‫המכללה האקדמית אחוה‬

‫המחלקה למדעי החיים‬

‫מעבדה במיקרוביולוגיה‬
‫(‪)2300172‬‬

‫חוברת מעבדה‬

‫מרצה הקורס‪ :‬דר׳ קרינה גולברג‬

‫מדריכי הקורס‪ :‬לנה משניק‪ ,‬יעל גרזון‬
‫מחבר‪ :‬פרופ' זאב ברק ופרופ' איתן בן‪-‬דב‬

‫תשפ"ב ‪2021-2022 -‬‬

 ‫הקורס מעבדה במיקרוביולוגיה – דרישות וכללים‬

‫הקורס מורכב ממעבדות ומדיונים‪ .‬המעבדות יינתנו פעם בשבועיים החל מהשבוע הראשון ללימודים‪ .‬הדיונים‬
‫יערכו פעם בשבועיים (בשבוע שלאחר כל מעבדה) על נושאי המעבדות המתאימים‪.‬‬
‫חייבת להיות התאמה בין קבוצת המעבדה לקבוצת התרגול‪.‬‬

‫◄ מעבדה ‪ -‬המעבדה תחל בשעה ‪ 09:00‬בדיוק‪ .‬יש להביא לכל מעבדה חלוק‪ ,‬מרקר לא מחיק‬
‫וסלוטייפ‪.‬‬
‫‪ .1‬לבישת חלוק במעבדה ונעליים סגורות הינה חובה‪.‬‬
‫‪ .2‬בסיום המעבדה יש להשאיר את מקום העבודה מסודר‪ ,‬להחזיר את כל הציוד שאיתו עבד הסטודנט‬
‫למגש ולפנות את כל המבחנות והתרביות שהיו בשימוש לצורכי הניסוי במעבדה‪ .‬את הצלחות הזרועות יש‬
‫להכניס לחדר הדגרה ולמחרת לאסוף אותן בתאום עם המדריך ‪.‬‬
‫אין לעזוב את המעבדה ללא אישור המדריך !!‬
‫‪ .3‬יש להכין לקראת כל מעבדה את התשובות לשאלות ההכנה ויישום ולהגיש אותן בתחילתה‪.‬‬
‫‪ .4‬דו"ח הסיכום יוגש שבוע לאחר הדיון בנושא המעבדה (שבועיים לאחר ביצוע הניסויים)‪ .‬דוח המעבדה‬
‫יכלול את תוצאות הניסויים והדיון בהן בלבד (עפ"י דף מפורט שיופץ בדיון הראשון)‪.‬סיכום התוצאות יעשה‬
‫כמפורט בחוברת המעבדה (שאלות סיכום בסוף כל מעבדה)‪ .‬יש להתייחס בדיון בצורה כללית או ספציפית‬
‫לכל אחת משאלות הסיכום של המעבדה‪ .‬חלק מהניסויים מבוצעים במתכונת קבוצתית ובמקרים אלו בדוח‬
‫יש בלהתייחס לתוצאות כל הקבוצה כולה‪.‬‬

‫◄ דיונים ‪ -‬דיונים מתחילים ‪ 10‬דקות לאחר השעה הנקובה‪.‬‬

‫‪ .1‬חובה להכין לקראת כל דיון את סיכום התוצאות שנתקבלו במעבדה בצורה של גרפים ו‪/‬או טבלאות‬
‫ולענות על שאלות הסיכום של המעבדה (נמצאות בסוף כל מעבדה‪ ,‬ראה חוברת המעבדה)‪.‬‬
‫‪ .2‬חובה להביא לדיון את צלחות הגידול שנתקבלו מניסויי המעבדה‪ ,‬על מנת שניתן יהיה לנתח אותן‬
‫בדיון‪( .‬התרביות או צלחות פטרי ישמרו במקרר עד למועד הדיון)‪.‬‬
‫הכנת או אי הכנת סכום תוצאות בצורה של גרפים ו‪/‬או טבלאות לקראת דיון תשפיע על הערכת מדריך‪.‬‬

‫◄ בחנים ‪ -‬בחנים יערכו בתחילת כל מעבדה על שאלות ההכנה למעבדה ובתחילת הדיונים על‬
‫שאלות ההכנה ושאלות הסיכום המתאימות הנמצאות בחוברת מעבדה‪.‬‬

‫◄ ערעורים ‪ -‬ערעור בכתב יוגש למדריך במעבדה או בדיון הקרובים בלבד‪ ,‬שבוע לאחר החזרת הבוחן‪.‬‬
‫לא יתקבלו ערעורים לאחר מועד זה‪.‬‬
‫בוחן או דו"ח מעבדה ייבדקו במלואם מחדש (לא רק שאלת הערעור) ויקבע ציון חדש‪.‬‬
‫(הציון יכול להשתנות לכל כוון או לא להשתנות כלל)‪ .‬הציון הקובע יהיה הציון החדש‪.‬‬

‫◄ הרכב הציון הסופי‪ :‬בחנים ‪ ,60% -‬הערכת מדריך ‪ .15% -‬ציון בוחן מסכם ‪.25% -‬‬
‫ציון עובר בקורס הוא ‪ 60‬כאשר בנוסף הושלמו כל חובות המעבדה והדיונים‪.‬‬
‫נוכחות חובה בכל המעבדות ודיונים (היעדרויות המותרות‪ :‬מעבדה אחד ודיון אחד‬
‫בלבד‪ ,‬מסיבות מוצדקות בלבד‪ ,‬בהצגת אישור רפואי ובאישור של מרצה הקורס)‪.‬‬

‫‪1‬‬
 ‫המכללה האקדמית אחוה‬
‫מעבדה במיקרוביולוגיה (‪)2300172‬‬

‫תרגיל‪ 2.0- ‬ש"ש‪ ,‬מעבדה ‪ 2.0 -‬ש"ש‪ ,‬סה"כ ‪ 2‬נק"ז‬

‫מקצוע קדם‪ :‬ביוכימיה א'‪ ,2300110 :‬מגן‪-‬לחלבון‪ ,‬קורס מקביל חובה מיקרוביולוגיה ‪2300170‬‬

‫מטרת הקורס‪:‬‬
‫לימוד שיטות מעבדה מתקדמות במיקרוביולוגיה‪ ,‬המהווה השלמה לחומר התיאורטי בתחום זה‪.‬‬

‫נושאי המעבדות ודיונים‪:‬‬

‫‪ .1‬תפוצת חיידקים בסביבתנו הקרובה‪.‬‬

‫‪ .2‬הכרת צורות מיקרוסקופיות של חיידקים ושיטות לבידוד חיידקים‪.‬‬
‫‪ .3‬שיטות לספירת חיידקים‪.‬‬
‫‪ .4‬שיטות עיקור‪ ,‬חיטוי‬
‫‪ .5‬גידול וזיהוי חיידקים על מצעי העשרה ומצעים סלקטיביים‪.‬‬
‫‪ .6‬עקומות גידול של חיידקים‪.‬‬
‫‪ .7‬השפעות של גורמים פיסיקליים וכימיים על חיידקים (טמפרטורה‪ ,pH ,‬קרינה‪ ,‬לחץ אוסמוטי‪,‬‬
‫חומרים אנטיבקטריאליים)‪.‬‬
‫‪ .8‬השפעות של כימיקלים על חיידקים (אנטיביוטיקות וחמרים מוטגנים)‪.‬‬
‫‪ .9‬הכרת מחזור חיים של בקטריופאז'ים אלימים‪.‬‬

‫ספרות מומלצת‪:‬‬

‫‪1. Biology of Microorganisms, Brock. T.D., Prentice Hall Inc. Englewood Cliffs, New-Jersey.‬‬
‫‪2. Microbiology, Prescott, L.M., Harley, J.P., and Klein,D.A. McGrow-Hill Co., Inc. Boston.‬‬
‫‪3. General Microbiology. Stanier, R.Y., Doudoroff, M. and Adelberg, A.E., Macmillan and Co. Ltd., London.‬‬
‫‪4. Microbiology, Davis, B.D., Dulbecco, R., Eeisen, H.N., Ginsberg, H.S. and Wood, W.B.‬‬
‫‪Jr. Harper and Row, New York.‬‬
‫‪.‬עולם החיידקים‪ ,‬הוצאת האוניברסיטה הפתוחה ‪5.‬‬

‫‪2‬‬
 ‫מעבדה מס' ‪.1‬‬
‫תפוצת חיידקים בסביבתנו הקרובה‬

‫מטרות‪:‬‬
‫‪ .1‬תפוצת חיידקים בסביבתנו‪.‬‬
‫‪ .2‬הכרת שיטות עבודה ומושגים בסיסיים בבקטריולוגיה‪.‬‬
‫‪ .3‬הבנת מושגים בסיסיים במחקר‪.‬‬

‫שאלות הכנה‪:‬‬
‫‪ .1‬שאלות מידע‪:‬‬
‫עמוד על ההבדלים בין‪ :‬פיסטור‪ ,‬סינון חיטוי ועיקור‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫תאר והסבר בקצרה תוך הדגשת היתרונות והחסרונות‪ ,‬את שיטות העיקור הבאות‪ :‬חום יבש‪ ,‬חום‬ ‫‪.2‬‬
‫רטוב‪ ,‬הקרנה באור על‪-‬סגולי (‪ ,)UV‬הקרנה בקרני גמא ועיקורים כימיים‪ :‬נוזלי וגזי‪.‬‬
‫הגדר את סוגי המצעים הבאים‪ :‬מצע עשיר‪ ,‬מצע מוגדר‪ ,‬מצע מינימאלי‪ ,‬מצע העשרה‪ ,‬מצע בררני‬ ‫‪.3‬‬
‫(‪ ,)selective media‬מצע מבדיל ( ‪.)Differential media or indicator media‬‬
‫מהו אגר ומהן התכונות המאפשרות את השימוש בו במצע מוצק לגידול חיידקים ואורגניזמים‬ ‫‪.4‬‬
‫אחרים?‬
‫‪ .2‬שאלות יישום‪:‬‬
‫באיזה צורת עיקור עדיף להשתמש למצעי מזון ומדוע?‬ ‫‪.1‬‬
‫בדקו את הרכב מצעי המזון ‪ LB‬ו‪ M9 -‬והסבירו‪:‬‬ ‫‪.2‬‬
‫‪ .i‬מדוע נחשב אחד כמצע עשיר והשני כמצע מינימאלי?‬
‫‪ .ii‬מה תפקיד המרכיבים השונים של כ"א ממצעי הגידול?‬
‫האם ‪ M9‬הוא מצע מינימאלי לכל חיידק? כיצד יראה מצע מינימלי לחיידק‬ ‫‪.iii‬‬
‫אוטוטרופי?‬
‫מה הריכוז הסופי באחוזים ובמולרים של גלוקוז וסידן כלורי במצע ‪?M9‬‬ ‫‪.3‬‬
‫כאשר תערוך ניסויים לגילוי והכרת חיידקים בסביבתך הקרובה‪ ,‬באילו מצעים תשתמש ומדוע?‬ ‫‪.4‬‬
‫אם ברצונך לבדוק השפעת מצע גידול על התרבות חיידקים עליך לוודא שכמות חיידקים שווה‬ ‫‪.5‬‬
‫נזרעה לכל אחד מהמצעים‪ ,‬מדוע? הצע דרך לבדיקה כזאת בחיידקי חול‪.‬‬
‫ברצונך לבדוק השפעת טיפולים שונים על חיטוי אצבע מחיידקים‪ .‬מוצע כי הבדיקה תעשה במצע‬ ‫‪.6‬‬
‫מוצק‪ .‬הבדיקה תעשה ע"י נגיעה עם אצבע במצע (לקביעת מספר החיידקים לפני הטיפול)‪ ,‬טיפול‬
‫באחד מחומרי החיטוי ונגיעה שניה‪ .‬כיצד ניתן לוודא שההבדל במספר החיידקים שנספרו לפני‬
‫ואחרי הטיפול‪ ,‬נובע מהטיפול עצמו ולא מהנגיעה הכפולה?‬
‫אילו גורמים יכולים לדעתך להשפיע על פיזור חיידקים בחלל החדר? תכנן ניסוי מבוקר שיבדוק‬ ‫‪.7‬‬
‫השפעת אחד הגורמים הנ"ל‪.‬‬

