‫מעבדה מס' ‪ :2‬מיקרוביולוגיה‬

‫את עולם החי והצומח ניתן לחלק ל‪ 2-‬קבוצות‪:‬‬

‫‪ .1‬אוקריוטים (‪ – )eukaryote‬שהם יצורים בעלי גרעין מוגדר וציטופלסמה (חד תאיים ורב‬
‫תאים) הכוללים את כל צורות החיים למעט וירוסים וחיידקים‪.‬‬
‫‪ .2‬פרוקריוטים (‪ – )prokaryote‬חיידקים (‪ )bacteria‬יצורים חיים חסרי גרעין הנקראים גם‬
‫אובקטריה (‪ )eubacteria‬על מנת להבדילם מקבוצה הארכאה (‪ )archaea‬שהם כעין‬
‫קבוצת ביניים המיוחדת בזה שהם גדלים בטמפרטורות גבוהות במיוחד ובתנאים‬
‫קיצוניים (כגון ים המלח‪ ,‬גייזרים וכו')‪.‬‬
‫המיקרוביולוגיה הוא מדע העוסק במבנה ובתפקוד של מיקרואורגניזמים שהם יצורים חיים‬
‫שהעין לא יכולה לראות‪ ,‬כלומר יצורים קטנים מ‪ 1-‬מ"מ‪.‬‬
‫להלן מספר דוגמאות לשם השוואה וקבלת מושג על סדרי הגודל‪:‬‬
‫תא דם אדום ‪8µm‬‬
‫‪1µm = 10 m‬‬‫‪-6‬‬
‫תא עצב ‪20µm‬‬
‫יצור אוקריוטי חד תאי ‪140µm‬‬
‫חיידקים ‪ 1-5µm‬באורך ‪ 0.1-0.5µm‬ברוחב‬
‫וירוסים ‪0.2µm‬‬
‫החיידקים מופיעים במספר רב ובמגוון של סוגים בסביבות גידול רבות‪ ,‬באוויר בים ביבשה בגוף‬
‫האדם ובבע"ח שונים‪ .‬לחיידקים תפקיד חשוב ביותר בפרוק ומיחזור בטבע‪ ,‬אך הם גם גורמי‬
‫מחלות‪ .‬אין לתאר את ההתפתחות הביוטכנולוגיה ללא הידע הרחב בתחום הבקטריולוגיה‪ ,‬כי‬
‫חשיבות החיידקים היא עצומה‪.‬‬
‫לחיוב‪ -‬כמו בחקלאות‪ ,‬בתעשיית מזון ובתעשיות כמו כריית מתכות ובתעשיית התרופות‪.‬‬
‫לשלילה‪ -‬כגורמי מחלות ואחראיים לנזקים כבדים ע"י יצירת ביופילמים (‪ )Biofilm‬בגוף האדם‬
‫או בסביבה‪.‬‬

‫מורפולוגיה של חיידקים‬
‫ענף הדן בגודל צורה ופרטי המבנה של החיידקים‪ ,‬ארגונם בצברים לאחר החלוקה ובהופעה של‬
‫מושבות ע"ג מצע מזון מוצק‪.‬‬

‫צורות התא השכיחות הם‪:‬‬

‫נקדים ‪ -‬צורתם עגולה ונראים ככדור‪ .‬נקראים ‪ -coccus‬ביחיד‪-cocci ,‬‬
‫ברבים‪.‬‬
 ‫מתגים ‪ -‬מקלונים ארוכים או קצרים הנקראים ‪ -bacillus, rod‬ביחיד‪ -rods, bacilli ,‬ברבים‪.‬‬
‫סלילונים – צורה גלית ארוכה או קצרה וכן ‪ -vibrio‬חיידקים שנראים כמו מקלון מעוקם‪.‬‬
‫התא הבודד יכול להכיל גם ספורה (צורה עמידה של החיידק) קפסולה ‪ ,‬פלגלה או פילי‪.‬‬

‫ארגון התאים בצברים‪:‬‬

‫צורת הופעה אופינית של התאים לאחר החלוקה‪ .‬החיידקים יכולים להישאר כתא יחיד או‬
‫להופיע כזוגות (דיפלוקוקים או דיפלובצילים) בשרשרות‪ ,‬בטטרדות או בצברים דמויי אשכול‬
‫ענבים (‪.)cluster‬‬

