‫מעבדה במיקרוביולוגיה כללית‬

‫מדעי התזונה‬
‫גרסה להדפסה‬

‫‪1‬‬
 ‫פרק ב'‪ :‬ניסויי הקורס‬
‫שבוע ‪ :3‬טכניקות זריעה במיקרוביולוגיה‬

‫באופן עקרוני‪ ,‬זריעת חיידקים מתבצעת על מצעים שונים בכלים שונים בכל פעם‪ ,‬לפי הצרכים של הניסוי או הבדיקה‬
‫שרוצים לבצע‪ .‬במעבדות נלמד ונתרגל עבודה עם כלים סטריליים‪ ,‬זריעות בסיסיות מכל סוג ונבצע ניסויים עם חיידקים‪.‬‬

‫מטרת המעבדה‪:‬‬

‫תרגול זריעות חיידקים למצע מוצק ולמצע נוזלי וספירת חיידקים‬

‫שימו לב ‪ -‬לשם ביצוע מעבדה זו יש ללמוד את פרוטוקולי הזריעה השונים‪ ,‬הכנת המיהולים העשרוניים וספירת חיידקים‪.‬‬

‫חומרים‪:‬‬
‫תרבית טהורהשל חיידקי ‪ E. coli (Escherichia Coli) :‬על צלחת פטרי ובמצע נוזלי‪.‬‬
‫תרבית נוזלית מעורבת של שמרים וחיידקי )‪S. aureus (Staphylococcus aureus‬‬
‫כל התרביות גודלו למשך ‪ 24‬שעות והנחת העבודה היא שהחיידקים הגיעו לריכוז של ‪ CFU/ml 109‬והשמרים‬
‫ל‪ ,CFU = Colony Forming Unit( CFU/ml 108-‬יחידה יוצרת מושבה)‪.‬‬
‫ציוד‪:‬‬

‫‪ 11‬צלחות ‪NA‬‬

‫‪ 2‬מבחנות ‪NB‬‬

‫צלחת פטרי ריקה‬

‫‪ 7‬מבחנות זכוכית ‪ 15‬מ"ל המכילות ‪ 9‬מ"ל מי פפטון או סליין סטרילי‬

‫מחט בקטריולוגית‬

‫פיפטורים‬

‫טיפים סטריליים‬

‫מקל דרגלסקי‬

‫‪2‬‬
 ‫כוסית כהל‬

‫בונזן‬

‫כוס לפסולת‬

‫מהלך המעבדה‪:‬‬

‫א‪ .‬זריעת בידוד ‪ -‬זריעת הבידוד תבוצע עבור התרבית הנוזלית המכילה תרבית מעורבת של שמרים וחיידקי ‪S.‬‬
‫‪ aureus‬שקיבלתם‪ ,‬על גבי צלחת ‪ NA.‬צלחת ללא טיפול תהווה ביקורת‪ .‬הצלחות יועברו להדגרה ב‪ 30-‬מעלות ‪-‬‬
‫טמפרטורה המתאימה גם להתפתחות השמרים וגם להתפתחות החיידקים‪.‬‬

‫ב‪ .‬זריעה פשוטה מתוך צלחת פטרי למבחנה ‪ -‬זריעה זו תבוצע עבור ‪ E. coli‬בלבד מצלחת הפטרי למבחנה המכילה‬
‫‪ . NB‬מבחנה ללא טיפול תהווה ביקורת ‪ .‬המבחנות יועברו להדגרה במטלטלת בטמפרטורה של ‪ 37‬מעלות‪ ,‬המתאימה‬
‫להתפתחות חיידקי הקולי‪.‬‬

‫ג‪ .‬הכנת מיהולים עשרוניים ‪ -‬מיהול עשרוני של תרבית החיידקים הנוזלית המכילה ‪ E. coli‬בלבד‪ ,‬עד מיהול פי‬
‫‪ .107=10,000,000‬נקרא גם מיהול ‪.-7‬‬

‫ד‪ .‬זריעת פיזור (דרגלסקי) ‪ -‬זריעות אלו יבוצעו עבור כל המיהולים שהוכנו בסעיף הקודם (ממיהול ‪ 0‬עד ‪ ,)7-‬על‬
‫גבי צלחות ‪ .NA‬הצלחות יועברו להדגרה ב‪ 37-‬מעלות ‪-‬טמפרטורה המתאימה להתפתחות חיידקי הקולי‪.‬‬

‫ה‪ .‬זריעת ‪ - pour plate‬זריעה זו תבוצע רק עבור מבחנה של מיהול ‪ -7‬מסעיף ג' (יש לשפוך על הדוגמה ‪ 15‬מ"ל‬
‫אגר מותך) ‪ -‬שימו לב כי יש להמתין עד אשר האגר התקרר והתמצק לפני שהופכים את הצלחת‪ .‬הצלחת תועבר‬
‫להדגרה ב‪ 37-‬מעלות ‪-‬טמפרטורה המתאימה להתפתחות חיידקי הקולי‪.‬‬

‫הזריעות תבוצענה ע"פ הפרוטוקולים בתחילת החוברת ובהתאם להנחיות המדריכים‪.‬‬

‫יש להניח את הצלחות כאשר המכסה כלפי מטה למניעת זיהום עקב עיבוי‪.‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בצלחות ומבחנות הנסוי והביקורת השונות בזמן ההדגרה? וכיצד תראו‬
‫זאת?‬

‫‪3‬‬
 ‫שבוע ‪ :4‬הכנת מצעי מזון וחשיבות הסטריליזציה‬
‫מטרות המעבדה‬

‫א‪ .‬לימוד הכנת מצעי מזון פשוטים נוזליים ומוצקים לעבודה מיקרוביאלית‪.‬‬

‫ב‪ .‬עיקור מצעים וכלים והדגמת חשיבות העיקור‪.‬‬

‫ג‪ .‬הכרת מצעים כללים וסלקטיביים‪.‬‬

‫חומרים וציוד‬
‫ארלנמייר של ‪ 250‬מ"ל‬
‫אבקת מרק מזין (‪)Nutreint broth‬‬
‫מאזניים‬
‫נייר שקילה‬
‫משורה של ‪ 100‬מ"ל‬
‫‪ 8‬מבחנות זכוכית בנפח ‪15‬מ"ל ופקקים‬
‫פלטה לחימום וערבוב‬
‫בוחש מגנטי‬
‫מעמד למבחנות‬
‫כוסות להכנסת המבחנות לסטריליזציה‬
‫פיפטות ‪ 10‬מ"ל ומשאבה‬
‫‪ 2‬צלחות מכל סוג‪.NA, BPA, VRBA :‬‬
‫מבחנות חיידקי ‪E. coli, S. aureus‬‬