‫‪3‬‬
 ‫חומרים ושיטות‪:‬‬
‫‪ .1‬אוטוקלב‪ :‬זהו למעשה סיר לחץ גדול‪ .‬באוטוקלב נוצר‪ ,‬או שמוזרם אלין קיטור‪ ,‬אשר בלחץ של ‪1.5‬‬
‫אטמוספרות מאפשר חימום מים ל‪ .1200C -‬חימום רטוב מעין זה למשך ‪ 20‬דקות גורם להרג כל‬
‫החיידקים ולעיקור מלא של תמיסות מצעים או מכשירים‪.‬‬
‫‪ .2‬מצע ‪ :LB‬מצע עשיר שהרכבו כדלקמן‪:‬‬
‫‪a. TRYPTONE‬‬ ‫‪10 g/l‬‬
‫‪b. YEAST EXTRAT‬‬ ‫‪5 g/l‬‬
‫‪c. NaCl‬‬ ‫‪10 g/l‬‬
‫‪ – TRYPTONE‬חלבון החלב‪ ,‬קזאין‪ ,‬אחרי עיכול פנקריאטי‪.‬‬
‫‪ – YEAST EXTRAT‬החלק המסיס במים של שמרים שעברו עיכול עצמי‪ .‬מכיל תערובת ויטמין שמצויים‬
‫בשמרים בנוסף לסוכרים וחומצות אמינו‪.‬‬
‫‪ .3‬מצע ‪ LB‬מוצק‪ :‬כמו המצע הנוזלי בתוספת ‪ g/l 15‬אגר‪.)BACTO-AGAR( .‬‬
‫‪ .4‬מצע ‪ :M9‬זהו מצע מינימלי שהרכבו כדלקמן‪:‬‬
‫‪a. Na2HPO4‬‬ ‫‪6 g/l‬‬
‫‪b. KH2PO4‬‬ ‫‪3 g/l‬‬
‫‪c. NaCl‬‬ ‫‪0.5 g/l‬‬
‫‪d. NH4Cl‬‬ ‫‪1 g/l‬‬
‫התמיסות הבאות עוברות עיקור בנפרד (מדוע?) ומוספות בצורה סטרילית לתמיסת המלחים הנ"ל לאחר‬
‫עיקורה‪ .‬לליטר אחר של תמיסת מלחים מוסיפים‪:‬‬
‫‪ ml 10 .a‬גלוקוז או סוכר אחר בריכוז ‪.20%‬‬
‫‪ ml 1 .b‬של תמיסת ‪ MgSO4‬בריכוז ‪1M.‬‬
‫‪ ml 1 .c‬של תמיסת ‪ CaCl2‬בריכוז ‪.0.1M‬‬

‫ניסויים‪:‬‬
‫הכנת צלחות מצע ‪ LB‬מוצק‪:‬‬ ‫‪.1‬‬
‫נתון מצע ‪ LB‬נוזלי ו‪ 1.5 -‬גר' אגר‪ .‬הוסף לאגר נפח של ‪ 100‬מ"ל מצע ‪ ,LB‬סגור בפקק צמר גפן וכסה‬
‫בנייר אלומיניום (מדוע?)‪ .‬לאחר העיקור באוטוקלב וקירור המצע לכ‪ 50oC -‬מזגו ל‪ 4 -‬צלחות פטרי‬
‫סטריליות שסומנו קודם לכן בצדן התחתון ע"מ שתוכלו לזהותן לאחר התקרשותן והדגרתה של ‪ 24‬שעות‬
‫ב‪.37oC -‬‬

‫סינון סטרילי להרחקת חיידקים מתמיסה‪:‬‬ ‫‪.2‬‬

‫סינון להרחקת חיידקים מתרחיף חול יודגם ע"י המדריך‪.‬‬

‫‪4‬‬
 ‫הכרת חיידקים ממקורות שונים‪:‬‬ ‫‪.3‬‬
‫לפניך צלחת ‪ LB‬מוכנה‪ ,‬חלק אותה לגזרות ע"י סימון במרקר על תחתיתה‪ ,‬מדוע? חשוף כל גזרה למקור‬
‫חיידקים שונה‪ :‬שערה‪ ,‬מי שלולית‪ ,‬רוק‪ ,‬סבון‪ ,‬מי ברז או אחרים‪ ...‬גזרה אחת השאר לביקורת‪ .‬מה תהיה‬
‫הביקורת ומדוע? יש להקפיד שהדגימות לא תחרוגנה מתחומיהן‪.‬‬
‫התרבות תערובת חיידקים על מצעים שונים‪:‬‬ ‫‪.4‬‬
‫זרע לביקורת ‪ 0.1‬מ"ל תמיסת סליין (‪ )NaCl 0.9%‬מעוקרת על מצע ‪ LB‬מוצק‪ .‬מדוע פעולה זאת‬
‫משמשת לביקורת? ומדוע משתמשים לביקורת צלחות פטרי עם מצע ‪?LB‬‬
‫ערבב תרחיף חול (כ‪ 10-‬מ"ל) של תמיסת הסליין המעוקרת‪ ,‬הנח על השולחן והמתן לשקיעת גרגרי החול‪.‬‬
‫הנוזל העליון של תרחיף זה ישמש כמקור לחיידקים‪ .‬זרע ‪ 0.1‬מ"ל בכל אחד מהמצעים הבאים‪:‬‬
‫מצע ‪ LB‬נוזלי‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫מצע ‪ LB‬מוצק‪.‬‬ ‫‪.2‬‬
‫מצע ‪ M9‬נוזלי‪.‬‬ ‫‪.3‬‬
‫מצע ‪ M9‬מוצק‪.‬‬ ‫‪.4‬‬
‫מצע ‪ LB‬מוצק ‪ +‬פניצילין‪.‬‬ ‫‪.5‬‬
‫*** שים לב !!! את התרחיף יש לקחת מחלקו העליון ללא החול‪.‬‬

‫בדיקה איכותית ליעילות החיטוי סבון וכוהל‪:‬‬ ‫‪.5‬‬

‫תוסיף ‪ l 10‬של חיידקי ‪ E. coli‬לכל אחד מארבע מבחנות אפנדורף המכילות ‪ l 990‬של תמיסה‬
‫פיזיאולוגית (‪ ,)NaCl 0.9%‬סבון נוזלי‪ ,‬כוהל בריכוז של ‪ 70%‬ושל ‪.20%‬‬
‫ערבב היטב ותתגיר במשך ‪ 10‬דקות את המבחנות בטמפרטורת החדר‪.‬‬
‫חלק את צלחת ‪ LB‬לרבעים ע"י סימון במרקר על תחתיתה‪ .‬באמצעות מחט בקטריולוגית תזרע על פני‬
‫צלחת ‪ LB‬מוצק בכל רבע את החיידקים מהמבחנות השונות‪.‬‬

‫ניסיון לזהות גורמים שונים המשפיעים על פיזור חיידקים באוויר‪:‬‬ ‫‪.6‬‬

‫עליך לבדוק אחד מהגורמים הבאים‪ :‬גובה‪ ,‬מרחק ממקור אויר חיצוני‪ ,‬מרחק ממקור לחות‪( .‬בתאום עם‬
‫המדריך)‪ .‬הבדיקה תעשה ע"י חשיפת הצלחות ‪ LB‬לפרק זמן קבוע של ‪ 5‬ד' במצב קבוע (אופקי)‬
‫במקומות השונים‪ .‬מדוע?‬

‫זיהוי גורמים המשפיעים על זיהום מצעים בחיידקי אויר‪:‬‬ ‫‪.7‬‬

‫יבדקו‪ :‬זמן חשיפה ( ‪ 5 ,2‬ו‪ 15 -‬ד') מרחק ממקור אש (צמוד‪ 30 ,‬ו‪ 60-‬ס"מ) ועמדת הצלחת (אופקי פתוח‬
‫כלפי מעלה ומטה ומאונך)‪ .‬עליך לבדוק גורם אחד בלבד‪( .‬בתאום עם המדריך)‪.‬‬

‫שים לב!!!‬
‫‪ .1‬על צלחות או מבחנות שיושארו להדגרה יש לרשום במרקר סימן זיהוי לקבוצה וסוג הטיפול‪ .‬הרישום יעשה‬
‫בתחתית הצלחת‪ ,‬בהיקפה ובקיצור‪.‬‬
‫‪ .2‬צלחות להדגרה יונחו ע"ג המכסה ע"מ למנוע טפטוף מי עיבוי מהמכסה על המצע‪.‬‬
‫‪ .3‬יש להקפיד לעבוד בצורה סטרילית ‪ -‬יודגם ע"י המדריכים‪.‬‬
‫‪5‬‬
 ‫‪ .4‬הכנת צלחות וזריעת דגימות נוזליות ופיזור ע"ג מצע מוצק בעזרת מקל דריגלסקי יודגמו תחילה ע"י מדריך‪.‬‬
‫‪ .5‬יש לבדוק את תוצאות הניסויים בתום יום הדגרה ב‪ 37oC -‬ולהשוות למצב התרבית כעבור ‪ 4‬ימי גידול נוספים‬
‫בטמפרטורת חדר‪ .‬בבדיקת התוצאות יש להבחין במספר המושבות הכללי בצבע ובצורת מושבות החיידקים‬
‫השונים‪.‬‬
‫‪ .6‬יש לשמור את תוצאות ניסוי החול (צלחות ותרביות נוזליות) במקרר לשם בדיקת המשכית במעבדה הבאה‪.‬‬

‫שאלות סיכום‪:‬‬
‫‪ .1‬כיצד תסביר גדילה של חיידקים בצורת מושבה? מדוע המושבה מפסיקה לגדול בשלב מסוים? כיצד תוכיח‬
‫שמושבה מקורה בחיידק בודד? חשב את מספר החיידקים המרבי במושבה ברדיוס של ‪ 1‬מ"מ וגובה של‬
‫‪ 0.5‬מ"מ‪ .‬בהנחה שנפח החיידק ‪ .1m3‬לאיזה הנחות נוספות זקוקים בכדי לחשב במדויק את המספר?‬
‫‪ .2‬מה היתרון והחיסרון של גידול על צלחת אגר בהשוואה לגידול על מצע נוזלי?‬
‫‪ .3‬האם ניתן להסיק שחיידקים מסוגלים לגדול על חומר מוצק?‬
‫_____________________________________________________________________‬
‫‪ .4‬בדוק והשווה את ההנחות שלך בעט תכנון הניסויים אל מול התוצאות שקיבלת‪ .‬האם קבלת תשובה‬
‫חד‪-‬משמעית? אם לא‪ ,‬הצע דרכים נוספות לוודא את נכונות הנחותיך‪.‬‬
‫‪ .5‬תאר צורות מושבות שראית במקורות השונים‪ .‬שים לב לגודל המושבה‪ ,‬צבעה‪ ,‬שטח פניה‪ ,‬גבולותיה ויחסי‬
‫הגומלין בין מושבות שכנות‪.‬‬
‫‪ .6‬האם ניתן לראות אוכלוסיות ספציפיות של חיידקים במקורות השונים? כיצד תסביר זאת? מאין באים‬
‫חיידקים לאוויר?‬

‫‪6‬‬
 ‫מעבדה מס' ‪2‬‬
‫קלסיפיקציה וזיהוי חיידקים‬
‫מטרות‪:‬‬
‫הסתכלות מיקרוסקופית בחיידקים‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫שיטות לבידוד חיידקים‪.‬‬ ‫‪.2‬‬