‫הופעת מושבות ע"ג מצע מוצק‪:‬‬

‫במצע מוצק מוגבלת לרוב יכולת התנועה של החיידקים‪ ,‬לכן תאי הבת נשארים סמוכים זה לזה‬
‫ויוצרים מושבה אופיינית לכל חיידק וחיידק‪ .‬תאור מאפייני המושבה הוא כלי חשוב לצורך אפיון‬
‫החיידק‪.‬‬
‫תאור מושבה של חיידקים נעשה לפי הפרמטרים הבאים‪:‬‬
‫‪ .1‬גודל מושבה (גדולה‪ ,‬בינונית או קטנה)‪.‬‬
‫‪ .2‬צורת המושבה (עגולה‪ ,‬אירגולרית)‪.‬‬
‫‪ .3‬צורת ההתרוממות (קעור‪ ,‬קמור‪ ,‬שטוח –עפ"י‬
‫התבוננות במושבה מהצד)‪.‬‬
‫‪ .4‬שוליים (עגולים או משוננים)‪.‬‬
‫‪ .5‬פני השטח [מחוספסים )‪ Rough(R‬או חלקים‬
‫)‪.]Smooth(S‬‬
‫‪ .6‬תכונות אופטיות (אטום‪ ,‬שקוף)‪.‬‬
‫‪ .7‬פיגמנט‪.‬‬

‫חיידקים בסביבתם הטבעית‬

‫הרכב אוכלוסיות מיקרוביאליות בסביבתן הטבעית (אויר‪ ,‬אדמה‪ ,‬מים‪ ,‬גוף אדם) נקבעת ע"י‬
‫גורמים רבים כגון; ריכוז החומר האורגני‪ ,‬ריכוז וסוג המלחים‪ ,‬נוכחות חמצן‪ ,‬טמפרטורה וכו'‪.‬‬
‫באוויר – נמצאים חיידקים והם נישאים ממקום למקום‪ .‬כאשר הם נוחתים על קרקע מזון נוח‬
‫להם הם יתחילו להתחלק‪ .‬חיידקי אויר מצטיינים בתכונתם לשרוד בתנאי יובש וקרינת שמש‬
‫חזקה‪.‬‬
‫במים – בית גידול זה מאפשר דיפוזיה מהירה של כל המרכיבים הכימיים והגורמים הפיזיקליים‬
‫של המערכת‪ .‬בתי הגידול העיקריים הם מי‪-‬ים (גם מלוחים מאוד)‪ ,‬מי‪-‬ברז ומי‪-‬נחל‪.‬‬
‫באדמה – הקרקע הנה בית גידול מורכב ומפאת מגוון האפשרויות הקרקע עשירה מאוד‬
‫במיקרואורגניזמים‪.‬‬
‫פלורה נורמלית – הם אותם מיקרואורגניזמים שפיתחו יחסי גומלין על אזורים‬ ‫בגוף האדם –‬
‫ספציפיים בגוף האדם‪ .‬הם אותם המיקרואורגניזמים הנמצאים אצל אדם בריא‪.‬‬
‫ה"פלורה הנורמלית" מורכבת מאוכלוסייה די קבועה של מיקרואורגניזמים‪ ,‬אך‬
‫היא משתנה במספר האורגניזמים ובסוגם באזורי הגוף השונים‪.‬‬
‫פרזיטים – הם מיקרואורגניזמים ווירוסים החיים על הגוף או בתוכו ואינם‬
‫מביאים לו תועלת‪ ,‬ולעיתים אף גורמים לנזק ולמחלה‪.‬‬
‫המיקרואורגניזמים של הפלורה הנורמלית נמצאים בד"כ באזורים החשופים‬
‫לסביבה החיצונית‪.‬‬
‫התכונה המאפיינת את כל החיידקים המהווים את הפלורה הנורמלית היא‬
‫יכולתם להתגבר על מנגנוני ההגנה של המאכסן ולהתרבות באותו האזור שבו‬
‫הם מוצאים את התנאים הטובים ביותר‪.‬‬
‫המערכות הסטריליות הן‪ :‬מערכת הדם‪ ,‬מערכת העצבים המרכזית‪ ,‬מערכת הנשימה התחתונה‪,‬‬
‫הכבד‪ ,‬טחול‪ ,‬כליות‪ ,‬שלפוחית השתן‪ ,‬מערכת המין הזכרית‪ ,‬העין‪.‬‬