‫מהלך המעבדה‬

‫א‪ .‬הכנת מצעים‪ :‬בניסוי זה נכין מרק מזין (‪ )Nutrient Broth‬שהוא אחד המצעים המקובלים לגידול חיידקים‪.‬‬
‫הכנתו פשוטה והוא מאפשר גידול סוגים רבים של מיקרואורגניזמים‪ .‬האבקה המוכנה מכילה‪ :‬תמצית בשר ופפטון‪.‬‬
‫(איזה סוג מצע זה? ראו מידע בפרק השיטות) להכנת ‪ 1‬ליטר נדרשים ‪ 8‬גרם אבקת מרק מזין(‪( )NB‬ריכוז סופי‬
‫‪ .)0.8%‬בתוספת ‪ 15‬גרם אגר (‪ )1.5%‬ייהפך המרק למוצק וייקרא בשם אגר מזין ‪)Nutrient Agar NA(.‬‬

‫הכנת מבחנות‪ 4 :‬מבחנות יכילו ‪ NB‬כאשר ‪ 2‬מתוכן יעברו עיקור ו‪ 2-‬לא יעברו‪ 4 .‬מבחנות נוספות יכילו ‪ NA‬כאשר ‪2‬‬
‫מתוכן יעברו עיקור ו‪ 2-‬לא יעברו עיקור‪ .‬יש לרשום מראש על גבי המבחנות את תכולתן ואת מספר הקבוצה שלכם‪.‬‬

‫‪ 1.‬הכנת מצע ‪ NB:‬העבירו ‪ 100‬מ"ל מים מזוקקים לארלנמייר והוסיפו ‪ 0.8‬גרם אבקת מרק מזין (‪ .)NB‬ערבבו היטב‪,‬‬
‫בעזרת מגנט‪ ,‬עד להמסה מלאה – הדוגמה הופכת צלולה‪.‬‬

‫‪ 2.‬העבירו ‪ 5‬מ"ל מהמצע (עם פיפטה ומשאבה( לכל אחת מ ‪ 4 -‬מבחנות עליהן רשמתם את מספר הקבוצה שלכם ופקקו‬

‫‪4‬‬
 ‫את המבחנות‪ .‬הניחו ‪ 2‬מהמבחנות בכוס‪ .‬מבחנות אלו יעברו עיקור באוטוקלאב‪.‬‬

‫את ‪ 2‬המבחנות הנותרות השאירו בצד‪ ,‬לביקורת‪ .‬מבחנות אלה לא תעבורנה עיקור‪.‬‬

‫‪ .3‬ליתרת המצע (כ‪ 80-‬מ"ל) הוסיפו ‪ 1.2‬גרם אגר (לקבלת ריכוז סופי של ‪ 1.5%(.‬המיסו את האגר ע"י הרתחה על‬
‫פלטה חשמלית תוך ערבוב עם בוחש מגנטי‪ ,‬כדי למנוע שריפת האגר‪ .‬היזהרו שחוט החשמל לא יגע בפלטה ‪ .‬ההמסה‬
‫מסתיימת כאשר התמיסה מצטללת (יש להקפיד שהתמיסה לא תגלוש‪(.‬‬

‫‪ 4.‬העבירו ‪ 4‬מ"ל מהמצע שהכנתם לכל אחת מ‪ 4 -‬מבחנות עליהן רשמתם את מספר הקבוצה ופקקו את המבחנות‪.‬‬

‫הניחו ‪ 2‬מהמבחנות בכוס וכסו בנייר אלומיניום ‪.‬מבחנות אלו יעברו עיקור באוטוקלאב ‪.‬‬

‫את ‪ 2‬המבחנות הנותרות השאירו בצד‪ ,‬לביקורת‪ .‬מבחנות אלה לא תעבורנה עיקור‪.‬‬

‫לאחר האוטוקלאב המבחנות יועברו לקירור בחדר וכל המבחנות (גם אלו לא עברו אוטוקלאב) יודגרו בטמפרטורת החדר‬
‫עד שבוע הבא‪.‬‬

‫ב‪ .‬זריעה על מצעים סלקטיביים‪:‬‬

‫‪ .1‬רשמו בעזרת טוש סימון על כל אחת מהצלחות ‪( NA, BPA, VRBA :‬באילו סוגי מצעים מדובר? ראו מידע בפרק‬
‫השיטות) את שם החיידק אותו תזרעו (מכל סוג צלחת – אחת תסומן ב‪ E. coli -‬ואחת תסומן ב‪.)S. aureus -‬‬

‫‪ .2‬בצעו זריעת בידוד מכל אחד מהחיידקים על כל אחת מהצלחות לפי ההסבר בפרוטוקול זריעת בידוד‪.‬‬

‫‪ .3‬הדגירו את הצלחות (הפוכות) ב‪.37C -‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים במבחנות ובצלחות השונות בזמן ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫למעבדה הבאה יש להביא דגימת מי ברז‪.‬‬

‫‪5‬‬
 ‫שבוע ‪ :5+6‬מיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית‬
‫מטרת המעבדה‬

‫לדגום ולהכיר אוכלוסיות מיקרוביאליות בסביבתן הטבעית (אוויר‪ ,‬אדמה‪ ,‬מים‪ ,‬גוף האדם)‪.‬‬

‫הרכבן של אוכלוסיות מיקרואורגניזמים אלו הנו פונקציה מורכבת של גורמים כגון ריכוז החומר האורגני‪ ,‬ריכוז וסוג‬
‫המלחים‪ ,‬נוכחות חמצן‪ ,‬טמפרטורה וכדומה‪.‬‬

‫א‪ .‬מיקרואורגניזמים באוויר‬

‫חומרים לזוג‬

‫‪ 2‬צלחות ‪NA‬‬

‫הקבוצות יחולקו ע"י המדריכים וידגמו הסביבות הבאות‪ :‬אזור המעבדה‪ ,‬בחוץ ‪ -‬ליד הכביש‪ ,‬בחוץ ‪ -‬באזור השדה‪.‬‬

‫מהלך הדגימה‬

‫‪ .1‬פתחו צלחת של ‪ NA‬לפרק זמן של דקה ואת השנייה ל‪ 10 -‬דקות (כל זוג יבדוק באזור אחר בהתאם לחלוקה)‪.‬‬

‫‪ .2‬הדגירו את הצלחות (הפוכות) ב‪( 30C -‬על מנת לאפשר גדילה של שמרים ועובשים הרגישים לטמפרטורה גבוהה‬
‫יותר וכן של חיידקים היכולים לגדול גם בטמפרטורה זו וגם בגבוהה יותר)‪.‬‬

‫‪ .3‬לאחר הדגרה (במעבדה הבאה) תארו את המושבות שהתקבלו וציינו באילו מהצלחות התקבלו יותר מושבות‪ .‬הסבירו‬
‫את התוצאות‪.‬‬

‫ב‪ .‬מיקרואורגניזמים במים‬

‫חומרים לזוג‬

‫‪ 2‬צלחות ‪NA‬‬

‫מבחנה עם ‪ 30‬מ"ל ‪ NA‬מותך‬

‫‪ 2‬צלחות פטרי ריקות‬

‫מי ברז – שהבאתם בעצמכם‬

‫פיפטורים‬

‫טיפים סטריליים‬

‫‪6‬‬
 ‫מקל דרגלסקי‬

‫כוסית כהל‬

‫בונזן‬

‫כוסית פסולת‬

‫מהלך הדגימה‬

‫‪ .1‬זריעת פיזור ‪ -‬זרעו ‪ 0.1‬מ"ל ממי הברז על כל אחת משתי הצלחות (דופליקט) ופזרו בעזרת מקל דרגלסקי‪.‬‬

