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엔도톡신
미생물한도시험법
시험법
※본 시험법은 대한민국약전 10개정 일반시험법에
반영될 미생물한도시험법을 기초로 작성되었습니다.
※본 시험법은 대한민국약전 10개정 일반시험법에
반영될 엔도톡신시험법을 기초로 작성되었습니다.

illust 삽입예정
 인/사/말

‘의약품 일반시험법 핸드북’발간을 기쁘게 생각합니다.

본 핸드북은「대한민국약전」에 수록된 일반시험법의

원리와 시험방법 및 적용에 관하여 보다 쉽게 설명하여,

시험법에 관한 전반적인 이해를 도우고 정확한 시험이

수행될 수 있게 하고자 제작되었습니다.

올해는 무균시험법 등 총 10개 시험법에 대한 핸드북을

우선 발간하고, 향후에도 지속적으로 나머지 시험법에

관한 추가 발간 및 업데이트에 힘써 현장에서 필요한

유용한 교재를 모두 갖추어 갈 계획입니다.

아무쪼록 본 핸드북이 의약품 시험 업무를 수행하는

많은 분들에게 실질적으로 도움이 되고 널리 활용되기

바라며, 제작에 도움을 주신 여러분들께 깊은 감사의

말씀을 드립니다.

2012. 9. 27.
의료제품연구부장 강신정
엔도톡신시험법

CONTENTS

Ⅰ. 개요 04
1. 엔도톡신 04
2. 엔도톡신시험법 04
3. 시험법 종류 04

Ⅱ. 시험법 06
1. 시험법 일반 06
2. 겔화법 08
3. 광학적 방법 11

Ⅲ. 참고자료 14
1. 엔도톡신시험법과 발열성물질시험법과의 관계 14
2. 엔도톡신시험법의 대표적인 반응저해 인자 15

Ⅳ. 국내외 약전 19
The Korean Pharmacopoeia 20
U.S. Pharmacopeia 29
European Pharmacopoeia 34
The Japanese Pharmacopoeia 39
 엔도톡신시험법

Ⅰ 개요
1 엔도톡신

그람 음성균의 세포벽 구성성분으로 극히 미량에서도 강한 발열활성을 나타내는 내열성의

독소이며, 경구적으로 섭취하면 독성을 나타내지 않으나 혈중에 들어가면 강한 발열활성을
나타냄

2 엔도톡신시험법
• 엔도톡신시험법은 참게(Limulus polyphemus 또는 Tachypleus tridentatus )
의 혈구추출성분으로 만든 라이세이트(Lysate) 시약을 써서 그람음성균에서
유래되는 엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법이다.
• 시험법의 목적은 주사제에 발열을 야기하는 양의 엔도톡신이 들어있지 않다는
것을 확인하여 주사제의 안전성을 확보하기 위함이다.(주로 정맥주사제에 적용)
• 개개주사제의 용량에 따라서 최소발열량에 상당하는 엔도톡신 규격 값이 설정되어
주사제에서 검출되는 엔도톡신의 농도가 규격 값 미만인 것을 가지고 엔도톡신
시험에‘적합’
하다고 판정한다.

3 시험법 종류
시험법 구분 시험법 원리

겔화법 엔도톡신의 작용에 의한 라이세이트 시약의 겔 형성을 지표로 하는 시험법

비탁법 라이세이트 시약의 겔화 과정에서의 탁도 변화를 지표로 하는 시험법

광학적
방법
비색법 합성기질의 가수분해에 의한 발색을 지표로 하는 시험법

4
 Ⅰ. 개요

• 결과에 있어 의심이 나는 경우에는 따로 규정이 없는 한 겔화법에 따라 최종

엔도톡신시험법
판정한다.
• 이 시험은 엔도톡신에 의한 오염을 피하여 시험한다.
- 엔도톡신은 환경 중에 보편적으로 존재하므로 오염을 피하기 위하여 기본적
으로 무균조작이 요구됨
- 공중낙하세균의 영향은 보통 무시할 수 있으므로 보통의 실험실에서 시험을 할
수 있음
- 검체용액이나 라이세이트 시약이 직접 닿는 기구 표면에는 손 같은 엔도톡신
오염원이 접촉해서는 안 됨

Limulus Amebocyte Lysate와 Endotoxin의 반응기구

5
 엔도톡신시험법

엔토톡신규격값 X 검액의 농도

Ⅱ 시험법 λ

1 시험법 일반

• 기구
- 시 험에 쓰는 모든 유리제 및 기타 내열성 기구는 유효한 방법으로 건열
처리한다. 보통 250 ℃에서 적어도 30 분간 건열 처리한다.
- 마 이크로플레이트, 마이크로피펫용팁 등의 플라스틱제품을 쓰는 경우에는
엔도톡신이 검출되지 않고 이 시험법에 대하여 간섭이 없는 것이 확인된 것을
쓴다.

• 엔도톡신표준원액 조제
- 엔도톡신표준품을 엔도톡신시험용 물로 녹여 엔도톡신표준원액을 만든다.
- 엔도톡신의 분산 상태는 활성에 크게 영향을 미치므로 엔도톡신 표준품을 녹일
때 vortex mixer 등으로 일정기간 세게 교반하여 균일한 분산상태의 용액을
만들어야 한다.
- 엔도톡신단위는 EU로 표시하고 1 EU는 1 엔도톡신국제단위(IU)와 같다.

• 엔도톡신표준액 조제
- 엔도톡신표준원액을 충분히 흔들어 섞은 다음 엔도톡신시험용 물로 희석하여
엔도톡신표준액을 만든다. 엔도톡신표준액은 엔도톡신이 용기에 흡착되는 것을
피하기 위하여 될 수 있는 대로 빨리 쓴다.

• 검액의 조제
- 따로 규정이 없는 한 의약품을 엔도톡신시험용 물로 녹이거나 희석하여 검액을

6
 Ⅱ. 시험법

만든다. 보통 검액의 pH는 6.0~8.0 범위에 있으면 된다. 검액에 라이세이트

엔도톡신시험법
시약을 섞었을 때의 pH가 라이세이트 시약에 표시된 pH를 벗어나는
경우에는 pH 조정이 필요할 수도 있다. pH 조정에 쓰는 시약 또는 용액은
엔도톡신시험용 물을 써서 만들고 엔도톡신이 검출되지 않는 용기에 보존한다.
사용하는 시약 또는 용액은 엔도톡신이 검출되지 않으며 반응간섭인자가
없음을 확인한 것이어야 한다.

• 최대유효희석배수
- 최 대유효희석배수란 검액 중에 반응간섭인자가 존재하여 이를 희석으로
없애고자 할 때 허용되는 검액의 최대희석배수이다.

엔토톡신규격값 검액의 농도
최대유효희석배수 =
λ

K/M
엔도톡신
K : 체중 1 kg당 발열을 일으키는 엔도톡신의 양(EU/kg)
규격 값
M : 체중 1 kg당 1 시간 이내에 투여하는 주사제의 최대량

검액의 농도 엔도톡신 규격 값이 규정하는 값에 따라 mg/mL, mEq/mL, 단위/mL, mL/mL

겔화법 : 라이세이트 시약의 표시감도(EU/mL)

λ
비탁법, 비색법 : 검량선의 최소엔도톡신농도(EU/mL)

7
 미생물한도시험법
엔도톡신시험법

1 생균수시험
2 겔화법

이겔화법은 존재하는 엔도톡신에

시험은 호기조건에서 증식할 수 의해
있는 라이세이트 시약이 응고반응을
중온성 (中溫性)의 일으키는
세균 및 진균을 것에
정량적으로
기초하여 엔도톡신을
측정하는 방법이다 검출유효성분으로
. 생균을 또는 정량하는 방법이다.
함유하는 시험법의
제품에는 정밀도
이 시험을 및 유효성을
적용하지 않는다.
보증하기
약전시험법과위하여 예비시험으로
동등성이 인정되는라이세이트
경우에는 시약의 표시감도확인시험
자동화법을 및 반응간섭인자
포함한 다른 미생물학적방법을
시험을 한다.
적용할 수 있다.