‫שאלות הכנה‬
‫מהי זריעה לבידוד ולמה היא משמשת?‬ ‫‪.1‬‬
‫מהן היתרונות והחסרונות של זריעה לבידוד (‪ )streaking‬לעומת זריעות מסדרת מהולים סטריליים?‬ ‫‪.2‬‬
‫מהם המהלכים העקרוניים והבלתי ניתנים לשינוי בזריעה לבידוד ואלו פרטים כן ניתן לשנות?‬ ‫‪.3‬‬
‫הציעו שיטות חדשות לזריעה לבידוד‪.‬‬
‫פרטו דרכים מקובלות לשימור (‪ )conservation‬של זני חיידקים מבודדים (‪ .)pure cultures‬השוו בינהן‪.‬‬ ‫‪.4‬‬
‫מהי צביעת גראם? למה היא משמשת?‬ ‫‪.5‬‬
‫מהי צביעת ‪ ?ACID FAST‬למה היא משמשת?‬ ‫‪.6‬‬
‫מה זה ‪?NEGATIVE STAINING‬‬ ‫‪.7‬‬
‫מהי קפסולה? כיצד ניתן לצבוע אותה?‬ ‫‪.8‬‬
‫מהו מיקרוסקופ פאזות? כיצד הוא עובד? מה ההבדל בינו לבין מיקרוסקופ אור רגיל?‬ ‫‪.9‬‬
‫העזר בספרי אופטיקה‪.‬‬
‫‪ .10‬מהן התאבכויות בונות ומהן התאבכויות הורסות?‬
‫‪ .11‬מדוע ניתן להבחין בשוטונים של חיידק במיקרוסקופ אלקטרוני אבל לא מבחינים בהם במיקרוסקופ אור?‬
‫‪ .12‬אלו צורות יש לחיידקים‪.‬‬
‫‪ .13‬מה ההבדל בין שמר לחיידק? כיצד ייצבע לדעתך שמר בצביעת גראם?‬
‫‪ .14‬אלו צורות יש לצברי חיידקים ומהם שמות הצברים השונים?‬
‫‪ .15‬לפניך רשימת חיידקים‪ ,‬כיצד ייצבע כל אחד מהם בצביעת גראם‪:‬‬
‫א‪Escherichia coli.‬‬
‫ב‪.israelensis Bacillus thuringiensis subsp.‬‬
‫ג‪Staphylococcus aureus .‬‬
‫ד‪Mycobacterium tuberculosis .‬‬
‫ה‪Lactobacillus .‬‬
‫‪ .16‬אלו פרטים תוכל להסיק לגבי החיידקים הללו מתוך שמם‪:‬‬
‫א‪Staphylococcus .‬‬
‫ב‪Streptococcus .‬‬
‫ג‪Bacillus .‬‬
‫שימו לב לצורת רישום שמות החיידקים (טקסט נטוי‪.)italics-‬‬

‫‪7‬‬
 ‫שיטות עבודה‪:‬‬

‫מהלך צביעת גראם‪:‬‬ ‫‪.1‬‬

‫סמן את מיקום החיידקים ואת סוגם ע"י מרקר בצידה התחתון של הזכוכית‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫פזר בעזרת מחט בקטריולוגית את החיידקים בתוך טיפת מים על גבי זכוכית נושאת ויבש אותה‬ ‫‪.2‬‬
‫באוויר‪.‬‬
‫קבע את החיידקים על הזכוכית ע"י העברתה במהירות באש מספר פעמים‪.‬‬ ‫‪.3‬‬
‫צבע בקריסטל ויולט‪ ,‬ע"י הצפה למשך דקה‪.‬‬ ‫‪.4‬‬
‫שטוף בעדינות ע"י הזלפת מי ברז וספוג את עודפי המים‪.‬‬ ‫‪.5‬‬
‫כסה את החיידקים בתמיסת ‪( KI-I‬לוגול) למשך דקה‪.‬‬ ‫‪.6‬‬
‫שטוף שוב במים ויבש באוויר‪.‬‬ ‫‪.7‬‬
‫שטוף באתנול ‪ 95%‬למשך כחצי דקה עד להפסקת יציאת הצבע‪.‬‬ ‫‪.8‬‬
‫שטוף שוב במים ויבש‪.‬‬ ‫‪.9‬‬
‫צבע בצבע השני‪ ,‬פוקסין או ספרנין‪ ,‬למשך דקה; שטוף במים ויבש‪.‬‬ ‫‪.10‬‬
‫ליפני דגימת החיידקים יש לערבל טוב את התרחיף שבמבחנה ולחטא את המחט באש‪.‬‬ ‫‪‬‬

‫זריעה לבידוד‬ ‫‪.2‬‬

‫זרע חיידקים בסדרת מהולים עוקבות בהתאם למצוין בציורים לפניך‪ .‬סדר הזריעות מצוין ע"י מספור מתאים‬
‫בציורים‪ .‬חיידקים ממבחנת המקור נזרעים רק בזריעה הראשונה (‪ .)1‬כל הזריעות העוקבות מפזרות חלק‬
‫מחיידקי הזריעה הקודמת‪ .‬יש להשמיד את עודפי החיידקים שע"פ המחט הבקטריולוגית‪ ,‬ע"י שריפה‪ ,‬בין זריעה‬
‫לזריעה‪ .‬לא לשכוח לקרר את המחט בתוך אזור סטרילי באגר לפני תחילת זריעה חדשה‪.‬‬

‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪6‬‬
‫‪3‬‬

‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬

‫תנועת החיידקים (הדגמה)‬ ‫‪.3‬‬

‫בנית גשר מזכוכיות מכסות על פני זכוכית נושאת‪(.‬יודגם ע"י המדריך)‬
‫הנח טיפה קטנה (‪ 5-10‬מיקרוליטר) של תרבית חיידקים בקצה הפתוח של הגשר‪.‬‬
‫צפה במיקרוסקופ פאזות על תנועת חיידקים חיים‪.‬‬

‫‪8‬‬
 ‫מהלך הניסויים‬

‫‪ .1‬זריעה לבידוד של תרחיפי חיידקים‪:‬‬

‫לפניך ‪ 5‬מבחנות‪ 4 :‬מבחנות המכילות תרביות נקיות של חיידקים שונים‪ ,‬מבחנה חמישית מכילה תערובת של‬
‫מספר סוגי חיידקים‪ .‬בנוסף‪ ,‬תשתמש במבחנות המכילות תרביות חיידקי החול שהתקבלו במעבדה מס' ‪1‬‬
‫במצעים הנוזליים ‪ LB‬ו‪.M-9 -‬‬
‫א‪ .‬הכן לעצמך תרחיף שישי ממושבה מבודדת שתבחר מניסויים קודמים במעבדה מס' ‪ .1‬ליצירת התרחיף יש‬
‫להעביר באמצעות מחט בקטריולוגית בצורה סטרילית חיידקים מהמושבה לתוך ‪ 0.5‬מ"ל תמיסת סליין‬
‫סטרילית ולערבב היטב ע"י ערבול חזק עד להרחפה מלאה של החיידקים‪.‬‬
‫ב‪ .‬זרע לבידוד (אחרי ערבוב)‪ ,‬על מצע עשיר‪ ,‬כל אחד משמונה התרחיפים הנ"ל‪.‬‬
‫יש לבדוק את תוצאות הניסויים בתום יום הדגרה ב‪ 37oC -‬ולהשוות למצב התרביות כעבור שלושה ימי גידול‬
‫נוספים בטמפרטורת החדר‪ .‬בבדיקת התוצאות יש להבחין במספר המושבות הכללי‪ ,‬בצבע ובצורת מושבות‬
‫החיידקים השונים‪.‬‬

‫‪ .2‬הסתכלות מיקרוסקופית אחרי צביעת גראם בחיידקים שונים‪:‬‬

‫צבע את ‪ 5‬התרחיפים הראשונים (ראה סעיף קודם) בצביעת גראם לפי הפרוטוקול‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫בדוק את הפרפרטים במיקרוסקופ אור‪ .‬התחל לבדוק מההגדלה הקטנה ביותר ומקד את‬ ‫‪.2‬‬
‫השדה הצבוע‪ .‬רק לאחר מיקוד השדה עבור להגדלה הבאה‪ .‬בהגדלות הנוספות תמקד עם המיקרומטר‬
‫בלבד‪ .‬לפני המעבר להגדלה פי ‪ 100‬טפטף טיפה אחת של שמן אימרסיה על הפרפרט ‪ .‬לאחר שלב זה אין‬
‫לחזור אחורה להגדלה של פי ‪ - 40‬כניסה של שמן אימרסיה לאובייקטיב של ‪ 40‬תהרוס אותו!!!‪.‬‬
‫קבע באיזה צבע נצבעו החיידקים השונים‪ ,‬מה צורתם וגודלם יחסית לאחרים ופרטים‬ ‫‪.3‬‬
‫צורתיים נוספים‪ ,‬אם ישנם‪.‬‬
‫האם עליך לעבוד סטרילי גם בשלב זה? הסבר‪.‬‬
‫הכן דגימה אחת של חיידקים חיים מאחד התרחיפים וצפה בהם במיקרוסקופ פאזות‪.‬‬ ‫‪.4‬‬
‫האם ישנם הבדלים בין דגימה זו לבין אותו חיידק לאחר צביעת גראם? מדוע?‬

‫שים לב !!!!‬
‫‪ .1‬לפני דגימת החיידקים מהמבחנות יש לערבב את התרחיף היטב בוורטקס‪.‬‬
‫‪ .2‬במיקרוסקופ אור בהגדלה של ‪ x100‬יש לשים טיפת שמן אימרסיה בין הפרפרט להעדשה ‪.‬מדוע?‪.‬‬
‫‪ .3‬יש להקפיד לנקות היטב את העדשות משאריות שמן אימרסיה‪.‬‬
‫‪ .4‬במהלך צביעת גראם אין להתיז מים בזמן השטיפה ישירות על החיידקים המקובעים‪.‬‬
‫‪ .5‬יש לסמן במרקר בתחתית הזכוכית הנושאת את מיקום הנחת החיידקים לפני הצביעה‪,‬‬
‫ואת מספר התרחיף ממנו נלקח‪.‬‬

‫‪9‬‬
 ‫שאלות סיכום‬
‫‪ .1‬זהה את החיידקים בתערובת הלא ידועה לפי הצביעה וההסתכלות במיקרוסקופ וצורת המושבות‪.‬‬
‫‪ .2‬א‪ .‬אלו עוד פרמטרים משמשים או עשויים לשמש להגדרה של חיידקים מלבד הפרמטרים‬
‫המוזכרים בשאלה‪? 1-‬‬
‫ב‪ .‬היעזרו בספרי הלימוד וזהו את סוגי החיידקים השונים שתכונותיהם מתוארות בעמוד זה והמשך‬
‫בעמוד הבא‪ .‬הגדירו או הסבירו בקצרה את המושגים המודגשים שקשורים לתכונות השונות‪.‬‬
‫‪ .3‬האם ייתכן שאותו חיידק‪ ,‬בתנאים שונים‪ ,‬ייצבע אחרת באותה צביעת גראם? אם כן מדוע?‬
‫‪ .4‬הצע אפשרויות שונות שיסבירו את ההבדלים בצביעה‪ .‬הצע כל היפותזה הגיונית שתסביר את הצביעה השונה‬
‫של החיידקים‪ .‬נסה להתייחס גם למבנה החיידקים השונה‪ .‬הצע ניסויים שיבדילו בין האפשרויות השונות‪.‬‬
‫_______________________________________________________________________‬
‫‪ .5‬עקוב אחר הופעת חיידקי התערובת לאורך קו זריעת הבידוד‪ ,‬האם קיימת השתנות ביחסים בין החיידקים?‬
‫מה ניתן להסיק מכך?‬
‫‪ .6‬האם מקורה של המושבה שנבחרה לבדיקה על ידך לבדיקה בסוג אחד של חיידקים?‬
‫‪ .7‬מה אופי החיידקים שהתפתחו מהחול בתרביות שגודלו במצע ‪ LB‬ו‪ M-9 -‬נוזליים? השווה את סוגיהם‬
‫והיחסים הכמותיים ביניהם לאלה שהתקבלו במעבדה הראשונה ע"ג המצעים המוצקים‪.‬‬
‫‪ .8‬לפניך שבעה תיאורים של חיידקים‪ :‬השתמשו בספרים שונים‪ ,‬הגדירו או הסבירו בקצרה את המושגים‬
‫המודגשים ונסו להגדיר את החיידקים‪.‬‬