‫‪ .2‬זריעת ‪ - pour plate‬העבירו ‪ 1‬מ"ל מי ברז לצלחת פטרי ריקה‪ ,‬שפכו על הדוגמה ‪ 15‬מ"ל אגר מותך (כמחצית‬
‫מכמות האגר המותך במבחנה) וערבבו היטב בתנועת ‪ .8‬חיזרו שנית על שלב זה ליצירת צלחת נוספת‪.‬‬

‫‪ 3.‬הדגירו את הצלחות )הפוכות ( ב‪30ºC.‬‬

‫‪ 4.‬לאחר הדגרה (בשבוע הבא)‪ :‬ספרו את המושבות שהתפתחו וחשבו את מספר המיקרואורגניזמים שהיו בדוגמת‬
‫המים המקורית‪.‬‬

‫ג‪ .‬מיקרואורגניזמים באדמה‬

‫חומרים לזוג‬

‫‪ 2‬צלחות ‪NA‬‬

‫מבחנה עם ‪ 9‬מ"ל מי פפטון‪.‬‬

‫מחט בקטריולוגית‬

‫אדמת גינה‬

‫מהלך הדגימה‬

‫‪ 1.‬העבירו כחצי כפית אדמה למבחנת הבופר‪.‬‬

‫‪ .2‬ערבבו היטב בוורטקס ותנו לגרגירי האדמה לשקוע‪.‬‬

‫‪ 3.‬הכניסו מחט בקטריולוגית לנוזל ופזרו בזריעת בידוד על פני הצלחות‪.‬‬

‫‪ .4‬הדגירו את הצלחות הפוכות ב ‪.30°C -‬‬

‫‪ 5.‬לאחר הדגרה‪ :‬סכמו את תצפיותיכם‪.‬‬

‫‪7‬‬
 ‫ד‪ .‬מיקרופלורה של גוף האדם‬

‫חומרים לזוג‬

‫‪ 6‬צלחות ‪NA‬‬
‫‪ 2‬קיסמים ומטושים סטריליים‬

‫הכנת הצלחות‪ :‬כל סטודנט מבצע חלק זה עבור עצמו‪ .‬צלחת ‪ - 1‬בעזרת טוש‪ ,‬חלקו את הצלחת ל‪ 2-‬ורשמו על "גרון"‬
‫בחצי אחד ו‪"-‬שיניים" בחצי השני‪ .‬צלחת ‪ - 2‬רשמו "נשיפה"‪ .‬צלחת ‪ - 3‬חלקו בעזרת טוש ל‪ 3-‬חלקים שווים ורשמו‬
‫"לפני"‪" ,‬אחרי"‪" ,‬כוהל"‪ .‬לא לשכוח לרשום את שם הסטודנט‪.‬‬

‫מהלך הדגימה‬

‫‪ 1.‬ערכו משטח גרון בעזרת מטוש (‪ )swab‬סטרילי‪ .‬זרעו על מחצית פלטת ‪( NA‬צלחת ‪.)1‬‬

‫‪ .2‬קחו קיסם סטרילי‪ ,‬חטטו בין השיניים‪ .‬פזרו בעזרת הקיסם בחלק העליון של המחצית השנייה של פלטת ה‪NA -‬‬
‫(צלחת ‪.)1‬‬

‫‪ .3‬נשפו אויר על צלחת ‪( NA‬אל תירקו) ‪ -‬צלחת ‪.2‬‬

‫‪ .4‬צלחת ‪ - 3‬געו באצבעות ידיכם על פני שליש אגר ‪ NA.‬שטפו היטב ידיים במים וסבון ואח"כ געו שוב על פני שליש‬
‫אחר של הצלחת עם אותן אצבעות‪ .‬חטאו ידיכם בכוהל (צמר גפן רווי באתנול) וגעו בשליש האחרון של הצלחת‪.‬‬

‫‪ 5.‬הדגירו את כל הפלטות באינקובטור‪ ,‬בטמפ ‪37°C.‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בניסויים השונים בצלחות השונות בזמן ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫כעבור שבוע‪:‬‬

‫סכמו את התוצאות‪ ,‬לאחר ההדגרה‪ .‬האם הן תואמות את הציפיות?‬ ‫‪.1‬‬

‫בחרו מספר מושבות שונות בצורתן‪ ,‬הכינו מהם דוגמה לצפייה בטיפה חיה במיקרוסקופ‪ ,‬והסתכלו במיקרוסקופ‪,‬‬ ‫‪.2‬‬
‫לפי הפרוטוקול בהמשך‪.‬‬

‫שימוש והסתכלות במיקרוסקופ‬

‫צפיה בטיפה חיה‬

‫הכנת הפרפרט (דוגמא) ‪ -‬בעזרת מרקר‪ ,‬סמנו שתי טבעות על גבי זכוכית נושא‪ .‬היפכו את הזכוכית‪ .‬עזרת מחט‬
‫בקטריאלית קחו דוגמה מהמושבה הנבחרת והעבירו אותה למרכז הטבעת‪ .‬חיזרו על הפעולה עם מושבה נוספת‪ .‬טפטפו‬
‫‪ 10l‬של מים מזוקקים על כל דוגמה וכסו בזכוכית מכסה‪.‬‬
‫‪8‬‬
 ‫השימוש הנכון במיקרוסקופ‬

‫יש להדליק את המיקרוסקופ בעזרת הכפתור המצוי בחלקו התחתון‪ .‬ניתן לכוון את עוצמת האור‬

‫בעזרת הכפתור המצוי בצדו של המיקרוסקופ‪.‬‬

‫במיקרוסקופים שבמעבדה שני סוגי עדשות אובייקטיב‪:‬‬

‫עדשת פאזות ‪40X‬‬

‫עדשת שמן רגילה ‪X100‬‬

‫עבודה עם עדשת הפאזות‬

‫יש לוודא כי עדשת הפאזות נמצאת בנתיב האור וכי טבעת הפאזות מכוונת למצב פאזה‪.‬‬
‫מניחים את הפרפרט (דוגמא) על שולחן המיקרוסקופ ‪ ,‬כך שמרכז הדוגמה יהיה בנתיב האור‪ .‬תוך מבט מהצד‪ ,‬מביאים‬
‫את עדשת האובייקטיב לנקודה הנמוכה ביותר האפשרית‪ ,‬בעזרת בורג המיקוד הגס‪ .‬תוך כדי מבט בעינית מגביהים את‬
‫האובייקטיב בעזרת בורג המיקוד העדין‪ ,‬עד קבלת תמונה ממוקדת‪.‬‬
‫תארו את המיקרואורגניזמים שראיתם‪ .‬האם מדובר בחיידק‪ ,‬שמר או פטריה? מה צורת התא?‬