11))예비시험
목적 및 유의사항
•가)
목적라이세이트 시약의 표시감도확인시험
이 시험은
시험목적 원료환경,
: 시험 또는 시험자
제제가및규정된
시약의 미생물학적 품질규격에
적절성을 판단하기 위함 적합한지 여부를
판정하는 것을 주목적으로 한다.
시험 방법

엔도톡신표준액 조제 2λ 1λ 0.5 λ 0.25 λ

• 유의사항
라이세이트 시약조제 엔도톡신시험용 물 또는 적당한 완충액에 용해
- 채취검체수를 포함하여 지시된 시험방법에 따라 시험하여 결과를 판정한다.
엔도톡신표준액 및
- 생균수시약
라이세이트 측정은 검체가 외부로부터의
0.1 mL씩 0.1미생물
mL씩 오염을0.1방지할
mL씩 수 있도록
0.1 mL설계된
씩
시험관 분주
조건에서 시험한다. 오염을 방지하기 위한 예방조치는 시험에서 검출하고자
하는 어떤 미생물에
37 ±대해서도
1 ℃, 60 ±2영향을 주어서는
분 방치 후 안 돌려
180°가만히 된다.관찰 → 4회 반복

- 검 체가 항균활성을 가지고 있을
양성 : 흘러내리지 때는겔이항균활성을
않는 견고한 가능한 한 제거 또는
형성되어 있을 때
음성 : 겔이 형성되지 않거나 형성된 겔이 흘러내릴 때
중화한다. 이를 위하여 불활성화제를 쓸 때는 그 불활성화제가 유효성이
매회
있으며, 미생물에 시험에서
대한 독성이0.25 λ 엔도톡신표준액이
없음을 확인한다.모두 음성을 나타낼
검체의 조제에경우 유효함
계면활성제를
판정쓸 회 양성을
때는 미생물에매 대한 나타내는
독성이 최소엔도톡신농도
없으며 → 종말점농도
또한 사용하는 불활성화제와 상호작용이
없음을 확인한다.4회 시험의 기하평균 종말점농도 구함
→ 0.5∼2.0 λ의 범위에 있을 때 표시감도가 확인됨
기하평균 종말점농도 =
- 보 통 멤브레인필터법 또는 한천평판법을 쓴다. 최확수 (Most Probable
: 각 회의 종말점농도의 대수 변환 값 e의 합계
f : 시험 회수 대체로 정밀도가 낮은 균수 측정법이기는 하나
Number ; MPN)법은
오염균수가 아주 적은 검체에 대해서는 최적의 방법이 될 수도 있다. 측정법의
라이세이트 시약의 표시감도는 라이세이트 시약에 규정하는 조건에서 라이세이트
선택은 검체의 특성과 규정된 미생물한도값 등에 근거하며, 선택한 측정법은
시약의 응고에 필요한 최소엔도톡신농도이다. 라이세이트 시약은 각 로트에 대하여
규격에 적합한지 여부를 판단하기에 충분한 양의 검체를 시험할 수 있어야 하고
쓰기 전에 그 표시감도 λ를 확인한다.
적합성이 확인되어야 한다.
* 일반적으로 엔도톡신시험용 물을 음성대조로 하여 음성을 나타내는지 확인한다.

8
 Ⅱ. 시험법

나) 반응간섭인자시험

미생물한도시험법
엔도톡신시험법
2이
) 시험균준비
시험은 검액에 대하여 반응을 촉진 또는 저해하는 인자의 유무를 조사하는
시험이다.
시험균은 표준화된 안정한 현탁액을 사용하거나 다음과 같은 방법으로 조제한다.

액 엔도톡신농도/피첨가액 희석액 희석 배수 엔도톡신의 농도 시험 회수

균 명칭 균주 예시 시험균의 조제
A1) 0 / 검액 - - - 4
대두카제인소화한천배지 또는 대두카제
Staphylococcus ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP4.83
, , ,
1 인소화액체배지 2λ
aureus NBRC 13276또는 KCTC 3881
2) 2 30 ~ 35 ℃ / 18 ~124
λ시간
B 2 λ / 검액 검액 4
4 0.5 λ
대두카제인소화한천배지 또는 대두카제
Pseudomonas ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.1188,
, , 0.25 λ
인소화액체배지
aeruginosa NBRC 13275, 또는 KCTC 2513
30 ~ 35 ℃ / 18 ~ 24 시간
1 2λ
엔도톡신 2 대두카제인소화한천배지 1λ 또는 대두카제
C3) 2 λ / 엔도톡신시험용 물
ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62,4 2
Bacillus subtilis 시험용 물 인소화액체배지 0.5 λ
NBRC 3134 또는 KCTC 1021 8 30 ~ 35 ℃ / 180.25
~ 24 λ
시간

D4) 0 / 엔도톡신시험용 사부로포도당한천배지 또는 사부로포도

ATCC 10231물, NCPF 3179,- IP 48.72, - - 2
Candida albicans 당액체배지
NBRC 1594 또는 KCTC 7965
20 ~ 25 ℃ / 2 ~ 3 일간
1) 음성대조, 검액만 함유
2) 반응간섭인자시험을 위한 표준엔도톡신을 첨가한 검액
사부로포도당한천배지 또는 감자덱스트
→ 기하평균종말점 농도가ATCC0.5~2.0
16404λ의, IMI범위일
149007 IP 1431.83
때,검액에 ,
반응간섭인자가 존재하지 않는 것으로 판정
Aspergillus 로오스한천배지
NBRC 9455 ,
3) 라이세이트시약의 표시감도확인을 위한 엔도톡신표준액KCTC 6317 또는 KCTC
brasiliensis 20 ~ 25 ℃ / 5 ∼ 7 일간 또는 양호한 포자
4) 음성대조, 엔도톡신시험용6196물만 함유
형성이 인정될 때 까지

■ 표준화된 안정한 현탁액

2) 한도시험법
표준화된 안정한 현탁액이란 미리 생균수를 알고 있고 균수가 일정한 상태로
이 시험은 검체에 각조에 규정된 엔도톡신 규격을 넘는 엔도톡신이 함유되어
유지되고 있는 것을 확인할 수 있는 균액을 말함.
있는지의 여부를 라이세이트시약의 표시감도에 따라 겔화반응으로 판정하는
방법이다.
■ 조제 시험균
·시험에
액 쓰는 미생물은 엔도톡신농도
최초의 마스터시드로트
/피첨가액 (master seed lot)로부터
시험회수 계대수 5
회를
1) 넘지 않도록 시드로트 배양관리수법 (seed lot system)으로 관리한다.
A 0 / 검액 2
2)
·시B험균 현탁액의 조제는 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액 또는 pH 7.22 인산완충액을
2 λ / 검액
C3) 2 λ / 엔도톡신시험용 물 2
쓴다.
4)
D 0 / 엔도톡신시험용 물 2
·현탁액은 2 시간 이내에 쓰며 2 ~ 8 ℃로 보존하는 경우에는 24시간 이내에 쓴다.
1) 한도시험을 위한 검액, 최대유효희석배수를 넘지 않는 범위 내 희석 가능
·A sperigillus brasiliensis 또는 Bacillus subtilis의 영양형세포의 신선한
현탁액을 조제하여 희석하는 것을 대신 포자현탁액 또는 아포현탁액을 조제하여
9
 미생물한도시험법
엔도톡신시험법

2) 양성대조, A액과 동일 배수로

접종균액으로 쓸 수희석한
있다. 최종농도가 2 λ가 되도록
검액,Asperigillus 표준엔도톡신을 포자를
brasiliensis의 첨가 현탁할 때는
3) 양성대조, 농도 2 λ의 엔도톡신표준액
완충액에 폴리소르베이트 80을 0.05 % 넣어도 된다.
4) 음성대조, 엔도톡신시험용 물만 함유
·각 현탁액은 보증된 기간 내에서는 2 ~ 8 ℃로 보존할 수 있다.
B, C : 양성, D : 음성 → 시험이 유효
A : 음성일 때 검액이 엔도톡신 규격에 적합하다고 판정
3) 배지준비, 배지성능시험
■ 배지준비

3)・정량시험법
대두카제인소화액체배지 (Soybean-Casein Digest Broth)
카제인제 펩톤 17.0 g
이 시험은 겔화반응의 종말점을 구함으로써 검액 중의 엔도톡신 농도를 측정하는
대두제 펩톤 3.0 g
방법이다.
염화나트륨 5.0 g
액 엔도톡신농도/피첨가액
인산수소이칼륨 희석액 2.5희석g 배수 엔도톡신의 농도 시험 회수

포도당 일수화물 2.5 g1

-
A1) 물 2
0 / 검액 검액 1000 mL - 2
4
- 조정한다. 검증된
멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.1 ~ 7.5가 되도록 pH를
8
주기로 고압증기멸균한다.
2)
B 2 λ / 검액 - 1 2λ 2

·대두카제인소화한천배지 (Soybean-Casein Digest Agar)