‫‪:‬‬

‫‪1. Rods. Usually motile by means of peritrichous flagella: occasionally non motile. Form‬‬
‫‪ovoid to spherical endospores that usually distend the cell. Generally Gram positive.‬‬
‫‪Chemoorganotrophs. Some species are saccharolytic, some are proteolytic, some are‬‬
‫‪both or neither. Most strains are strictly anaerobic. Commonly found in soil, marine and‬‬
‫‪fresh water sediments and in the intestinal tract of humans and animals. The G+C content‬‬
‫‪of DNA ranges from 23 to 43 moles %.‬‬
‫‪2. Straight rods, 1.1 to1.5 by 2.0 to 6.0 m Motile by peritrichous flagella or nonmotile. Gram‬‬
‫‪negative. Grow readily on simple nutrient media. Lactose is fermented by most strains, with‬‬
‫‪production of acid and gas. G+C content of DNA: 50 to 51 moles %.‬‬
‫‪Sensitive to KCN. Do not produce H2S.‬‬
‫‪3. Straight to slightly curves rods with irregularly stained segments and sometimes granules.‬‬
‫‪Frequently show club-shaped swelling. Snapping division produces angular and palisade‬‬
‫‪(picket fence) arrangement of cells. Generally nonmotile. Gram positive.‬‬

‫‪10‬‬
 Chemorganotrophs; Metabolism is mixed fermentative and respiratory. Aerobic and
facultatively anaerobic. The G+C content of DNA probably 57 to 60 moles %. Widely
distributed in nature.
4. Rigid, helical cells. 0.25 to 1.7 m im diameter, with less than one turn to many turns.
Intracellular granules of polyhydroxibutyrate present in most species. Motile by means of
polar polytrichous flagella. Gram negative. Chemoorganotrophs, having a strictly
respiratory metabolism with oxygen as the terminal electron acceptor. A few species can
grow anaerobically with nitrate. Found in fresh and salt waters containing organic matter.
The G+C content of DNA ranges from 38 to 65 moles %.
5. Nonmotile rods, Gram negative, not encapsulated. Grow well on nutrient media and do not
need special growh factors. Cannot use citrate or malonate as sole carbon source. Growth
inhibited by KCN. H2S is not produced. Glucose and other carbohydrates are fermented with
production of acid but not gas.
6. Cells spherical to ovoid, less than 2 m in diameter, occurring in pairs or chains when grown
in liquid media. Occasional motile strains in serological group D. gram positive.
Chemoorganotrophs: Metabolism fermentative. Facultative anaerobes. Minimal nutritional
requirements are generally complex (but variable). Temperature optimum about 370C. The
G+C content of the DNA ranges from 33 to 42 moles %.
7. Cocci. 0.6 to 1.0 um in diameter, occurring singly but often pairs with adjascent sides
flattened. Division in two planes at right angles to each other sometimes resulting in the
formation of tetrads. No formation of Endospores; nonmotile. Capsules and fimbriae may
be present. Gram negative. Chemoorganotrophic. Few carbohydrates utilized. Aerobic or
facultative anaerobic. Temperature optimum about 37 0C. Parasites of mucose membranes
of mammals. The G+C content of the DNA ranges from 47 to 52 moles %.

11
 ‫מעבדה מס' ‪3‬‬
‫שיטות לספירת חיידקים‬

‫מטרות‪ :‬הכרות עם שיטות לספירת חיידקים‪.‬‬

‫שאלות הכנה‬

‫שאלות מידע‪:‬‬ ‫‪.1‬‬

‫נפלומטר (‪ :)Nephelometer‬כיצד הוא עובד? מה השוני בינו לבין ‪?Photometer‬‬ ‫‪.1‬‬
‫מהו פיזור אור (‪ ,)Light scattering‬ומהי בליעת אור (‪?)Absorption‬‬ ‫‪.2‬‬
‫מה נקלט ע"י העין האנושית כעכירות (‪ ? )Turbidity‬ומה לדעתך מגבלותיה?‬ ‫‪.3‬‬
‫האם ניתן לקרוא עכירות גם ע"י קולורימטר (‪ )Colorimeter‬וספקטרופוטומטר (‬ ‫‪.4‬‬
‫‪?)Spectrophotometer‬‬
‫מהו תחום האור הנראה ואיזה מבין התמיסות‪/‬תרחיפים הבאים יראו עכירות ו‪/‬או בליעה בתחום זה?‬ ‫‪.5‬‬
‫תרחיף חיידקים חסרי צבע‪ ,‬תרחיף חיידקים אדומים‪ ,‬תמיסת ‪ 2%‬מלח בישול‪ ,‬תמיסת המוגלובין‪ ,‬תרחיף‬
‫נגיפי פוליו‪.‬‬
‫כיצד ניתן לספור חיידקים בתא ספירה (‪ ,)Bacterial cell counter‬מידותיו הם‪ :‬שטח משבצת‬ ‫‪.6‬‬
‫‪ mm2 0.0025‬וגובה הטיפה ‪ ,mm 0.02‬ולחשב מכך את ריכוז החיידקים במ"ל ? מדוע צריך להיות‬
‫הבדל בין תא לספירת חיידקים ותא לספירת דם (‪?)Hemocytometer‬‬
‫כיצד סופרים חיידקים ומהם היתרונות והחסרונות של כל אחת מהשיטות הבאות‪:‬‬ ‫‪.7‬‬
‫עכירות‪.‬‬ ‫‪)1‬‬
‫ספירה מיקרוסקופית (‪.)Microscopical counting‬‬ ‫‪)2‬‬
‫ספירה חיה (‪ )Viable counting‬ע"י ספירת מושבות (‪.)Colony forming units‬‬ ‫‪)3‬‬

‫שאלות יישום‪:‬‬ ‫‪.2‬‬

‫האם מדידות עכירות על ידי ספקטרופוטומטר‪ /‬קולורימטר של אותו תרחיף באורכי גל שונים ייתן אותן‬ ‫‪.1‬‬
‫תוצאות ? אם לא‪ ,‬מדוע וכיצד ניתן לבדוק זאת?‬
‫האם קיים יחס ישר בין ריכוז החיידקים לבין העכירות אותה הם מראים? כיצד ניתן לבדוק זאת? האם‬ ‫‪.2‬‬
‫יחס זה יהיה קבוע לגבי כל החיידקים‪ ,‬או ספציפי לגבי כל חיידק ? האם יתכן שוני ביחס לאותו חיידק?‬
‫באיזה מצע היית בוחר לספירה חיה של חיידק ידוע ושל חיידק לא ידוע‪ ,‬מדוע?‬ ‫‪.3‬‬
‫המהולים הסדרתיים הסטנדרטיים הנהוגים לספירה חיה הם‪ 1:10 :‬ו‪ .1:100-‬מהמהולים המתאימים‬ ‫‪.4‬‬
‫נהוג לזרוע בין ‪ 0.05‬ל‪ 0.2-‬מ"ל לצלחת מצע מוצק‪ .‬טווח נפחים זה מוכתב‪ ,‬מאחר ונפח גדול מדי לא‬
‫ייספג במצע המוצק‪ ,‬ואילו נפח קטן מדי לא יתפזר טוב‪ .‬אם נתון לך תרחיף חיידקים בריכוז משוער של‬

‫‪12‬‬
 ‫‪ 2x108‬חיידקים למ"ל‪ ,‬איזה מיהולים תעשה ומאיזה מהם תזרע ואיזה נפח תיקח על מנת לקבל כ‪20-‬‬
‫מושבות וכ‪ 200-‬מושבות חיידקים על צלחת ?‬
‫כיצד ניתן לבצע מיהולים אלה‪ ,‬אם הנפח הסופי המתאים לערבול במבחנה הוא ‪ 5‬מ"ל ?‬
‫מה יהיה מספר החיידקים הממוצע במשבצת של תא ספירה סטנדרטי לחיידקים‪ ,‬שמידותיו נתונות‬
‫בשאלת מידע ו' שיתקבלו בספירה מיקרוסקופית של תרחיף החיידקים ( ‪2x108‬חיידקים למ"ל) הנתון?‬

‫מהלך העבודה‬
‫‪ .1‬נתון‪ 3 :‬מ"ל של תרחיף חיידקים שטופים ומרוכזים של ‪ Escherichia coli‬משלב גידול האקספוננציאלי‬
‫(החיידקים לניסוי גודלו תוך טלטול במצע ‪ LB‬נוזלי)‪.‬‬
‫בצע סדרת מהולים‪ 1:256 ,1:128 ,1:64 ,1:32 ,1:16 ,1:8 ,1:4 ,1:2 ,‬על ידי סדרת העברות של ‪ 2‬מ"ל‬
‫מהתרחיף למבחנה עם ‪ 2‬מ"ל סליין (מיהול ‪ .)1:2‬בין המהולים ערבב היטב במערבל‪ .‬ממבחנה זו העבר ‪1‬‬
‫מ"ל למבחנה נוספת עם ‪ 1‬מ"ל סליין (מהלת ‪ .)1:4‬המשך כך עד למיהול של ‪ .1:256‬קרא כל אחת‬
‫מהמבחנות‪ ,‬כולל התרחיף המקורי‪ ,‬במכשיר הספקטרופוטומטר באורכי גל שונים המסומנים על גבי מסנני‬
‫האור‪.‬‬
‫שים לב ! ! לפני תחילת הקריאה יש לאפס את המכשיר בעזרת קיובטה עם סליין‪ .‬הקריאות של סדרת‬
‫המהולים תעשנה בקיובטות חד‪-‬פעמיות לכל מהול‪ .‬במידה וקריאות נעשות באותה מבחנה נתחיל‬
‫מהמיהול הגבוה (‪ )1:256‬עד לתרחיף המקורי‪ .‬מדוע ?‬
‫‪ .2‬מהתרחיף שנמהל ל‪ 1:32 -‬או ‪ 1:64‬יש להעביר דגימה לתא ספירת החיידקים‪ .‬בצע ספירה מיקרוסקופית‬
‫וחשב את ריכוז החיידקים בתרבית המקורית‪.‬‬
‫א‪ .‬מדוע להשתמש במהולים אלה דווקא ?‬
‫ב‪ .‬האם יש חשיבות לדיוק בנפח המועבר לספירה ?‬
‫ג‪ .‬האם יש צורך להשגיח על עבודה בתנאים סטריליים במהלך הספירה המיקרוסקופית ?‬
‫‪ .3‬לפי הריכוז שהתקבל מהספירה המיקרוסקופית‪ ,‬יש לתכנן סידרת מיהולים לספירה חיה‪.‬‬

‫זכור ! !‬
‫א‪ .‬יש לזרוע ‪ 0.1‬מ"ל על גבי כל צלחת מצע מוצק‪.‬‬
‫ב‪ .‬מספר המושבות הרצוי על גבי הצלחות ינוע בין מושבות בודדות למאות מושבות‪.‬‬
‫ג‪ .‬המהולים פי ‪ 10‬ופי ‪ 100‬יעשו על ידי העברת ‪ 0.5‬מ"ל ל‪ 4.5 -‬מ"ל ו‪0.05 -‬‬
‫ל‪ 4.95-‬מ"ל‪ ,‬בהתאמה‪.‬‬

‫‪13‬‬
 ‫שאלות סיכום‬
‫‪ .1‬כיצד משתמשים בעכירות כשיטה לספירת חיידקים ?‬
‫___________________________________________________________________‬
‫‪ .2‬הצג את התוצאות שקיבלת בסעיף ‪ 1‬בצורה גראפית‪.‬‬
‫‪ .3‬מתוך ניתוח התוצאות‪ ,‬קבע איזה אורך גל מהשלושה שנבדקו עדיף לקביעת עכירות חיידקי ‪ E. coli‬כמדד‬
‫לריכוזם‪ .‬מהם השיקולים שהנחו את בחירתך?‬
‫‪ .4‬חשב את ריכוז החיידקים בתרבית המקור לפי תוצאות הספירה החיה‪.‬‬
‫‪ .5‬השווה בין תוצאות הספירה החיה לספירה המיקרוסקופית והסבר במידה וישנם הבדלים‪.‬‬

‫מקורות‪:‬‬
‫‪" .1‬מושגים על אור וקביעתו" ‪ -‬מהקורסים לכימיה כללית וספרי פיזיקה‬
‫‪ .2‬מושגים בקטריולוגיים מהסעיפים הדנים ב‪ Growth Measuring of .... :‬בספרי המיקרוביולוגיה‬
‫המומלצים‪Brock et al. Biology of Microorganisms, .Stanier et al. Microbial World :‬‬

