‫מעבדה בביוכימיה‬

‫דו"ח מספר ‪:4‬‬

‫מג יש ות‪:‬‬
‫דודי העייפבורגר‪-‬מצאתי‪-‬מחשבון‪-‬הזוי‪-‬בגוגל‬
‫עמיר אמויאלוקרבונאט‬
 ‫הקדמ ה‪:‬‬
‫האנזימים הינם חלבונים המשמשים כקטליזאטורים ביולוגיים בעלי יעילות וספציפיות גבוהה מאוד אשר על‬
‫ידי קשירה לסובסטרט‪ ,‬יוצרים סביבה נוחה מבחינה אנרגטית המאפשרת לריאקציה כימית להתרחש‪ .‬קומפלקס‬
‫אינזים‪-‬סובסטרט הוא המרכזי בפעילות אינזימים; זוהי נקודת ההתחלה לטיפול מתמטי המגדיר את ההתנהגות‬
‫הקינטית של תגובות של אינזימים קטליטיים‪.‬‬
‫מולקולת האנזים מורכבת ממספר איזורים‪:‬‬
‫האתר הפעיל‪ ,‬המהווה חלק קטן מסך גודלו של החלבון‪ ,‬הינו האיזור אליו נקשר הסובסטרט‪ .‬כתוצאה‬
‫מהקשירה‪ ,‬מתרחש שינוי כימי במבנה הסובסטרט ויוצאת לפועל תגובה קטליטית‪ .‬האתר הפעיל כולל בתוכו‬
‫את האתר הקושר‪ ,‬שקושר את הסובסטרט ואת האתר הקטליטי שמפרק אותו‪.‬‬
‫אתר קושר ‪ -‬מותאם לסובסטרט בגודל‪ ,‬בצורה‪ ,‬מטען ואופי הידרופילי או הידרופובי‪ .‬זוהי אינטראקציה‬
‫ספציפית‪ :‬החלבון מסוגל "לסנן" דרך אלפי מולקולות שונות בסביבתו‪ ,‬ובאופן סלקטיבי להתחבר לאחת או‬
‫לכמה‪ .‬לחלבון מסויים יכולים להיות אתרי קישור שונים ונפרדים עבור מספר ליגאנדים שונים‪ .‬אינטראקציה‬
‫מולקולרית ספציפית זו קריטית על מנת לשמור על רמת אירגון וסדר גבוה במערכת החיים‪.‬‬
‫כאמור‪ ,‬הקישור מתקיים באתר הקושר ואילו האתר הקטליטי הנמצא בתוך החלבון ולא על פני שטח הפנים‪,‬‬
‫אחראי על קיומה של הפעילות הקטליטית לאחר היקשרותו של הסובסטרט‪ .‬באתר זה מצויות חומצות אמינו‬
‫עם פעילות ספציפית של האינזים‪ ,‬בדר"כ בתוך שקע הידרופובי‪.‬‬
‫מעכבים ( ‪)Inhibitors‬‬
‫חומרים הנקשרים לאנזים ומשפיעים על פעולתו‪ .‬פעולתם ואתרי התקשרותם שונים זה מזה אולם בעיקרון‬
‫כולם מביאים לתוצאה דומה ‪ -‬פגיעה ביציאתה של תגובה לפועל והשפעה על הפרמטרים ‪ Km‬ו ‪ Vmax‬בדרך זו‬
‫או אחרת‪ .‬הקישור של המעכב לאנזים יכול להיות קישור הפיך‪ ,‬כך שהאנזים יכול להשתחרר מהמעכב‬
‫ולהמשיך לפעול‪ .‬או קישור בלתי‪-‬הפיך‪ ,‬כזה שלמעשה נקשר בקשר חזק לאנזים ומונע פעילות עם‬
‫הסובסטרט‪.‬‬
‫בעיכוב הפיך‪ ,‬המעכב נקשר לאינזים בצורה לא קוולטית אל האתר הקושר‪ .‬קשירה זו אינה משפיעה על ‪Vmax‬‬
‫כיוון שההפרעה הינה ארעית‪ .‬המעכב מתחרה עם הסובסטרט על אתר הקשירה‪ ,‬וע"י כך מקטין את סיכויי‬
‫הסובסטרט להיקשר לאינזים‪ ,‬מגדיל את ‪ Km‬והזיקה לסובסטרט יורדת‪ .‬במידה ונטה את ש"מ לטובת‬
‫הסובסטרט ע"י הגדלת ריכוזו‪ ,‬נוכל להקטין את מידת העיכוב‪.‬‬
‫מעכבים הפיכים מתחלקים לשלושה סוגים‪:‬‬
‫מע כבים תח רותים‪ :‬חומרים הדומים במבנה המרחבי לסובסטראט ונקשרים לאתר הפעיל של האנזים‪ .‬כל עוד‬
‫המעכב קשור לאנזים‪ ,‬האנזים אינו יכול לפעול‪ .‬כאשר מדובר על קישור מעכב‪-‬סובסטרט הפיך‪ ,‬שלאחריו יכול‬
‫המעכב להשתחרר מהאתר הפעיל‪ ,‬אז הסובסטרט יכול להקשר אליו‪ .‬שוב מידת העיכוב של התגובה תלויה‬
‫בריכוזים היחסים של הסובסטרט ושל המעכב‪ .‬ככל שיש יותר סובסטרט ביחס למעכב‪ ,‬הסיכוי שהסובסטרט‬
‫ייכנס לאתר הפעיל גבוה יותר‪ .‬כלומר‪ ,‬בריכוז סובסטרט מספיק גבוה‪ ,‬הסובסטרט "יתגבר" על העיכוב‪ .‬ע"י‬
‫הקשרותו לאתר הפעיל‪ ,‬מקטין המעכב את סיכויי הסובסטרט להיקשר לאינזים ובעצם כך מגדיל את ‪Km‬‬
‫המלמד על הזיקה של האנזים לסובסטרט‪ ,‬בעוד ש ‪ Vmax‬אינו משתנה‪.‬‬
‫מע כבים בלתי ת חרו תיים‪ :‬חומרים הנקשרים לאנזים באתר שאינו האתר הפעיל‪ ,‬אך עם זאת‪ ,‬עצם הקישור‬
‫משפיע על פעילות האנזים‪ .‬עצם הקשרותם לאתר אחר מהאתר הפעיל‪ ,‬היא שמקנה להם את שמם "בלתי‬
‫תחרותיים" כיוון שאינם מתחרים בסובסטרט ולכן הוספת סובסטרט למערכת לא תקטין את העיכוב‪ .‬הפרעתם‬
‫באה לידי ביטוי בקצב איטי יותר של פירוק וקבלת תוצר בכמות פחותה‪ .‬במצב זה‪ Vmax,‬משתנה כי המעכב‬
‫מפריע כל הזמן להגיע לערך זה אולם ‪ Km‬אינו משתנה וזאת מכיוון שאין פגיעה באפיניות קומפלקס אנזים‪-‬‬
‫סובסטרט‪.‬‬
‫קיימים מעכבים לא תחרותיים הנקשרים לקומפלקס ‪ )ES (Un‬וקיימים כאלה הנקשרים ל ‪ E‬החופשי או‬
‫לקומפלקס ‪ ES‬לאחר שנוצר (‪.)Non‬‬
‫‪E+S‬‬ ‫‪ES‬‬ ‫‪P‬‬
‫‪+‬‬ ‫‪+‬‬
‫‪I‬‬ ‫‪I‬‬
‫= ‪Non‬לא משפיע על ‪ Km‬אבל ‪ Vmax‬יורדת‪.‬‬ ‫משנה את ‪ Km‬ומשפיע על ‪Vmax = Un‬‬
‫המעכב יכול להיקשר או לקומפלקס או ל‬ ‫מתקשר רק לקומפלקס ‪ES‬‬
‫‪EIE+ S‬‬ ‫‪EIS‬‬
‫בלבד‬

‫‪2‬‬
 ‫עיכוב בלתי הפיך לעומת זאת‪ ,‬מבוסס על מודיפיקציה כימית כתוצאה מיצירת קשרים קוולנטיים בין האינזים‬
‫למעכב‪ .‬קשרים בלתי הפיכים אלה גוררים שינוי בלתי הפיך בצורתו המרחבית של האינזים‪ ,‬חסימת אחד‬
‫האתרים ע"ג האינזים בצורה בלתי הפיכה המפריעה לפעילות האינזים‪ .‬העיכוב יכול להיות סלקטיבי = ייפגע‬
‫ישירות באתר הפעיל‪ ,‬או לא סלקטיבית = יהרוס בכל צורה אחרת את האינזים‪ .‬מנגנון העיכוב מבוסס בדרך‬
‫כלל על שני שלבים‪ :‬תחילה נקשרים לאתר הקושר ורק אחר כך נקשרים לאתר הקטליטי‪ .‬עד רגע הקשירה‬
‫לאתר הקטליטי‪ ,‬מדובר על עיכוב הפיך‪ .‬הרברסיבליות תלויה בזמן הדגירה בין האינזים למעכב‪.‬‬
‫‪E+I‬‬ ‫‪EI‬‬ ‫‪EI‬‬

‫במעבדה זו‪ ,‬ננשתמש באינזימים טריפסין וכימוטריפסין‪ .‬אלו הם אנזימים פרוטואוליטים אשר הזימוגנים‬
‫(הצורה הבלתי פעילה) שלהם נוצרים בתאים האקסוקרנים של הלבלב‪ ,‬ממנו הם מופרשים אל המעי הדק ושם‬
‫הופכים להיות פעילים בעקבות תהליך אקטיבציה‪.‬‬