‫כדי שניתן יהיה לראות חיידקים בודדים יש צורך לצבוע אותם ולהשתמש במיקרוסקופ‪.‬‬
‫הצבע הינו תרכובת כימית המכילה שתי קבוצות יסוד‪:‬‬
‫‪ – Chromophore‬קבוצה הבולעת אור בתחום מסוים והגורמת לכך שהתרכובת תראה כצבועה‪.‬‬
‫‪ – Auxochrome‬קבוצה הגורמת להתקשרות התרכובת עם החומר הנצבע‪.‬‬
‫רוב הצבעים השימושיים במיקרוביולוגיה הם צבעים בעלי מטען חיובי והם נקשרים למרכיבים‬
‫שונים בתא הטעונים במטען שלילי כמו חומצות גרעין או מולקולות בדופן החיידקים‪.‬‬

‫סוגי צביעה‪:‬‬
‫צביעה פשוטה – זו צביעה בה כל החיידקים נצבעים בצבע אחד‪.‬‬
‫צביעה מבדלת – זו צביעה שאינה צובעת את כל התאים באופן שווה‪ .‬צביעה מבדלת היא צביעת‬
‫גרם (ע"ש הבקטריולוג הדני ‪ Christian Gram‬שפיתח צביעה זו)‪.‬‬
‫בהתאם לתגובת החיידקים לצביעת גרם מחלקים אותם לשתי קבוצות עיקריות גרם חיוביים‬
‫וגרם שליליים‪ .‬לתכונה זו יש חשיבות טקסונומית‪ ,‬כי היא מייצגת הבדלים יסודיים במבנה דופן‬
‫החיידק‪.‬‬
‫צובעים את החיידקים שעברו פיקסציה בחום בקריסטל ויולט ושוטפים את עודף הצבע‪ .‬בשלב‬
‫זה כל החיידקים גרם חיוביים והגרם שליליים נצבעים בכחול‪ .‬מוסיפים ‪( I2 + KI‬לוגול)‪ ,‬היוד‬
‫חודר לתאים ויוצר קומפלקס עם הקריסטל ויולט‪ ,‬גם בשלב זה הגרם חיוביים והגרם שליליים‬
‫מגיבים באופן דומה‪ .‬בשלב הבא שהוא דקולוריזציה בעזרת כהל מתבטא ההבדל בין הקבוצות‪.‬‬
‫הגרם חיוביים יציבים לדקולוריזציה בעוד שהגרם שליליים אינם יציבים‪ .‬יציבות זאת היא‬
‫כנראה הודות לעובדה שכהל ממיס את הליפידים בדופן הגרם שליליים ומותיר אחריו דופן‬
‫פורוזית המאפשרת סילוק הצבע מהדופן‪ ,‬בעוד שהדופן העבה של הגרם חיוביים עוברת‬
‫דהידרציה ע"י הכהל ונמנעת יציאת הקומפלקס ‪-I2‬קריסטל ויולט מהתא‪ .‬אחרי הדקולוריזציה‬
‫חיידקים גרם חיוביים צבועים עדיין בכחול אולם הגרם שליליים נותרים חסרי צבע‪ .‬כדי לאבחן‬
‫את החיידקים האלו משתמשים בצביעה נגדית‪ ,‬בד"כ פוקסין (אדום)‪ .‬כך מתקבלות שתי קבוצות‬
‫של חיידקים כאשר כל קבוצה נצבעת בצבע אחר‪.‬‬

‫פיסיולוגיה של חיידקים‬
‫ענף העוסק בתפקוד החיידקים‪ ,‬פעילותם המטבולית‪ ,‬השפעת הסביבה על מסלולי הביוסינטזה‬
‫של החיידקים והדרישות לנוטריינטים של קבוצות שונות של חיידקים‪.‬‬
‫הנוטריינטים הינם חומרים אנאורגניים ואורגניים הדרושים לאורגניזמים חיים למטרות צמיחה‬
‫ותפקוד‪.‬‬
‫בהתאם לדרישות התזונתיות ניתן לחלק את החיידקים ל‪ 2-‬קבוצות גדולות‪:‬‬
‫א‪ .‬אוטוטרופיים (‪ – )Autotrophs‬מסוגלים לסנתז בעצמם את כל מרכיבי התא ממלחים‬
‫אנאורגניים פשוטים‪ .‬מקור הפחמן שלהם הוא ‪ CO2‬ומקור האנרגיה הינו חמצון תרכובות‬
‫אנאורגניות מחוזרות (כימוליטוטרופיים) או ניצול אנרגית האור (פוטואוטוטרופיים)‪.‬‬
‫ב‪ .‬הטרוטרופיים (‪ – )Hetrotrophs‬אינם מסוגלים לסנתז את כל חומרי התא בהעדר פחמן אורגני‬
‫ואנרגיה‪ .‬גם כאן כימוהטרוטרופיים המחמצנים תרכובות אורגניות כמקור אנרגיה‬
‫ופוטוהטרוטרופיים – המשתמשים באור כמקור אנרגיה‪.‬‬