1 2λ
카제인제 펩톤 엔도톡신 15.0 2g 1λ
C3) 2 λ / 엔도톡신시험용 물 2
대두제 펩톤 시험용 물5.0 g4 0.5 λ
8 0.25 λ
염화나트륨 5.0 g
D4) 한천
0 / 엔도톡신시험용 물 - 15.0 -g - 2
물 1000 mL
1) 정량시험을 위한 검액, 단계희석배수는 최대유효희석배수를 넘지 않는 범위에서 적절히 바꿀 수 있다.
멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.1 ~ 7.5가 되도록 pH를 조절한다. 검증 된
2) 양성대조, A액과 최대희석배수와 동일한 배수로 희석한 검액에 최종농도가 2 λ가 되도록 표준엔도톡신을 첨가
주기로 고압에
3) 라이세이트시약의 증기멸균한다.
표시감도확인을 위한 엔도톡신표준액
4) 음성대조, 엔도톡신시험용 물만 함유

·사부로포도당한천배지 (Sabouraud Dextrose Agar)

D : 음성, B : 양성, C : 기하평균종말점 농도가 0.5~2.0 λ의 범위
포도당 40.0 g
→ 시험이 유효
펩톤 (육제 및 카제인제 1 : 1) 10.0 g
A : A 액의 엔도톡신 농도 = λ× 종말점에서의 희석배수
한천 15.0 g
2회 시험결과 → 각 기하평균 엔도톡신 농도 → 검체의 엔도톡신 농도 산출
물 1000 mL

10
 Ⅱ. 시험법

3 멸균한
광학적 방법pH가
다음의 25 ℃에서 5.4 ~ 5.8이 되도록 pH를 조절한다. 검증된

미생물한도시험법
엔도톡신시험법
주기로 고압증기멸균한다.
• 기본적으로 보통의 분광광도계로 측정이 가능하지만 전용측정기기를 사용하여
■간편하고도 고정밀도로 측정할 수 있다.
배지성능시험
• 최
· 배근에는 전용 컴퓨터
지성능시험은 5가지 소프트웨어가
미생물 모두에개발되어 컴퓨터 제어로 측정에서부터 데이터
대해서 실시
해석에
· 이르기까지
시판배지는 입고된 자동적으로 되도록
배지 배치마다, 되어있다. 제조배치마다 시험
건조분말배지는
·미생물 소량 (100 CFU 이하)을 대두카제인소화액체배지의 일부, 대두카제인소화
한천배지 및 사부로포도당한천배지의 평판에 접종하고 균주마다 별개로 액체배지
또는 평판을 써서 아래의 조건으로 각각 배양

균 종류 배지 종류 접종균수(CFU) 배양온도(℃) 배양기간(day)

Casein soya bean digest agar

음성대조 ≤ 100 30 ~ 35 ≤3
Casein soya bean digest broth
(균 X)
Sabouraud-dextrose agar ≤ 100 20 ~ 25 ≤5
Staphylococcus Casein soya bean digest agar
≤ 100 30 ~ 35 ≤3
aureus Casein soya bean digest broth
Pseudomonas Casein soya bean digest agar
≤ 100 30 ~ 35 ≤3
aeruginosa Casein soya bean digest broth
Casein soya bean digest agar
Bacillus subtilis ≤ 100 30 ~ 35 ≤3
Casein soya bean digest broth

Candida Casein soya bean digest agar ≤ 100 30 ~ 35 ≤5

albicans Sabouraud-dextrose agar ≤ 100 20 ~ 25 ≤5

Aspergillus Casein soya bean digest agar ≤ 100 30 ~ 35 ≤5

brasiliensis Sabouraud-dextrose agar ≤ 100 20 ~ 25 ≤5

1) 비탁법
판정
• 이 방법은 라이세이트 시약의 겔화에 따른 탁도의 변화를 측정하여 검액의 엔도톡신
·음성대조
농도를 : 미생물이
측정하는 방법이다.증식해서는 안됨 37 ± 1 ℃에서 한다.
시험은 보통
·액체배지 : 유효성이 확인된 배지 배치로 미리 시험하여 얻은 증식과 동등한
• 종 말점비탁법 - 엔도톡신 농도와 일정 반응시간 후의 반응액의 탁도와의
증식이 인정되어야 함
용량반응관계를 기초로 하는 방법이다.
·고체배지
• 속도론적비탁법 - 엔도톡신의 농도와 반응액의 탁도 변화가 미리 설정한 탁도에
1) 표 준화된 균액을 사용한 경우 : 접종균의 출현집락수가 표준화된 균액의
도달하는 시간 또는 탁도의 경시변화율과의 용량반응관계를 기초로 하는 방법이다.
측정값의 1/2 ~ 2 배 이내

11
 미생물한도시험법
엔도톡신시험법

2) 비색법
2) 신선한 배양균을 사용한 경우 : 유효성이 확인된 배지 배치로 미리 시험하여
얻은 증식과 동등한 증식이 인정되어야 함
• 이 방법은 엔도톡신이 라이세이트 시약과의 반응에 의해 발색합성기질에서
유리하는 발색기의 양을 흡광도 또는 투과율로 측정하여 엔도톡신을 정량하는
4) 검체의시험은
방법이다. 조제 보통 37 ± 1 ℃에서 한다.
검액의
• 종 조제법은
말점비색법 - 검체의 물리학적
엔도톡신의 특성에
농도와 일정의존한다.
반응시간아래에 기재한 어느
후 발색기의 방법도
유리량과의
만족할 수 없을 때에는
용량반응관계를 기초로 따로
하는 적절한 다른 방법을 확립한다.
방법이다.
• 속도론적비색법 - 엔도톡신의 농도와 반응액이 미리 설정한 흡광도 또는 투과율에
■ 수용성시간
도달하는 제제또는 발색의 경시변화율과의 용량반응관계를 기초로 하는 방법이다.
검체를 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액, pH 7.2 인산완충액 또는 대두카제인소화
액체배지로 녹이거나 희석한다 (보통 10 배 희석액을 조제한다). 필요하면 pH 6 ~
3) 예비시험
8로 조정한다. 희석이 더 필요할 때에는 같은 희석액으로 조제한다.
비탁법 또는 비색법의 정밀도와 유효성을 보증하기 위하여 검량선의 신뢰성
확인시험
■ 물에 및
녹지반응간섭인자시험을
않는 비지질제제 한다.
검체를 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액, pH 7.2 인산완충액 또는
가) 검량선의 신뢰성 확인시험
대두카제인소화액체배지에 현탁한다 (보통 10 배 희석액을 조제한다). 분산하기 쉽게
• 라이세이트
하기 위하여 예를
시약의들면각 폴리소르베이트 80(농도 : 1 g/L)과 같은 계면활성제를 넣을
로트에 대하여 시험한다.
• 라있다.
수 이세이트필요하면
시약에pH규정하는
6 ~ 8로 엔도톡신
조정한다.농도범위에서
희석이 더 필요할 최소 때에는
3 농도,같은
각각희석액으로
3회 이상
조제한다.
측정하여 검량선을 작성한다.
- 단, 검량선의 농도범위를 2 자리수 보다 크게 할 때 1 자리수를 크게 할 때마다
■엔도톡신
지질제제 표준액의 농도를 1 농도씩 추가해야 한다.
• 검
검체를
량선의여과멸균한
상관계수 r의이소프로필미리스테이트에 녹이거나
절대값 |r|은 0.980 이상임을 필요하면 40℃ 이하
확인한다.
(예외적인 경우에는 45℃ 이하)에서 가온한 최소필요량의 멸균된 폴리소르베이트
80
나)또는 다른 저해성이 없는 계면활성제를 써서 혼합한다. 필요하면 수욕에서 그
반응간섭인자시험
온도를 유지하면서 주의깊게 섞는다. 선정한 희석액을 미리 가온하여 넣어 검체의
액 엔도톡신 농도 피첨가액 시험관 또는 웰(well)의 수
10 배 희석액을 조제한다. 유화에 필요한 가장 짧은 시간 동안 온도를 유지하면서
A1) 0 검액 2 이상
주의하여 섞는다. 적절한 농도의 멸균한 폴리소르베이트 80 또는 다른 저해성이 없는
B2) 검량선의 가운데 점 농도 검액 2 이상
계면활성제를 함유하는 같은 희석액으로 10 배 단계 희석계열을 조제해도 된다.
C3) 3농도 이상 엔도톡신시험용 물 각 농도 2 이상
4)
D 에어로솔형의 액체
■ 0 또는 고체 엔도톡신시험용 물 2 이상

1) 검체를 무균적으로
검액만 함유(검액의 멤브레인필터장치에
엔도톡신 넣거나
농도 측정용) 최대유효희석배수를 넘지검체 채취를희석
않는 범위에서 위하여
가능 멸균용기로
2 ) A 액과 동일배수로
옮긴다. 희석한 검액으로
각 검체용기에서 전량을검량선의
쓰거나가운데 점 또는 가운데
정량분무한 일정량을 점 부근의
쓴다.엔도톡신 농도가 되도록
표준엔도톡신을 첨가