‫הטריפסין והכימוטריפסין הם אנזימים הומולוגים בעלי דימיון רב במבנה הראשוני והמרחבי‪ ,‬וכן במבנה האתר‬
‫הקטליטי שלהם הבנוי מ ‪ Aspatic acid, Histadin‬ו ‪ .Serine‬למרות זאת‪ ,‬הספציפיות של אינזים אלו שונה‬
‫לחלוטין‪ .‬בעוד שטריפסין פותח קשרים בהם הקבוצה הקרבוקסילית נתרמה על ידי חומצות אמינו בסיסיות כגון‬
‫ליזין וארגנין‪ ,‬הרי שכימוטריפסין פותח בעיקר קשרים פפטידיים בהם הקבוצה הקרבוקסילית נתרמה ע"י‬
‫חומצות אמינו ארומטיות‪ .‬שוני זה נובע מאופיו של האתר הקושר הבנוי כ"הכיס ההידרופובי"‪.‬‬
‫בתחתית האתר הקושר של הטריפסין מצויה החומצה האספרטית בעלת מטען חשמלי שלילי ואילו‬
‫בכימוטריפסין‪ ,‬חומצת האמינו סרין‪ ,‬חסרת המטען‪ ,‬היא שמצויה בתחתיתו של "כיס" זה‪ .‬שוני זה מביא גם כן‪,‬‬
‫להיווצרותן של אינטראקציות שונות כן; בטריפסין‪ ,‬החומצה האספרטית אחראית ליצירת קשר יוני (חזק) עם‬
‫סובסטרט טעון חיובית (הבדלי מטענים) ואילו בכימוטריפסין‪ ,‬האינטראקציה בין האינזים לטבעת הבנזנית של‬
‫הסובסטרט‪ ,‬הינה חלשה יותר כיוון שהינה בעלת אופי הידרופובי‪.‬‬

‫יש לציין כי שני האנזימים מאופיינים ביכולתם לפתוח קשרים פפטידים‪ ,‬אמידים ואסטרים‪.‬‬

‫‪3‬‬
 ‫מטרו ת המעבד ה‪:‬‬
‫א‪ .‬השפעת ריכוז סובסטרט על קצב הריאקציה‬
‫ב‪ .‬השפעת מעכב ‪ )PABA (p-amino benzamidine‬על הפעילות האינזימטית‪.‬‬
‫ג‪ .‬בדיקת הפעילות של טריפסין וכימוטריפסין על סובסטרטים ספציפיים ועיכובם ע"י מעכבים ספציפיים‬
‫בלתי הפיכים‪.‬‬

‫ניס וי ‪ - 1‬נ יס ויי ם ו ' ו‪ -‬ז '‬

‫מטרות ה ניסו י‪:‬‬
‫ניסוי ו'‪ :‬בדיקת השפעת ריכוזים שונים של סובסטרט על קצב הריאקציה של האנזים טריפסין‪.‬‬
‫ניסוי ז'‪ :‬בדיקת השפעת מעכב תחרותי ‪ )PABA (p-amino benzamidine -‬על הפעילות האינזימטית של‬
‫האינזים טריפסין‪ ,‬קביעת אופי פעילותו והקינטיקה שלו‪.‬‬

‫שיט ת עבודה‪:‬‬
‫ניסוי ו'‪ :‬במהלך הניסוי הוכנו ‪ 15‬מבחנות שחולקו ל ‪ 5‬מערכות‪ .‬כל מערכת‪ ,‬שהכילה שתי מבחנות ריאקציה‬
‫ומבחנת ביקורת‪ ,‬נבדלה מאחרת בריכוז תמיסת הסובסטרט (‪ )BAPNA‬שהוכנסה אליה ריכוזים משתנים בטווח‬
‫שבין ‪ 10-2M*1‬ל ‪10-3M*2.0‬בכמות של ‪ .ml 0.1‬כמו כן‪ ,‬לכל המבחנות הוכנס נפח זהה של בופר טריס (‪.)2ml‬‬
‫לאחר שהמבחנות עברו פראינקובציה למשך ‪ 5‬דקות ‪ -‬הושמו באמבט מים בטמפרטורה ‪ 30°C‬הוספנו לכל‬
‫מבחנות הריאקציה כמות זהה של האינזים טריפסין‪ ,‬והמבחנות הושמו שוב באמבט למשך ‪ 15‬דקות ‪ -‬זמן‬
‫אינקובציה‪.‬‬
‫הריאקציה הופסקה על ידי הוספת חומצת חומץ ‪ 30%‬בנפח זהה לכל המבחנות‪ .‬לאחר סיום האינקובציה‪ ,‬לשם‬
‫השוואת נפחים‪ ,‬הוסף אנזים למבחנות ה"בלנק"‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬עורבבו כל המבחנות ב ‪ Vortex‬לשם קבלת תמיסות‬
‫הומוגניות ובוצעה קריאה של התמיסות בספקטרופוטומטריה באורך גל של ‪.nm 410‬‬

‫ניסוי ז'‪ :‬הכנת הניסוי ומהלכו זהים לניסוי ו'; בניסוי זה נבדקה השפעתו של המעכב ‪ ,PABA‬שהינו מעכב‬
‫תחרותי של טריפסין‪ ,‬על הפעילות האנזימטית ולשם כך‪ ,‬בתמיסת בופר הטריס שהוכנסה לכל מערכת הומס‬
‫המעכב הנבדק‪.‬‬

‫פראינקובציה = הכנסת המבחנות לאמבט מים בטמפרטורה של ‪ 30°C‬למטרת הבטחה כי לפני התחלת‬
‫הפעילות‬
‫האינזימטית‪ ,‬כל מרכיבי המערכת יהיו בטמפרטורה אחידה ואופטימאלית‪.‬‬
‫אינקובציה = זמן הריאקציה‪ .‬מרגע הוספת הסובסטרט למבחנות הריאקציה ועד להפסקת התגובות ע"י הוספת‬
‫חומצת חומץ‪ .‬המבחנות הוכנסו לאמבט המים על מנת לספק לאנזים תנאים אופטימאליים לפעילותו‪.‬‬
‫מבחנת ה"בלנק" = מכילה את כל מרכיבי הריאקציה‪ ,‬אך מבלי שתתרחש בה תגובה‪ .‬סדר הכנסת החומרים‬
‫שונה ממבחנות הריאקציה אך מוודאים כי הנפח הסופי של כל המערכות הנבדקות יהיה שווה‪ .‬שתי מטרות אלו‬
‫מושגות‪ ,‬כאמור‪ ,‬ע"י הוספת החומרים בזמנים שונים‪.‬‬

‫‪4‬‬
 ‫תוצאו ת‪:‬‬
‫א נוכחות מעכב‬ ‫טבלה מספר ‪ : 1‬ה שפעת ריכוז ה סובסטרט על מ הירות ה ראקציה‪ ,‬לל‬
‫במערכת (ניסוי ו')‪:‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫פעילות‬ ‫ממוצע‬ ‫ממוצע‬ ‫צפיפות‬ ‫ריכוז‬ ‫ריכוז‬ ‫מס'‬
‫אינזימטית‬ ‫צפיפות‬ ‫צפיפות‬ ‫אופטית‬ ‫סובסטרט‬ ‫סובסטרט‬ ‫מבחנ‬
‫‪S‬‬ ‫‪V0‬‬ ‫‪V0‬‬ ‫אופטית‬ ‫אופטית ‪-‬‬ ‫‪OD410‬‬ ‫סופי‬ ‫מקורי‬ ‫ה‬
‫‪]µmol/min [1 -‬‬ ‫[ ‪]µmol/min‬‬ ‫לאחר‬ ‫מבחנות‬ ‫‪nm‬‬ ‫[ ‪]M‬‬ ‫[ ‪]M‬‬
‫‪-1‬‬
‫[ ‪M‬‬ ‫הפחתת‬ ‫ריאקציה‬
‫מבחנת‬ ‫‪OD410 nm‬‬
‫ביקורת ‪ΔOD‬‬
‫‪410 nm‬‬
‫‪0.231‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪00.00‬‬ ‫‪0.2215‬‬ ‫‪0.212‬‬ ‫‪10-5*6.452‬‬ ‫‪10-3*2.0‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪172.6668‬‬ ‫‪0.005792‬‬ ‫‪0.2145‬‬ ‫‪-‬‬
‫‪0.007‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.379‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.378‬‬
‫‪393.94‬‬ ‫‪0.377‬‬
‫‪10-4*1.065‬‬ ‫‪10-3*3.3‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪99.56193‬‬ ‫‪0.010044‬‬ ‫‪0.372‬‬
‫‪0.006‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.553‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.542‬‬ ‫‪-4‬‬ ‫‪-3‬‬
‫‪00.00‬‬ ‫‪0.531‬‬
‫‪10 *1.613‬‬ ‫‪10 *5.0‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪69.09895‬‬ ‫‪0.014472‬‬ ‫‪0.536‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.006‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪0.663‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪0.6525‬‬
‫‪96.97‬‬ ‫‪0.642‬‬
‫‪10-4*2.129‬‬ ‫‪10-3*6.6‬‬ ‫‪11‬‬
‫‪57.64519‬‬ ‫‪0.017348‬‬ ‫‪0.6425‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.01‬‬ ‫‪12‬‬
‫‪0.972‬‬ ‫‪13‬‬
‫‪0.9795‬‬
‫‪00.00‬‬ ‫‪0.987‬‬
‫‪10-4*3.226‬‬ ‫‪10-2*1.0‬‬ ‫‪14‬‬
‫‪38.32078‬‬ ‫‪0.026096‬‬ ‫‪0.9665‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.013‬‬ ‫‪15‬‬

‫של ריכוז הסובסטרט ללא נוכחות מעכב‬ ‫ריאקציה כפונקצ יה‬ ‫גרף מספר ‪ : 1‬מהירות ה‬
‫במערכת‪:‬‬
‫פעילות אינזימטית ‪V0( (μmol/min‬‬

‫‪0.030‬‬

‫‪0.025‬‬

‫‪0.020‬‬

‫‪0.015‬‬

‫‪0.010‬‬

‫‪0.005‬‬ ‫‪y = 75.813x + 0.001‬‬

‫‪2‬‬
‫‪R = 0.9998‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪0.0E+00‬‬ ‫‪5.0E-05‬‬ ‫‪1.0E-04‬‬ ‫‪1.5E-04‬‬ ‫‪2.0E-04‬‬ ‫‪2.5E-04‬‬ ‫‪3.0E-04‬‬ ‫‪3.5E-04‬‬

‫‪5‬‬

‫ריכוז טריפסין (‪(M‬‬

 ‫חישובים‪:‬‬
‫‪ . 1‬פעילות אינזי מטי ת ( ‪:) V0‬‬
‫חישוב הפעילות האינזימטית יעשה על פי הנוסחה‪:‬‬