‫מצעי גידול במעבדה‬

‫כאשר מגדלים מיקרואורגניזמים שונים במעבדה מנסים לחקות את הסביבה‪ .‬משתמשים במצעי‬
‫גידול נוזליים או מוצקים ומתחשבים בדרישות התזונתיות של מיקרואורגניזמים‪.‬‬
‫היסודות העיקריים המרכיבים את התא הם‪Na, K, S, P, H, N, O, C :‬‬
‫אולם גם יסודות כגון‪ Cl, I, Mg, Co, Fe :‬וכו' חשובים בתזונת המקרואורגניזמים‪ ,‬כמו גם‬
‫ויטמינים בעיקר מקבוצה ‪ B‬וח‪.‬אמינו‪.‬‬
‫כדי לספק את הדרישות הנ"ל בהכנת מצעי הגידול משתמשים ב‪ :‬מים מזוקקים‪ ,‬פפטון (‬
‫‪ )peptone‬שהוא הידרוליזט אנזימטי של חלבונים‪ ,‬תמצית בשר (‪ ,)Beef extract‬תמצית שמרים (‬
‫‪ ,)Yeast extract‬סוכרים וחומרים אי אורגניים כמו‪ SO4, Fe, Mg :‬וכו'‪.‬‬

‫מצעי הגידול השונים מתחלקים ל‪ 2-‬קבוצות עיקריות‪:‬‬

‫מצע מוגדר (מצע סינטטי) – מכיל חומרים בעלי הרכב כימי ידוע כמו‪ :‬מלחים‪ ,‬סוכרים‪ ,‬ח‪.‬אמינו‬
‫וכו'‪.‬‬
‫מצע מורכב (לא סינטטי) – מכיל תערובות שהרכבן המדויק אינו ידוע כמו‪ :‬תמצית בשר‪ ,‬תמצית‬
‫שמרים‪ ,‬פפטון וכו'‪.‬‬
 ‫ניתן גם להגדיר את המצעים השונים לפי התפקידים שמייעדים להם‪:‬‬
‫מצע בררני (סלקטיבי) – מצע גידול המכיל מעכב המונע את גידולם של חיידקים מסוימים אבל‬
‫אינו מפריע לגידולם של אחרים‪.‬‬
‫מצע אבחנתי – מצע גידול שהרכבו מאפשר את ההבחנה בין סוגי חיידקים על סמך תכונותיהם‬
‫הביולוגיות‪.‬‬
‫ישנם מצעים המשלבים בין בררנות לאבחנה‪.‬‬

‫כאשר מגדלים חיידקים או מיקרואורגניזמים אחרים על קרקע מזון מלאכותי‪ ,‬חייבים כמובן‬
‫לדאוג שקרקע המזון כמו גם הכלים שבהם משתמשים יהיו סטריליים‪.‬‬

‫עיקור וחיטוי‬
‫עיקור – ‪ sterilization‬פירושו סילוק (הרג) כל צורות החיים‪ ,‬כולל נבגים של חיידקים שהם בעלי‬
‫מבנה ייחודי המקנה להם עמידות גבוהה לתנאים קיצוניים‪.‬‬
‫חיטוי – ‪ disinfection‬פירושו השמדת מיקרואורגניזמים פתוגניים‪.‬‬