12
 Ⅱ. 시험법

3) ■
예비시험 가) 검량선의 신뢰성 확인시험에 쓴 여러 농도의 엔도톡신표준액(검량선작성용)
경피흡수패취

미생물한도시험법
엔도톡신시험법
4) 음성대조, 엔도톡신시험용 물만 함유
경피흡수패취의 보호피복 (박리라이너)을 제거하고 점착면을 위로 향하게 하여
멸균유리 또는 멸균플라스틱트레이 (tray) 위에 놓는다. 패취끼리 부착하는 것을 막기
• 다음의 조건에 적합하여야 시험이 유효하다.
위하여 멸균한 다공성물질 (예를 들면 멸균거즈)로 점착면을 덮는다. 폴리소르베이트
조건 1 검량선의 상관계수의 절대값|r|이 0.980이상
80 및/또는 레시틴 등의 불활성화제를 함유하는 선정한 희석액 적당량에 패취를 넣고
조건 2 B액에 첨가한 엔도톡신 농도의 회수율이 50~200 %의 범위이내
적어도 30 분간 세게 흔들어 섞는다.
조건 3 엔도톡신시험용 물의 결과가 라이세이트 시약에 설정하는 공시험의 한도
값을 넘지 않거나 또는 엔도톡신의 검출한계 미만
5) 측정법적합성시험
본격적인 시험에 들어가기에 앞서, 시험하고자 하는 검체의 특성에 따라 시험법이
4) 정량법
결정되어야 한다.
가) 조작법
• 예비시험의 반응간섭인자시험에
미생물한도의 생균수시험법은 총따라4가지이며,
조작 이후 모든 과정은 시험법에 맞게
선택하여 실시한다.
나)
ⅰ.엔도톡신
멤브레인농도의
필터법산출
ⅱ.음한천평판법
• 다 조건에 적합해야 한다.
- 한천평판혼합법
조건 1 검량선의 상관계수의 절대값|r|이 0.980이상
- 한천평판도말법
조건 2 회수율 50~200 %의 범위
ⅲ.
조건최확수법 : 정밀도가물의
3 엔도톡신시험용 낮으나 오염균수가
결과가 아주시약에
라이세이트 적은 검체일 때 최적의
설정하는 공시험의방법
한도
값을 넘지 않거나 엔도톡신의 검출한계 미만
■ 측정법적합성시험 개요
• 접종
다) 및 희석엔도톡신 농도를 기초로 하여 검체의 엔도톡신 농도(EU/mL, EU/mg,
판정검액의
- 100 CFU
EU/mEq 또는 이하의 접종균을
EU/단위)가 얻는데 충분한
의약품각조에서 양의 시험균
규정하는 엔도톡신현탁액을
기준을 4)
만족할검체의
때
준비에. 따라 마련된 검액 및 대조액 (검체 불포함)에 넣는다.
적합하다
- 접종하는 시험균 현탁액의 양은 검액량의 1 %를 초과하지 않도록 한다.
- 제품에서 허용가능한 미생물 회수결과를 얻기 위하여 가장 낮은 희석배율의
검액을 가지고 시험한다.
- 항균활성 또는 낮은 용해도 때문에 가장 낮은 희석배율의 검액으로 시험할 수
없는 경우에는 다시 적절한 시험방법을 확립한다. 검체로 인한 증식저지를
피할 수 없는 경우에는 중화, 희석 또는 여과한 다음에 시험균 현탁액을 넣어도
된다.

13
 엔도톡신시험법

Ⅲ 참고자료
별첨

1 엔도톡신시험법과 발열성물질시험법과의 관계
발열성물질시험법은 토끼의 정맥 내에 대량의 검액을 주사하여 발열성물질의
존재여부를 조사하는 방법이다. 발열성물질시험법은 엔도톡신 이외의 발열성물질도
검출할 수 있다는 점에서 엔토톡신시험법과 차이가 있다. 주사제를 오염시킬 가능성이
있는 외인성 발열성물질로서는 엔도톡신 이외에 그람 음성균 및 양성균 공통의 세포벽
구성성분인 peptidoglycan, 그람 양성균 등에 의하여 생산되는 외독소, 바이러스,
병원성진균 등을 들 수 있다. 그러나 주사제 제조에서 가장 오염의 가능성이 높은
발열성물질은 물, 실내, 그 밖에 어디에나 존재하는 엔도톡신이다. 엔도톡신이 강한
내열성을 보이는데 대하여 외독소나 바이러스 등은 열에 대한 저항성이 약하고
가열멸균된 제제에서는 활성을 잃는다. Peptidoglycan은 내열성을 나타내지만
발열활성은 엔도톡신의 수천~수만분의 1이다. 예를 들면 가열사균의 발열활성을
발열성물질시험법으로 비교한 경우 그람 음성균에서 발열이 인정되는 것은 103~105
cell/mL인데 그람양성균에서는 108 cell/mL 내지는 그 이상을 필요로 한다.
진균에서의 발열성물질의 본체는 명확하지 않지만 그람 양성균보다 더 발열활성은
약하다. 이와 같이 엔도톡신 이외의 발열성물질에 의하여 주사제가 발열야기량을
넘어서 오염될 가능성은 극히 낮다고 여겨진다.

실제 발열성물질 시험법의 엔도톡신 검출감도는 ng/mL의 수준인데 비하여

엔도톡신시험법에서는 pg/mL수준의 엔도톡신을 신속하고도 간편하게 검출할 수
있다. 이상에서 볼 때 엔도톡신 이외의 발열성물질에 의한 오염의 가능성이 극히 낮고
엔도톡신시험법을 적용하는 것이 보다 바람직하다고 판단되는 주사제에 대하여는
발열성물질시험법을 엔도톡신시험법으로 바꾸는 것이 진행되고 있다. 이와 같이
발열성물질시험법에서 엔도톡신시험법으로의 전환 또는 신규적용은 세계적 동향이며
USP, EP, JP 의 각 약전에서 이 시험법의 적용품목은 앞으로 증가할 것으로
생각된다.

14
 Ⅲ. 참고자료

2 엔도톡신시험법의 대표적인 반응저해 인자

엔도톡신시험법
• 라이세이트 시약의 효소활성을 저해하는 것
- 라 이 세 이 트 시 약 의 반 응 은 엔 도 톡 신 에 의 한 일 련 의 효 소 활 성 화 반 응
(cascade반응)이므로 효소활성저해제(특히 프로테아제 저해제), 단백변성제,
chelate제 등은 반응저해인자로 된다.

• 엔도톡신에 작용하여 반응을 저해하는 것

- 계면활성제나 금속이온, 특히 철, 알루미늄 등의 금속이온은 1~10 ㎛에서
반응저해를 나타낸다. 또한 반응촉진인자로는 glucan 등이 있다. 그리고
반응간섭인자는 아니지만 검액의 혼탁은 비탁법의 측정에, 또 착색은 비색법의
측정에 각각 영향을 준다.