‫‪∆OD 410 * 3.6ml‬‬

‫= ‪V0‬‬
‫‪(8.8ml / µmol ( *15 min‬‬
‫הפר מט רים‪:‬‬
‫‪ : ∆OD410‬הפרש ערכי הצפיפות האופטית שנמדדו עבור ממוצע תמיסות נבדקות ותמיסת הביקורת‪.‬‬
‫‪ : 3.6ml‬הנפח הכללי של כל מערכת נבדקת‪.‬‬
‫‪ : 8.8ml / µmol‬ערכו של מקדם הבליעה המולרי של התוצר‪.‬‬
‫‪ : 15 min‬אינקובציה = משך זמן הריאקציה‪ ,‬החל מהרגע בו הובאו שני החומרים (אנזים וסובסטרט) במגע‪.‬‬

‫חישוב עבור מבחנות מספר ‪( 1-3‬ממוצע לאחר הפחתת ביקורת)‪:‬‬

‫‪0.2150 * 3.6ml‬‬
‫= ) ‪V0( 1−3‬‬
‫‪( 8.8ml / µmol )* 15 min‬‬

‫‪V0( 1−3 ) = 5.864 * 10 −3 µmol / min‬‬

‫ראקציה בנוכחות מעכב‬ ‫טבלה מספר ‪ : 2‬ה שפעת ריכוז ה סובסטרט על מ הירות ה‬
‫במערכת (ניסוי ז' )‪:‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫פעילות‬ ‫ממוצע‬ ‫ממוצע‬ ‫צפיפות‬ ‫ריכוז‬ ‫ריכוז‬ ‫מס'‬
‫אינזימטית‬ ‫צפיפות‬ ‫צפיפות‬ ‫אופטית‬ ‫סובסטרט‬ ‫סובסטרט‬ ‫מבחנ‬
‫‪S‬‬ ‫‪V0‬‬ ‫‪V0‬‬ ‫אופטית‬ ‫אופטית ‪-‬‬ ‫‪OD410‬‬ ‫סופי‬ ‫מקורי‬ ‫ה‬
‫‪]µmol/min [1 -‬‬ ‫[ ‪]µmol/min‬‬ ‫לאחר‬ ‫מבחנות‬ ‫‪nm‬‬ ‫[ ‪]M‬‬ ‫[ ‪]M‬‬
‫[ ‪]M-1‬‬ ‫הפחתת‬ ‫ריאקציה‬
‫מבחנת‬ ‫‪OD410 nm‬‬
‫ביקורת‬
‫‪ΔOD410 nm‬‬
‫‪0.104‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪-3‬‬ ‫‪0.099‬‬ ‫‪0.105‬‬
‫‪5500.00‬‬ ‫‪370.371‬‬ ‫‪10 *2.7‬‬ ‫‪0.099‬‬ ‫‪10-5*6.452‬‬ ‫‪10-3*2.0‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.004‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.179‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.149‬‬ ‫‪0.183‬‬
‫‪393.94‬‬ ‫‪246.085‬‬ ‫‪10-3*4.064‬‬ ‫‪0.149‬‬ ‫‪10-4*1.065‬‬ ‫‪10-3*3.3‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.005‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.271‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.246‬‬ ‫‪0.264‬‬
‫‪200.00‬‬ ‫‪149.052‬‬ ‫‪10-3*6.709‬‬ ‫‪0.246‬‬ ‫‪10-4*1.613‬‬ ‫‪10-3*5.0‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.006‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪0.515‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪0.385‬‬ ‫‪0.336‬‬
‫‪696.97‬‬ ‫‪95.735‬‬ ‫‪10-2*1.045‬‬ ‫‪0.383‬‬ ‫‪10-4*2.129‬‬ ‫‪10-3*6.6‬‬ ‫‪11‬‬
‫‪0.007‬‬ ‫‪12‬‬
‫‪0.507‬‬ ‫‪13‬‬
‫‪0.524‬‬ ‫‪0.512‬‬
‫‪100.00‬‬ ‫‪70.785‬‬ ‫‪10-2*1.413‬‬ ‫‪0.518‬‬ ‫‪10-4*3.226‬‬ ‫‪10-2*1.0‬‬ ‫‪14‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.011‬‬ ‫‪15‬‬

‫‪6‬‬
 ‫ל ריכוז הסובסטרט בנוכחות מעכב‬ ‫ריאקציה כפונקצ יה ש‬ ‫גרף מספר ‪ : 2‬מ הירות ה‬
‫במערכת‪:‬‬

‫‪0.016‬‬
‫פעילות אינזימטית ‪V0( (μmol/min‬‬

‫‪0.014‬‬
‫‪0.012‬‬
‫‪0.010‬‬
‫‪0.008‬‬
‫‪0.006‬‬
‫‪0.004‬‬
‫‪0.002‬‬ ‫‪y = 45.034x - 0.0005‬‬
‫‪2‬‬
‫‪R = 0.9981‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪0.0E+00‬‬ ‫‪5.0E-05‬‬ ‫‪1.0E-04‬‬ ‫‪1.5E-04‬‬ ‫‪2.0E-04‬‬ ‫‪2.5E-04‬‬ ‫‪3.0E-04‬‬ ‫‪3.5E-04‬‬

‫* החסרנו את מבחנות ‪10-12‬‬

‫חישובים‪:‬‬
‫‪ . 1‬פעילות אינזי מטי ת ( ‪:) V0‬‬
‫חישוב הפעילות האינזימטית יעשה על פי הנוסחה‪:‬‬

‫‪∆OD410 * 3.6ml‬‬
‫= ‪V0‬‬
‫(‪((M‬‬
‫‪8.8ml‬‬ ‫ריכוז‪/ µmol‬‬
‫טריפסין‬ ‫‪( * 15 min‬‬
‫הפר מט רים‪:‬‬
‫‪ : ∆OD410‬הפרש ערכי הבליעה שנמדדו עבור תמיסה הביקורת ותמיסה נבדקת‪.‬‬
‫‪ : 3.6ml‬הנפח הכללי של כל מערכת נבדקת‪.‬‬
‫‪ : 8.8ml / µmol‬ערכו של מקדם הבליעה המולרי של התוצר‪.‬‬
‫‪ : 15 min‬אינקובציה = משך זמן הריאקציה‪ ,‬החל מהרגע בו הובאו שני החומרים (אנזים וסובסטרט) במגע‪.‬‬

‫חישוב עבור מבחנות מספר ‪( 1-3‬ממוצע לאחר הפחתת ביקורת)‪:‬‬

‫‪0.099 * 3.6ml‬‬
‫= ) ‪V0( 1−3‬‬
‫‪( 8.8ml / µmol ) * 15 min‬‬

‫‪V0( 1−3 ) = 2.7 * 10 −3 µmol / min‬‬

‫‪7‬‬
 ‫שני הניסויים )‪:‬‬ ‫באופן זהה עבו ר‬ ‫ריכוז סובסט רט סופי ( מח ושב‬ ‫‪.2‬‬
‫‪ : ml 0.1‬נפח הסובסטרט במערכת הריאקציה‪.‬‬
‫‪ :ml 3.1‬נפח מערכת הראקציה שהשתתף בתגובה‪( .‬לא לוקחים בחשבון את ה ‪ ml 0.5‬של חומצת החומץ)‬

‫נפח מערכת הראקציה‬ ‫‪3.1ml‬‬

‫=‬ ‫נחשב את הנפח החדש של הסובסטרט על פי המשוואה‪:‬‬
‫נפח הסובסטרט שנלקח‬ ‫‪0.1ml‬‬

‫כלומר‪ ,‬במערכת נעשה מיהול פי ‪ 31‬של ריכוזי הסובסטרט המקוריים‪.‬‬

‫ריכוז סובסטרט שנלקח‬

‫על מנת למצוא את הריכוז הסופי של הסובסטרט נשתמש המשוואה‪:‬‬
‫‪31‬‬

‫לדוגמא‪ ,‬חישוב עבור מבחנות ‪:1-3‬‬

‫‪ :10-3*2.0‬ריכוז מקורי של סובסטרט‪.‬‬
‫‪2.0 * 10−3 M‬‬
‫=‪C‬‬ ‫‪= 6.4516 * 10− 5 M‬‬ ‫נציב במשוואה‪:‬‬
‫‪31‬‬

‫קל ריכוז הסובסטרט כפונק ציית רציפרוק ל קצב הר אקציה‪:‬‬ ‫גרף ‪ : 3‬רציפרו‬

‫‪A Lineweaver-Burk plot‬‬

‫‪400‬‬

‫‪350‬‬

‫‪300‬‬
‫‪y = 0.0243x + 1.3502‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪250‬‬ ‫‪R = 0.9926‬‬
‫‪V‬‬ ‫ללא נוכחות מעכב‬
‫‪200‬‬
‫‪ min ‬‬ ‫עם נוכחות המעכב‬
‫‪‬‬ ‫‪‬‬
‫‪ µmol  150‬‬

‫‪100‬‬
‫‪y = 0.0105x + 9.1477‬‬
‫‪2‬‬
‫‪50‬‬ ‫‪R = 0.9987‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪2500‬‬ ‫‪5000‬‬ ‫‪7500‬‬ ‫‪10000‬‬ ‫‪12500‬‬ ‫‪15000‬‬ ‫‪17500‬‬
‫‪-1‬‬
‫[‪] M‬‬
‫‪1‬‬
‫‪S‬‬

‫על מנת לחשב את ערכי הפרמטרים ‪ Vmax‬ו ‪ Km‬נשתמש במשוואות קווי הרגרסייה שהתקבלו‪.‬‬
‫‪1‬‬
‫‪ −‬של המערכת בעוד שנקודת‬ ‫נקודת החיתוך עם ציר ה ‪ ,x‬כאשר הפעילות היא אפס (‪ ,)y = 0‬מהווה את‬
‫‪Km‬‬
‫החיתוך עם ציר‬
‫‪1‬‬
‫של המערכת‪.‬‬ ‫ה ‪ ,y‬כלומר כאשר הריכוז הוא אפס (‪ ,)x = 0‬מהווה את ה‬
‫‪Vmax‬‬

