敞度 、
小 均
: I
'BSA , , 00I. ;5955.P 0ooo 不 同
_
『的两 t
l】L

cJ ̄
ele . =一0691.P=000o P<0 01.
f F
同作用时I
hI的胰拦 酶刘兔 胸 动脉处理 .
大体表
= 8 80 P =0 00(
 ̄3 = 一0 55
5 t
J_0 l
Y]9 P (c
】( , =8 i
8 P
现见图 1.
表I J
^中可 以看出.
I%Tt
it
an和 I
%SDS
=I
J ;
s= 1 Ol
6 ,
l_0 0I
5 P (0 0
5. =3
4 67 p ;0 m;
作用 2
4h ,
血管人体外形 、
弹性 和韧性 良好 :
镜下 = 一 I
’629 P =0 《
Hm

可见结构完好 .
胶 纤维 弹 纤维完 整,
横 而上
同心 圆排 列;
纠胞虽没柏脱十净 ,
低细胞枝 变模 _=综 多步 法处 岩I
的脱细胞 效果
糊或碎 袋 .
没有溶 .
细胞脱 除率分 别为 418
%和 I组织学 :大体 、
镜 结构如图 2 从图巾 u以

88% I
%TnBP作 用 2
4 h后 ,
细胞 脱 陈 率 仅为 看 出经过本浊处理 的 血符 大体 形态完好 ,
没有塌陷
77% 胰蛋 l酶作用 2h后 ,
血管大体 1
镜 下结构 断裂 ;
镜 可见细胞草本完全脱除 .
『f
『【
管基质保存完
破坏均较, 重.
尤 “ 02
5% 的浓 度破坪:
更严 畦(如 整:
股原和弹性纤维结 构虽 稍素乱 .
但保 留完好 ,

图I
EII) 上进 几种 化学脱自i
l胞液处弹 的血管厚 确断裂 手
l1
破坏 .
基底膜 清晰
度.
除 丁胰酶外 .
均 比 PBSA对照降低 ,
但 差异 无统 2 学 : 学拉仲 实验结果见表 I.1
叮见综 合法
计学意 义 脱细胞所借 的 管最 大批 力强度为 (
070±00
6)
MP
a,与 PBS
—A对照 相近 ,
约 为新鲜 A的 584% 。
二维爆破 删定值如闭 3,
从 巾可以看 出,
脱细胞
动脉所能承受的爆破压 值约为 5
0kP
a.虽然 比新鲜


A低 .
但与 PRS
—A刘照相似 ,
fll
高于新鲜静脉组
二 异体移植实验

半 个月和 1个月时 ,
通过超声探盎 ,
所有移植的
_
m管均通畅(图 4A):
2个月叫 ,
造影爪管腔通畅 (图
4B);取 材作组织病 理学 检奇 (圉 4C、
4D).
大体 观
察, 移植段 l
m管 与正 常段 已无法 辨认 .
管 语畅 .未
见扩张 .
内膜光滑,
无增 生狭窄 ;
病理 见细 胞在 移植
压 内已何生 长.
从移植段 边 中间逐渐爬行 巾间
处细胞最少 ,
只有 膜 和外膜有细胞生长,
中膜 内外
圈I H脱 胜糠 理 心 t 太悱衅 巷结 椅 I^ 侧仪打少最细胞生长 ;
靠近 l
卜常段吻台 门有大 量细

I 舒驯为止常 0 I
%l'

il
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mri
DS % r
nBJ
,作丌{:
4 胞生长 , 巢样积聚。
h 0l
25 ̄
k 025% 雕 怍¨j2h

2 力学 拉伸 实验 :
从 表 I中可 以看出 经过 S
DS
处理 后血管 的伸 长比确l
I ̄g
ran
ge应变明显 变小 .与 一

脱细胞方法自
口探 讨技脱细胞 管的制 备
PBS—
A对 照 帕 比 差 异 有 统 计 学 意 义 ;Lagr
m ̄g
e应 力 日前临床可供选用 生物 血管替代物主要有 白
强度 比其他稍强 .
但彼此之 问差异 尢统计学意 义、 体 静脉 .
其来源 有限 .
利用 率 :
足5O% 经 物理

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堆 塑堕 L 3
_挂塑旦 L 丛 2 ! 4

§ ~

洗 ,使 部 分 纠 胞 溶 胀 、破 裂 去
除 “.
另一力面也可使经过 去垢剂
处理的细胞膜受损但未破裂溶解 的

黧 细胞 ,
溶 胀后加速破裂 脱 出 本 实
验将 Tr
it

是 因为 S
nX一
】o0放在 SDS之前 ,
DS为离子型去垢 剂 ,
脱细
胞效果强 短 时间 内大量细 胞破裂

…霪
窜蓐
后释放 的蛋 闩酶较 多 ,
从 而引起较
多的蛋 白纤维损 伤,影响血管 的结
构和力学特 忡 .
救 让柔和 的非离 于
型去垢剂 Tr
it
onX-
100先 去除部 分
? ‘