15
 미생물한도시험법
엔도톡신시험법

시험 사례) 겔화법 - 표시감도확인시험

• 항균활성의 중화・제거
λ = 0.06(25) EU/mL 인 경우
각 시험법에 따라 시험하여 검액에서 회수한 균수와 대조액에서 회수한 균수를
(시약의 감도는 0.06 EU/mL로 표시되어 있으나 실질적인 계산은
비교한다. 증식이 저해되는 경우 (검액에서 회수한 균수가 대조액에서 회수한 균수의
0.0625 EU/mL로 함)
1/2 미만인 경우)에는 결과의 유효성을 확보하기 위하여 생균수 측정법을 변경한다.
① 엔도톡신표준원액(Control Standard Endotoxin, CSE) 희석
방법의 변경은 예를 들어 (1) 희석액 또는 배지의 증량, (2) 특이적 또는 일반적인
희석단계
중화제를 희석방법
희석액에 첨가, (3) 막여과 또는 (4) 위의 측정법의 조합 등이다.
A 20 EU/mL(CSE vial) 5분간 vortexing
B A 0.5 mL액 1.5 mL
를 취하여 5 EU/mL
엔도톡신시험용 물에 희석( )
• 중화제
C B액 0.5 mL를 취하여 1.5 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(1.25 EU/mL=>20 λ)
항균제의 활성을 중화하기 위하여 중화제를 쓸 수 있다(표 I). 중화제는 선정한
D C액 0.2 mL를 취하여 1.8 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(2 λ)
희석액 또는 배지에 멸균 전에 미리 첨가할 수 있다. 중화제를 쓴 경우에는 그
E D액 1 mL를 취하여 1 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(1 λ)
유효성과 미생물에 대한 독성이 없음을 증명하기 위해 검체를 함유하지 않고
F E액 1 mL를 취하여 1 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(0.5 λ)
중화제만을 넣어 공시험하여 확인한다.
G F액 1 mL를 취하여 1 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(0.25 λ)
표 1. 저해물질에 대한 일반적인 중화제/중화법
* 각 희석단계마다 1 분간 vortexing 해준다.
저해물질 중화제/중화법
② Tube 준비
글루타르알데히드, 수은제 아황산수소나트륨
반응용 tube를 각 농도별로 4개씩 준비한 후 ①에서 희석된
페놀류, 알코올류, 알데히드류, 소르빈산염 희석
CSE 2 λ, 1 λ, 0.5 λ,
0.25 λ(D,
알데히드류 E, F, G)액을 0.1 mL 씩 분주한다. 음성대조군으로
글리신 엔도톡신 시험용
4물도 4개의
급 암모늄 tube에
화합물, 0.1 mL 씩 비스
파라옥시벤조산류, 분주한다.
-비구아니드류 레시틴
4급 암모늄 화합물, 파라옥시벤조산류, 요오드 폴리소르베이트
2λ 1λ 1/2 λ 1/4 λ 엔도톡신시험용물
수은제 티오글리콜산염
2λ 1λ 1/2 λ 1/4 λ 엔도톡신시험용물
수은제, 할로겐류, 알데히드류 티오황산염
2λ 1λ 1/2 λ 1/4 λ 엔도톡신시험용물
에틸렌디아민테트라아세트산염(EDTA) 마그네슘 또는 칼슘이온
2λ 1λ 1/2 λ 1/4 λ 엔도톡신시험용물

• 적절한 중화법을 확립할 수 없는 경우에는 그 검체가 가지는 항균활성 때문에

③ 시약분주
접종균을 분리할 수 없는 것으로 간주한다. 따라서 그 검체가 접종균과 같은 종의
라이세이트시약을 적절한 양의 엔도톡신시험용 물로 녹인 후 ②에 있는 각 tube에
균이나 근연종에 오염되었을 가능성은 낮은 것으로 생각한다. 그러나 그 검체가 이들
0.1mL 씩 분주한다.
일부 미생물만을 저해할 뿐이고, 시험균주 이외의 균주는 저해하지 않을 가능성도
* 라이세이트시약을 녹일 때 절대 vortexing해서는 안 된다.
있으므로 미생물의 증식과 그 허용기준에 적합한 가장 낮은 농도로 시험한다.

• 아래의 기술한 어떠한 방법에서도 시험균 하나 또는 그 이상의 균종에서 위의

기준을 충족시키지 못하는 경우에는 기준에 가장 근접한 방법과 시험조건으로 검체를

16
 참고자료
Ⅲ.Ⅱ. 시험법

시험한다.
④ 반응

미생물한도시험법
엔도톡신시험법
Tube를 37±1 ℃에서 60±2 분간 반응시킨다. 반응 중에 tube에 충격이
■ 멤브레인필터법
가해지면 안 된다.
• 멤브레인 필터
- 공경 : 0.45 μm 이하
⑤ 결과 확인
- 재질 : 검체의 성분에 의하여 세균포집능력이 영향을 받지 않도록 주의하여 선택
Tube를 180도 뒤집었을 때 겔이 형성되면 양성, 흘러내리면 음성이다.
• 각 미생물마다 1 개의 멤브레인필터를 사용
Tube를 뒤집을 때 조심스럽게 뒤집어야 하며, 충격이 가해질 경우 gel이 깨질 수
•있다.
조작순서
결과는 단 한번만 확인한다.

준비된 검체의 적당량을 멤브레인필터에 넣어 바로 여과

시험 (가능하면 검체의 1 g 해당량
사례) 비탁법, 비색법- 검량선의 신뢰성
또는 다수의 확인시험
집략형성이 예측되는 경우에는 그 이하)

* Standard 농도: 5 EU/mL, 0.5 EU/mL, 0.05 EU/mL, 0.005

▼EU/mL인 경우
* 비탁법과 비색법은 표준액조제 및 검체준비 등의 조작은 동일하며, 마지막에 분주하는 라이세이트 시약의 종류와
소프트웨어상의 Onset OD값 설정만 달리 한다 적당량의 희석액을 여과
.
▼
① CSE 희석
총호기성미생물수(TAMC) 측정용 총진균수(TYMC) 측정용
희석단계 희석방법
멤브레인필터를 대두카제인소화한천배지의 멤브레인필터를 사부로포도당한천배지
A 50표면으로
EU/mL(CSE
옮김vial) 5 분간 vortexing 표면으로 옮김
B A액 0.2 mL를 취하여 1.8 mL엔도톡신시험용 물에 희석(5 EU/mL)
▼ ▼
C B액 0.2 mL를 취하여 1.8 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(0.5 EU/mL)
30 D~ 35 ℃에서
C액 0.2후
배양 mL3를
일취하여 1.8 mL측정
이내 집락수 엔도톡신시험용
20 ~물에 희석(0.05
25 ℃에서 배양EU/mL
후 5일) 이내 집락수 측정
E D액 0.2 mL를 취하여 1.8 mL 엔도톡신시험용 물에 희석(0.005 EU/mL)
판정
*각 희석단계마다 1분간 vortexing 해준다.

·모 든 시험균의 평균측정값이 대조액 (검체 불포함)의 측정값의 1/2 ~ 2배

② 소프트웨어 설정
이내이어야 한다.
검량선 신뢰성 확인시험은 일상시험과 달리 3반복 실험하며, 반복간 평균을 내지 않는
■ 한천평판법 (한천평판혼합법, 한천평판도말법)
것으로 설정한다.
• 한천평판법은 각 배지에 대하여 적어도 2 개의 평판을 써서 시험하며 결과는 각
평판의 측정균수의 평균값을 사용
③ Standard 분주
• 조작순서 (한천평판혼합법)
96well plate에 소프트웨어 셋팅과 동일한 위치에 각 농도 별 standard를 0.1 mL 씩
분주한다. 엔도톡신 시험용 준비된
물도 0.1
검체 mL씩 분주한다. 옮김
1 mL를 페트리접시에

17
 미생물한도시험법
엔도톡신시험법

B B B
C C C
D D D
E E E

W W W

B, C, D, E → ①에서 희석한 CSE

W → 엔도톡신시험용 물

④ 시약분주
라이세이트 시약을 적절한 양의 엔도톡신시험용 물로 녹인 후 ③에 있는 plate의 각
well에 0.1 mL 씩 분주한다.
* 라이세이트시약을 녹일 때 절대 vortexing해서는 안 된다.

⑤ 반응
Plate를 기기에 넣고 분석을 시작한다.(plate는 뚜껑을 제외하고 넣어 준다)

⑥ 결과 확인
반응이 끝나고 결과를 프린트한다.
R값이 0.98이상이어야 하며, 엔도톡신시험용 물의 반응시간이 0.005 EU/mL의
반응시간 보다 길어야 한다. 또한 반복간 편차(CV %)가 10 % 미만이어야 한다.

18
N a t i o n a l I n s t i t u t e o f F o o d a n d D r u g S a f e t y E v a l u a t i o n

Ⅳ. 국내외 약전
The Korean Pharmacopoeia
U.S. Pharmacopeia
European Pharmacopoeia
The Japanese Pharmacopoeia
 The Korean Pharmacopoeia