‫העיקור יכול להתבצע במספר אמצעים‪:‬‬

‫א‪ .‬אמצעים פיזיקליים‬
‫‪ .1‬חום יבש ‪ 160-180°C -‬במשך ‪ 3‬שעות‪ .‬משמש לסטריליזציה של כלים שאינם עלולים‬
‫להישרף‪ ,‬להתאדות או להנמס‪ .‬מתבצע בתנור‪.‬‬
‫‪ .2‬חום רטוב ‪ -‬מאפשר סטריליזציה בטמפרטורה של ‪ 121°C‬במשך כ‪ 20-‬דקות‪ .‬מתבצע‬
‫במכשיר הנקרא אוטוקלב‪ .‬עקרון השיטה מבוסס על העובדה שטמפרטורת הרתיחה של‬
‫המים תלויה בלחץ האדים‪ .‬אם נגדיל את הלחץ בתוך הדוד המכיל קיטור (ללא אויר) ל‪-‬‬
‫‪ 1.2-1.4‬אטמוספירות תעלה הטמפרטורה ל‪ .121°C-‬טמפרטורה זו מספיקה בד"כ להרוג‬
‫גם את הנבגים ע"י דנטורציה של החלבונים העיקריים‪ .‬יש לדאוג לכך שכל מה שעובר‬
‫סטריליזציה לא יהיה אטום למעבר האדים‪ .‬שכבות צמר גפן ונייר ממלאות תפקיד זה‪.‬‬
‫ב‪ .‬קרינת ‪ -.U.V‬קרינה זו (‪ )180-320nm‬נבלעת ע"י שיירים של ח‪.‬אמינו ארומטיות בחלבונים‬
‫(טריפטופן‪ ,‬פניל‪-‬אנלין‪ ,‬טירוזין והיסטידין) וע"י ח‪.‬גרעין בדנ"א והרנ"א‪ .‬הנזק המשמעותי הוא‬
‫בעקבות פגיעה בדנ"א (אורך גל ‪ )260nm‬החדירות של הקרניים האולטרסגוליות נמוכה מאוד‬
‫ועל כן יש תלות חזקה בין זמן החשיפה לקרינה ובין רמת הנזק‪ .‬בשיטה זו מעקרים; כלי‬
‫פלסטיק שלא יכולים לעמוד בחום גבוה של תנור או אוטוקלב‪ ,‬נוזלים בתמיסות רדודות‪,‬‬
‫מכשור‪ ,‬חדרי ניתוח וכו'‪.‬‬
‫ג‪ .‬אמצעים מכניים – ע"י פעולת סינון באמצעות פילטרים (בהם גודל החרירים קטן מ‪)0.4µm-‬‬
‫שעברו עיקור ב‪ ..U.V-‬שימושי לעיקור חומרים תרמולביליים כגון‪ :‬חלבונים‪ ,‬חומרים‬
‫אנטיביוטיים ועוד‪.‬‬
‫ד‪ .‬אמצעים כימיים –לדוגמא פנולים‪ ,‬קרבולים‪ ,‬ליזול‪ ,‬ח‪.‬פרכלורית‪ ,‬פורמאלדהיד‪ ,‬גלוטראלדהיד‬
‫ואתילן אוקסיד (שהוא גז ומשתמשים בו לחיטוי כלי מיטה)‪ .‬גם למתכות יש אפקט‬
‫אנטיבקטריאלי‪ ,‬במיוחד מלחי כספית‪ ,‬כסף‪ ,‬קדמיום‪ ,‬ארסן ועוד‪ .‬השפעתם נובעת מכך שיש‬
‫להם זיקה גבוהה לקבוצות ‪ SH‬שבחלבונים‪ ,‬כך שקשירתם מונעת פעילות של אנזימים‬
‫וקואנזימים של התא התלויים בקבוצות ‪ SH‬חופשיות‪.‬‬

‫החיטוי יכול להתבצע במספר אמצעים‪:‬‬

‫א‪ .‬בעזרת אלכוהול הגורם לדנטורציה של חלבונים‪ .‬יעילותו עולה בתמיסה מימית ולכן‬
‫משתמשים באלכוהול בריכוז ‪.70%-50%‬‬
‫ב‪ .‬ע"י דטרגנטים שונים הממסים שומנים ולכן פוגעים גם ברוב החיידקים‪.‬‬
‫ג‪ .‬ע"י שימוש בצבעים שונים‪ ,‬כמו גנציאן ויולט‪ ,‬מרקורי כרום‪ ,‬יוד‪.‬‬
‫ד‪ .‬ע"י חומרים מחמצנים כמו ‪ H2O2‬ו‪.K2MnO4-‬‬