‫‪8‬‬
 ‫עבור ניסוי ו' (ללא מעכב)‪:‬‬
‫משוואת קו הרגרסייה שהתקבלה הינה‪. y = 0.0105 x + 9.1477 :‬‬
‫נציב ‪ x = 0‬ונקבל‪y = 0.0105 * 0 + 9.1477 :‬‬

‫‪1‬‬
‫= ‪y = 9.1477‬‬
‫‪V max‬‬

‫‪µmole‬‬
‫‪V max = 0.109‬‬
‫‪min‬‬

‫נציב ‪ y= 0‬ונקבל‪0 = 0.0105 x + 9.1477 :‬‬

‫‪− 9.1477 = 0.0105 x‬‬

‫‪1‬‬
‫‪x = −871.21 = −‬‬
‫‪Km‬‬

‫‪K m = 1.148 * 10 −3 M‬‬

‫עבור ניסוי ז' (עם מעכב)‪:‬‬

‫משוואת קו הרגרסייה שהתקבלה הינה‪. y = 0.0243 x + 1.3502 :‬‬
‫נציב ‪ x = 0‬ונקבל‪y = 0.0243 * 0 + 1.3502 :‬‬

‫‪1‬‬
‫= ‪y = 1.3502‬‬
‫‪V max‬‬

‫‪µmole‬‬
‫‪V max = 0.741‬‬
‫‪min‬‬

‫נציב ‪ y= 0‬ונקבל‪0 = 0.0243 x + 1.3502 :‬‬

‫‪− 1.3502 = 0.0243 x‬‬

‫‪1‬‬
‫‪x = −55.56 = −‬‬
‫‪Km‬‬

‫‪K m = 0.018M‬‬

‫‪ . 3‬מספר מ ולים של אינזי ם טר יפסין במ ערכות הרי אקציה‪:‬‬

‫‪µg‬‬
‫‪100‬‬ ‫‪ :ET‬סך האינזים במערכת הריאקציה‪ :‬טריפסין‬
‫‪ml‬‬
‫נפח של אינזים במערכות הריאקציה‪ml 1 :‬‬

‫כמות (מסה) של אינזים במערכות הריאקציה ‪g = 100 μg 10-6 *100 :‬‬

‫‪9‬‬
 ‫‪( MW‬מסה מולרית) של טריפסין‪ 24000 :‬דלטון‪.‬‬

‫מסה‬
‫=‪n‬‬ ‫חישוב מספר המולים של האינזים במערכות הריאקציה ייעשה על ידי שימוש במשוואה‪:‬‬
‫מסה מולרית‬
‫‪100 * 10 −6 g‬‬
‫=‪n‬‬
‫‪g‬‬
‫‪24000‬‬
‫‪mole‬‬

‫‪n = 4.167 * 10 −9 mol‬‬

‫‪n = 4.167 * 10 −3 µmol‬‬

‫‪ .‬קבוע קטליטי ‪: K2 -‬‬ ‫‪4‬‬

‫‪ 1‬‬ ‫‪  1 ‬‬
‫‪ ‬אשר הינם‪ ,‬כאמור‪ ,‬נקודות החיתוך של הגרף עם הצירים‪.‬‬ ‫‪  −‬ו‪ -‬‬ ‫מגרף ‪ 3‬התקבלו הערכים ‪‬‬
‫‪ Vmax‬‬
‫‪  Km ‬‬
‫מתוכם חושבו הערכים ‪ Km‬ו ‪.Vmax‬‬
‫על מנת למצוא את הקבוע הקטליטי של מערכות הניסוי‪ ,‬בנוכחות וללא נוכחות מעכב‪ ,‬נשתמש במשוואה‬
‫‪ V max = K 2 * E T‬הקושרת בין הקבוע הקטליטי‪ ,‬סך האינזים במערכת הראקציה והפעילות האינזימטית‪.‬‬

‫הפר מט רים‪:‬‬
‫‪ :ET‬סך האינזים במערכת הריאקציה‬
‫‪ :K2‬קבוע קטליטי של פירוק קומפלקס ‪ ES‬לתוצר (‪)P‬‬

‫‪V max = K 2 * E T‬‬

‫‪µmol‬‬
‫‪V max‬‬ ‫‪1‬‬
‫= ‪K2‬‬ ‫= ‪= min‬‬ ‫‪= min −1‬‬
‫‪ET‬‬ ‫‪µmol min‬‬

‫כיוון שהקבוע הקטליטי (‪ )K2‬בעל יחידות של ‪ , sec-1‬עלינו לחלק את הערך המתקבל ב ‪:60‬‬

‫‪1‬‬ ‫‪1 min‬‬

‫* ‪K2‬‬ ‫*‬ ‫) ‪⇒ K 2 (sec −1‬‬
‫‪min 60 sec‬‬

‫נציב‪:‬‬
‫עבור ניסוי ו' (ללא מעכב)‪:‬‬
‫‪µmol‬‬
‫‪V max = 0.109‬‬ ‫הפעילות האינזימטית שחושבה‪:‬‬
‫‪min‬‬

‫נציב במשוואה‪V max = K 2 * ET :‬‬

‫‪µmol‬‬
‫‪0.109‬‬ ‫‪= K 2 * 4.167 * 10 −3 µmol‬‬
‫‪min‬‬
‫‪µmol‬‬
‫‪0.109‬‬
‫= ‪K2‬‬ ‫‪min‬‬
‫‪4.167 * 10 −3 µmol‬‬

‫‪K 2 = 26.16 min −1‬‬

‫‪10‬‬
 ‫‪26.16 min −1‬‬
‫= ‪K2‬‬ ‫‪= 0.434 sec −1‬‬ ‫כאמור‪ ,‬יחידות ‪ K2‬הינן ‪ sec-1‬ולכן נחלק ב ‪:60‬‬
‫‪60‬‬

‫עבור ניסוי ז' (עם מעכב)‪:‬‬

‫‪µmole‬‬
‫‪V max = 0.741‬‬ ‫הפעילות האינזימטית שחושבה‪:‬‬
‫‪min‬‬

‫נציב במשוואה‪V max = K 2 * E T :‬‬

‫‪µmol‬‬
‫‪0.741‬‬ ‫‪= K 2 * 4.167 * 10 −3 µmol‬‬
‫‪min‬‬
‫‪µmol‬‬
‫‪0.741‬‬
‫= ‪K2‬‬ ‫‪min‬‬
‫‪4.167 * 10 −3 µmol‬‬

‫‪K 2 = 177.83 min −1‬‬

‫‪177.83 min −1‬‬

‫= ‪K2‬‬ ‫‪= 2.963 sec −1‬‬ ‫כאמור‪ ,‬יחידות ‪ K2‬הינן ‪ sec-1‬ולכן נחלק ב ‪:60‬‬
‫‪60‬‬

‫‪ . 5‬חישוב של ‪( KI‬קבו ע אינ אקטיבציה)‪:‬‬

‫על מנת למצוא את ערכו של קבוע זה‪ ,‬נשתמש במשוואה‪:‬‬
‫‪‬‬ ‫‪I ‬‬
‫‪K m ' = K m 1 +‬‬ ‫‪‬‬
‫‪ KI ‬‬
‫הפר מט רים‪:‬‬
‫‪ Km': Km‬בנוכחות מעכב (‪.)PABA‬‬
‫‪ Km Km:‬אמיתי (ללא נוכחות מעכב)‪.‬‬
‫‪ :KI‬קבוע אינאקטיבציה‪.‬‬
‫[‪ :]I‬ריכוז סופי של מעכב במערכת הריאקציה‪.‬‬

‫תחילה נחשב את הריכוז הסופי של המעכב (מחושב עבור ניסוי ז')‪:‬‬

‫‪ :ml 2.0‬נפח בופר ההתחלתי שנלקח‪ ,‬המכיל ‪ M 10-4*0.5‬של ‪.PABA‬‬
‫‪ :ml 3.1‬נפח מערכת הראקציה שהשתתף בתגובה‪( .‬לא לוקחים בחשבון את ה ‪ ml 0.5‬של חומצת החומץ)‬

‫נפח מערכת הראקציה‬ ‫‪3.1ml‬‬

‫=‬ ‫נחשב את הנפח החדש של המעכב על פי המשוואה‪:‬‬
‫נפח המעכב שנלקח‬ ‫‪2.0ml‬‬

‫כלומר‪ ,‬במערכת נעשה מיהול פי ‪ 1.55‬של ריכוזי המעכב המקוריים‪.‬‬

‫ריכוז מעכב שנלקח‬

‫על מנת למצוא את הריכוז הסופי של המעכב נשתמש המשוואה‪:‬‬
‫‪1.55‬‬

‫‪11‬‬
 ‫‪0.5 * 10 −4 M‬‬
‫‪= 3.226 * 10 −5 M‬‬ ‫נציב‪:‬‬
‫‪1.55‬‬

‫כאמור‪ ,‬על מנת למצוא את ערכו של קבוע זה‪ ,‬נשתמש במשוואה‪:‬‬

‫‪‬‬ ‫‪I ‬‬
‫‪K m ' = K m 1 +‬‬ ‫‪‬‬
‫‪ KI ‬‬
‫נציב ערכים‪:‬‬
‫‪0.018M = 'Km‬‬
‫‪1.148* 10 −3 M = Km‬‬
‫[ ‪I[ = 3.226*10-5 M‬‬
‫‪ 3.226 * 10 −5 M ‬‬
‫‪0.018M = ( 1.148 * 10 −3 M ) * 1 +‬‬ ‫‪‬‬
‫‪‬‬ ‫‪KI‬‬ ‫‪‬‬

‫‪0.018M‬‬ ‫‪ 3.226 * 10 −5 M ‬‬

‫‪=1+ ‬‬ ‫‪‬‬
‫‪1.148 * 10 −3 M‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪KI‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ 3.226 * 10 −5 M ‬‬