엔도톡신시험법

엔도톡신시험법은 참게 (Limulus polyphemus 또는 Tachypleus tridentatus)의

혈구추출성분으로 만든 라이세이트 (Lysate) 시약을 써서 그람음성균에서 유래되는
엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법이다. 이 시험에는 엔도톡신의 작용에 의한 라
이세이트 (Lysate) 시액의 겔형성을 지표로 하는 겔화법 및 광학적 변화를 지표로
하는 광학적측정법이 있다. 광학적측정법에는 라이세이트 (Lysate) 시액의 겔화 과
정에서의 탁도 변화를 지표로 하는 비탁법 및 합성기질의 가수분해에 의한 발색을
지표로 하는 비색법이 있다.
엔도톡신시험은 겔화법, 비탁법 또는 비색법에 따라 시험한다. 다만 그 결과에 있
어 의심이 나는 경우에는 따로 규정이 없는 한 겔화법에 따라 최종 판정한다.
이 시험은 엔도톡신에 의한 오염을 피하여 시험한다.
기 구 시험에 쓰는 모든 유리제 및 기타 내열성 기구는 유효한 방법으로 건열처
리한다. 보통 250 ℃에서 적어도 30 분간 건열처리한다. 마이크로플레이트, 마이크
로피펫용팁 등의 플라스틱제품을 쓰는 경우에는 엔도톡신이 검출되지 않고 이 시
험법에 대하여 간섭이 없는 것이 확인된 것을 쓴다.
엔도톡신표준원액의 조제 엔도톡신표준품을 엔도톡신시험용 물로 녹여 엔도톡신표준
원액을 만든다. 엔도톡신단위는 EU로 표시하고 1 EU는 1 엔도톡신국제단위 (IU)
와 같다.
엔도톡신표준액의 조제 엔도톡신표준원액을 충분히 흔들어 섞은 다음 엔도톡신시험
용 물로 희석하여 엔도톡신표준액을 만든다. 엔도톡신표준액은 엔도톡신이 용기에
흡착되는 것을 피하기 위하여 될 수 있는 대로 빨리 쓴다.
검액의 조제 따로 규정이 없는 한 의약품을 엔도톡신시험용 물로 녹이거나 희석하여
검액을 만든다. 의약품 용기 시험에 따로 규정하는 방법에 따라 검액을 만든다. 보
통 검액의 pH는 6.0 ∼ 8.0 범위에 있으면 된다. 검액에 라이세이트 시액을 섞었을
때의 pH가 라이세이트 시액에 표시된 pH를 벗어나는 경우에는 pH 조정이 필요할
수도 있다. pH 조정에 쓰는 시액 또는 용액은 엔도톡신시험용 물을 써서 만들고
엔도톡신이 검출되지 않는 용기에 보존한다. 사용하는 시액 또는 용액은 엔도톡신
이 검출되지 않으며 반응간섭인자가 없음을 확인한 것이어야 한다.
최대유효희석배수 최대유효희석배수란 검액 중에 반응 간섭인자가 존재하여 이를 희

20
 The Korean Pharmacopoeia

석으로 없애고자 할 때 허용되는 검액의 최대희석배수이다.

최대유효희석배수는 다음 식으로 구한다.

KP
최대유효희석배수

엔도톡신규격값 × 검액의 농도



엔도톡신규격값 주사제의 엔도톡신규격값은 투여량에 근거하여 규정하며 K/M과

같다. 다만 K는 체중 1 kg 당 발열을 일으키는 엔도톡신의 양 (EU/kg)이고, 투여
경로에 따른 구분을 기준으로 다음 표와 같이 설정한다. 단, 다음 표의 투여경로
구분 이외의 경로로 투여되는 의약품 등의 K값은 정맥내 투여의 K값에 따른다.

투여경로 K(EU/kg)
정맥내 5.0
정맥내 : 방사성 의약품 2.5
척수강내 0.2

또한, M은 체중 1 kg 당 1 회에 투여하는 주사제의 최대량이다. 단, 주사제를 여

러 번 또는 지속적으로 투여하는 경우에 M은 1 시간 이내에 투여하는 주사제의
최대총량으로 한다. M의 단위는 투여량이 제제의 용량을 기준으로 한 경우에는
mL/kg, 의약품의 질량을 기준으로 한 경우에는 mg/kg 또는 mEq/kg, 의약품의 생
물학적 단위를 기준으로 한 경우에는 단위/kg 로 나타낸다. 단, 질량 또는 단위를
기준으로 투여하는 제제에서는 의약품의 표시량을 기준으로 엔도톡신 규격값을
설정한다.
성인의 체중 1 kg 당 최대 투여량을 산출할 때 성인의 평균체중으로 60 kg을 쓰
며, 체중 1kg 당 소아투여량이 성인투여량보다 많을 때에는 소아투여량을 기준으
로 엔도톡신 규격값을 설정한다.
검액의 농도 단위는 엔도톡신규격값이 질량 당 (EU/mg)으로 규정하는 경우에는
mg/mL, 당량 당 (EU/mEq)으로 규정하는 경우에는 mEq/mL, 생물학적단위 당
(EU/단위)으로 규정하는 경우에는 단위/mL, 용량 당 (EU/mL)으로 규정하는 경우
에는 mL/mL이다.
λ 겔화법인 경우 라이세이트 시약의 표시감도 (EU/mL)이고 비탁법 또는 비색법

21
 The Korean Pharmacopoeia

에서는 검량선의 최소엔도톡신농도 (EU/mL)이다.

겔 화 법 겔화법은 존재하는 엔도톡신에 의해 라이세이트시액이 응고반응을 일으키
는 것에 기초하여 엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법이다. 시험법의 정밀도 및
유효성을 보증하기 위하여 예비시험으로 라이세이트 시약의 표시감도확인시험 및
반응간섭인자시험을 한다.
1) 예비시험 가) 라이세이트 시약의 표시감도확인시험 라이세이트 시약의 표시
감도는 라이세이트시약에 규정하는 조건에서 라이세이트시액의 응고에 필요한 최
소 엔도톡신농도이다. 라이세이트시약은 각 로트에 대하여 쓰기 전에 그 표시감도
λ를 확인한다. 이 시험은 시험결과에 영향을 줄 가능성이 예상되는 시험조건의 변
경이 있을 때에도 한다.
라이세이트시약의 표시감도는 다음 방법에 따라 확인한다.
엔도톡신표준원액을 엔도톡신시험용 물로 희석하여 2 λ, 1 λ, 0.5 λ 및 0.25 λ의 4 가
지 농도의 엔도톡신표준액을 만든다. 라이세이트시약을 엔도톡신시험용 물 또는
적당한 완충액으로 녹여 라이세이트시액으로 한다. 라이세이트시액 일정량, 보통
0.10 mL 및 이와 같은 양의 엔도톡신표준액을 시험관에 취하여 섞는다. 1 회 시험
용의 동결건조 라이세이트시약을 쓰는 경우는 그 용기에 엔도톡신표준액을 직접
넣어 라이세이트시약을 녹인다. 이들 시험관 또는 용기를 보통 37 ± 1 ℃로 유지하
고 진동을 피하여 60 ± 2 분간 가만히 방치한 다음 약 180°로 가만히 돌려 내용물
을 관찰한다. 흘러내리지 않는 견고한 겔이 형성되어 있을 때 양성으로 한다. 겔이
형성되지 않거나 형성된 겔이 흘러내릴 때 음성으로 한다.
희석하여 만든 4가지 농도의 엔도톡신표준액을 1 조로 하여 4 회 시험한다.
매 회 시험에서 농도 0.25 λ 의 엔도톡신표준액이 모두 음성을 나타낼 경우 시험은
유효하다. 시험이 유효하지 않을 때에는 시험조건을 정비하여 재시험을 한다.
매 회 시험에서 양성을 나타내는 최소엔도톡신농도를 종말점농도로 하고 다음 식
으로 4 회 시험의 기하평균 종말점농도를 구한다.

기하평균 종말점농도 = antilog(∑e/f)

∑e : 각 회의 종말점농도의 대수 변환값 e 의 합계
f : 시험 회수

22
 The Korean Pharmacopoeia

구한 기하평균 종말점농도가 0.5 ∼ 2.0 의 범위에 있을 때 라이세이트시약의 표

시감도는 확인된 것으로 판정하고 다음의 시험에는 그 표시감도를 이용한다.
나) 반응간섭인자시험 이 시험은 검액에 대하여 반응을 촉진 또는 저해하는 인자

KP
의 유무를 조사하는 시험이다. 표 1에 따라 A, B, C 및 D액을 조제하여 A 및 B액
은 4 회, C 및 D액은 2 회 시험한다. 반응온도, 반응시간 및 겔화판정법은 1) 예비
시험 가) 라이세이트시약의 표시감도확인시험에 따른다. B 액 및 C 액의 기하평
균종말점농도는 1) 예비시험 가) 라이세이트시약의 표시감도확인시험의 계산식으
로 구한다. 이 시험은 시험조건이 변경되어 시험결과에 영향을 미칠 가능성이 예
상될 때에도 한다. A 및 D 액 모두 음성을 나타내고 C 액의 시험결과로 라이세이
트시약의 표시감도가 확인될 때 반응간섭인자시험은 유효한 것으로 한다. B 액에
있어서 기하평균종말점농도가 0.5 ∼ 2 의 범위에 있을 때 검액에 반응간섭인자
가 존재하지 않는 것으로 판정하고 검액은 반응간섭인자시험에 적합하다.