‫‪14‬‬
 ‫מעבדה מס' ‪4‬‬
‫עקומת גידול מנתי של חיידקים‬

‫שאלות הכנה‬

‫שאלות מידע‪:‬‬ ‫‪.1‬‬

‫א‪ .‬מהם השלבים שעוברת אוכלוסיית חיידקים בגידול מנתי (‪,)Batch culture‬‬
‫מתחילת הגידול ועד מותה‪ .‬הגדר והסבר את הדמיון וההבדלים ביניהם‪.‬‬
‫ב‪ .‬איזו הצגה גראפית תאפשר אבחנה בין ארבעת שלבי הגידול? צייר סכמאטית עקומת גידול שמניחה‬
‫עכירות התחלתית של ‪ 0.05‬יח' ‪ ,OD‬תקופת פיגור (‪ )Lag period‬של ‪ 1‬שעה‪ ,‬זמן דור (‪Generation‬‬
‫‪ )time‬של ‪ 1‬שעה‪ ,‬וכניסה לתקופת "עמידה" (‪ )Stationary phase‬בעכירות של ‪ 3.00‬יח' ‪.OD‬‬
‫ג‪ .‬איזה פקטורים גורמים להפסקת הגידול בתרבית וכניסה למצב עמידה?‬
‫ד‪ .‬מנה גורמים שונים המשפיעים על קצב הגידול של אוכלוסיית חיידק מסוים‪.‬‬

‫שאלות יישום‪:‬‬ ‫‪.2‬‬

‫א‪ .‬במעקב אחר עקומת גידול מנתי של תרבית חיידקים משתמשים במצע נוזלי ולא במצע מוצק‪ -‬מדוע?‬
‫ב‪ .‬מדוע יש לטלטל את תרבית החיידקים במהלך הניסוי?‬
‫ג‪ .‬מדוע משתמשים בעכירות כשיטת הספירה בניסוי זה? מה הפרשי הזמן הרצויים לקביעת העכירות?‬
‫האם ההפרשים יהיו שווים בחיידקים שונים ובתרביות של אותו חיידק במצעים שונים?‬
‫ד‪ .‬מדוע יש להשתמש גם בספירה חיה במהלך ניסוי זה? כיצד ניתן לכוון את המיהול הרצוי לספירה החיה‬
‫בניסוי זה?‬
‫ה‪ .‬מה צריכה להיות התרבית שתשמש לזריעה בניסוי זה (מצע‪ ,‬תנאים ושלב הגידול) בכל שלבי הגידול של‬
‫התרבית?‬
‫ו‪ .‬מה צריך להיות ריכוז תרבית הזריעה ונפח הזריעה היחסי‪ ,‬כדי שניתן יהיה לעקוב אחר עקומת הגידול‬
‫בכל שלביה?‬

‫מהלך הניסוי ‪ -‬קבוצת בוקר‬

‫‪ .1‬איפוס מכשיר הספקטרופוטומטר עם קיוותה המכילה מים או סליין‪.‬‬
‫‪ .2‬קביעת הבליעה של המצע בלבד‪.‬‬
‫‪ .3‬יש לחשב את נפח הזריעה (‪ )V1‬מתרבית בשלב העמידה בעכירות ‪ C1‬לתוך נפח מצע ‪ V2‬כדי לקבל‬
‫עכירות סופית של ‪ ,OD 0.05‬יש למדוד את העכירות לאחר הזריעה= זמן ‪ ,0‬ולהתחיל את הגידול‬
‫בטלטול (‪ 200‬תנודות לדקה) באמבט ב‪:370C -‬‬
‫תרבית במצע ‪:LB‬‬

‫‪15‬‬
 ‫בדיקת עכירות בכל רבע שעה‪ .‬מדוע? (לרישום תשתמש בדף שבעמוד ‪)20‬‬ ‫א‪.‬‬
‫ספירה חיה בזמנים ‪ 15‬ו‪ 100 -‬דקות מהזריעה‪.‬‬ ‫ב‪.‬‬
‫תרבית במצע ‪:M9‬‬
‫בדיקת עכירות כל חצי שעה‪.‬‬ ‫א‪.‬‬
‫ספירה חיה בסוף המעבדה‪.‬‬ ‫ב‪.‬‬
‫את התוצאות יש לערוך בצורה גרפים של עכירות כנגד זמן על נייר חצי‪-‬לוגריתמי (ראה דף האחרון‬
‫בחוברת) וב‪.Excel -‬‬

‫כל הקריאות תעשנה באותו מכשיר ספקטרופוטומטר !!!‬ ‫שים לב !!‬

‫שאלות סיכום‪:‬‬
‫‪ .1‬תאר בצורה גרפית באמצעות תוכנת ‪( Excel‬תצורה ליניארית ולוגריתמית) את גידול החיידק ‪E. coli‬‬
‫(עכירות כתלות בזמן)‪.‬‬
‫‪ -‬חשב זמן דור של ‪ E. coli‬במצעים הנוזליים השונים‪ ,‬מתוך גרף חצי לוגריתמי‪.‬‬
‫‪ .2‬אם קיימים הבדלים בזמני הדור ובגידול ‪ E. coli‬במצעים השונים‪ ,‬הסבר‪.‬‬
‫‪ .3‬השווה את העכירות המקסימלית אליה הגיע ‪ E. coli‬במצעים הנוזלים השונים‪ .‬אם קיימים הבדלים‪ ,‬הסבר‪.‬‬
‫‪ -‬האם אפשרי שהעכירות המקסימלית אליה מגיע חיידק אחר במצע ‪ LB‬נוזלי תהיה שונה מזו של ‪?E. coli‬‬
‫הסבר‪.‬‬
‫‪ .4‬האם הבחנת בתקופת לג (‪ )lag‬בניסוייך? (אם כן‪ ,‬או לא) הסבר‪.‬‬
‫‪ . 5‬האם העכירות מקיימת יחס ישר לריכוז החיידקים החיים ? (נתח לפי תוצאות המעבדה) העזר ע"י קביעה של‬
‫פקטור העכירות (יחס ריכוז החיידקים לעכירות)‪.‬‬
‫א‪ .‬האם אותו יחס של עכירות למספר החיידקים ישמר בכל שלבי עקומת הגידול? נמק‪.‬‬
‫ב‪ .‬השווה פקטור עכירות של ‪ E. coli‬במצעים השונים‪ .‬אם הפקטור שונה‪ ,‬הסבר‪.‬‬
‫ג‪ .‬האם יתכן פקטור עכירות שונה בתרביות של חיידקים מאותו מין? הסבר‪.‬‬
‫ד‪ .‬מה המשמעות הפיסיקלית של פקטור עכירות?‬
‫‪ .6‬ענו על השאלות לתרגיל חלוקת החיידקים המצורף בעמ' ‪.19‬‬

‫‪16‬‬
 ‫חלוקת חיידקים‬

‫דוֹגמה‪ :‬לכל חיידק חי צריך להיות כרומוזום מושלם אחד לפחות‪.‬‬

‫מכאן שצריכה להיות התאמה בין סיום חלוקת הכרומוזום לחלוקת החיידק (יצירת המחיצה)‪ ,‬שהרי אחרת לא‬
‫ישמרו הצאצאים על תכונות ההורה‪.‬‬

‫א‪ .‬זמן הכפלת כרומזום שלם של ‪ E. coli‬הוא תמיד ‪ 40‬דקות‪.‬‬ ‫ממצאים‪:‬‬

‫ב‪ .‬זמן יצירת מחיצה מושלמת ב‪ E. coli -‬הוא לפחות ‪ 20‬דקות‪.‬‬
‫מכאן שחיידק לא מתחלק (שמקורו "משלב העמידה" ‪ )stationary‬דורש‬
‫לפחות ‪ 60‬דקות לחלוקה ראשונה‪.‬‬
‫כיצד??‬ ‫ג‪ .‬חיידק ‪ E. coli‬במצע עשיר מסוגל להתחלק כל ‪ 20‬דקות‪.‬‬ ‫אבל !!‬

‫לפי הדוֹגמה הנ"ל צריך החיידק להשלים הכפלת כרומוזום כל "זמן דור" (‪ 20‬דקות לפי ממצא ג')‪ .‬כדי לאפשר מצב‬
‫כזה‪ ,‬צריכה להתחיל הכפלת כרומוזום כל ‪ 20‬דקות (זמן דור)‪ .‬מאחר וזמן זה קצר מ‪ 60-‬דקות‪ ,‬הרי חייב כרומוזום‬
‫להתחיל בהכפלה נוספת עוד לפני סיום ההכפלה הראשונית‪ .‬יוצא מכאן שדרושה התאמה בין "זמן הדור" וזמני‬
‫ההתחלה של הכפלת הכרומוזום‪.‬‬

‫זמן דור מוגדר כ‪ -‬הזמן הקבוע הדרוש לגידול מסת תרבית החיידקים פי שתיים בתקופת הגידול האקספוננציאלי‪.‬‬
‫מכאן שצריך להיות תיאום בין הגדלת מסת החיידק (או נפחו בהנחה שצפיפותו קבועה)‬
‫פי ‪ ,2‬ותחילת ההכפלה של כרומוזום החיידק‪.‬‬
‫בהסתמך על כל הנ"ל ניתן ליצור טבלה שתעקוב אחר גידול חיידק ‪ E. coli‬כדלהלן‪:‬‬

‫‪17‬‬
 ‫סוף של ה‪Lag -‬‬ ‫שלב ה‪Exponential growth)Log (-‬‬
‫‪’0‬‬ ‫‪’20‬‬ ‫‪’40‬‬ ‫‪’60-‬‬ ‫‪’60+‬‬ ‫‪’80-‬‬ ‫‪’80+‬‬ ‫‪’100-‬‬ ‫‪’100+‬‬
‫כרומוזום‬

‫נפח‬ ‫‪Vo‬‬ ‫‪Vi‬‬ ‫‪2Vi‬‬ ‫‪4Vi‬‬ ‫‪8Vi‬‬ ‫‪4Vi‬‬ ‫‪8Vi‬‬ ‫‪4Vi‬‬ ‫‪8Vi‬‬ ‫‪4Vi‬‬
‫מספר‬ ‫‪1‬‬ ‫‪*1‬‬ ‫‪*1/2*1‬‬ ‫(‪x2)*1/2*1‬‬ ‫(‪x4)*1/2*1‬‬ ‫(‪x2)*1/2*1‬‬ ‫(‪x4)*1/2*1‬‬ ‫(‪x2)*1/2*1‬‬ ‫(‪x2)*1/2*1‬‬ ‫(‪x2)*1/2*1‬‬
‫התחלה‬ ‫‪I‬‬ ‫‪II‬‬ ‫‪III‬‬ ‫‪IV‬‬ ‫‪V‬‬ ‫‪VI‬‬
‫סיום‬ ‫‪I‬‬ ‫‪II‬‬ ‫‪III‬‬ ‫‪IV‬‬
‫התחלה‬ ‫‪I‬‬ ‫‪II‬‬ ‫‪III‬‬ ‫‪IV‬‬
‫מחיצה‬

‫סיום‬ ‫‪I‬‬ ‫‪II‬‬ ‫‪III‬‬

‫חלוקה‬

‫כניסה ל‪stationary -‬‬ ‫שלב ה‪stationary -‬‬

‫והפסקת הגידול (‪)#‬‬
‫‪’100+‬‬ ‫‪’120-‬‬ ‫‪’120+‬‬ ‫‪’140-‬‬ ‫‪’140+‬‬ ‫‪’160-‬‬ ‫‪’160+‬‬
‫כרומוזום‬

‫נפח‬ ‫‪4Vi‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪8Vi‬‬ ‫‪4Vi‬‬
‫‪-‬‬
‫‪4Vi‬‬
‫‪-‬‬
‫‪2Vi‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬
‫‪2Vi‬‬ ‫‪Vi‬‬
‫‪-‬‬

‫מספר‬ ‫(‪x2)*1/2*1‬‬ ‫(‪x4)11/2‬‬ ‫(‪x2)11/2‬‬ ‫(‪x4)1‬‬ ‫(‪x2)1‬‬ ‫(‪x2)1‬‬ ‫‪1‬‬

