‫שחר אברמוביץ' ‪42834770‬‬

‫תהילה בוקרה‪-‬שתיוי ‪392840231‬‬

‫גבור בני ‪40590697‬‬
‫מיקרוביולוגיה מעבדה מס' ‪3‬‬
‫מטרות המעבדה‪:‬‬
‫היכרות שיטות לספירת חיידקים‪.‬‬

‫השיטות‪:‬‬
‫עכירות – שיטה עקיפה לספירת חיידקים העוקבת אחר מידת העכירות‬
‫המשתנה באופן יחסי (בתחום הלינארי) עם ריכוז החיידקים שבתרחיף‪ .‬בניסוי‬
‫שלנו – ריכוז החיידקים כנגד בליעה‪ ,‬ע"י ספקטרופוטומטר (סדרת מיהולים‬
‫ועקומת כיול על פיהם)‪.‬‬
‫מיקרוספקופית – שיטה חצי ישירה לספירת חיידקים‪ ,‬בה עשינו ספירת‬
‫חיידקים בתא ספירה בעל נפח ידוע המחולק למשבצות שוות גודל במיקרוסקופ‬
‫פאזות‪ .‬מתוך יחידת נפח קטנה וידועה חישבנו את ריכוז החיידקים בנפח‬
‫הכולל‪.‬‬
‫חיה ‪ -‬שיטה ישירה לספירת חיידקים המתבססת על זריעת חיידקים בנפח ידוע‬
‫על מצע מוצק‪ .‬ספירת מושבות החיידקים מתבצעת כשההנחה היא שכל‬
‫מושבה נוצרת מחיידק בודד‪.‬‬

‫ניסוי מספר ‪ – 1‬מדידת ריכוז חיידקים עפ"י עכירות‬

‫מטרת הניסוי‪ :‬יצירת עקומת כיול של ריכוז החיידקים כנגד עכירות באורכי גל‬
‫שונים‪ ,‬ומציאת אורך הגל האופטימלי לעקומת הכיול‪.‬‬

‫צפי‪ :‬נצפה לראות קשר לינארי בין ריכוז החיידקים לעוצמת הבליעה‪O.D ,‬‬
‫(עלייה בבליעה עם העלייה בריכוז)‪ .‬בנוסף אורכי גל שונים ייתנו רמת עכירות‬
‫שונה בריכוזים זהים שכן ככל שאורך הגל קצר יותר‪ ,‬כך תדירותו והאנרגיה שלו‬
‫גבוהה יותר ולכן יכול לפגוע ביותר חלקיקים דבר אשר יצטייר בעיננו כעכירות‬
‫גבוהה‪ .‬ברכוזים גבוהים במיוחד (תרבית מרוכזת)‪ ,‬נצפה לראות יציאה‬
‫מלינאריות שכן המכשיר אינו יכול להבדיל בין מצבים חשוכים יותר או פחות‪.‬‬

‫תוצאות הניסוי‪:‬‬

‫‪6‬‬ ‫‪1:128‬‬ ‫‪1:64‬‬ ‫‪1:32‬‬ ‫‪1:16‬‬ ‫‪1:8‬‬ ‫‪1:4‬‬ ‫‪1:2‬‬ ‫מקור‬ ‫אורך גל‬
‫‪7‬‬ ‫‪0.024‬‬ ‫‪0.067‬‬ ‫‪0.135‬‬ ‫‪0.294‬‬ ‫‪0.567‬‬ ‫‪1.057‬‬ ‫‪1.803‬‬ ‫‪2.442‬‬ ‫‪610‬‬
‫‪3‬‬ ‫‪0.044‬‬ ‫‪0.083‬‬ ‫‪0.166‬‬ ‫‪0.372‬‬ ‫‪0.693‬‬ ‫‪1.223‬‬ ‫‪1.930‬‬ ‫‪2.545‬‬ ‫‪540‬‬
‫‪4‬‬ ‫‪0.045‬‬ ‫‪0.097‬‬ ‫‪0.0197‬‬ ‫‪0.435‬‬ ‫‪0.779‬‬ ‫‪1.259‬‬ ‫‪1.834‬‬ ‫‪2.358‬‬ ‫‪420‬‬
‫‪8‬‬
‫‪1.28 ⋅ 109‬‬ ‫‪2.56 ⋅ 109‬‬ ‫‪5.12 ⋅ 10 9 1.02 ⋅10 10‬‬ ‫‪2.04 ⋅1010‬‬ ‫‪4.08 ⋅10‬‬‫‪10‬‬
‫‪8.19 ⋅ 10‬‬‫‪10‬‬
‫‪1.64 ⋅10‬‬‫‪11‬‬
‫ריכוז‬
‫•הקריאה היא ביחידות ‪O.D‬‬
‫חישוב ריכוז חיידקים נעשה במיהול ‪: 1:32‬‬
‫‪C = 5.12 ⋅ 10 9‬‬