표 1

엔도톡신의
액 엔도톡신농도 / 피첨가액 희석액 희석배수 시험 회수
농도
A1) 0 / 검액 - - - 4
1 2 λ
2 1 λ
B2) 2 λ / 검액 검액 4
4 0.5 λ
8 0.25 λ
1 2 λ
엔도톡신
3) 2 1 λ
C 2 λ / 엔도톡신시험용 물 시험용 2
4 0.5 λ
물
8 0.25 λ
4)
D 0 / 엔도톡신시험용 물 - - - 2
1)
음성대조. 검액만 함유
2)
반응간섭인자시험을 위한 표준엔도톡신을 첨가한 검액
3)
라이세이트시약의 표시감도확인을 위한 엔도톡신표준액
4)
음성대조, 엔도톡신시험용 물만 함유

기하평균종말점농도가 이 범위에들지 않을 때 검액에 반응간섭인자가 존재한다.

검액에 반응간섭작용이 인정되면 최대유효희석배수를 넘지 않는 범위에서 검액을
희석하여 다시 시험한다. 고감도의 라이세이트시약을 사용하여 검액의 최대유효희

23
 The Korean Pharmacopoeia

석배수를 더 크게 할 수도 있다. 또 검액의 반응간섭작용을 없애기 위하여 검액 또

는 희석한 검액에 적절한 처리(여과, 반응간섭인자의 중화, 투석 및 가열처리 등)
를 할 수 있다. 단, 처리에 의해 엔도톡신이 손실되지 않는 것을 확인하기 위하여
엔도톡신을 첨가한 검액에 해당 처리를 하여 위의 시험에 적합한 결과를 얻을 수
있는지 확인한다.
2) 한도시험법 이 시험은 검체에 각조에 규정된 엔도톡신 규격을 넘는 엔도톡신
이 함유되어 있는지의 여부를 라이세이트시약의 표시감도에 따라 겔화반응으로
판정하는 방법이다.
가) 조작법 표 2에 따라 A, B, C 및 D 액을 만들고, 이들 4 가지 액을 1 조로 하여
2 회 시험한다. A 및 B 액의 검액은 1) 예비시험 나) 반응간섭인자시험에 적합한
용액을 쓴다. 반응온도, 반응시간 및 겔화 판정은 1) 예비시험 가) 라이세이트시약
의 표시감도확인시험에 따른다.

표 2

액 엔도톡신농도 / 피첨가액 시험 회수
1)
A 0 / 검액 2
2)
B 2 λ / 검액 2
3)
C 2 λ / 엔도톡신시험용 물 2
4)
D 0 / 엔도톡신시험용 물 2
1)
한도시험을 위한 검액. 최대유효희석배수를 넘지 않는 범위에서 희석할 수 있다.
2)
양성대조. A액과 동일 배수로 희석한 검액으로 최종농도가 2 λ가 되도록 표준엔도톡신을 첨가한 것
3)
양성대조. 농도 2 λ의 엔도톡신표준액
4)
음성대조. 엔도톡신시험용 물만 함유

나) 판정 B 및 C 액의 2 회 시험결과가 모두 양성이고 D 액의 2 회 시험결과가

모두 음성일 때 시험은 유효하다. A 액의 2 회 시험결과가 모두 음성일 때 검체는
엔도톡신 시험에 적합하며 모두 양성일 때는 부적합하다. A 액의 2 회 시험결과에
있어서 1 회가 음성이고 다른 1 회가 양성일 때 다시 2 회를 반복시험한다. 이 2
회의 시험결과가 모두 음성일 때 검체는 엔도톡신시험에 적합하다. 반복한 2회 시
험 중 모두 또는 1회가 양성인 경우에는 부적합하다.
다만 결과가 양성인 그 어느 경우라도 검액의 희석배수가 최대유효희석배수 미만
인 경우에는 최대희석배수 혹은 그것을 넘지 않는 희석배수로 희석하여 시험을 다
시 할 수 있다.

24
 The Korean Pharmacopoeia

3) 정량시험법 이 시험은 겔화반응의 종말점을 구함으로써 검체의 엔도톡신 농도

를 측정하는 방법이다.
가) 조작법 표 3에 따라 A, B, C 및 D액을 만든다. 이 4 가지 액을 1 조로 하여

KP
2 회 시험한다. A 및 B 액의 검액은 1) 예비시험 나) 반응간섭인자시험에 적합한
용액을 쓴다. 시험의 조작조건은 1) 예비시험 가) 라이세이트시약의 표시감도확인
시험에 따른다.
표 3
엔도톡신농도 /
액 희석액 희석배수* 엔도톡신의 농도 시험회수
피첨가액
1 -
엔도톡신 2 -
A1) 0 / 검액 2
시험용 물 4 -
8 -
2)
B 2 λ / 검액 - 1 2 λ 2
1 2 λ
2 λ /
엔도톡신 2 1 λ
C3) 엔도톡신시험용 2
시험용 물 4 0.5 λ
물 0.25 λ
8
0 /
4)
D 엔도톡신시험용 - - - 2
물
1)
정량시험을 위한 검액. 단계희석배수는 최대유효희석배수를 넘지 않는 범위에서 적절히 바
꿀 수 있다.
2)
양성대조. A액의 최대희석배수와 동일한 배수로 희석한 검액에 최종농도 2 λ이 되도록 표
준엔도톡신을 첨가한 것
3)
라이세이트시약의 표시감도확인을 위한 엔도톡신표준액
4)
음성대조. 엔도톡신시험용 물만 함유

나) 엔도톡신 농도의 산출 및 판정 2 회 시험에서 D 액은 모두 음성을, B 액은 모

두 양성을 나타내고 C 액의 기하평균종말점농도가 0.5 ∼ 2.0 λ의 범위에 있으면
시험은 유효하다. A 액의 희석계열에 있어서 양성을 나타내는 최대희석배수를 종
말점으로 하여 λ에 종말점에서의 희석배수를 곱하여 얻은 값을 검액의 엔도톡신
농도로 한다. A 액의 희석계열 중 양성을 나타내는 것이 없을 때 검액의 엔도톡신
농도는 λ에 A 액의 최소희석배수를 곱한 값 미만으로 한다. A 액의 희석계열 모
두가 양성일 때 검액의 엔도톡신 농도는 λ에 A 액의 최대희석배수를 곱한 값 이

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 The Korean Pharmacopoeia

상으로 한다. 검액의 엔도톡신농도로부터 검체의 엔도톡신 농도 (EU/mL, EU/mg,

EU/mEq 또는 EU/단위)를 산출한다. 2 회의 시험으로 검체를 가지고 구한 두 값
의 엔도톡신 농도 (EU/mL, EU/mg, EU/mEq 또는 EU/단위) 모두 의약품각조에
서 규정하는 엔도톡신 규격을 만족할 때 적합하다.
광학적 방법 1) 비탁법 이 방법은 라이세이트시액의 겔화에 따른 탁도의 변화를 측
정하여 검액의 엔도톡신 농도를 측정하는 방법이다. 종말점비탁법과 속도론적비탁
법이 있다. 종말점비탁법은 엔도톡신 농도와 일정 반응시간 후의 반응액의 탁도와
의 용량반응관계를 기초로 하는 방법이다. 속도론적비탁법은 엔도톡신의 농도와
반응액의 탁도 변화가 미리 설정한 탁도에 도달하는 시간 또는 탁도의 경시변화율
과의 용량반응관계를 기초로 하는 방법이다.
시험은 보통 37 ± 1 ℃에서 하고 탁도는 흡광도 또는 투과율로 나타낸다.
2) 비색법 이 방법은 엔도톡신이 라이세이트시액과의 반응에 의해 발색합성기질
에서 유리하는 발색기의 양을 흡광도 또는 투과율로 측정하여 엔도톡신을 정량하
는 방법이다. 종말점비색법과 속도론적비색법이 있다. 종말점비색법은 엔도톡신의
농도와 일정 반응시간 후 발색기의 유리량과의 용량반응관계를 기초로 하는 방법
이다. 속도론적비색법은 엔도톡신의 농도와 반응액이 미리 설정한 흡광도 또는 투
과율에 도달하는 시간 또는 발색의 경시변화율과의 용량반응관계를 기초로 하는
방법이다.
시험은 보통 37 ± 1 ℃에서 한다.
3) 예비시험 비탁법 또는 비색법의 정밀도와 유효성을 보증하기 위하여 검량선의
신뢰성 확인시험 및 반응간섭인자시험을 한다.
가) 검량선의 신뢰성 확인시험 라이세이트시약은 각 로트별로 사용하기 전에 그
검량선의 신뢰성을 확인하여야 한다. 이 시험은 시험결과에 영향을 미칠 가능성이
예상되는 시험조건의 변경이 있는 경우에도 수행한다.
사용하는 라이세이트 시약에 규정된 엔도톡신의 농도범위 내에서 적어도 3 가지
농도의 엔도톡신 표준액을 만들어 이들 각 농도에 대하여 3회 이상 측정하여 검량
선을 작성한다. 엔도톡신표준액과 라이세이트시액의 용량비, 반응시간, 반응온도,
pH 등의 조작조건은 라이세이트 시약의 최적조건에 따른다. 검량선의 농도범위를
2 자리수보다 크게 할 때 1 자리수를 크게 할 때마다 엔도톡신표준액의 농도를 1
농도씩 추가한다. 작성한 검량선의 상관계수 r를 구하여 그 절대값 |r|이 0.980 이
상일 때 검량선의 신뢰성이 확인되었다고 판단한다. 검량선의 신뢰성이 확인되지

26
 The Korean Pharmacopoeia

않을 때는 시험조건을 정비하여 다시 시험한다.