‫התחלה‬
‫סיום‬ ‫‪V‬‬ ‫‪VI‬‬

‫התחלה‬ ‫‪V‬‬ ‫‪VI‬‬

‫מחיצה‬

‫סיום‬ ‫‪IV‬‬ ‫‪V‬‬ ‫‪VI‬‬

‫חלוקה‬

‫‪-‬‬
‫‪ #‬הפסקת הגידול של החיידק נעשתה בין ‪ 100‬ל‪ 120-‬דקות‪ .‬נפח החיידק ב '‪ 120‬יהיה לכן ‪8Vi‬‬
‫(פחות מ‪ ) 8Vi-‬בהתאם לזמן בו הפסיק החיידק לגדול‪.‬‬
‫‪ Vi‬הנפח בו מופעלת מערכת הכפלת הכרומוזום‪.‬‬ ‫סימונים‪:‬‬
‫‪ Vo‬נפח החיידק "בשלב העמידה" – ‪.stationary‬‬
‫* התחלת הכפלה בכרומוזום ‪.initiation -‬‬

‫שאלות (לתרגיל)‪:‬‬
‫‪ .1‬להכין טבלאות גידול מפורטות כנ"ל לחיידק ‪ E. coli‬הגדל בקצב גידול של ‪ 30‬ו‪ 40-‬דקות לדור‪.‬‬
‫‪ .2‬להכין עקומות שיעקבו אחר השינוי בפקטור העכירות של תרביות החיידקים במהלך עקומות הגידול‬
‫בהנחה שהן סינכרוניות (ז‪.‬א‪ .‬כל החיידקים גדלים ומתחלקים בו זמנית)‪.‬‬

‫עקומת גידול של ‪E. coli‬‬

‫‪18‬‬
‫תרבית במצע ‪LB‬‬ ‫תרבית במצע ‪M9‬‬

‫‪19‬‬
 ‫ספירה חיה*‬ ‫מס' המכשיר‬ ‫ספירה חיה*‬ ‫מס' המכשיר‬
‫מס' מושבות‬ ‫מיהול‬ ‫‪ODnet‬‬ ‫‪OD‬‬ ‫זמן‬ ‫שעה‬ ‫מס' מושבות‬ ‫מיהול‬ ‫‪ODnet‬‬ ‫‪OD‬‬ ‫זמן‬ ‫שעה‬

‫*לפני דגימה לספירה חיה‪ ,‬יש לבדוק עכירות‬

‫מעבדה מס' ‪5‬‬

‫‪20‬‬
 ‫השפעת גורמים פיסיקליים וכימיים על חיידקים‬

‫מטרות‪:‬‬
‫‪ .1‬לימוד השפעת גורמים פיסיקליים שונים על חיות חיידקים‪.‬‬
‫‪ .2‬לימוד מהי עקומת הישרדות ((‪.Survival Curve‬‬
‫‪ .3‬הכרת גופים ברי‪-‬קיימא – ספורות (‪.)spores‬‬
‫‪ .4‬בידוד מוטנטים עמידים לסטרפטומיצין (‪.)streptomycine resistant‬‬
‫‪ .5‬קביעת תדירות המוטציה‪ ,‬המקנה עמידות לסטרפטומיצין (‪.)mutant frequency‬‬
‫‪ .6‬הכרת שיטה לבידוד מוטנטים בלתי תלויים (‪.)genetically independent mutants‬‬
‫‪ .7‬בדיקת רגישות חיידקים שונים לחומרים אנטיביוטיים‪.‬‬
‫‪ .8‬בידוד חיידק היוצר אנטיביוטיקה‪.‬‬
‫‪ .9‬הכרת השפעתן של אנטיביוטיקות על גידול חיידקים‪.‬‬

‫שאלות הכנה‪:‬‬
‫שאלות מידע‪:‬‬
‫‪ .1‬מדוע מתים חיידקים בחום ?‬
‫‪ .2‬הגדר ותן דוגמאות לסוגי החיידקים הבאים‪.Thermophile, Mesophile, Psychrophile :‬‬
‫‪ .3‬הגדר את המושגים הבאים והסבר כיצד הם נקבעים‪:‬‬

‫)‪.Decimal Reduction Time (D value‬‬

‫)‪.Thermal Death Time (TDT‬‬
‫)‪.Thermal Death Point (TDP‬‬

‫‪ .4‬הגדר והסבר את המושגים הבאים‪:‬‬

‫‪Thermotolerant,‬‬ ‫‪Osmophile,‬‬
‫‪Halotolerant,‬‬ ‫‪Acidophile,‬‬
‫‪Barophile,‬‬ ‫‪Halophile‬‬

‫‪ .5‬אילו מנגנונים מאפשרים לחיידק להיות תרמופילי ? ואילו מאפשרים לו להיות אוסמאופילי?‬
‫‪ .6‬מהן ספורות? מה מקנה לספורות עמידות לחום? באילו חיידקים מופיעות הספורות ומאיזו קבוצת גראם?‬
‫מה היתרונות שהן מקנות? מהי צורתן המיקרוסקופית?‬
‫‪ .7‬מצא בספרות וסרטט את המבנה הכימי של החומצה האמינית אלאנין ושל האנטיביוטיקה פנצילין ‪-‬‬
‫הדגש את הטבעת הבטא – לקטמית‪.‬‬
‫‪ .8‬מהו ההבדל בין פעילות בקטריוסטטית ופעילות בקטריוצידית של חומר ? מהי פעילות בקטריוליטית?‬
‫‪ .9‬מהו מנגנון הפעולה של כל אחד מהחומרים המוזכרים בסעיף ז' ? האם יפעלו ובאיזו צורה על תאים‬
‫אנימליים?‬
‫‪21‬‬
 ‫‪ .10‬מהו ההבדל בין ספרופלסטים לפרוטופלסטים?‬
‫‪ .11‬הגדר את המושגים הבאים‪:‬‬
‫מוטציה ספונטאנית (‪,) Spontaneous Mutation‬‬
‫מוטנטים בלתי תלויים (‪,)Genetically Independent Mutants‬‬
‫קצב מוטציה (‪,)Mutation Rate‬‬
‫תדירות מוטנטים (‪.)Mutant Frequency‬‬
‫‪ .12‬מהו מנגנון המוטגניות של ניטרוזוגואנידין ?‬

‫שאלות ישום‪:‬‬
‫‪ .1‬לפניך שלוש מבחנות לא מסומנות‪ ,‬במבחנה אחת חיידקים מזופילים‪ ,‬במבחנה שנייה חיידקים תרמופילים‪,‬‬
‫ובשלישית חיידקים תרמוטולרנטיים‪ .‬הצע ניסוי או סדרת ניסויים על מנת להבחין ביניהם‪.‬‬
‫‪ .2‬כיצד תראה עקומת תמותה של כלל החיידקים בתערובת המכילה ‪ 108*8‬חיידקים למ"ל מסוג אחד ו‪*1 -‬‬
‫‪ 108‬חיידקים למ"ל מסוג שני כשהראשון בעל ‪ D value‬של ‪ 5‬דקות והשני בעל ‪ D value‬של ‪ 45‬דקות?‬
‫סרטט גרף חצי לוגריתמי לתיאור מדויק של העקומה ועקוב במשך ‪ 60‬דקות‪ .‬הסבר מדוע משתמשים‬
‫בגרף חצי לוגריתמי?‬

‫ניסויים‪:‬‬
‫חומרים‪:‬‬
‫‪ .1‬מצע ‪ LB‬נוזלי‪.‬‬
‫‪ .2‬צלחות ‪. LB‬‬
‫‪ .3‬צלחות ‪ LB‬המכילות סטרפטומיצין ‪.µg/ml 50‬‬
‫‪ .4‬דסקיות נייר ספוגות באנטיביוטיקה‪.‬‬
‫‪ .5‬אגר רך (‪ :)soft-agar‬מצע ‪ LB‬בתוספת ‪ 0.7%‬אגר‪.‬‬
‫‪ .6‬תמיסת מלח ‪.NaCl 0.9%‬‬

‫מהלך הניסויים‪:‬‬
‫תגובת חיידקים לאנטיביוטיקה‪:‬‬
‫‪22‬‬
 ‫‪ .1‬השפעת חומרים אנטיביוטיים שונים על גידול חיידקים‪:‬‬
‫בדוק את בליעת הרקע של מצע הגידול המעוקר‪ .‬זרע ‪ 15‬מ"ל של תרבית ‪ E.coli‬משלב גידול אקספונינצאלי‬
‫לבקבוקי גידול‪ ,‬המכילים ‪ 15‬מ"ל מצע מעוקר‪.‬‬
‫הוסף פניצילין (ריכוז סופי ‪ )100µg/ml‬לבקבוק אחד‪ .‬ריכוז תמיסת מקור ‪.10mg/ml‬‬
‫הוסף כלורמפניקול (ריכוז סופי ‪ )100µg/ml‬לבקבוק שני‪ .‬ריכוז תמיסת מקור ‪.10mg/ml‬‬
‫הוסף פנצילין (ריכוז סופי ‪ )10µg/ml‬לבקבוק השלישי‪ .‬ריכוז תמיסת מקור ‪.10mg/ml‬‬
‫הוסף כלורמפניקול (ריכוז סופי ‪ )10µg/ml‬לבקבוק הרביעי‪ .‬ריכוז תמיסת מקור ‪.10mg/ml‬‬
‫הבקבוק החמישי ישמש לביקורת‪ ,‬לצורך זה מה לדעתך צריך להוסיף אליו ?‬
‫קבע עכירות מדי ‪ 15‬דקות‪.‬‬
‫יש לקבוע את ריכוז החיידקים (באמצעות ספירה חיה) בתחילת הניסוי ובסופו בכל אחד מהבקבוקים‪.‬‬ ‫‪-‬‬
‫כל קבוצה תעקוב אחר ניסוי ביקורת אחד ושני ניסויי טיפול באנטיביוטיקה‪.‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪ .2‬בידוד מוטנטים (בלתי תלויים) עמידים לסטרפטומיצין‪:‬‬

‫כל זוג מקבל ‪ 10‬מ"ל תרבית ‪ E.coli‬ב‪ O.D. 0.7 (660nm)-‬שמקורה ממושבה בודדת (לכל זוג תרבית ממושבה‬
‫אחרת)‪ .‬סרכז את התרבית בצנטריפוגת שולחן ושפה את הנוזל העליון‪.‬‬
‫הרחף את משקע החיידקים ב‪ 0.15-‬מ"ל של תמיסת מלח סטרילית‪.‬‬
‫זרע דוגמה של ‪ 0.1‬מ"ל מהתרחיף המרוכז על צלחת ‪ LB‬המכילה סטרפטומיצין‪.‬‬
‫הסבר‪ :‬מדוע מתחילים הגידול ממושבה בודדת ? מדוע נעשה גידול המושבות ב ‪ 10‬מ"ל מצע נוזלי? מדוע רוכזו‬
‫החיידקים מהתרבית? ומדוע הורחפו מחדש בנפח מינימאלי?‬
‫קבע את מספר החיידקים החיים שזרעת (מדוע? באילו מהולים תשתמש?)‪.‬‬
‫אחרי הדגרה במשך לילה ב‪ ,37ºC -‬יש לבודד מושבה יחידה‪.‬‬

‫‪ .3‬ספקטרום רגישות של חיידקים שונים לחומרים אנטיביוטיים‪:‬‬

‫פזר ‪ 0.1‬מ"ל של כל אחת מתרביות החיידקים הנתונים‪ ,‬בצורה סטרילית‪ ,‬על גבי צלחת ‪ .LB‬המתן כחצי שעה‪.‬‬
‫מדוע ?‬
‫הנח בצורה סטרילית (באמצעות פינצטה מחוטאת) ע"ג משטח החיידקים דסקיות נייר סופג המכילות חומרים‬
‫אנטיביוטיים שונים‪ .‬אל תשכח ביקורת – דסקית שאינה מכילה אנטיביוטיקה‪ .‬לאחר ‪ 24‬שעות הדגרה ב‪37ºC -‬‬
‫מדוד את רדיוס עיכוב הגידול‪.‬‬

‫‪ .4‬יצירת חומרים אנטיביוטיים ע"י חיידקים‪:‬‬

‫‪23‬‬
 ‫לפניך צלחת בה זרוע פס מרכזי אם חיידקי ‪ Pseudomonas‬ובמאונך לו ‪ 3‬פסים נוספים עם‬
‫חיידקים שונים (שגדלו במשל לילה ב‪ . )37ºC -‬זרע בעזרת מחט בקטריולוגית את אותם שלושת‬
‫החיידקים מהתרחיפים שלפניך בחצי הצלחת הפנוי כהמשך לפסים המאונכים מבלי לגעת בקו‬
‫הזריעה של ה‪ .Pseudomonas -‬בדוק את הגידול לאחר ‪ 24‬שעות הדגרה ב‪.37ºC -‬‬