‫‪9‬‬
 ‫שבוע ‪ :7+8‬עקום התרבות של חיידקים‬
‫**מעבדה זו תתבצע במשך ‪ 3‬שעות**‬
‫עקומת גידול של חיידקים‬

‫המיקרואורגניזים בהם נשתמש במעבדה‬

‫חיידקי ‪ – E. coli‬חיידק מזופילי הנמצא באופן טבעי במעיים של בני אדם ויצורים נוספים בעלי דם חם (איזו טמפרטורת‬
‫גידול יעדיף?)‪.‬‬

‫שמר אפיה – מיקרואורגניזם אאוקריוטי‪.‬‬

‫מטרת המעבדה לימוד קינטיקת הגידול של חיידקים במערכת סגורה ולהכיר שיטות לספירת מיקרואורגניזמים‪.‬‬

‫בניסוי זה נעקוב אחר הגידול של חיידקים בטמפ' של ‪ 37°C‬ו ‪ 30°C‬באמצעות מדידת עכירות מצע מזון בו גדלים‬
‫החיידקים בעזרת ספקטרופוטומטר ובעזרת ספירת החיידקים החיים‪( .‬כיצד תצפו שעכירות מצע המזון תשתנה עם הזמן‬
‫וכיצד ישפיעו הבדלי הטמפרטורה על הקצב השינוי בעכירות? כיצד תצפו שיראה גרף עקומת הגידול בכל אחת‬
‫מהטמפרטורות?)‬

‫חומרים‬

‫ארלנמייר בנפח ‪ 250‬מ"ל עם ‪ 30‬מ"ל ‪ LB‬סטרילי‬

‫תרבית חיידקי ‪E. coli‬‬

‫תרבית של שמרי אפיה‬

‫מבחנה המכילה ‪ 10‬מ"ל ‪( LB‬למיהול דוגמאות ובלנק)‬

‫‪ 3‬קיווטות חד פעמיות‬

‫‪ 32‬מבחנות בנפח ‪ 15‬מ"ל המכילות ‪ 9‬מ"ל מי פפטון‬

‫‪ 12‬צלחות ‪LBA‬‬

‫מקל דרגלסקי‬

‫כוסית כוהל‬

‫בונזן‬

‫פיפטורים וטיפים‬

‫כוסית לפסולת‬

‫‪10‬‬
 ‫המוציטומטר‬

‫מהלך העבודה‬

‫חלק א ‪ -‬קינטיקת גידול של חיידקים‬

‫‪ .1‬בתחילת המעבדה מהלו תרבית נוזלית של חיידקי ‪( E. coli‬בריכוז ‪ )CFU/ml 109‬ביחס של ‪ 1:50‬לתוך ‪ 30‬מ"ל של‬
‫מצע ‪ LB‬בארלנמיירים של ‪ 250‬מ"ל‪ .‬איזה נפח מתרבית המקור עליכם להעביר לארלנמייר? (יש לוודא מול‬
‫המדריכים לפני תחילת העבודה)‪ .‬מהו ריכוז החיידקים שמתקבל בארלנמייר? יש לערבב את הארלנמייר על מנת‬
‫ליצור אחידות בתרבית‪.‬‬

‫‪ .2‬אפסו את הספקטרופוטומטר בעזרת קיווטת בלנק )מצע מזון בלבד‪ ,‬ללא חיידקים ‪ -‬יש לשמור אותה לכל אורך‬
‫הניסוי!) באורך גל של ‪ .600nm‬הוציאו באופן סטרילי‪ ,‬ליד אש‪ ,‬דגימה של ‪ 1‬מ"ל מהארלנמייר המאולח‪ ,‬העבירו‬
‫לקיווטה וקראו את העכירות בספקטרופוטומטר באורך גל של ‪ .600nm‬תעדו את תוצאותיכם בטבלה מסודרת‪.‬‬

‫‪ .3‬הוציאו דוגמה נוספת בנפח של ‪ 1‬מ"ל מהארלנמייר לצורך ספירה חיה לתוך מבחנה המכילה ‪ 9‬מ"ל מי פפטון (מיהול ‪-‬‬
‫‪ .)1‬והעבירו את הארלנמייר למטלטלת המתאימה בהקדם האפשרי ‪ -‬קבוצות זוגיות ל ‪ 37°C -‬וקבוצות אי זגיות ל ‪-‬‬
‫‪ .30°C‬הפעילו את שעון העצר ‪ -‬זהו זמן ‪ 0‬של הניסוי‪.‬‬

‫‪ .4‬בצעו מיהול עשרוני לדוגמה שאספתם מהארלנמייר (זכרו‪ ,‬העברתם כבר למבחנה שכעת היא מיהול ‪ )-1‬עד מיהול ‪-8‬‬
‫וזרעו את מיהולים ‪ 8-,7-,6-‬על צלחות ‪ .LBA‬הדגירו את הצלחות הפוכות באינקובטור ‪.37°C‬‬

‫* חזרו על פעולה ‪ - 2‬כל ‪ 20‬דקות‪.‬‬

‫* חזרו על פעולות ‪ - 3+4‬כל שעה (סה"כ ‪ 4‬פעמים נוספות)‪ .‬בין לקיחת הדוגמאות יש לסדר את מבחנות המיהול לדגימה‬
‫הבאה‪.‬‬

‫שימו לב ‪ -‬במידה ומתקבלת בליעה אופטית מעל ‪ 1.5‬יש למהול את הדוגמה פי ‪ 10‬בתוך קיווטה נוספת העומדת‬
‫לרשותכם לקבלת סה"כ ‪ 1‬מ"ל ‪ LB‬עם דוגמה מהולה (חשבו ‪ -‬כמה עליכם לקחת מהדוגמה ומה ‪ .)?LB -‬יש להתחשב‬
‫בפקטור המיהול‪ ,‬אם ונערך‪ ,‬בעת חישוב תוצאות הניסוי‪.‬‬

‫תעדו את תוצאותיכם בטבלה (זמן‪ )O.D ,‬וכן את הזמנים בהם התבצעה ספירה חיה‪ .‬בסוף המעבדה יש לאשר‬
‫את התוצאות‪ ,‬כולל קבלת חתימה‪ ,‬מהמדריכים ולצרפם לדו"ח‪.‬‬

‫תעדו את תוצאותיכם והשוו את התוצאות עבור חיידקי הקולי לאלו שיתקבלו בספירה החיה‪.‬‬

‫במקביל או במהלך המעבדה הבאה‪ ,‬יש לבצע את חלק ב של המעבדה‬

‫חלק ב – בדיקה מיקרוסקופית של ריכוז מיקרואורגניזמים‬

‫‪11‬‬
 ‫שימוש בתא ספירה – המוציטומטר‬

‫תא ספירה הינו תא בנפח של ‪ 0.1mm3‬המורכב על גבי זכוכית נושאת ומחולק לריבועים כפי שנראה בתמונה‪:‬‬