나) 반응간섭인자시험 표 4에 따라 A, B, C 및 D 액을 만들어 시험한다. 라이세
이트시액의 채취량, 라이세이트시액에 대한 검액의 용량비, 반응시간 등의 조적조

KP
건은 라이세이트시약의 최적 조건에 따른다. 이 시험은 시험조건의 변경으로 시험
결과에 영향을 미칠 가능성이 예상되는 경우에도 한다.

이 시험은 다음의 두 조건에 적합할 때 유효하다.

조건 1 C 액으로 작성한 검량선의 상관계수의 절대값은 0.980 이상이다.
조건 2 D 액의 측정결과는 라이세이트시약에 규정하는 공시험의 한도치를 넘지
않거나 엔도톡신의 검출한계 미만이다.
B 액으로 측정된 엔도톡신 농도와 A 액으로 측정된 엔도톡신 농도의 차이를 기초
로 하여 B 액에 첨가한 엔도톡신의 농도에 대한 엔도톡신의 회수율을 계산한다.
첨가한 엔도톡신의 회수율이 50 ∼ 200 %의 범위에 있을 때 검액에 반응간섭인자
가 존재하지 않는다고 판정하고 반응간섭인자시험에 적합하다.

표 4
시험관 또는 웰 (well)의
액 엔도톡신 농도 피첨가액
수
A1) 0 검액 2 이상

2) 2)
B 검량선의 가운데 점 농도 검액 2 이상

C3) 3 농도 이상 엔도톡신시험용 물 각 농도 2 이상

4)
D 0 엔도톡신시험용 물 2 이상
1)
검 액 만 함 유 .(검 액 의 엔 도 톡 신 농 도 측 정 용 ) 최 대 유 효 희 석 배 수 를 넘 지 않 는 범 위
에서 희석할 수 있다.
2)
A액과 동일배수로 희석한 검액으로 검량선의 가운데 점 또는 가운데 점 부근의 엔도톡신
농도가 되도록 표준엔도톡신을 첨가한 것.
3)
예비시험 가) 검량선의 신뢰성 확인시험에 쓴 여러농도의 엔도톡신표준액(검량선작성용)
4)
음성대조. 엔도톡신시험용수만 함유

엔도톡신의 회수율이 규정하는 범위에 들지 않을 때 검액은 반응간섭작용을 나타

낸다. 검액에서 반응간섭작용이 인정되면 최대유효희석배수를 넘지 않는 범위에서
검액을 다시 희석하여 시험한다. 또 검액 또는 최대유효희석배수를 넘지 않는 범

27
 The Korean Pharmacopoeia

위로 희석한 검액에서 반응간섭인자를 제거하기 위하여 적절한 처리(여과, 반응간

섭인자의 중화, 투석 및 가열처리 등)을 할 수 있다. 단, 처리에 의해 엔도톡신이
손실되지 않는 것을 확인하기 위하여 엔도톡신을 첨가한 검액에 해당 처리를 하여
위의 시험에 적합한 결과를 얻을 수 있는지 확인한다.
4) 정 량 가) 조작법 표 4에 따라 A, B, C 및 D액을 만들어 3) 예비시험 나)
반응간섭인자시험에 따라 조작한다.
나) 엔도톡신 농도의 산출 C 액으로 작성한 검량선에서 A 액의 엔도톡신 농도를
산출한다. 다만 다음 모든 조건에 적합할 때 시험은 유효하다.
조건 1 C 액으로 작성한 검량선의 상관계수의 절대값은 0.980 이상이다.
조건 2 B 액으로 측정한 엔도톡신 농도와 A 액으로 측정한 엔도톡신 농도의 차
이를 기초로 하여 B 액에 첨가한 엔도톡신의 농도에 대한 엔도톡신의 회수율을 계
산할 때 회수율은 50 ∼ 200 %의 범위에 있다.
조건 3 D 액의 결과가 라이세이트 시약에 설정하는 공시험의 한도값을 넘지 않
거나 또는 엔도톡신의 검출한계 미만이다.
다) 판정 A 액의 평균엔도톡신 농도를 기초로 하여 검체의 엔도톡신 농도
(EU/mL, EU/mg, EU/mEq 또는 EU/단위)가 의약품각조에서 규정하는 엔도톡신
기준을 만족할 때 적합하다.

28
U.S. Pharmacopoeia

USP

29
 U.S. Pharmacopoeia

30
U.S. Pharmacopoeia

USP

31
 U.S. Pharmacopoeia

32
U.S. Pharmacopoeia

USP

33
 European Pharmacopoeia

34
European Pharmacopoeia

EP

35
 European Pharmacopoeia

36
European Pharmacopoeia

EP

37
 European Pharmacopoeia

38
The Japanese Pharmacopoeia

JP

39
 The Japanese Pharmacopoeia

40
The Japanese Pharmacopoeia

JP

41
 The Japanese Pharmacopoeia

42
The Japanese Pharmacopoeia

JP

43
 Ⅱ. 시험법

미생물한도시험법
발 행 일 2012년 9월
발 행 인 이광호 식품의약품안전평가원장

편집위원장 강신정 의료제품연구부장

김인규, 이광문, 심영훈, 이종화, 최 란

편 집 위 원
서재욱, 최연희, 김정현, 이종철, 최승은

도움주신분 녹십자 김성문, SK케미칼 이난주

발 행 처 식품의약품안전평가원 의약품규격연구과

식품의약품안전평가원 의약품규격연구과
Tel : 043)719-4604, Fax : 043)719-4602
E-mail : spleekm@korea.kr, http://www.nifds.go.kr

19
 미생물한도시험법

직무와 관련된 금품・향응을

주고받지 맙시다.

미리 45 ℃ 이하로 보온한 대두카제인소화한천배지 또는 사브로포도당한천배지를 넣고 잘 흔들어 줌

(예, 지름 9 cm 페트리접시인 경우 배지량 15 ~ 20 mL)

총호기성미생물수(TAMC) 측정용 총진균수(TYMC) 측정용

30 ~ 35 ℃에서 배양 후 3일 이내 집락수 측정 20 ~ 25 ℃에서 배양 후 5일 이내 집락수 측정
(산술평균) (산술평균)

<대한민국약전>

• 조작순서 (한천평판도말법)
- 무균시험법 - 용출시험법
- 미생물한도시험법 - 원자흡광광도법
대두카제인소화한천배지 또는 사브로포도당한천배지를 약 45 ℃ 일 때 넣어 굳힌 다음 평판배지 건조
- 발열성물질시험법 - 적외부스펙트럼측정법
(예, 지름 9 cm 페트리접시인 경우 배지량 15 ~ 20 mL)
- 수분측정법 - 제제균일성시험법
▼
- 엔도톡신시험법 - 핵자기공명스펙트럼측정법
준비된 검체 0.1 mL 이상을 정확하게 취하여 배지표면전체에 폄

총호기성미생물수(TAMC) 측정용 총진균수(TYMC) 측정용

30 ~ 35 ℃에서 배양 후 3일 이내 집락수 측정 20 ~ 25 ℃에서 배양 후 5일 이내 집락수 측정
(산술평균) (산술평균)

판정
·모 든 시험균의 평균측정값이 대조액 (검체 불포함)의 측정값의 1/2 ~ 2배
이내이어야 한다.

■ 최확수법
• 최 확 수 법 의 정 밀 도 및 정 확 도 는 멤 브 레 인 필 터 법 또 는 한 천 평 판 법 보 다
낮다(특히 진균). 이러한 이유로 최확수법은 다른 방법의 이용이 불가능할 때의
총호기성미생물수의 측정에 이용한다.
• 조작순서

준비된 검체를 적어도 각각 3 개씩의 10 배 단계 희석계열로 조제

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