‫‪14.679 = ‬‬ ‫‪‬‬
‫‪‬‬ ‫‪KI‬‬ ‫‪‬‬

‫] ‪K I = 2.198 * 10 −6 [ M‬‬

‫ומסקנות‪:‬‬ ‫דיון‬
‫גרף של פעילות אינזימטית כפונקציה של ריכוז הסובסטרט הינו גרף מיכאליס מנטן‪ .‬לפי גרף זה‪ ,‬ככל שמעלים‬
‫את ריכוז הסובסטרט‪ ,‬כך גדלה הפעילות האינזימטית עד לשלב מסויים בו מגיעה המערכת למהירות‬
‫מקסימלית הנשארת קבועה‪ .‬בשלב זה העקום ישאף לאסימפטוטה ‪ -‬לפרמטר הקינטי ‪ .Vmax‬על מנת שנוכל‬
‫להגיע לערך זה‪ ,‬עלינו לעבור בריכוז עודף של סובסטרט אולם היות ודבר זה לא התאפשר במעבדה כיוון‬
‫שמסיסות הסובסטרט איתו עבדנו הינה נמוכה‪ ,‬חישבנו והסקנו את מסקנותינו על סמך גרף ‪Lineweaver-Burk‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪.‬‬ ‫ו‪-‬‬ ‫בו הצבנו את הערכים‬
‫‪V0‬‬ ‫]‪[S‬‬
‫‪ :Vmax‬הינו ערך קבוע אליו מגיעה מהירות הריאקציה כאשר שומרים על ריכוז קבוע של אינזים ומעלים את‬
‫ריכוז הסובסטרט‪.‬‬
‫העלאה נוספת של ריכוז הסובסטרט לא תשנה את ערך זה‪ .‬ערך זה נמדד במצב רוויה‪ ,‬כלומר‪ ,‬כאשר כל‬
‫מולקולות האינזים תפוסות ליצירת קומפלקס ‪ ES‬ועל כן‪ ,‬כאמור‪ ,‬תוספת סובסטרט לא תשפיע‪ .‬ערך זה‬
‫מאפיין את הפעילות המתרחשת באתר הקטליטי‪.‬‬
‫‪ :Km‬זהו ערך קבוע בכל מערכת‪ ,‬המבטא את האפיניות בין האינזים לסובסטרט כאשר ‪ .K2 << K-1‬ערך זה‬
‫מאפיין את הפעילות המתרחשת באתר הקושר‪.‬‬
‫‪K1‬‬ ‫‪K2‬‬
‫‪E+S‬‬ ‫‪ES‬‬ ‫‪E+P‬‬
‫‪K-1‬‬

‫פירוק ‪K −1 + K 2‬‬
‫= ‪Km‬‬ ‫=‬
‫‪K +1‬‬ ‫יצירה‬

‫בניסויים אלו נבדקה השפעתו של מעכב על הפעילות האינזימטית‪ .‬מערכות הריאקציה שהוכנו בניסויים אלו‪,‬‬
‫היו זהות לגמרי מלבד העובדה כי בניסוי ז' הוסף למערכות המעכב ‪. PABA‬‬

‫‪12‬‬
 ‫על סמך התוצאות והחישובים שהתקבלו‪ ,‬בהם נצפתה עלייה בערכו של ‪ Km‬בנוכחות מעכב‪ ,‬כלומר‪ ,‬ירידה‬
‫באפיניות‪ ,‬ניתן להסיק כי מדובר במעכב תחרותי הפיך‪ .‬למרות שמסקנה זו לא תואמת את ערכי ה ‪Vmax‬‬
‫שהתקבלו (‪ Vmax‬בנוכחות מעכב עלה ולא נשאר קבוע כמצופה) עדיין ניתן לזהות בוודאות מעכב זה כתחרותי‬
‫הפיך‪ .‬כמו כן‪ ,‬לא ידוע על מעכב אחר (הפיך או בלתי הפיך) אשר השפעתו על ‪ Km‬מתבטאת בעלייה‪.‬‬
‫בניסוי שלנו התקבלו ערכים שונים עבור ‪ ,Vmax‬עם וללא נוכחות מעכב‪ ,‬למרות שציפינו כי יהיה זהים‪ .‬ההבדל‬
‫נובע משגיאות אפשריות כגון‪:‬‬
‫‪ .1‬תנאי טמפרטורה שונים בין המערכות‪.‬‬
‫‪ pH .2‬שונה למרות שימוש בבופר זהה‪.‬‬
‫‪ .3‬חוסר דיוק במדידות‪ :‬זמנים‪ ,‬נפחים‪.‬‬
‫‪ .4‬שגיאות מכשירים (ספקטרופוטומטר‪ ,‬פיפטות)‪.‬‬
‫‪ .5‬ניקיון ואיכותם של החומרים בהם השתמשנו (אינזים‪ ,‬מעכב‪ ,‬בופר)‬

‫‪ , K2‬הקבוע הקטליטי או ‪ turnover number‬הינו מושג המכמת פעילות קטיליטית‪ ,‬דהיינו חישוב מספר מולים‬
‫של תוצר הנוצרים על ידי מול אינזים במשך שנייה אחת‪.‬‬
‫‪V max‬‬
‫= ‪ , K 2‬גם כן השתנה‪ ,‬וזאת בניגוד לציפיותינו‪.‬‬ ‫ערך ‪ ,K2‬אותו חישבנו מתוך המשוואה‪:‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪K2‬בנוכחות מעכב צריך להיות דומה לזה שמתקבל ללא נוכחות מעכב משום ש ‪ Vmax‬בשני המצבים אינו אמור‬
‫להשתנות אולם כיוון שלא כך קרה‪ ,‬הרי שניתן לההתייחס לסטייה זו כנגררת‪.‬‬
‫הערך הסיפרותי של ‪ K2‬הינו ‪. sec -1 0.611‬‬

‫נחשב אחוזי שגיאה עבור שני הניסויים‪:‬‬

‫ניסוי ז' (בנוכ חות מע כב)‬ ‫ו' (ללא נוכחות מ עכב)‬ ‫ניסוי‬
‫‪ K2‬שהתקבל = ‪sec-1 2.963‬‬ ‫‪ K2‬שהתקבל = ‪sec-1 0.434‬‬
‫תוצאה ניסיונית ‪ −‬תוצאה סיפרותית‬
‫‪ %‬שגיאה = ‪* 100‬‬
‫תוצאה סיפרותית‬

‫‪0.611 sec −1 − 2.963 sec −1‬‬ ‫‪0.611 sec −1 − 0.434 sec −1‬‬
‫‪ %‬שגיאה = ‪* 100‬‬ ‫‪ %‬שגיאה = ‪* 100‬‬
‫‪0.611 sec −1‬‬ ‫‪0.611 sec −1‬‬
‫‪%‬שגיאה = ‪385‬‬ ‫‪ %‬שגיאה = ‪28.96‬‬

‫כיוון שקיימת תלות בין ‪ Vmax‬ל ‪ K2‬והרי הפעילות האינזימטית מושפעת מהטמפרטורה (טמפרטורה גבוהה‬
‫מקנה לאנזים אנרגיה קינטית גבוהה יותר‪ ,‬דבר המביא למספר גדול יותר של מפגשים "פוריים" ומכאן ליצירת‬
‫יותר קומפלקסים בכל פרק זמן)‪,‬‬
‫הרי שניתן לומר כי ערך ‪ K2‬שנצפה לקבל הינו גדול מהערך הסיפרותי וזאת כאמור מהבדלי הטמפרטורות בהן‬
‫נמדדו‪.‬‬
‫כפי שניתן לראות מחישוב אחוזי השגיאה‪ ,‬קיים הבדל בין הנתון הסיפרותי לבין הערכים שהתקבלו‪ ,‬ובעיקר‬
‫בניסוי ז'‪.‬‬
‫יש לציין כי למרות שהניסויים בוצעו ב ‪ pH‬דומה (‪ ,)pH = 8-8.5‬הרי שהערך הסיפרותי נמדד בטמפרטורה של‬
‫‪ 15°C‬בעוד שאנו ביצענו את הניסוי בטמפרטורה של ‪ .30°C‬אומנם תוצאה זו עלולה להוביל להבדל מסויים‪,‬‬
‫אך אין להשליך מכך על ההבדל העצום שהתקבל עבור ניסוי ז' אלא לקחת בחשבון‪ ,‬כאמור‪ ,‬טעות נגררת‬
‫מערכי ה ‪.Vmax‬‬

‫‪ KI‬הינו קבוע הדיסוציאציה של קומפלקס אינזים‪-‬מעכב המייצג את האפיניות בין האנזים למעכב‪.‬ערך זה ניתן‬
‫לחישוב לאחר קבלת ערך ‪ Km‬תוך שימוש במשוואה‪:‬‬
‫‪‬‬ ‫‪I ‬‬
‫‪K m ' = K m 1 +‬‬ ‫‪‬‬
‫‪ KI ‬‬
‫ניתן לומר כי ככל ש ‪ KI‬גדול יותר‪ ,‬כלומר‪ ,‬ככל שהזיקה בין האינזים למעכב קטנה יותר‪ 'Km ,‬המבטא את‬
‫הזיקה בין האינזים לסובסטרט בנוכחות מעכב יהיה ערך גדול יותר‪ ,‬ולהיפך‪ .‬וזאת כמובן כיוון שמדובר על‬
‫מעכב תחרותי הפיך‪.‬‬

‫‪13‬‬
 ‫נחשב א חו ז שגיאה‪:‬‬

‫תוצאה ניסיונית ‪ −‬תוצאה סיפרותית‬

‫‪ %‬שגיאה = ‪* 100‬‬
‫תוצאה סיפרותית‬
‫‪ KI‬שחושב‪M 10-6*2.198 :‬‬
‫‪ KI‬סיפרותי‪M 10-6*8.25 :‬‬

‫) ‪( 8.25 * 10 −6 M ) − ( 2.198 * 10 −6 M‬‬

‫‪ %‬שגיאה = ‪* 100‬‬
‫‪8.25 * 10 −6 M‬‬

‫‪%‬שגיאה = ‪73.36‬‬

‫שוב התקבל הבדל משמעותי בין הערך הספרותי לערך שחושב‪ .‬הסיבות להבדל זה הינן אותן הסיבות‬
‫המשוערות לגבי שאר הערכים שחושבו‪ .‬יש לזכור כי לסטיות הנגררות לאורך החישובים משקל גדול יותר ככל‬
‫שמתבססים על יותר ערכים מחושבים מתוך התוצאות שקיבלנו‪ .‬כמו כן‪ ,‬יש לזכור כי הערך הסיפרותי חושב‬
‫עבור טמפרטורה של ‪ 15°C‬ואנו ביצענו את הניסוי בטמפרטורה של ‪.30°C‬‬