‫שמים על פני התא ‪ 50l‬מדוגמת המיקרואורגניזמים ומכסים בזכוכית הנושא כך שבאזור המסומן בתמונה באדום מתקבל‬
‫נפח של ‪ .0.1mm3‬מעבירים את תא הספירה למיקרוסופ (כמו זכוכית נושא רגילה) ומסתכלים בהגדלה של ‪. 40X‬‬
‫מאתרים את האזור המסומן האדום בתמונה וסופרים את מספר המיקרואורגניזמים (עיגולים בתמונה) הנמצאים באזור‪.‬‬
‫את תוצאת הספירה כופלים ב‪ 10,000-‬כדי לקבל את ריכוז המיקראורוגניזמים בתמיסה המקורית‪ ,‬ביחידות של‬
‫מיקרואורגניזמים למ״ל או ‪cfu/ml‬‬

‫השתמשו בהמוציטומטר לספירה מיקרוסקופית של שמרי האפיה בתמיסות המקור‪ ,‬לפי הוראות השימוש‬ ‫א‪.‬‬
‫בהמוציטומטר‪ .‬במידה והתרבית צפופה מדי מהלו אותה פי ‪ ,10‬לנפח סופי של ‪ 1‬מ״ל בעזרת מים מזוקקים‬
‫(אילו נפחים של מים ושמרים נחוצים לכך?) ובצעו שנית ספירה בהמוציטומטר‪ .‬מה ריכוז התאים בדוגמה?‬

‫ערבבו ‪ 100l‬מתמיסת השמרים (או התמיסה המהולה‪ ,‬אם מהלתם את התמיסה בשלב א) עם ‪ 100l‬מתמיסת‬ ‫ב‪.‬‬
‫כחול מתילן‪ .‬צבע זה חודר לתאי השמר‪ .‬תאים חיים מחזרים אותו והופכים אותו ללבן‪ ,‬בעוד תאים מתים‬
‫נשארים צבועים בכחול‪ .‬השתמשו בהמוציטומטר לספירת התאים הלבנים והכחולים‪ .‬מה ריכוז התאים החיים‬
‫והמתים בדוגמה?‬

‫‪12‬‬
 ‫שבוע ‪ :9‬צביעת גרהם‪ ,‬הסתכלות בטיפה חיה ושלב א' של מבחן קוך‬
‫* הניסוי האחרון במעבדה זו יעשה כהכנה למעבדה הבאה בו נוכיח את מבחן קוך על חיידקים לקטיים בלבן‪ ,‬יעשה‬
‫שימוש במצע ‪( MRS‬מצע סלקטיבי לחיידקים לקטיים)‪.‬‬

‫המיקרואורגניזמים בהם נצפה‬

‫במעבדה זו נצפה בשני חיידקים (מיקרואורגניזמים פרוקריוטים)‪:‬‬
‫)‪ – E. coli (Escherichia Coli‬מתג גרהם שלילי‪.‬‬
‫)‪ – S. aureus (Staphylococcus aureus‬נקד‪ ,‬גרם חיובי‪.‬‬
‫וכן במיקרואורגניזם אאוקריוטי – שמר אפיה‪.‬‬

‫מטרות המעבדה‬

‫‪ .1‬צפייה בטיפה חיה של חיידקי ‪ E. coli‬ו‪ S. aureus -‬וכן של שמר אפיה‪.‬‬

‫‪ .2‬צביעת גרהם לחיידקי ‪ E. coli‬ו‪S. aureus -‬‬

‫חומרים לזוג‬

‫תרביות נוזליות של חיידקי ‪ E. coli , S. aureus‬ושמר אפיה‪.‬‬

‫ריאגנטים לצביעת גרהם‬
‫‪ 2‬זכוכיות נושאות‬
‫‪ 6‬זכוכיות מכסה‬
‫מחט בקטריולוגית‬
‫מתקן לצביעה‬
‫פיפטורים או פיפטות פסטר‬

‫מהלך הניסוי‬
‫א‪ .‬צפיה בטיפה חיה‬
‫העבירו ‪ 10µ‬מכל תרבית נוזלית של המיקרואורגניזמים השונים לזכוכית נושאת וכסו בזכוכית מכסה‪.‬‬

‫יש להדליק את המיקרוסקופ בעזרת הכפתור המצוי בחלקו התחתון‪ .‬ניתן לכוון את עוצמת האור‬

‫בעזרת הכפתור המצוי בצדו של המיקרוסקופ‪.‬‬

‫במיקרוסקופים שבמעבדה שני סוגי עדשות אובייקטיב‪:‬‬

‫‪13‬‬
 ‫עדשת פאזות ‪40X‬‬

‫עדשת שמן רגילה ‪X100‬‬

‫ודאו כי עדשת הפאזות (‪ )X40‬נמצאת בנתיב האור וכי טבעת הפאזות מכוונת למצב פאזה‪.‬‬
‫הניחו את הפרפרט (דוגמא – זכוכית נושא) על במתן המיקרוסקופ‪ ,‬כך שמרכז הדוגמה יהיה בנתיב האור‪ .‬תוך מבט‬
‫מהצד‪ ,‬מביאים את עדשת האובייקטיב לנקודה הנמוכה ביותר האפשרית‪ ,‬בעזרת בורג המיקוד הגס‪ .‬תוך כדי מבט‬
‫בעינית מגביהים את האובייקטיב בעזרת בורג המיקוד העדין‪ ,‬עד קבלת תמונה ממוקדת‪.‬‬

‫רישמו את תצפיותיכם‪.‬‬

‫ב‪ .‬צביעת גרהם‬

‫בצעו צביעת גרהם ל‪ 10µl-‬מהתרבית הנוזלית של חיידקי ‪ E. coli‬ו‪S. aureus -‬‬
‫‪ .1‬מהלך הצביעה‪:‬‬

‫א‪ .‬הכנת משטח החיידקים (יוכן בהתאם למקור הדוגמא(‪:‬‬

‫א‪ 1:‬מקור נוזלי‪ :‬שמים טיפה מתרחיף החיידקים או מהנוזל הנבדק במרכז זכוכית נושא‪.‬‬

‫מפזרים בעזרת מחט בקטריאלית עד קבלת שכבה דקה‪.‬‬

‫א‪ 2:‬מקור מוצק‪ :‬שמים טיפה של בופר סטרילי במרכז זכוכית נושא‪ .‬מרחיפים בתוך טיפה זו מהמקור המוצק (בד"כ‬
‫מושבת חיידקים) בעזרת מחט בקטריאלית‪.‬‬

‫ב‪ .‬ייבוש‪ :‬מייבשים את הפרפרט באוויר‪ ,‬קרוב לאש‪.‬‬

‫ג‪ .‬קיבוע (פיקסציה)‪ :‬לאחר ייבוש מלא‪ ,‬מעבירים את הזכוכית כמה פעמים בתוך הלהבה (כשצידה התחתון ללא‬
‫החיידקים מופנה כלפי מטה אל האש)‪ .‬פעולה זו גורמת לתמותת החיידקים והדבקתם לזכוכית‪.‬‬