‫הערכה כמותית של חיידקים‬

‫א‪ .‬ספירה ישירה – בשיטה זו נספרים המיקרואורגניזמים תחת מיקרוסקופ בעזרת תא ספירה‬
‫מכויל‪.‬‬
‫יתרונות ‪:‬‬
‫שיטה מהירה וזולה‪.‬‬
‫ניתן לראות ולהשוות צורות מורפולוגיות‪.‬‬
‫חסרונות‪:‬‬
‫לא ניתן להבדיל בין חיידקים חיים למתים‪.‬‬
‫קשה להבחין בחיידקים קטנים‪.‬‬
‫קשה להשיג דיוק גבוה‪.‬‬
‫ניתן לספור רק אוכלוסיות המכילות ‪ 10‬חיידקים למ"ל‪.‬‬
‫‪5‬‬

‫ג‪ .‬ספירה חיה‬

‫ההנחה היא כי מכל חיידק אמורה להתפתח מושבה אחת בלבד‪ .‬ספירת המושבות תוך התחשבות‬
‫בפקטור המיהול תיתן לנו את מספר החיידקים שהיו בתמיסה המקורית‪ .‬כדי שניתן יהיה לקבל‬
‫מושבות בודדות במספר כזה שניתן לספירה – צריך למהול את התרבית‪ .‬עורכים מהולים‬
‫עשרוניים וזורעים דוגמא על צלחות אגר‪.‬‬

‫מספר חיידקים במ"ל = ההופכי של יחידת הנפח שנזרעה בצלחת ‪ X‬ההופכי של המיהול ‪ X‬מספר‬
‫מושבות‬
 ‫יתרונות‪:‬‬
‫ספירת חיידקים חיים בלבד‪.‬‬
‫רגישות (ניתן לראות פחות מ‪ 500-‬חיידקים למ"ל)‪.‬‬
‫מאפשרת בדיקת ניקיון התרבית‪.‬‬
‫מאפשרת בידוד וספירת חיידקים שונים הנמצאים בתערובת‪.‬‬
‫חסרונות‪:‬‬
‫המהולים הרבים מגדילים את הסיכוי לשגיאה‪.‬‬
‫אין ודאות מוחלטת שבכל המקרים מקור המושבה הוא בחיידק בודד (בייחוד‬
‫כשמדובר בחיידקים הצומחים בקבוצות)‪.‬‬
‫כל מצע מוצק הינו מצע גידול המאפשר גידול של קבוצת חיידקים מוגדרת‪.‬‬
‫למרות כל המגבלות הנ"ל זוהי שיטה בעלת שימוש רחב במיקרוביולוגיה של מזון‪ ,‬רפואה‬
‫וסניטציה‪.‬‬

‫ה‪ .‬שיטות עקיפות להערכת מספר חיידקים‬

‫‪ .1‬קביעת משקל יבש (משקל מרכיבי התא לאחר הוצאת המים)‪ .‬השיטה מסורבלת‪ ,‬גוזלת‬
‫זמן ואינה מדויקת‪ ,‬כי ‪ 1mg‬הוא יותר מ‪ 109-‬חיידקים‪.‬‬
‫‪ .2‬מעקב אחר שינויים באחד ממרכיבי התא שריכוזו בתא הוא די קבוע‪.‬‬
‫‪ .3‬אומדן מס' חיידקים עפ"י צפיפות אופטית (מדידת עכירות)‪ .‬קיים יחס ישר בין צפיפות‬
‫החיידקים בתרחיף (כלומר מספרם) למידת הפיזור של אלומת קרני האור‪ .‬ככל‬
‫שהצפיפות גבוהה יותר‪ ,‬כך קטנה עוצמת האור העוזבת את התרחיף‪.‬‬
‫יתרונות‬
‫שיטה מהירה מאד המאפשרת קבלת תוצאות באופן מידי‪.‬‬
‫שיטה פשוטה‪.‬‬
‫מאפשרת מעקב אחרי גידול‪.‬‬

‫חסרונות‬
‫אינה מספיק רגישה‪.‬‬
‫אינה מבדילה בין מתים לחיים‪.‬‬
‫תלויה בסוג האורגניזם‪ ,‬גודלו וכו'‪.‬‬
‫מחייבת הכנה של עקום כיול לקביעת הקשר בין עכירות למספר תאים‪.‬‬