‫דיון ומסקנות‪:‬‬
 ‫‪.1‬חישבנו את ריכוז החיידקים לגרף עפ"י הספירה המיקרוסקופית‪,‬‬
‫מכיוון שספירה זו לוקחת בחשבון גם חיידקים חיים וגם מתים‪ ,‬כפי‬
‫שעושה זאת מדידת עכירות בספקטרופוטומטר‪.‬‬
‫‪.2‬בניית עקומת כיול תוך שימוש בנתוני ה‪ O.D -‬שקיבלנו שימשה‬
‫לחישוב ריכוז החיידקים‪ .‬העקומה הסופית מתבססת על בסיס‬
‫הנקודות הנמצאות בתחום הלינארי בלבד‪.‬‬
‫יציאה מלינאריות נובעת משתי סיבות עיקריות‪:‬‬
‫‪ .1‬הסיבה הביולוגית (בריכוזים גבוהים)‪:‬‬
‫•מיסוך חיידקים במצע ע"י חיידקים אחרים‪.‬‬
‫•קרן האור הפוגעת בחיידק מסויים מוסטת ממסלולה בזוית שונה ע"פ‬
‫גודל החיידק‪ ,‬ועשויה לפגוע בחיידקים אחרים‪ ,‬וע"י כך תפגע חזרה‬
‫בגלאי‪ ,‬דבר שיתפרש כחוסר פיזור‪.‬‬
‫במקרה זה היציאה מלינאריות עבור ‪ 3‬אורכי הגל השונים תהיה‬
‫באותו ריכוז‪.‬‬
‫‪ .2‬הסיבה הפיזיקלית‪:‬‬
‫‪-‬המכשיר לא מבדיל בין מצב של "חשוך" ו"חשוך יותר"‬
‫בשל רגישות מוגבלת של המכשיר לעוצמות אור‬
‫נמוכות‪.‬‬
‫‪-‬בריכוזים נמוכים – המכשיר לא מבחין בין "אור" ו"יותר‬
‫אור" בגלל אותן סיבות‪.‬‬
‫בגרף נצפה לקבל‪ ,‬במקרה זה‪ ,‬שבירה של שלושת אורכי הגל באותה‬
‫בליעה‪.‬‬
‫‪.3‬בכל אחד מאורכי הגל התקבלו ערכי ‪ .O.D‬שונים‪ ,‬זאת משום שלכל‬
‫אורך גל סיכוי שונה לפגוע בחיידקים‪ .‬ככל שאורך הגל קצר יותר‪,‬‬
‫סיכויו לפגוע בחיידקים גבוה יותר‪.‬‬
‫‪.4‬במיהול ‪( 1/2‬הריכוז הגבוה מבין סדרת המיהולים) קיבלנו ערכי ‪.O.D‬‬
‫גבוהים יותר באורך גל ‪ 540nm‬לעומת אורך גל ‪ .420nm‬נתון זה לא‬
‫תואם את ציפיותנו (אורך גל קצר יותר‪ ,‬העכירות גבוהה יותר)‪ .‬ניתן‬
‫להסביר סטייה זו בכך שרגישות המכשיר‪ ,‬לא גבוהה בריכוזים‬
‫גבוהים ולכן התוצאה אינה מהימנה‪.‬‬
‫‪.5‬שיטת מדידה עפ"י עכירות מבוססת על פיזור קרן האור אחרי‬
‫פגיעתה בחלקיק‪ .‬כאשר קרן אור פוגעת בחלקיק שגודלו יותר מחצי‬
‫אורך הגל שלה‪ ,‬היא סוטה ממסלולה ומאבדת מעוצמתה‪ ,‬כלומר‪,‬‬
‫מתפזרת (תכונה פיזיקלית של הקרן)‪ .‬מידת הפיזור (מדד לעכירות)‬
‫של החיידקים בתרחיף תלויה בצפיפות‪/‬ריכוז החיידקים‪ ,‬גודלם אורך‬
‫הגל שעובר‪.‬‬
‫הספקטרופוטומטר מאפשר את מדידת העוצמה של הבליעה‪+‬פיזור‬
‫‪l‬‬
‫בהתאם לנוסחת בר‪-‬למברט‪ – I0( A = log l :‬עוצמת האור הנכנס‪– I ,‬‬
‫‪0‬‬