‫השלבים הבאים יבוצעו בעמדות המיועדות לצביעה בלבד‪:‬‬

‫ד‪ .‬צביעה בסיסית‪ :‬כסו את המשטח בתמיסת קריסטל ויולט למשך ‪ 2‬דקות‪ .‬שטפו במים‪.‬‬

‫ה‪ .‬הוספת יוד‪ :‬כסו את המשטח בתמיסת לוגול למשך ‪ 2‬דקות‪ .‬שטפו במים‪.‬‬

‫ו‪ .‬שטיפת הצבע‪ :‬שטפו בתמיסת כוהל‪-‬אצטון עד ליציאת הצבע‪ .‬בצעו את הפעולה בזריזות‪ .‬שטפו במים‪.‬‬

‫ז‪ .‬צביעה נגדית‪ :‬כסו את המשטח בפוקסין או ספרנין למשך ‪ 1‬דקה‪ .‬שטפו במים וייבשו בעדינות‪.‬‬

‫ח‪ .‬המשטח מוכן כעת להסתכלות מיקרוסקופית‪.‬‬

‫‪ .2‬הסתכלות במיקרוסקופ אור‪:‬‬

‫יש להדליק את המיקרוסקופ בעזרת הכפתור המצוי בחלקו התחתון‪ .‬ניתן לכוון את עוצמת האור בעזרת הכפתור המצוי‬
‫בצדו של המיקרוסקופ‪ .‬במיקרוסקופים שבמעבדה שני סוגי עדשות אובייקטיב‪:‬‬

‫‪14‬‬
 ‫עדשת פאזות ‪40X‬‬

‫עדשת שמן רגילה ‪X100‬‬

‫עבודה עם עדשת שמן רגילה‬

‫יש לוודא כי העדשה הרגילה (‪ )X100‬נמצאת בנתיב האור וכי טבעת הפאזות מכוונת למצב אור רגיל‪ .‬מניחים את‬
‫הפרפרט (דוגמא) על שולחן המיקרוסקופ ‪ ,‬כך שמרכז הדוגמה יהיה בנתיב האור ושמים טיפה קטנה של שמן אימרסיה‬
‫על גבי הפרפרט‪ .‬תוך מבט מהצד‪ ,‬מביאים את עדשת האובייקטיב לנקודה הנמוכה ביותר האפשרית‪ ,‬בעזרת בורג‬
‫המיקוד הגס‪ .‬תוך כדי מבט בעינית מגביהים את האובייקטיב בעזרת בורג המיקוד העדין‪ .‬מטרת השימוש בשמן‬
‫אימרסיה היא לחדד את התמונה ע"י כינוס קרני האור לעדשה‪ ,‬כמודגם באיור‪:‬‬

‫שימוש בשמן אימרסיה בהגדלה ‪X100:‬‬

‫משמאל‪ :‬ללא שמן‪ ,‬קרני האור מתפזרות; מימין‪ :‬עם שמן‪ ,‬קרני האור מתכנסות לתוך העדשה‪.‬‬

‫הטיפול הנכון י ש לשמור על ניקיונם המוחלט של חלקי המיקרוסקופ‪ ,‬ובפרט של העדשות‪ .‬העדשות עשויות מזכוכית‬
‫אופטית רכה הנשרטת בקלות‪ .‬לכן אין לנקותן אלא בעזרת נייר עדשות מיוחד‪ .‬במקרה וטיפת חומר זר נדבקה לאחת‬
‫העדשות‪ ,‬אפשר לרחוץ את זכוכית העדשה במים מזוקקים ואח"כ לנגבן בנייר עדשות‪ .‬עם גמר העבודה‪ ,‬וודאו‬
‫שהאובייקטיב הקצר ביותר נמצא בנתיב האור‪.‬‬

‫סכמו את תצפיותיכם משני חלקי הניסוי בטבלה הבאה‪ .‬מידע זה ישמש אתכם במעבדות הבאות‪.‬‬ ‫‪.3‬‬

‫גרם חיובי‪/‬שלילי‬ ‫צבע‬ ‫צורה‬ ‫פרוקריוטי‪/‬‬ ‫שם המיקרואורגניזם‬

‫אאוקריוטי‬

‫‪15‬‬
 ‫‪ .4‬שלב א' מבחן קוך (כהכנה למעבדה הבאה)‪:‬‬

‫* ניסוי זה יעשה כהכנה למעבדה הבאה בו נוכיח את מבחן קוך על חיידקים לקטיים בלבן‪ ,‬יעשה שימוש במצע ‪MRS‬‬
‫(מצע סלקטיבי לחיידקים לקטיים)‪.‬‬
‫חומרים וציוד‬

‫גביע לבן‬

‫צלחת ‪MRS‬‬

‫מחט בקטריולוגית‬

‫נייר ‪pH‬‬

‫בונזן‬

‫מהלך הניסוי‬

‫א‪ .‬זרעו זריעת בידוד מהלבן על צלחת מצע ‪.MRS‬‬

‫ב‪ .‬הדגירו את הצלחות ב ‪ .30°C -‬המושבות שיתקבלו במעבדה הבאה ישמשו להמשך מבחן קוך‪.‬‬

‫ג‪ .‬יש למדוד את ה‪ pH-‬של הלבן בעזרת נייר ‪ pH‬ולתעד אותו‪.‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בצלחת במבלך ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫‪16‬‬
 ‫שבוע ‪ :10‬מבחן קוך‬

‫מטרת המעבדה‬

‫הכרה ויישום של עקרונות קוך על מוצרי תסיסה לקטית‪ -‬לבן‪ .‬שבוע שעבר בוצע השלב הראשון של המבחן ‪ -‬זריעת‬
‫בידוד מלבן של חיידקים לקטיים על מצע ‪( MRS‬ראו טבלת מצעים)‪.‬‬

‫לבן הינו תוצר של תסיסה לקטית של חיידקי סטרפטוקוקוס (נקד‪ ,‬גרהם חיובי) בחלב כאשר תוצאת תהליך התסיסה‬
‫היא הורדת ה‪ pH-‬של החלב‪ .‬במעבדה זו ננסה לבודד ולאפיין את החיידק האחראי להורדת ה‪ pH-‬ולהוכיח כי הוספתו‬
‫לחלב אכן תגרום ירידה דומה ב‪.pH-‬‬