细胞厦内在的蛋 白酶 ,
使细 胞 内的
蚩 『酶 至 于短 时间 内大量释 放
目2 联舟脱 胞 胸 动 M≈ 织 态结构 2
^为 I
BsA 常对 组 2I

为综合 脱 盹 I U左 依此为 kf
槲 掏 伴日病理(旺 船也 )
和腔 降低胶原纤维 、弹 力纤维晌损 伤
纤维 忠结 掏(V I
G w Ⅲ 也 x2f
lO3 二、多步 骤脱细胞 管 织 的
力学特 性
血管组织的力学强度非常重要 多步骤方法获
得的血管脱细胞 l
织基 质 完 全去除了细胞成分 .


剩主耍为维持 I
管'J
E)J的胶蟓蛋 白和弹 眭蛋 白.

物力学检测 农叫.
其所能承受 的最大负载和爆破压 ,
及其在外力作片jF所 产生的应 变和 m载一 仲长 曲
线均与正常血 管相 似 ‘ :
可 以满 足体 内组织 工程
血管的力学强度
三、脱细 咆异体 『
血管移植宾验
均 ¨ d 划脓 =5R 4 ,l_n㈣ =J
&6 脱细胞异体血管 . 以其无或低抗原性 、
与受体细
’P n 05 = 41 8 P £0 01
咆有极佳 的相容性 .
以 受含打促 进细 胞牛 长特殊
目3 m管时科岫=维 懈 骑lk
生物信息 的生物性细胞外基 匝 .无疑是异体血 管
或化学交联处理后 的同种 异体 血管 ,
情 人体内的敬 移檀的理想材 料 血管脱细 胞的方法报道较 多 ,

果始终不住 .直¨自身细胞难以长人 .术后钙化率雨/ 臾 异休血管移植 的报道却很少 ,究其原因,-.
方面可能
收率很高 等 而经过 脱细 胞处 舶异 体血 管 基 是众 多作者睨细咆的 目的在 于制作血管体外红I
织工
质很好地去除了抗j泉性 .
移植后与受 体细胞有较 好 程 点架 ,
另一方画 ,
可能是有些脱细胞的方法有待进
的相容性 .使受体 I

.常 m管 的细 胞,
通过 爬行 生 一

步改进 导致 管 材料移植失败 的原因 ,


有动脉
长生戚新 的m管,
从 而完成体 向 织工程 I
血管 .
这已 僖样 扩张 、
感染、
血 栓 和 内膜 增 生 而致 的狭 窄… 。
成为现在 管组织工稚 的热 ‘ 脱细胞方法不当. 使 会损 伤内膜币 l

纤维基质 .
导致失
本实验先 商过筛检常用脱细胞试剂的脱细胞效 败;同时 m
借 的直径越细 , 移 植段越 K.
移植成功率
果,
实验 比较 后发现 Tr
lmn
X-1
00和 S
DS小论是脱细 越低
胞效果 ,
还 是维持管壁结 构和 力学 特件 都较 好 虽 F
lil
ber
t等 使用羊 的颈 动脉 ,
进行 实验 .
取得
然有文献报道 单弛他用这断种洗脱 _ 刊 叮以脱 点血管 了 7个月 的通 畅时 间,
不过其血管赢径为 5 O肌n
细胞 ,
佩需 时问较 }
∈,最 k1
70余小时 .
本实验 毛 另有报遭采用 人的大隐静脉 ,脱除细胞 后移植于犬
复后发现 ,血管结构 破坏 严重 :
Sch
ane
r等 ‘电报 道 的颈 动脉 ,
观察通畅 1
5d ~本实验制 各的移植血
单独使用 SDS能较 I兜脱除静脉血管 的细胞 .但非 管管径为 20m”,
移植长度 I5~2 5c
m,通过 2个
动脉 月的观l
删,5例 均通 畅 ,
所打移楠 血管管腔通 畅 ,

本实验 在 多步 法中.采用 低渗 离子水先行漂 见扩张和 登窄 目前脱细胞 异种 皮肤 ,
心脏瓣膜 穆

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通过 2个月的观测 , 初步取得成功。 化学萃取 法 研究 中华外科杂志.
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不过移植长度鞍 短 .
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参 考 文 献
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{奉立编辑 :
韩静

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