‫עוצמת האור היוצא)‪.‬‬

‫במעבדה זו עבדנו עם חיידקי ‪ E.coli‬שהם חיידקים שקופים‪ ,‬לכן‬
‫הקריאה בספקטרופוטומטר הצביעה רק על פיזור‪.‬‬
‫הערה‪ :‬בליעה היא תכונה מולקולרית‪ ,‬במהלכה פוטון פוגע במולקולה‬
 ‫וגורם לעירור אלקטרונים‪ ,‬שפולטים את אנרגית הפוטון כאנרגיה‬
‫חלופית כאשר הם שבים לרמת האנרגיה שלהם‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬פיזור‬
‫תלוי בתכונות החלקיק (צורתו‪ ,‬גודלו וכדומה)‪.‬‬
‫מדידות בליעה ומדידות פיזור אור מצביעות על רמת הצפיפות של‬
‫החיידקים‪ .‬ככל שהצפיפות עולה‪ ,‬יעלו ערכי ה‪ ,.O.D-‬באורכי הגל‬
‫המתאימים‪.‬‬
‫לפי תוצאות הקריאות בספקטרופוטומטר‪ ,‬בנינו עקומת כיול‬
‫(המתאימה רק לסוג חיידקים ספציפי זה ולתנאי הגידול הספציפיים‪,‬‬
‫כגון‪ :‬מצע‪ ,‬טמפרטורה‪ ,‬שלב גידול ועוד) ומתוכו חישבנו את פקטור‬
‫העכירות (מתוך התחום הלינארי)‪.‬‬

‫פקטור העכירות – קבוע המראה את היחס בין ריכוז החיידקים לבין‬

‫הצפיפות האופטית‪ .‬קבוע זה נכון עבור חיידק ספציפי‪ ,‬באורך גל מסוים‬
‫ובתנאי גידול מסוימים (‪ ,pH‬טמפרטורה‪ ,‬סוג מצע ועוד)‪.‬‬
‫את ערך הפקטור ניתן לחשב עפ"י הנוסחה‪ – a ( , F = 1a :‬שיפוע הישר)‪.‬‬
‫משוואת הישר‪ b , O.D. = aC + b :‬מתאפס כיוון שאיפסנו את המכשיר‬
‫‪C‬‬
‫=‪F‬‬
‫באמצעות תמיסת בלנק (ולכן יש לנו נקודת (‪ )0,0‬בגרף)‪ .‬מכאן‪O.D. ,‬‬
‫חישוב הפקטור עבור כל אחד מאורכי הגל (הנקודות נלקחו מתוך עקומת‬
‫הכיול)‪:‬‬