‫‪ .5‬בידוד וזיהוי חיידקים יוצרי אנטיביוטיקה‪:‬‬

‫בידך צלחת מצע ‪ LB‬מוצק שעל גביה מושבות של חיידקי חול שגדלו במשך ‪ 48‬שעות ב‪ .37ºC -‬התרביות‬
‫התקבלו מהרחפת קורט של חול ב‪ 1-‬מ"ל תמיסת מלח ופיזור ‪ 0.1‬מ"ל מהתרחיף על הצלחת‪ .‬הוסף ‪ 0.1‬מ"ל של‬
‫חיידקים לתוך ‪ 4.5‬מ"ל אגר רך מותך ופזר את התרחיף מעל התרביות שעל הצלחת‪ .‬באיזה חיידק כדאי‬
‫להשתמש בניסוי זה? מדוע נשתמש באגר רך ולא במקל דריגלסקי על מנת לפזר את החיידקים? בדוק לאחר‬
‫‪ 24‬שעות הדגרה ב‪ 37ºC, -‬האם נוצרו אזורים נקיים מחיידקים?‬

‫‪ .6‬תמותת חיידקים שונים כתלות בזמן בטמפרטורות שונות‪ ,70 ,90( .‬ו‪:)50ºC-‬‬
‫לפניך תרביות של )‪ Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti‬ו‪ E.coli -‬בשלבי גידול (‪ ) log‬ובשלבי‬
‫העמידה (‪ .)stationery‬מבחנה ראשונה תועבר לחימום באמבט בטמפ' שתקבע ע"י המדריך‪ ,‬בזמן שיוגדר כזמן‬
‫אפס של הניסוי‪ .‬הטיפול בתרבית שנייה יתחיל בהפרש זמן מוגדר מתחילת הניסוי‪ .‬בזמנים שונים מתחילת‬
‫הטיפול תוצא דגימה באמצעות מחט בקטריולוגית מעוקרת‪ ,‬ותזרע על פני צלחת ‪ LB‬מוצק המחולקת ל‪ 5-‬גזרות ‪.‬‬
‫זמני הזריעות יקבעו ע"י המדריך‪.‬‬

‫שאלות סיכום‪:‬‬
‫‪ .1‬מדוע תלויה תמותת החיידקים בטמפרטורת ובזמן החימום?‬
‫‪ .2‬השווה עקומת תמותה ונוסחת תמותה לעקומת גידול ולנוסחת קצב הגידול של חיידקים‪.‬‬
‫‪ .3‬כיצד משפיע גיל תרבית החיידקים על עמידותם לחום?‬
‫‪ .4‬מה ההבדל בין אנדוספורה לאקסוספורה?‬
‫‪ .5‬קרינה אולטרה סגולה (‪ )UV‬הורגת חיידקים‪ .‬מדוע? נמצא שיש חיידקים שמסוגלים להתפתח בתנאי‬
‫קרינה‪ .‬איזו מוטציה יכולה להקנות עמידות כזו?‬
‫‪ .6‬ברשותך תערובת המכילה את המיקרואורגניזמים ‪ ,E.coli B.subtilis‬ו‪Saccharomyces -‬‬
‫‪( cerevisiae‬שמר אפיה)‪ .‬הצע סדרת פעולות על מנת להעשיר את התערובת בכל אחד‬
‫מהמיקרואורגניזמים הנ"ל‪.‬‬
‫‪ .7‬כיצד תוכיח ש מושבות החיידקים שגדלו על פני הצלחת המכילה סטרפטומיצין הם אכן מוטנטים‬
‫עמידים לסטרפטומיצין?‬
‫‪ .8‬מדוע מושבות שונות שגדלו על אותה צלחת עם סטרפטומיצין אינן מייצגות מוטנטים בלתי תלויים?‬
‫האם קביעה זו נכונה תמיד?‬
‫‪ .9‬האם תוכל למצוא במעבדה זו מוטנטים עמידים לסטרפטומיצין שהינם בלתי תלויים במוטנטים‬
‫שבודדת ? כיצד ? מה תפקיד המוטנטים הבלטי תלויים בחקר המורכבות של התכונה?‬
‫‪24‬‬
 ‫‪ .10‬ממה נובעים ההבדלים ברגישות החיידקים לחומרים האנטיביוטיים השונים?‬
‫‪ .11‬נתח את עקומות הגידול של ‪ E.coli‬שהתקבלו בנוכחות פניצילין וכלורמפניקול והסבר‪.‬‬
‫________________________________________________________________‬
‫‪ .12‬חשב את תדירות המוטנטים הספונטאניים לעמידות לסטרפטומיצין ב‪ .E.coli -‬מה יתרונה של מוטציה‬
‫ספונטאנית על מוטציה מושרית במחקר ביולוגי?‬
‫‪ .13‬הכן טבלה של רגישות החיידקים הנתונים לאנטיביוטיקות השונות‪ .‬באילו גורמים ‪,‬נוסף למידת רגישות‬
‫החיידקים לתרופה‪ ,‬תלוי רדיוס ההריגה? (ניסוי ‪)3‬‬
‫‪ .14‬האם גילית חיידק יוצר אנטיביוטיקה בחיידקי החול? מה תפקיד החיידקים שהוספו באמצעות האגר‬
‫הרך לצלחת חיידקי החול? מה יהיו השלבים הבאים בתהליך של בידוד חיידק המייצר תרופה כנגד‬
‫מחלות חיידקים באדם ?‬
‫‪ .15‬האם החיידק ‪ Pseudomonas‬יוצר אנטיביוטיקה? הסבר את יחסי הגומלין בינו לבין החיידקים‬
‫האחרים ששמשו בניסוי זה‪ .‬האם קיים הבדל ביחסים אלו כאשר החיידקים נזרעים בוזמנית מאשר‬
‫כשהחיידקים נזרעים יום לאחר זריעת חיידקי ה‪ ?Pseudomonas-‬מדוע?‬

‫‪25‬‬
 ‫מעבדה מספר ‪6‬‬
‫מחזור גידול של פאז'ים‬
‫‪ .1‬מטרות‬
‫א‪ .‬לימוד מחזור החיים של בקטריופאז'‪.‬‬
‫ב‪ .‬השפעת הבקטריופאז'ים על המאכסנים שלהם‪.‬‬
‫ג‪ .‬קביעה איכותית של רגישות חיידקים לבקטריופאז'ים‪.‬‬

‫‪ .2‬שאלות הכנה‬
‫א‪ .‬מהם ההבדלים בין בקטריופאז'ים אלימים (‪ )Virulent‬ומתונים (‪?)Temperate‬‬
‫ב‪ .‬פרט מחזור חיים אלים של בקטריופאז' ‪.T4‬‬
‫ג‪ .‬מהו פלאק (‪ ,)Plaque‬כיצד הוא נוצר ומה קובע את גודלו?‬
‫ד‪ .‬מהי עקומת ‪?One Step Growth‬‬
‫ה‪ .‬מה ההבדל בין )‪ Plaque Forming Unit (PFU‬לבין ‪?Infective center‬‬
‫ו‪ .‬מנה את ההבדלים בין וירוס אאוקריוטי לבין בקטריופאז'‪.‬‬
‫ז‪ .‬חשב ותאר במדויק בעקומה מתאימה את השינויים בעכירות ובריכוזים של החיידקים‬
‫‪.‬‬ ‫החיים והפאז'ים ((‪ PFU‬בתרבית של ‪ E.coli‬בריכוז ‪ 108‬למ"ל שהודבקה ע"י ‪ 105‬למ"ל ‪.T4‬‬
‫נתון‪ :‬זמן דור של החיידק ‪ 20‬דק'; זמן מחזור של הפאז' ‪ 20‬דק'; גודל פריצה של הפאז' ‪.100‬‬
‫פרט מה ההנחות הנוספות שאתה מניח בכדי לאפשר את התיאור המדויק‪.‬‬

‫‪ .3‬חומרים‬
‫‪ )1‬מצע ‪ LB‬נוזלי‪.‬‬
‫‪ )2‬צלחות ‪.LB‬‬
‫‪ )3‬אגר רך ‪Soft Agar -‬‬

‫‪ .4‬מהלך הניסוי‬
‫א‪ .‬מחזור חיים ליטי של בקטריופאז' ‪ 4T‬בחיידקי ‪ – B E.coli‬עקומת מחזור אחד‪.‬‬
‫נתונים ‪ 12‬מ"ל של תרבית טרייה של חיידקי ‪ B E.coli‬בריכוז ‪ 2x108‬למ"ל בשלב‬
‫אקספוננציאלי‪.‬‬
‫הוסף בקטריופאז' ‪ T4‬ליחס מספרי סופי של ‪( 1:5‬פאז' ‪ :‬חיידק)‪ .‬מדוע?‬
‫טלטל קלות במשך ‪ 3‬דקות ב ‪.C37°‬‬
‫סרכז את החיידקים המודבקים במשך ‪ 6‬דקות במהירות ‪ rpm 4,000‬והרחק את הנוזל‬
‫העליון‪ .‬מדוע?‬
‫הרחף את המשקע שבמבחנה ב ‪ 12‬מ"ל ‪ LB‬והעבר את התרחיף לאלנמייר מעוקר וריק‪.‬‬
‫קבע את העכירות (‪ ,)nm 660‬הגדר נקודה זו כזמן ‪ 0‬של הגידול‪.‬‬

‫‪26‬‬
 ‫הוצא דגימה של ‪ 0.05‬מ"ל לתוך ‪ 4.95‬מ"ל סליין קר לסדרת מהולים ושמור אותה בקרח (זמן ‪.)0‬‬
‫הכנס את האלנמייר לאמבט מטלטל בטמפ' ‪.C37°‬‬
‫קבע שינוי העכירות בתרבית במרווחי זמן של ‪ 10‬דקות (או בהתאם לנקבע ע"י המדריך)‪.‬‬
‫הוצא במקביל דגימות לספירת בקטריופאז'ים בהתאם לטבלה המצורפת‪:‬‬
‫הסבר מדוע נבחרו מיהולים אלה לזריעה‪.‬‬

‫זמן‬ ‫מדידת‬ ‫מיהול‬

‫בדקות‬ ‫עכירות‬
‫‪10-2‬‬ ‫‪10-4‬‬ ‫‪10-5‬‬ ‫‪10-6‬‬ ‫‪10-7‬‬ ‫‪10-8‬‬

‫‪0‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול‬ ‫‪-‬‬

‫‪10‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול‬ ‫‪-‬‬

‫‪20‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪30‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫‪-‬‬ ‫זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול‬

‫‪40‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫‪-‬‬ ‫זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול‬

‫‪50‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬

‫‪60‬‬ ‫‪+‬‬ ‫מיהול‬ ‫מיהול‬ ‫‪-‬‬ ‫מיהול‬ ‫זריעה‪+‬מיהול זריעה‪+‬מיהול‬

‫‪70‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬

‫לאגר רך (‪ 4.5‬מ"ל) בטמפ' של ‪ C48-45°‬הוסף ‪ 0.1‬מ"ל מהמהולים המסומנים "זריעה" ובנוסף הוסף ‪ 0.2‬מ"ל‬
‫תרבית חיידקי ‪ B E.coli‬טרייה בריכוז ‪ 2x108‬למ"ל‪ .‬ערבב היטב ושפוך את כל התוכן על פני צלחת אגר ‪ ,LB‬פזר‬
‫את האגר הרך באופן שווה ע"י הטיית הצלחת‪ .‬לאחר שהאגר נקרש הפוך את הצלחת לצורך הדגרה‪.‬‬
‫הסבר מדוע משתמשים באגר רך ולמה מוסיפים את החיידקים הנוספים למבחנה‪.‬‬