‫‪14‬‬
 ‫ניס וי ‪ - 3‬נ יס וי ח'‬
‫מטרת ה ניסוי‪:‬‬
‫א‪ .‬בדיקת הספציפיות של טריפסין וכמוטריפסין לגבי סובסטרט ומעכבים בלתי הפיכים‪.‬‬
‫ב‪ .‬השוואה בין האינזימים על סמך רגישותם לסובסטרטים ולמעכבים שלהם‪.‬‬
‫ג‪ .‬בדיקת הערכים‪ ,‬בהתאם למבנה האינזימים‪.‬‬

‫שיט ת עבודה‪:‬‬
‫בניסוי זה הוכנו ‪ 24‬מבחנות; המבחנות חולקו ל ‪ 2‬מערכות על פי מטרות הניסוי‪ .‬ל ‪ 10‬מבחנות הוכנס‬
‫הסובסטרט ‪ BAPNA (0.1ml‬בריכוז של ‪ )mM 10‬ול ‪ 10‬המבחנות האחרות הוכנס הסובסטרט ‪ATPNA (0.5ml‬‬
‫בריכוז של ‪ .)mM 1.25‬סובסטרטים אלו הינם ספציפיים לטריפסין ולכימוטריפסין בהתאמה‪ .‬ל ‪ 2‬מבחנות‬
‫נוספות הוכנסה ‪ HCl‬עם ‪BAPNA‬‬
‫ו ‪ ATPNA‬ול ‪ 2‬הנותרות הוכנס אתנול עם ‪ BAPNA‬ו ‪ ATPNA. 4‬מבחנות אלו הוכנו על מנת לבדוק האם יש‬
‫לממסים‪ ,‬הן של האניזימים והן של המעכבים‪ ,‬השפעה כלשהי על כמות הריאקציה המתרחשת‪.‬‬

‫ספציפיות סובסטר ט לאנזים‪:‬‬ ‫א‪ .‬ב דיקת‬

‫הוכנו מבחנות (מבחנות ‪ 1-4‬ו ‪ )13-16‬שהכילו את האינזימים‪ ,‬אליהן הוספו שני הסובסטרטים (בכל מבחנה‪,‬‬
‫אינזים אחד וסובסטרט אחד) ונבדקה התקדמות הריאקציה על סמך תוצאות צפיפות אופטית שנמדדו‬
‫בספקטרופוטומטריה באורך גל ‪( 410nm‬בליעה האופיינית לתוצרי הפרוק של הקומפלקס)‪.‬‬
‫על מנת להבטיח תוצאות מדוייקות ככל האפשר‪ ,‬הוכנו מבחנות ביקורת‪ :‬מבחנות עם סובסטרטים ו ‪( HCl‬ממס‬
‫של אינזימים) ומבחנות עם סובסטרט‪ ,‬אינזימים ואתאנול (ממס של מעכבים)‪.‬‬

‫בדיקת ספציפיות מ עקב לאנזים ‪:‬‬ ‫ב‪.‬‬

‫כל אחד מהאינזימים נבדק בנוכחות שני סוגי מעכבים (בנפרד‪ ,‬כמובן); המעכב ‪ TLCK‬אשר הינו ספציפי‬
‫לטריפסין‬
‫ו ‪ TPCK‬אשר הינו ספציפי לכמוטריפסין (מבחנות ‪ 7-10‬ו ‪.)22-19‬התקדמות הריאקציה נבדקה על פי עוצמת‬
‫הבליעה (צפיפות אופטית) בספקטרופוטומטר באורך גל של ‪( 410nm‬בליעה האופיינית לתוצרי הפרוק של‬
‫הסובסטרטים)‪.‬‬

‫יש לציין כי‪:‬‬

‫בכל המבחנות הושם בופר טריס (‪ )pH =8‬על מנת לשמור על ‪ pH‬אופטימלי לראקציית האינזימים‪ .‬כמו כן‪ ,‬כל‬
‫אחד מהניסויים בוצע פעמיים‪ ,‬כלומר הוכנו ‪ 2‬מבחנות זהות‪ ,‬וזאת בכדי לקבל תוצאות מדוייקות ככל האפשר‪.‬‬
‫על מנת להבטיח זאת‪ ,‬הנתונים שהתקבלו חושבו כממוצעים‪.‬‬
‫את מרכיבי מערכת ללא הסובסטרט שמנו לפרהאינקובציה למשך ‪ 15‬דקות בטמפרטורה של ‪ 30°C‬על מנת‬
‫להביא את המערכות לטמפרטורה אחידה‪ ,‬רצויה ואופטימלית‪.‬‬
‫לאחר פרההאינקובציה‪ ,‬הוכנסו הסובסטרטים למבחנות הרצווית והמערכות הוכנסו שוב לאמבט המים ל ‪15‬‬
‫דקות של אינקובציה‪ .‬בשלב הבא הוספה חומצת חומץ ‪ 0.5ml 30%‬לשם הפסקת הריאקציות‪ .‬לאחריה‪ ,‬נבדקו‬
‫התמיסות בספקטרופוטומטריה‪.‬‬

‫תוצאו ת‪:‬‬
‫‪ :‬ריכוזי וכמויות החומרים במערכות ה ריאקציה‪:‬‬ ‫טבלה מספר ‪3‬‬
‫כמות‬ ‫ריכוז‬ ‫החומר‬
‫בטווח שבין‬ ‫בופר טריס‬
‫‪1.7 - 1.2‬‬ ‫‪M 0.14‬‬ ‫‪=pH 08.‬‬
‫‪ml 1.0‬‬ ‫‪)μg/ml( 60‬‬ ‫כימוטריפסין‬
‫‪ml 1.0‬‬ ‫‪)μg/ml( 25‬‬ ‫טריפסין‬
‫‪ml 0.1‬‬ ‫(‪)mM 10‬‬ ‫‪BAPNA‬‬
‫‪ml 0.1‬‬ ‫(‪)mM 1.25‬‬ ‫‪BTPNA‬‬
‫‪ml 0.1‬‬ ‫‪M 0.02‬‬ ‫‪TLCK‬‬
‫‪ml 0.1‬‬ ‫‪M 0.02‬‬ ‫‪TPCK‬‬
‫‪ml 1.0‬‬ ‫‪M 0.002‬‬ ‫‪HCl‬‬
‫‪ml 0.1‬‬ ‫‪-‬‬ ‫אתאנול‬

‫‪15‬‬
 ‫טבלה מספר ‪ : 4‬ריכוז תוצ אות הניסוי‪:‬‬
‫תגובה‬ ‫ממוצע צפיפות‬ ‫צפיפות‬ ‫‪/ HCl‬‬ ‫מעכב‬ ‫סובסטרט‬ ‫אנזים‬ ‫מס'‬
‫צפויה‬ ‫אופטית ‪-‬‬ ‫אופטית‬ ‫אתאנול‬ ‫מבחנ‬
‫מבחנות ריאקציה‬ ‫‪OD410 nm‬‬ ‫ה‬
‫‪OD410 nm‬‬
‫‪0.458‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪+‬‬ ‫‪0.4535‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪BAPNA‬‬ ‫טריפסין‬
‫‪0.449‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.006‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.006‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪BAPNA‬‬ ‫כימוטריפסי‬
‫‪0.006‬‬ ‫ן‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.007‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.007‬‬ ‫‪HCl‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪BAPNA‬‬ ‫‪-‬‬
‫‪0.007‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.013‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.012‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪TLCK‬‬ ‫‪BAPNA‬‬ ‫טריפסין‬
‫‪0.011‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪0.499‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪+‬‬ ‫‪0.5005‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪TPCK‬‬ ‫‪BAPNA‬‬ ‫טריפסין‬
‫‪0.502‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪0.502‬‬ ‫‪11‬‬
‫‪+‬‬ ‫‪0.4945‬‬ ‫אתאנול‬ ‫‪-‬‬ ‫‪BAPNA‬‬ ‫טריפסין‬
‫‪0.487‬‬ ‫‪12‬‬
‫‪0.008‬‬ ‫‪13‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.008‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪ATPNA‬‬ ‫טריפסין‬
‫‪0.008‬‬ ‫‪14‬‬
‫‪0.378‬‬ ‫‪15‬‬
‫‪+‬‬ ‫‪0.377‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪ATPNA‬‬ ‫כימוטריפסי‬
‫‪0.376‬‬ ‫ן‬ ‫‪16‬‬
‫‪0.014‬‬ ‫‪17‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.0175‬‬ ‫‪HCl‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪ATPNA‬‬ ‫‪-‬‬
‫‪0.021‬‬ ‫‪18‬‬
‫‪+‬‬
‫‪0.333‬‬ ‫‪19‬‬
‫‪0.327‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪TLCK‬‬ ‫‪ATPNA‬‬ ‫כימוטריפסי‬
‫‪0.321‬‬ ‫ן‬ ‫‪20‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.025‬‬ ‫‪21‬‬
‫‪0.025‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪TPCK‬‬ ‫‪ATPNA‬‬ ‫כימוטריפסי‬
‫‪0.025‬‬ ‫ן‬ ‫‪22‬‬
‫‪+‬‬
‫‪0.331‬‬ ‫‪23‬‬
‫אתאנול‬ ‫‪-‬‬ ‫‪ATPNA‬‬ ‫כימוטריפסי‬
‫‪0.3255‬‬ ‫‪0.32‬‬ ‫ן‬ ‫‪24‬‬

‫חישובים‪:‬‬
‫‪ . 1‬חישוב הפ עילות הספציפית ‪:‬‬
‫על מנת לחשב את הפעילות הספציפית של כל אנזים נשתמש במשוואה הבאה‪:‬‬
‫) ‪∆OD410 * Vׂ( ml‬‬
‫= ‪S .A‬‬
‫)‪mgE * ε * t (min‬‬
‫הפר מט רים‪:‬‬
‫‪ : ∆OD410‬הפרש ערכי הבליעה שנמדדו עבור תמיסות הביקורת ותמיסות נבדקות‪.‬‬
‫) ‪ : V( ml‬הנפח הכללי של כל מערכת נבדקת‪.‬‬
‫‪ : 8.8ml / µmol‬ערכו של מקדם הבליעה המולרי של התוצר‪.‬‬
‫)‪: t (min‬משך זמן האינקובציה = משך זמן הריאקציה‪ ,‬החל מהרגע בו הובאו שני החומרים (אנזים וסובסטרט)‬
‫במגע (= ‪)min 15‬‬
‫‪ = mgE‬כמות האנזים ביחידות של ‪.mg‬‬