‫אורך גל ‪420nm‬‬
‫‪C‬‬ ‫‪5.12 ⋅ 10 9‬‬
‫=‪F‬‬ ‫=‬ ‫‪= 2.44 ⋅ 1010‬‬
‫‪O.D.‬‬ ‫‪0.21‬‬
‫אורך גל ‪540nm‬‬
‫‪C‬‬ ‫‪5.12 ⋅ 10 9‬‬
‫=‪F‬‬ ‫=‬ ‫‪= 3.01 ⋅ 1010‬‬
‫‪O.D.‬‬ ‫‪0.17‬‬
‫אורך גל ‪660nm‬‬
‫‪C‬‬ ‫‪5.12 ⋅ 10 9‬‬
‫=‪F‬‬ ‫=‬ ‫‪= 3.56 ⋅ 1010‬‬
‫‪O.D.‬‬ ‫‪0.44‬‬
 ‫‪.6‬בהתאם לריכוז החיידקים יבחר אורך הגל המועדף‪:‬‬
‫‪-‬בריכוזים נמוכים‪ ,‬נעדיף אורך גל קצר יותר משום שיש‬
‫לו סיכוי גבוה יותר לפגוע בחלקיקים‪ ,‬כך שמקבלים‬
‫תוצאות מדויקות יותר‪.‬‬
‫‪-‬בריכוזים גבוהים‪ ,‬נעדיף לעבוד עם אורך גל ארוך יותר‬
‫מכיוון שהיציאה מהתחום הלינארי של אורך גל ארוך‬
‫הינה בשלב מאוחר יותר‪ ,‬בריכוזים גבוהים יותר‪.‬‬
‫כלומר‪ ,‬הטווח הלינארי שלו הוא הארוך ביותר‪.‬‬
‫לינאריות מסמלת יחס ישר בין ריכוז החיידקים לצפיפותם האופטית‬
‫ולכן נבחר באורך גל בו הטווח הלינארי הוא הגדול ביותר‪.‬‬
‫את אורך הגל המתאים לקביעת עכירות חיידקי ‪ E.coli‬כמדד לריכוזם‬
‫בחרנו לפי אורך הגל בעל הטווח הלינארי הארוך ביותר – אורך הגל‬
‫המתאים לטווח זה הוא ‪.660nm‬‬
 ‫ניסוי מס' ‪ – 2‬ספירה מיקרוסקופית‬

‫מטרה‪ :‬ספירה של חיידקים בתא ספירה והסקה לגבי ריכוז החיידקים בתרחיף‬
‫המקורי‪.‬‬

‫צפי‪ :‬בספירה זו נסיק לגבי ריכוז החיידקים בתרחיף המקורי‪ ,‬נצפה שריכוז‬
‫החיידקים ישקף את הריכוז בתרחיף המקורי נאמנה‪ ,‬מפני שגם בתרחיף וגם‬
‫בתאי הספירה יש לנו חיידקים מתים וחיים‪.‬‬

‫תוצאות‪:‬‬
‫ספרנו ‪ 8‬משבצות במיהול של ‪ 1/32‬והתקבלו מספרי החיידקים הבאים‪:‬‬
‫‪6,8,7,13,9,10,12,7,6,6‬‬
‫ממוצע – ‪ 8‬חיידקים למשבצת‪.‬‬
‫חישוב נפח משבצת‪:‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1cm 3‬‬ ‫‪1ml‬‬
‫= ‪V‬‬ ‫= ‪mm 2 × mm‬‬ ‫× ‪mm 3‬‬ ‫×‬ ‫‪= 5 × 10 −8 ml‬‬
‫‪400‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪20,000‬‬ ‫‪1,000mm 1cm 3‬‬
‫‪3‬‬

‫חישוב ריכוז החיידקים בתרחיף המקורי‪:‬‬

‫‪a × n bac‬‬
‫=‪C‬‬
‫‪V ml‬‬
‫כאשר‪:‬‬
‫מס' חיידקים ממוצע למשבצת ‪= n‬‬
‫מיהול = ‪a‬‬
‫נפח משבצת = ‪V‬‬
‫‪32 × 8‬‬ ‫‪bac‬‬
‫=‪C‬‬ ‫‪−8‬‬
‫‪= 5.12 × 10 9‬‬
‫‪5 × 10‬‬ ‫‪ml‬‬
‫דיון ומסקנות‪:‬‬
‫‪.1‬בחרנו להשתמש במיהול של ‪ 1:32‬כיוון שבו נקבל בתא הספירה מס'‬
‫חיידקים שנוכל לספור בצורה סבירה‪ .‬במיהול גדול יותר מס'‬
‫החיידקים היה אפסי והסיכוי לסטייה סטטיסטית היה גדל‪ .‬במיהול‬
‫קטן יותר הספירה תהיה כמעט בלתי אפשרית מכיוון שמס' החיידקים‬
‫יהיה גדול ותיתכן ספירה חוזרת של אותם החיידקים‪.‬‬
‫‪.2‬החיידקים החיים היו בתנועה‪ ,‬דבר שהקשה על הספירה ועלול היה‬
‫לגרום לאי דיוקים (ספירת אותו החיידק פעמיים וכו') ‪.‬‬
‫‪.3‬על סמך הריכוז ההתחלתי שחישבנו מספירה זו‪ ,‬נחשב בניסוי הבא‬
‫את ערכי המיהולים עבור הספירה החיה‪ .‬כמו כן אנו משתמשים‬
‫בניסוי זה לחישוב פקטור העכירות לעורכי הגל השונים בניסוי ‪.1‬‬
 ‫ניסוי מס' ‪ – 3‬ספירה חיה‪:‬‬