‫א‪ .‬שלב ההדבקה של מבחן קוך (שלב ב')‬

‫חומרים‬
‫‪ 3‬מבחנות עם חלב‬
‫צלחת זריעת בידוד משלב א' של ניסוי מבחן קוך‬
‫נייר ‪pH‬‬
‫מחט בקטריולוגית‬
‫בונזן‬
‫מהלך המעבדה‬
‫‪ .1‬מדדו את ה‪ pH-‬של החלב במבחנה הראשונה בעזרת נייר לקמוס‪.‬‬
‫‪ .2‬בעזרת מחט בקטריולוגית העבירו מושבה בודדת מצלחת הבידוד של שלב א' לתוך מבחנת החלב השנייה‪.‬‬
‫‪ .3‬הדגירו את המבחנה המאולחת וכן את מבחנת החלב השלישית ב‪.30°C -‬‬
‫מדוע איננו משתמשים במבחנה החלב הראשונה? למה משמשת מבחנת החלב השלישית?‬
‫‪ .4‬לאחר ההדגרה (במעבדה הבאה) בידקו את ‪ pH‬החלב המאולח והלא מאולח בעזרת נייר ‪.pH‬‬
‫ב‪ .‬צביעת גרהם לחיידקים שבודדו מהלבן (משלב א' ‪ -‬שבוע שעבר)‬
‫מהלך הצביעה‪:‬‬
‫א‪ .‬הכנת משטח החיידקים‪:‬‬
‫מקור מוצק‪ :‬שמים טיפה של בופר סטרילי במרכז זכוכית נושא‪ .‬מרחיפים בתוך טיפה זו מהמקור המוצק (בד"כ מושבת‬
‫חיידקים) בעזרת מחט בקטריאלית‪.‬‬
‫ב‪ .‬ייבוש‪ :‬מייבשים את הפרפרט באוויר‪ ,‬קרוב לאש‪.‬‬
‫ג‪ .‬קיבוע (פיקסציה)‪ :‬לאחר ייבוש מלא‪ ,‬מעבירים את הזכוכית כמה פעמים בתוך הלהבה (כשצידה התחתון ללא‬
‫החיידקים מופנה כלפי מטה אל האש)‪ .‬פעולה זו גורמת לתמותת החיידקים והדבקתם לזכוכית‪.‬‬

‫‪17‬‬
 ‫השלבים הבאים יבוצעו בעמדות המיועדות לצביעה בלבד‪:‬‬
‫ד‪ .‬צביעה בסיסית‪ :‬כסו את המשטח בתמיסת קריסטל ויולט למשך ‪ 2‬דקות‪ .‬שטפו במים‪.‬‬
‫ה‪ .‬הוספת יוד‪ :‬כסו את המשטח בתמיסת לוגול למשך ‪ 2‬דקות‪ .‬שטפו במים‪.‬‬
‫ו‪ .‬שטיפת הצבע‪ :‬שטפו בתמיסת כוהל‪-‬אצטון עד ליציאת הצבע‪ .‬בצעו את הפעולה בזריזות‪ .‬שטפו במים‪.‬‬
‫ז‪ .‬צביעה נגדית‪ :‬כסו את המשטח בפוקסין או ספרנין למשך ‪ 1‬דקה‪ .‬שטפו במים וייבשו בעדינות‪.‬‬
‫ח‪ .‬המשטח מוכן כעת להסתכלות מיקרוסקופית בהתאם לפרוטוקול מהמעבדה הקודמת‪.‬‬
‫ג‪ .‬צביעת גרהם לדוגמת לבן ‪ -‬חזרו על השלבים לצביעה זו‪.‬‬

‫מה מסקנותיכם מהניסוי? מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בחלב במהלך ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫‪18‬‬
 ‫שבוע ‪ :11‬בקטריופאג'ים‬

‫מטרת המעבדה למצוא את ריכוז הבקטריופאג'ים בדוגמה‪.‬‬

‫חומרים‬
‫‪ 11‬מבחנות סטריליות וריקות‪.‬‬
‫‪ 11‬צלחות ‪LBA‬‬
‫אפנדורף עם דוגמת בקטריופאג' בקרח‬
‫‪ 2‬מבחנות עם ‪ 10‬מ"ל ‪LB‬‬
‫‪ 10‬אפנדורפים סטריליים‬
‫תרבית חיידקי ‪ 2( E. coli‬מ"ל)‬
‫‪°‬‬
‫ארלנמייר עם ‪ 100‬מ"ל ‪ LBA‬רך (‪ 1%‬אגר) באמבט מים בטמפרטורה של ‪50 C‬‬

‫בונזן‬
‫פיפטורים‬
‫טיפים‬
‫משאבה‬
‫פיפטות‬
‫כוס לפסולת‬
‫מהלך הניסוי‬
‫יש לסמן ‪ 11‬צלחות ‪ LBA‬במספרים ‪ 0‬עד (‪ )-10‬ולכתוב את שם הקבוצה‬ ‫‪)1‬‬
‫יש לסמן ‪ 11‬מבחנות במספרים (‪ )0‬עד (‪)-10‬‬ ‫‪)2‬‬
‫יש לסמן ‪ 10‬אפנדורפים במספרים (‪ )-1‬עד (‪ )-10‬ולפקוק אותם‪.‬‬ ‫‪)3‬‬

‫הכנת מבחנות מיהול של בקטריופאג'‬

‫משלב זה יש לעבוד ליד אש‬
‫יש להעביר ‪ µl900 LB‬לכל אחד מאפנדורפים שמספרתם בשלב הקודם‪ ,‬לסגור ולשים בקרח‪.‬‬ ‫‪)1‬‬
‫יש להעביר ‪ µl100‬מהאפנדורף עם דוגמת הבקטריופאג' לאפנדורף (‪ )-1‬ולעשות וורטקס ולהחזיר לקרח‪.‬‬ ‫‪)2‬‬
‫יש להעביר ‪ µl100‬מאפנדורף (‪ )-1‬לאפנדורף (‪ )-2‬ולעשות וורטקס וכן הלאה עד (‪ .)-10‬לשמור את‬ ‫‪)3‬‬
‫האפנדורפים עם הבקטריופאג׳ בקרח‪.‬‬

‫ערבוב החיידקים‪ ,‬הבקטריופאג׳ים והאגר הרך וזריעתם בצלחת‬

‫יש להוסיף למבחנה ‪ µl100 0‬חיידקים‪ µl100 +‬מהאפנדורף עם דוגמת הבקטריופאג' המקורית‪ ,‬לעשות‬ ‫‪)1‬‬
‫‪19‬‬
 ‫וורטקס ולהחזיר לקרח‪.‬‬
‫יש להוסיף למבחנה ‪ µl100 1‬חיידקים‪ µl100 +‬מהאפנדורף עם המסומן ב (‪ ,)-1‬לעשות וורטקס ולהחזיר‬ ‫‪)2‬‬
‫לקרח וכן הלאה עד מבחנה (‪.)-10‬‬
‫יש להביא ארלנמייר עם אגר רך מהאמבט‪.‬‬ ‫‪)3‬‬
‫יש להוסיף ‪ 5‬מ״ל של אגר רך למבחנה ‪.0‬‬ ‫‪)4‬‬
‫יש לשפוך את תוכן מבחנת האגר הרך על גבי צלחת ‪ LBA‬המסומנת ב‪ 0-‬ולפזר את האגר הרך בתנועות‬ ‫‪)5‬‬
‫בצורת ‪.8‬‬
‫יש להשאיר את הצלחת מכוסה חלקית ליד האש עד התמצקות האגר‪.‬‬ ‫‪)6‬‬
‫יש לחזור על שלבים ‪ 4-6‬עבור כל שאר המבחנות המכילות חיידקים ‪ +‬בקטריופאג׳‪.‬‬ ‫‪)7‬‬
‫בתום הניסוי‪ ,‬לאחר התמצקות וייבוש הצלחות‪ ,‬יש לסגור את הצלחות ולהעבירן הפוכות לאינקובטור‬ ‫‪)8‬‬
‫בטמפרטורה של ‪ 37°C‬למשך ‪ 24‬שעות‪.‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בצלחות השונות לאחר ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫בשבוע הבא תספרו את מספר הפלאקים השתקבלו ותחשבו את ריכוז הפלאקים בתמיסה המקורית‬