‫‪16‬‬
 ‫‪. 1‬א ‪ -‬ע בור טר יפסין ‪:‬‬
‫מסת האנזים ‪25µg = 0.025mg -‬‬
‫‪ΔO.D = 0.5455410O.D410‬‬ ‫בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות ‪= 0.565 - )1,2‬‬
‫‪O.D410‬‬ ‫בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות ‪= 0.0195 - )5,6‬‬

‫‪0.5455 * 3.3ml‬‬
‫= ‪S .A‬‬
‫‪ml‬‬
‫‪0.025mg * 8.8‬‬ ‫‪* 15 min‬‬
‫‪µmol‬‬

‫‪µmol‬‬
‫‪S .A = 0.5455‬‬
‫‪mg * min‬‬

‫‪ -‬עבור כי מוטריפסין‪:‬‬ ‫‪.1‬ב‬

‫מסת האנזים ‪60µg = 0.06mg -‬‬
‫‪ΔO.D = 0.2985410‬‬ ‫בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות ‪O.D410 = 0.03145 - )15,16‬‬
‫בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות ‪= O.D410 0.0160 - )17,18‬‬

‫‪0.2985 * 3.3ml‬‬
‫= ‪S .A‬‬
‫‪ml‬‬
‫‪0.06mg * 8.8‬‬ ‫‪* 15 min‬‬
‫‪µmol‬‬

‫‪µmol‬‬
‫‪S .A = 0.1244‬‬
‫‪mg * min‬‬

‫‪ . 2‬חישוב הקבו ע הקטלי טי ‪: K2‬‬

‫הקבוע הקטליטי מתאר את שלב הפירוק של הקומפלקס אינזים‪-‬סובסטרט לתוצר סופי‪ .‬היות ולשני האנזימים‬
‫משקל מולקולרי זהה ניתן להתייחס לפעילות הספציפית של שניהם‪ .‬בנוסף לכך‪ ,‬היות ואנו מחשבים את ‪K2‬‬
‫עבור מבחנה אחת‪ ,‬הרי שלא נוכל להשתמש ב ‪ Vmax‬אלא במהירות הרלוונטית למבחנה הנבדקת‪ .‬נסמנה ‪.V0‬‬
‫על מנת לחשב את ערכו של ‪ K2‬של כל אנזים‪ ,‬נשתמש במשוואה הבאה‪:‬‬
‫‪V‬‬ ‫) ‪∆OD410 * Vׂ( ml‬‬ ‫‪1‬‬
‫= ‪K 2 = max‬‬ ‫*‬
‫‪ET‬‬ ‫‪E‬‬ ‫‪* ε * t(min) 60‬‬
‫) ‪( mol‬‬
‫הערות‪:‬‬
‫* מכיוון שחישוב ‪ K2‬נובע מ ‪ ,V0‬פעילות אינזימטית‪ ,‬הרי שעלינו לעבוד עם מולים‪.‬‬
‫* מכיוון שהקבוע הקטליטי (‪ )K2‬בעל יחידות של ‪ , sec-1‬עלינו לחלק את הערך המתקבל ב ‪.60‬‬

‫‪17‬‬
 ‫‪. 2‬א ‪ -‬ע בור טר יפסין עם ‪: TLCK‬‬
‫מסת האנזים ‪25µg = 0.025mg -‬‬
‫‪( Mw‬מסה מולרית) ‪ 24000 -‬דלטון‬
‫מסה‬
‫= ‪:n‬‬ ‫חישוב מספר המולים של האינזים במערכות הריאקציה ייעשה על ידי שימוש במשוואה‪:‬‬
‫מסה מולרית‬
‫‪25 * 10 −6 g‬‬
‫=‪n‬‬
‫‪g‬‬
‫‪24000‬‬
‫‪mole‬‬

‫‪n = 1.04 * 10 −9 mol‬‬

‫‪n = 1.04 * 10 −3 µmol‬‬

‫בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות ‪O.D410 = 0.0265 - )7,8‬‬

‫‪ΔO.D = 0.007410 O.D‬‬
‫בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות ‪410 = 0.0195 - )5,6‬‬

‫‪0.007 * 3.3ml‬‬ ‫‪1‬‬

‫= ‪K2‬‬ ‫*‬
‫‪ml‬‬ ‫‪60‬‬
‫‪1.04 * 10 −3 µmol * 8.8‬‬ ‫‪* 15 min‬‬
‫‪µmol‬‬

‫‪1‬‬
‫‪K 2 = 2.8 * 10 − 3‬‬
‫‪sec‬‬

‫‪ -‬עבור כי מוטריפסין עם ‪: TPCK‬‬ ‫‪.2‬ב‬

‫מסת האנזים ‪60µg = 0.06mg -‬‬
‫‪( Mw‬מסה מולרית) ‪ 24000 -‬דלטון‬
‫מסה‬
‫=‪n‬‬ ‫חישוב מספר המולים של האינזים במערכות הריאקציה ייעשה על ידי שימוש במשוואה‪:‬‬
‫מסה מולרית‬
‫‪60 * 10 −6 g‬‬
‫=‪n‬‬
‫‪g‬‬
‫‪24000‬‬
‫‪mole‬‬

‫‪n = 2.5 * 10 −9 mol‬‬

‫‪n = 2.5 * 10 −3 µmol‬‬

‫בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות ‪O.D410 = 0.0375 - )21,22‬‬

‫בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות ‪ΔO.D = 0.0215410 = O.D 0.0160 - )17,18‬‬
‫‪410‬‬

‫‪0.0215 * 3.3ml‬‬ ‫‪1‬‬

‫= ‪K2‬‬ ‫*‬
‫‪ml‬‬
‫‪2.5 * 10 − 3 µmol * 8.8‬‬
‫‪60‬‬
‫‪* 15 min‬‬
‫‪µmol‬‬

‫‪1‬‬
‫‪K 2 = 3.58 * 10 − 3‬‬
‫‪sec‬‬

‫‪18‬‬
 ‫‪ . 3‬חישוב ‪ %‬עיכוב ‪:‬‬
‫‪ 100% − X ‬‬
‫‪ % = ‬עיכוב‬ ‫‪ * 100‬‬
‫‪ 100% ‬‬
‫‪ - 100%‬מתייחס לבליעה שהתקבלה במבחנה ללא מעכב שהכילה אתאנול‪.‬‬
‫‪ - X‬מתייחס לבליעה המתקבלת במבחנה עם מעכב לאחר החסרת מבחנת ביקורת‪.‬‬

‫‪. 3‬א ‪ -‬ע בור טר יפסין ‪: TLCK +‬‬

‫‪( 100%‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.2795 - )11,12‬‬
‫‪( - X‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.007 - )7,8‬‬

‫‪ 0.2795 − 0.007 ‬‬

‫‪ % = ‬עיכוב‬ ‫‪ * 100‬‬
‫‪‬‬ ‫‪0.2795‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ % = 97.5‬עיכוב‬
‫‪. 3‬א ‪ -‬ע בור טר יפסין ‪: TPCK +‬‬
‫‪( 100%‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.2795 - )11,12‬‬
‫‪( - X‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.4905 - )10, 9‬‬

‫‪ 0.2795 − 0.4905 ‬‬

‫‪ % = ‬עיכוב‬ ‫‪ * 100‬‬
‫‪‬‬ ‫‪0.2795‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ % = 75.5‬עיכוב‬

‫‪ . 3‬ג‪ -‬ע בור כימו טריפסין ‪: TPCK +‬‬

‫‪( 100%‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.0275 - )23,24‬‬
‫‪( - X‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.0375 - )22, 21‬‬

‫‪ 0.0275 − 0.0215 ‬‬

‫‪ % = ‬עיכוב‬ ‫‪ * 100‬‬
‫‪‬‬ ‫‪0.0275‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ % = 21.8‬עיכוב‬

‫‪ . 3‬ד‪ -‬ע בור כימו טריפסין ‪: TLCK +‬‬

‫‪( 100%‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.0275 - )24, 23‬‬
‫‪( - X‬ממוצע בליעה במבחנות ‪0.227 - ) 19,20‬‬

‫‪ 0.0275 − 0.0215 ‬‬

‫‪ % = ‬עיכוב‬ ‫‪ * 100‬‬
‫‪‬‬ ‫‪0.0275‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ % = 725‬עיכוב‬

‫דיון ומסקנות‬
‫‪19‬‬
 ‫טבלה ‪ : 5‬ריכוז חי שובים‪:‬‬
‫כי מוט ריפסין‬ ‫טר יפסין‬
‫‪µmol‬‬ ‫‪µmol‬‬ ‫פעילות ספציפית‪S.A -‬‬
‫‪8.96 * 10 −3‬‬ ‫‪0.007‬‬
‫‪mg * min‬‬ ‫‪mg * min‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫קבוע קטליטי ‪K2 -‬‬
‫‪3.58 * 10 − 3‬‬ ‫‪2.8* 10 − 3‬‬
‫‪sec‬‬ ‫‪sec‬‬
‫‪21.8‬‬ ‫‪97.5‬‬ ‫‪ %‬עיכוב עם מעכב ספציפי‬
‫‪725‬‬ ‫‪75.5‬‬ ‫‪ %‬עיכוב עם מעכב לא ספציפי‬