‫‪4‬‬ ‫ב‪ ..‬רגישות חיידקים שונים לפאז' ‪T‬‬

‫פזר ‪ 0.1‬מ"ל של ‪ E.coli, Staphilococcus‬ו ‪ Bti‬על גבי צלחות ‪ LB‬נפרדות בעזרת מקל דריגלסקי והמתן דקה עד‬
‫לספיגה ויבוש של התרחיף שפוזר‪.‬‬
‫סמן במרקר שני עגולים בקוטר ‪ 1‬ס"מ על תחתית הצלחת על גבי החיידקים שפוזרו‪ ,‬במקום המסומן בעיגול‪ ,‬הנח‬
‫טיפה של תרחיף פאז' ‪( 4T‬כ‪ 5-‬מיקרוליטר) ובעיגול השני טיפה של סליין כביקורת‪ .‬הדגר ב‪ C37° -‬למשך הלילה‪.‬‬
‫בדוק רגישות החיידקים השונים לבקטריופאז' ‪.4T‬‬

‫‪27‬‬
 ‫‪ .5‬שאלות סיכום‬
‫‪ .1‬ישנה אפשרות לפיצוץ אקטיבי של חיידקים בעזרת כלורופורם‪ .‬מה יהיה‪ ,‬לדעתך‪ ,‬ריכוז הפלאקים‬
‫בהשוואה לריכוז החיידקים המודבקים‪ ,‬לאחר פיצוץ החיידקים בזמנים הבאים‪:‬‬
‫‪ .1‬מיד אחרי הספיחה‪.‬‬
‫‪ 15 .2‬דקות לאחר הספיחה‪.‬‬
‫‪ 30 .3‬דקות לאחר הספיחה‪.‬‬
‫____________________________________________________________________‬
‫‪ .2‬הצע דרך לבידוד מוטנטים של החיידק ‪ E.coli‬שיהיו עמידים לבקטריופאז' ‪.4T‬‬
‫‪ .3‬העלה על גרף חצי לוגריתמי (מדוע?) את תוצאות הקריאה בספקטרופוטומטר ואת תוצאות‬
‫הספירה של הפלאקים‪.‬‬
‫‪ .4‬מה ביכולתך להסיק מעקומת הקריאות בספקטרופוטומטר ומעקומת הספירה של הפאז'ים? מה‬
‫מבטאת העלייה החדה במס' הפלאקים בזמן הניסוי? מדוע אין עליה בריכוז הפאז'ים בתקופה‬
‫הראשונה אחרי הספירה?‬
‫‪ .5‬מהו ‪ ?Burst size‬מה קובע אותו? חשב את גודלו בניסוי שלך‪.‬‬

‫ספרות מומלצת‬
‫יש לקרוא השלמות לדיון ‪ 6‬בע"מ ‪.30-31‬‬
‫)‪.Stent, G, S. (and Calender, R.) Molecular Genetics, 1st (2nd) Edn., 1971 (1978‬‬
‫)‪W.H. Freeman & Co., San Francisco. Chapters 10, 14 (9, 13), (pp. 293-322, 413-426‬‬

‫‪28‬‬
 ‫השלמות בקורס למיקרוביולוגיה‬

‫תגובה חיסונית (‪ )Immune response‬היא תגובת הגוף לפלישה של גוף זר לאו דווקא גורם מזיק‪ .‬התגובה‬
‫מלווה בייצור נוגדנים (‪ )Antibodies‬ספציפיים‪ ,‬שמכירים ומגיבים עם הגורם הזר וגורמים להרחקתו‪ .‬על מנת‬
‫שייווצרו נוגדנים‪ ,‬חייב הגורם הזר להיות אימיונוגני (‪ .)Immunogenic‬הנוגדנים נוצרים כנגד מגזרים אנטיגנים (‬
‫‪ , )Antigenic determinant‬שמצויים על פני הגורם הזר‪ ,‬והם ספציפיים להם‪ .‬כתגובה לגורם זר אחד ניתן לקבל‬
‫מספר סוגי נוגדנים‪ ,‬שכל אחד ספציפי כנגד מרכיב אנטיגני אחר שלו‪ .‬מאחר וכל אחד מהנוגדנים נוצר מתא מקור‬
‫שונה‪ ,‬נחשבים נוגדנים אלה כרב שבטיים (‪ .)Polyclonal Ab‬נוגדנים כנגד מגזר אנטיגני אחד‪ ,‬והם נוגדנים זהים‬
‫כיוון שיוצרו על ידי אותו סוג של תאי מערכת החיסון שמקורם בתא יחיד שיצר שבט (קלון)‪ ,‬קרואים נוגדנים חד‬
‫שבטיים (‪. )Monoclonal Ab‬‬
‫החיסון משמש כצורת טיפול רפואית‪ ,‬בעיקר כנגד מחלות נגיפיות‪ ,‬שתרופות ספציפיות כנגדן מעטות‪ ,‬בגלל‬
‫אופי ההתרבות של הנגיפים בתוך תאי החולה‪ .‬חיסון פעיל הוא תגובה חיסונית פעילה של הגוף כנגד גורם‬
‫(מחלה) ספציפי‪ .‬במידה ומדובר בגורם מחלה‪ ,‬יש להשתמש בחיסון זה בגורם מוחלש – מוטנט או גורם שעבר‬
‫שינוי ללא פגיעה באימיונוגניות שלו‪ .‬מאחר שהתגובה החיסונית הראשונית (‪ )Primary response‬אורכת זמן‬
‫ורמת הנוגדנים בדם עולה לרמה מספיקה רק כעבור שבועיים או יותר‪ ,‬משמש החיסון הפעיל כדרך למניעת‬
‫מחלה‪ .‬לצורך טיפול במחלה יש להשתמש בחיסון סביל‪ ,‬שבו מקבל החולה נוגדנים מוכנים כנגד גורם המחלה‬
‫ברמה מספיקה לפעול מיי ד כנגדו‪ .‬נוגדנים אלה מיוצרים בבעל חיים אחר או שמקורם בחולה שהבריא מאותה‬
‫מחלה‪ .‬משך החיסון הסביל קצר‪ ,‬מאחר שהנוגדנים הזרים מורחקים מהחולה תוך מספר ימים‪ .‬גם רמת הנוגדנים‬
‫בדם האדם המחוסן בחיסון פעיל יורדת במשך הזמן (מספר חודשים) עם העלמות גורם המחלה‪ ,‬אבל במגע חדש‬
‫נוסף איתו נוצרת תגובה שניונית (‪ ,)Secondary‬בה קופצת רמת הנוגדנים בדם בתוך יום לרמה המספיקה‬
‫לנטרול גורם המחלה‪ .‬משום כך במחלות חריפות ומסוכנות משתמשים בזריקת דחף (‪ , )Booster‬כדי להתגבר על‬
‫המחלה במהירות ולמנוע פגיעה‪ ,‬אפילו התחלתית‪ ,‬בחולה‪.‬‬
‫חיסון פעיל כנגד רוב המחלות הנגיפיות הקשות (חזרת‪ ,‬חצבת‪ ,‬אדמת) מקבלים בארץ באופן סדיר (משולשת‬
‫שנייה) חיסון נגד מחלות חיידקיות (טטנוס‪ ,‬דיפטריה ושעלת) מקבלים במשולשת הראשונה‪ .‬חיסון כנגד נגיף‬
‫הפוליו (הגורם לשיתוק ילדים) מקבלים כיום בתרכיב סיבין (נגיף מוטנטי חי במזון) ובעבר קיבלו תרכיב סלק (נגיף‬
‫מת שעבר טיפול כימי בהזרקה לדם)‪ .‬מחלת הטטנוס נגרמת כתוצאה מפעילות רעלן (‪ )Toxin‬שמקורו בחיידק‬
‫‪ Clostridium tetani‬והחיסון נעשה בהזרקת רעלן מוחלש (‪ .)Toxoid‬כאשר יש חשש להדבקה במחלה פטאלית‬
‫זו‪ ,‬משתמשים בזריקת דחף באדם מחוסן‪ ,‬או בחיסון סביל בו מזריקים לאדם נוגדנים שנוצרו בסוסים כנגד הרעלן‬
‫(‪ . )Anti- tetanus‬תגובת החיסון אחראית להתגברות הטבעית על מחלות חיידקים ונגיפים‪ ,‬אבל גם לדחיות שתל‬
‫ולאלרגיות באדם‪ .‬נוגדנים‪ ,‬בעיקר חד שבטיים משמשים לזיהוי מגזרים אנטיגנים ספציפיים‪ ,‬או להפרדה זיקתית‬
‫וניקוי שלהם מתערובות ביולוגיות‪.‬‬
‫חיידקים גורמים מחלות על ידי התרבותם באזורים ספציפיים בגוף‪ ,‬תוך פגיעה ברקמות החולה באזור הנגוע‪.‬‬
‫מחלות אחדות מקורן ברעלנים (‪ )Toxins‬חיידקיים‪ .‬הרעלנים פוגעים בחולה גם כשהחיידקים היוצרים אותם‬
‫מתים‪ ,‬בתנאי שריכוזם גבוה מספיק ליצירת המחלה‪ .‬מכירים רעלנים חוץ תאיים (‪ , )Exotoxin‬המופרשים‬
‫מהחיידקים לנוזל הגוף או למצע הגידול‪ .‬האקסוטוקסינים פועלים ולכן עשויים לגרום לפגיעה בחולה באזורים בגוף‬
‫‪29‬‬
 ‫בהם אין חיידקים כלל‪ .‬רעלנים אחרים הם תוך תאיים (‪ )Endotoxins‬והם מהווים חלק ממרקם גוף החיידק‪ .‬כדי‬
‫לפעול‪ ,‬חייבים החיידקים‪ ,‬המכילים אנדוטוקסינים‪ ,‬להתפורר ולשחרר את הרעלן מתוכם‪ .‬גם במקרה זה עלול‬
‫האנדוטוקסין המשוחרר לפעול במקום שונה ממקום התרבות החיידק‪ ,‬אבל לרוב אזור פגיעתו בחולה קרוב למיקום‬
‫החיידק‪ .‬גם במקרה של מחלות חיידקים הנגרמות על ידי רעלנים‪ ,‬חייבים החיידקים להתרבות ולהגיע בחולה‬
‫לרמה שיוצרת רעלנים בכמות שפוגעת באדם מספיק כדי שיוכר כחולה‪ .‬בחלק מהמחלות הנגרמות על ידי רעלנים‪,‬‬
‫כמו בטטנוס‪ ,‬מטפלים בחולה בטיפול סביל על ידי נוגדנים כנגד הרעלנים דווקא ולא כנגד החיידקים‪ .‬גם החיסון‬
‫הפעיל במחלה זו הוא כנגד הרעלן החיידקי‪.‬‬
‫מחלות נוספות הנגרמות ע"י אקסוטוקסינים הן‪ :‬הרעלת שימורי מזון‪ ,‬הנגרמת ע"י ‪,Clostridium botulinum‬‬
‫כולירע הנגרמת ע"י ‪ Vibrio cholerae‬וכרמת הנגרמת ע"י ‪ .Corynebacterium dipheteriae‬המחלות דיזנטריה‬
‫(ע"י ‪ )Shigella dusenteriae‬ודלקת מעיים‪ -‬סלמונלוזיס (ע"י ‪ )Salmonella typhimurinm‬נגרמות ע"י‬
‫אנדוטוקסינים‪ .‬רעלנים חיידקיים פוגעים גם בבעלי חיים ירודים‪.‬‬
‫החיידק ‪ subsp. israelesis (Bti) Bacillus thuringiensis‬גורם למחלה והרג מהיר של זחלי יתושים‪ ,‬בגלל‬
‫אנדוטוקסין שנוצר בחיידק זה בזמן הספורולציה‪ .‬האנדוטוקסין פוגע בזחלים רק אחרי שהזחל מעכל במעי את‬
‫החיידק שמכיל את הספורה והרעלן בתוכו‪ .‬הרעלן‪ ,‬המשוחרר מהחיידק המעוכל‪ ,‬מומס בנוזל המעי של הזחל‬
‫ופוגע בצורה ספציפית (אחרי התקשרות לרצפטור מיוחד) בתאי האפיתל של המעי‪ .‬החיידקים אינם מתרבים במעי‬
‫הזחל החי‪ ,‬וכדי שיגרמו לתמותה חייב הזחל לקלוט ולעכל רמה קטלנית של חיידקים מכילי רעלן מסביבתו‪ .‬בגלל‬
‫הרעילות הגבוהה של ‪ Bti‬וספציפיות הפעולה של רעלניו כנגד זחלי יתושים בלבד‪ ,‬משמש החיידק להדברה‬
‫ביולוגית של יתושים במקווי מים‪.‬‬

‫‪30‬‬
31
32