‫מטרה‪ :‬ביצוע מיהולים ע"ס הריכוז שהתקבל בספירה המיקרוסקופית‪ ,‬וזריעה‬

‫ע"ג מצע מוצק ‪ LB‬לקבלת מושבות אחדות‪ ,‬עשרות ומאות‪.‬‬

‫צפי‪ :‬בזריעת תרחיף חיידקים במיהול של ‪ 10-8‬נקבל מושבות אחדות ‪,‬במיהול‬

‫של ‪ 10-7‬נקבל עשרות מושבות‪ ,‬במיהול של ‪ 10-6‬נקבל מאות מושבות‪ .‬כמו כן‪,‬‬
‫בחישוב הריכוז ההתחלתי נצפה לקבל מספר קרוב לזה של הספירה‬
‫המיקרוסקופית‪.‬‬

‫תוצאות‪:‬‬
‫ריכוז חיידקים מחושב‬ ‫מס' מושבות‬ ‫מס'‬ ‫מיהול‬
‫ממוצע‬ ‫מושבות (‬ ‫התרחיף (‪)a‬‬
‫‪)n‬‬
‫‪10 8 × 29‬‬ ‫‪bac‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪10-8‬‬
‫=‪C‬‬ ‫‪= 2.9 × 1010‬‬
‫‪0.1‬‬ ‫‪ml‬‬
‫‪10 × 195.5‬‬
‫‪7‬‬
‫‪bac‬‬ ‫‪195.5‬‬ ‫‪155‬‬ ‫‪10-7‬‬
‫=‪C‬‬ ‫‪= 1.96 × 10 9‬‬
‫‪0.1‬‬ ‫‪ml‬‬ ‫‪236‬‬
‫לא ניתן‬ ‫‪10-6‬‬
‫היה לספור‬

‫‪bac‬‬
‫‪Χ = 1.55 × 1010‬‬ ‫ממוצע‪:‬‬
‫‪ml‬‬

‫דיון ומסקנות‪:‬‬
‫‪ .1‬כל המושבות היו עגולות‪ ,‬ובצבע לבן עכור‪ ,‬ומכאן שניתן להניח שהמושבות‬
‫הן כולן של ‪.E.coli‬‬
‫‪ .2‬בניגוד לציפיות בספירה החיה‪ ,‬המושבות שקיבלנו היו בסדר גודל אחד יותר‬
‫ממה שרצינו‪ .‬במאות אף קיבלנו רצף כמעט אחיד ובלתי ניתן לספירה של‬
‫חיידקים‪ .‬ניתן להסביר זאת במיהול לא נכון או עבודה לא סטרילית‪.‬‬
‫‪bac‬‬
‫‪ , C = 5.12 ⋅ 10 9‬ואילו בספירה‬ ‫‪ .3‬בספירה המיקרוסקופית קיבלנו ריכוז של‬
‫‪ml‬‬
‫‪bac‬‬
‫‪ . C = 1.55 × 1010‬ייתכן והבדל זה נובע מכך‬ ‫החיה קיבלנו ריכוז ממוצע של‬
‫‪ml‬‬
‫שה‪ CFU -‬היה מורכב ממס' חיידקים בשל זריעה לא אחידה‪ .‬בנוסף מכיוון‬
‫שהתוצאות הספירה החייה גדולה מהציפיות לא ניתן לקבוע חד משמעית את‬
‫ההבדל‪ .‬היינו מצפים כי דווקא במקרוסקופית יהיו יותר חיידקים שכן בספירה זו‬
‫אנו סופרים גם חיידקים מתים (שלא יקימו מושבות בחיה)‪.‬‬