‫טבלה מספר ‪ : 6‬סיכום ה ממצאים‪:‬‬

‫תוצאו ת ‪ +‬מסקנות‬ ‫מ טר ת ה ניסוי‬ ‫מ בחנה‬
‫התרחשה תגובה;‬ ‫מדידת התאמת סובסטרט לאנזים‬ ‫‪2,1‬‬
‫‪ BAPNA‬הינו הסובסטרט הספציפי לטריפסין‪.‬‬ ‫טריפסין ‪ +‬סובסטרט ‪.BAPNA‬‬
‫לא נצפתה תגובה;‬ ‫מדידת התאמת סובסטרט לאנזים‬ ‫‪3,4‬‬
‫‪ BAPNA‬אינו סובסטרט ספציפי לכימוטריפסין‪.‬‬ ‫כימוטריפסין ‪BAPNA +‬‬
‫לא נצפתה תגובה;‬ ‫בדיקת השפעת ‪ HCl‬על כמות התוצר‬ ‫‪5,6‬‬
‫‪ HCl‬אינו משפיע על קבלת תוצר‪.‬‬ ‫(‪ HCl‬הינו הממס של האינזימים)‬
‫מדידת פעילות טריפסין בנוכחות מעכב בלתי לא נצפתה תגובה;‬ ‫‪7,8‬‬
‫‪ TLCK‬הינו מעכב ספציפי של הטריפסין‪ .‬זהו‬ ‫הפיך‬
‫מעכב בלתי הפיך‪.‬‬ ‫ספציפי לטריפסין ‪ +‬בדיקת ספציפיות‬
‫המעכב‪.‬‬
‫התרחשה תגובה;‬ ‫מדידת פעילות הטריפסין בנוכחות מעכב‬ ‫‪9,10‬‬
‫ה ‪ TPCK‬אינו מעכב של הטריפסין‬ ‫בלתי הפיך‬
‫ספציפי ‪ +‬בדיקת ספציפיות המעכב‪.‬‬
‫התרחשה תגובה;‬ ‫בדיקת השפעת אתאנול על כמות התוצר‬ ‫‪11,12‬‬
‫אתאנול אינו משפיע על קבלת תוצר‪.‬‬ ‫(אתאנול הינו הממס של המעכבים)‪.‬‬
‫לא התרחשה תגובה;‬ ‫בדיקת התאמת אנזים טריפסין לסובסטרט‬ ‫‪13,14‬‬
‫‪ BAPNA‬אינו סובסטרט ספציפי לטריפסין‪.‬‬ ‫‪.BTPNA‬‬
‫התרחשה תגובה;‬ ‫בדיקת התאמת אנזים כימוטריפסין‬ ‫‪15,16‬‬
‫‪ BTPNA‬הינו סובסטרט ספציפי לכימוטריפסין‪.‬‬ ‫לסובסטרט ‪.BTPNA‬‬
‫לא נצפתה תגובה;‬ ‫בדיקת השפעת ‪ HCl‬על כמות התוצר‬ ‫‪17,18‬‬
‫‪ HCl‬אינו משפיע על קבלת תוצר‪.‬‬ ‫(‪ HCl‬הינו הממס של האינזימים)‬
‫התרחשה תגובה;‬ ‫מדידת פעילות כמוטריפסין בנוכחות מעכב‬ ‫‪19,20‬‬
‫ה ‪ TLCK‬אינו ספציפי לכימוטריפסין ולכן אינו‬ ‫בלתי הפיך ספציפי ‪ +‬בדיקת התאמת‬
‫משפיע‪.‬‬ ‫המעכב‪.‬‬
‫מדידת פעילות האנזים בנוכחות מעכב בלתי לא נצפתה תגובה;‬ ‫‪21,22‬‬
‫ה ‪ TPCK‬הינו מעכב ספציפי של כימוטריפסין‪.‬‬ ‫הפיך‬
‫ספציפי‪ +‬בדיקת ספציפיות המעכב‪.‬‬
‫לא התרחשה תגובה;‬ ‫בדיקת השפעת אתאנול על כמות התוצר‬ ‫‪23,24‬‬
‫אתאנול אינו משפיע על קבלת תוצר‪)*(.‬‬ ‫(אתאנול הינו הממס של המעכבים)‪.‬‬
‫* לא התרחשה תגובה דבר שנוגד את הציפיות היות והכימוטריפסין הושם עם הסובסטרט ‪ ,ATPNA‬הספציפי‬
‫לו ולא היה אף מעכב במערכת (אתאנול אינו משפיע על קבלת התוצר)‪.‬‬

‫‪20‬‬
 ‫בניסוי זה נבדקו שני האינזימים הפרוטאוליטים ‪ -‬טריפסין וכימוטריפסין‪.‬‬
‫כאמור‪ ,‬לשני אינזימים אלו מבנה ראשוני ומרחבי דומה אך הם הינם בעלי ספציפיות שונה הנגרמת כתוצאה‬
‫מהמצאותן של חומצות אמינו שונות בתחתיתו של האתר הקושר ("הכיס ההידרופובי")‪.‬‬
‫בטריפסין הקשירה נובעת מאינטרקציות יוניות בין החומצה האספרטית‪ ,‬בעלת המטען השלילי‪ ,‬לבין סובסטרט‬
‫טעון חיובית עליו מצויות חומצות אמינו בסיסיות‪ ,‬בעוד שבכימוטריפסין האינטראקציה הינה הידרופובית‬
‫כתוצאה מהמפגש בין הסרין‪ ,‬חסרת המטען‪ ,‬לבין הטבעת הבנזנית של הסובסטרט‪.‬‬
‫יש לזכור כי האינטראקציה היונית‪ ,‬המתרחשת בטריפסין הינה חזקה יותר מזו שבכימוטריפסין ועל כן‬
‫הסובסטרטים הספציפיים של הטריפסין בעלי ‪ Km‬נמוך בהשוואה לאלו של הכימוטריפסין‪.‬‬
‫הסובסטרט ‪ BAPNA‬מכיל בתוכו את חומצת האמינו ארגנין שהיא בעלת מטען חיובי‪ ,‬בעוד שב ‪ATPNA‬‬
‫מצוייה חומצת האמינו טירוזין‪ ,‬שהיא לא פולרית ובעלת טבעת בנזנית‪.‬‬
‫כאמור‪ ,‬ייחודיות זו מושתת על מבנה האתר הקושר‪ .‬על כן‪ ,‬בהסתמך על עובדה זו ועל תוצאות הניסוי ניתן‬
‫לומר כי אכן‬
‫ה ‪ BAPNA‬הינו הסובסטרט הספציפי לטריפסין (נוצר קשר בין החומצה אספרטית בעלת המטען השלילי לבין‬
‫הארגנין בעלת המטען החיובי) ואילו ה ‪ ATPNA‬הינו הספציפי לכימוטריפסין (נוצר קשר בין הסרין חסרת‬
‫המטען לבין הטבעת הבנזנית של טירוזין הלא פולרית)‪.‬‬
‫ספציפיות המעכבים לאנזימים השונים תלויה גם כן במבנה המרחבי והרכבו של האתר הקושר ובהתאמתו‬
‫למעכב הספציפי‪ TLCK .‬בעל מבנה מרחבי הדומה ל ‪( BAPNA‬לחלק ממנו) ואילו ל ‪ TPCK‬יש מבנה מרחבי‬
‫דומה לחלק מה ‪.ATPNA‬‬
‫על כן‪ ,‬מתוך ספציפיות אינזים‪-‬סובסטרט‪ ,‬ניתן להשליך על ספציפיותם של מעכבים אלו; לטריפסין‬
‫ולכימוטריפסין בהתאמה‪.‬‬
‫מעכבים אלו הינם בלתי הפיכים וזאת כתוצאה מאלקילציה של היסטדין (‪ )Hist 57‬באתר הפעיל של‬
‫האינזימים‪ ,‬דבר המביא ליצירת קשר קוולנטי בלתי הפיך בין המעכב לאינזים‪.‬‬
‫* יש לציין כי בשני המעכבים הינם החלק שפונה לאתר הקטליטי שונה מזה של הסובסטרט ולכן לא תהיה‬
‫תגובה אנזימתית‪.‬‬

‫מבחינה קינטית‪ ,‬פעילותו הספציפית של כימוטריפסין גבוהה יותר מזו של הטריפסין וזאת מכיוון שהקשר היוני‬
‫חזק יותר מהאינטראקציה הידרופובית‪ .‬אולם‪ ,‬הקבוע הקטליטי‪ ,K2 ,‬של כימוטריפסין שהתקבל בחישובים גבוה‬
‫יותר מזה של טריפסין כלומר יותר מולקולות סובסטרט הופכות לתוצר בעזרת כימוטריפסין מאשר בטריפסין‪,‬‬
‫בפרק זמן זהה‪ .‬קביעה זו נוגדת את מה שהיה אמור לקרות ועל כן ניתן להסיק כי קיימות בניסוי שגיאות רבות‪,‬‬
‫אשר השפיעו על התוצאות באופן דרסטי‪.‬‬

‫על סמך תוצאות הבליעה ניתן לקבוע ספציפיות אינזים‪-‬מעכב ואינזים‪-‬סובסטרט אולם על סמך חישובי אחוזי‬
‫העיכוב ניתן רק לקבוע כי ‪ BAPNA‬הינו אכן המעכב הספציפי של הטריפסין‪ .‬לעומת זאת כתוצאה משגיאות‬
‫ניסוי‪ ,‬אותן נפרט בהמשך‪ ,‬התקבלו תוצאות הפוכות בקשר לכימוטריפסין ‪ -‬אחוז העיכוב גבוה יותר כאשר‬
‫המעכב איננו ספציפי‪.‬‬

‫יש לציין כי כל הסטיות והתוצאות ההפוכות שקיבלנו נובעות כנראה מעצם העובדה כי במבחנות ‪ 23-24‬היתה‬
‫אמורה להתרחש תגובה‪ ,‬דבר שלא קרה וכאמור השפיע על כל החישובים‪.‬‬

‫השגיאו ת ה אפשריות בניסוי‪:‬‬

‫א‪ .‬שגיאות מדידה של מבצעות הניסוי‪.‬‬
‫ב‪ .‬סטיות של המכשירים בהם השתמשנו‪.‬‬
‫ג‪ .‬ניקיון ואיכותם של החומרים בהם השתמשנו‪ :‬בחומרים ישנים‪ ,‬לא נקיים‪ ,‬ריכוזים לא מדוייקים וכדומה‬
‫(למשל‪ :‬הבופר לא‬
‫שמר על ‪ pH‬קבוע)‪.‬‬
‫ד‪ .‬תנאי טמפרטורה שונים בין המערכות‪.‬‬

‫‪21‬‬