‫‪20‬‬
 ‫שבוע ‪ :12+13‬אנטיביוטיקה‬

‫חומרים‬

‫תרבית ‪ S. aureus‬או ‪ E. coli‬בריכוז ‪CFU/ml 106‬‬

‫‪7‬פיפטות סטריליות של ‪ 5‬מ"ל‬
‫‪ 1‬מבחנת המכילה ‪ 6‬מ"ל ‪NB‬‬
‫‪ 9‬מבחנות ‪ NB‬המכילות ‪ 3‬מ"ל למבחנה‬
‫‪1‬מ"ל תמיסת אמפיצילין בריכוז ‪mg/ml 0.2‬‬
‫משאבה לפיפטות‬
‫פיפטורים‬
‫טיפים‬
‫מהלך העבודה‬

‫‪ .1‬מסמנים את המבחנה המכילה ‪ 6‬מ"ל ‪ NB‬במספר ‪ .1‬מסמנים את ‪ 9‬המבחנות המכילות כל אחת ‪ 3‬מ"ל ‪NB‬‬
‫במספרים ‪ 2‬עד ‪10‬‬

‫‪ .2‬מעבירים ‪ 60‬מיקרוליטר מתמיסת האמפיצילין לתוך המבחנה המכילה ‪ 6‬מ"ל ‪- NB‬מבחנה ‪ 1‬ומערבבים בוורטקס‪.‬‬
‫(מה ריכוז האמפיצילין שהתקבל?)‬

‫‪ .3‬מעבירים ‪ 3‬מ"ל מצע עם אמפיצילין ממבחנה ‪ 1‬למבחנה ‪ 2‬ומערבבים בוורטקס וממשיכים ועורכים מיהולים כפולים‬
‫של האנטיביוטיקה החל ממבחנה ‪ 2‬עד מבחנה ‪( 9‬מהם ריכוזי האנטיביוטיקה?) יש לערבב כל מבחנה לאחר המיהול‪.‬‬
‫ממבחנה ‪ 9‬יש להוציא ‪ 3‬מ"ל ולהעבירם לפסולת הביולוגית‪ .‬יש להחליף פיפטה בין מיהול למיהול‪.‬‬
‫משאירים את מבחנה מספר ‪ 10‬ללא אנטיביוטיקה – מבחנת ביקורת (=ריכוז ‪.)0‬‬

‫‪ 4.‬מוסיפים לכל אחת מהמבחנות ‪ 30‬מיקרוליטר מתרחיף החיידק‪( .‬פי כמה מהלנו את החיידק? לאיזה ריכוז חיידקים‬
‫הגענו?)‬

‫‪ 5.‬מדגירים את המבחנות במטלטלת ב‪ 37ºC --‬למשך ‪ 24‬שעות‪.‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בבמבחנות השונות לאחר ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫לאחר ההדגרה (מעבדה הבאה)‪ :‬בודקים בספקטרופוטומטר הופעת עכירות בכל אחת מהמבחנות על ידי קריאה‬
‫באורך גל ‪( .600nm‬לא לשכוח לעשות וורטקס למבחנות לפני לקיחת דוגמה‪).‬‬

‫סכמו את תצפיותיכים‪ .‬האם הן תואמות לציפיות?‬

‫‪21‬‬
 ‫חלק ב ‪ -‬בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה בשיטת הדסקיות‪.‬‬

‫מטרת המעבדה‬

‫בניסוי זה נקבע אם חיידקי ‪ E. coli‬ו ‪S. aureus -‬עמידים או רגישים למספר חומרים אנטיביוטיים‪( .‬על סמך‬
‫הנהתונים שאספתם עד כה במעבדה לגבי חיידקים אלו‪ ,‬מה ההבדל המשמעותי בינהם שבגללו בחרנו דווקא בשני‬
‫חיידקים אלו? כיצד ישפיע הבדל זה על תוצאות הניסוי הצפויות?)‬

‫חומרים‬

‫תרבית ‪ E. coli‬ו ‪S. aureus -‬‬

‫‪ 2‬צלחות ‪NA‬‬

‫דיסקיות של החומרים האנטיביוטיים‪:‬‬

‫‪ - penicillin-G‬אנטיביוטיקה צרת טווח‪ ,‬נגד גרהם חיוביים‪ ,‬מונעת סינתזת דופן‪.‬‬

‫‪ - ampicillin‬אנטיביוטיקה רחבת טווח‪ ,‬מונעת סינתזת דופן‪.‬‬

‫‪ - chloramphenicol‬אנטיביוטיקה רחבת טווח‪ ,‬מונעת תרגום חלבון‪.‬‬

‫פיפטורים‬

‫טיפים סטריליים‬

‫מקל דריגלסקי‬

‫כוהל‬

‫פינצטה‬

‫בונזן‬

‫כלי לפסולת‬

‫מהלך הניסוי‬

‫א‪ .‬בעזרת טוש חלקו את הצלחות לשלישים ורשמו בכל שליש את שם האנטיביוטיקה (בקיצור‪ ,‬לדוגמה ‪penicillin‬‬
‫רשמו ‪ .)P‬בנוסף‪ ,‬רשמו על כל צלחת איזה חיידק היא תכיל (‪ E.C‬או ‪ )S.A‬ואת מספר קבוצתכם‪.‬‬

‫ב‪ .‬בצעו זריעות פיזור של ‪ 0.1‬מ"ל מכל אחד מתרביות החיידקים על שתי צלחות ‪ NA‬נפרדות והניחו לנוזל‬
‫‪22‬‬ ‫להיספג באגר‪.‬‬
‫ג ‪ .‬הניחו על הצלחות הנ"ל את דיסקיות האנטיביוטיקה במרכז כל שליש לפי הרישום‪ .‬שימו לב כי אין לגעת עם‬
‫הפינצטה באגר עצמו‪ .‬במידה והפינצטה נגעה (או יש חשש כי היתה נגיעה) יש להעבירה באש ולהמשיך לאחר‬
‫קירורה‪.‬‬

‫הדגירו את צלחות ה‪ NA -‬ב‪ 37C -‬כשהן ישרות‪.‬‬ ‫ג‪.‬‬

‫מה תצפו שיקרה למיקרואורגניזמים בצלחות השונות במשך ההדגרה וכיצד תראו זאת?‬

‫לאחר ההדגרה (כעבור שבוע) ‪ :‬מדדו את קוטר איזור העיכוב כולל הדיסקיות (במ"מ) וסכמו את‬
‫תצפיותיכם‪ .‬האם הן תואמות לציפיות?‬

‫‪23‬‬