‫גידול חיידקים בתרבית‬

‫התרבות החיידקים‪ ,‬גידול מספרם באוכלוסיה – הוא ע"י חלוקה‪.‬‬
‫דרך חלוקת החיידקים היא חלוקת התא לשניים והיא נקראת חלוקה בינארית‪ .‬בחלוקה זו תא‬
‫אם נחלק לשני תאי‪-‬בת זהים בעלי גודל זהה ובעלי קיום עצמאי‪.‬‬
‫כאשר עוקבים אחר גידול תרבית חיידקים לאורך זמן מבחינים במספר שלבים‪:‬‬
‫‪ .1‬שלב ההמתנה (‪ – )lag phase‬בשלב זה אין‬
‫שינוי במספר התאים בתרבית ולפיכך אין‬
‫שינוי ב‪ ..O.D-‬זהו שלב ההתאמה‪ ,‬ובתא‬
‫אותו‬ ‫המכינים‬ ‫תהליכים‬ ‫מתרחשים‬
‫לחלוקה‪ ,‬כמו סינתזה של אנזימים חדשים‬
‫ואגירה של מטבוליטים החיוניים להכפלה‪.‬‬
‫משך זמן ההמתנה מותנה בסוג המצע‪,‬‬
‫בטמפרטורה ובמצב התאים‪.‬‬
‫(‪logarithmic‬‬ ‫הלוגריתמי‬ ‫הגידול‬ ‫‪ .2‬שלב‬
‫‪ – )phase‬או שלב הגידול האקספוננציאלי‬
‫‪ .Exponential growth phase‬שלב שבו כל‬
‫החיידקים באוכלוסייה מתחלקים בקצב מרבי ביחס לתנאים בהם הם מצויים‪ .‬כאשר‬
‫התאים נכנסים לשלב הזה כל המנגנונים מותאמים לגידול ולהכפלה ובשלב הזה חל‬
‫גידול מאוזן‪ ,‬עליה הדרגתית בקצב שווה‪ ,‬של כל מרכיבי התא – חלבונים‪ ,‬רנ"א‪ ,‬דנ"א‪,‬‬
‫מים‪ ,‬המוביל לחלוקת התא לשניים‪ .‬מתא אחד התקבלו ‪ ,2‬מ‪ 2-‬תאים התקבלו ‪ 4‬גידול‬
‫זה הוא גידול לוגריתמי או אקספוננציאלי‪ .‬בשלב זה ניתן למדוד את הפרמטרים של‬
‫גידול החיידקים‪ :‬זמן דור‪ ,‬קצב הגידול‪ .‬זמן הגידול הלוגריתמי אינו נמשך עד אין סוף‪.‬‬
‫הוא מותנה בתנאי הסביבה‪ .‬קצב הגידול של התרבית יורד בשל הידלדלות המצע‪,‬‬
‫הפרשת מוצרי פסולת ושינויי ‪.pH‬‬
‫‪ .3‬שלב העמידה (‪ – )stationary phase‬שלב זה הוא שלב של גידול שבו לא מבחינים בעליה‬
‫במספר החיידקים ולכן אין שינוי ב‪ .O.D-‬של התרבית‪ .‬מספר החיידקים לא משתנה כי‬
‫יש איזון‪ ,‬גידול = תמותה‪.‬‬
‫‪ .4‬שלב התמותה (‪ – )death phase‬בשלב זה מספר התאים החיים קטן ממספרם בשלבים‬
‫הקודמים‪ ,‬קצב התמותה הרבה יותר מהיר מקצב הגידול‪ .‬בסוגים שונים של חיידקים‬
‫(אך לא בכל החיידקים) שהפסיקו להתחלק מופעלים בד"כ אוטוליזינים המפרקים את‬
‫התאים ולכן ניתן לראות ירידה בצפיפות האופטית של התרבית‪.‬‬

‫אנטיביוטיקה‬
‫חומר אנטימיקרוביאלי הוא חומר שהורג או מעכב את גידולו של המיקרואורגניזם‪ ,‬החומר יכול‬
‫להיות טבעי או סינטטי‪ ,‬סלקטיבי או לא סלקטיבי‪.‬‬
 ‫ישנן ‪ 3‬קבוצות של חומרים‪:‬‬
‫‪ – Cidal agent‬חומר שהורג את המיקרואורגניזם‪ ,‬אך בד"כ אינו גורם לליזיס של התא‪.‬‬
‫‪ – Lytic agent‬חומר שגורם למוות ע"י ליזיס של התא‪.‬‬
‫‪ – Static agent‬חומר שאינו הורג אך מעכב גידול‪.‬‬

‫חומר בקטריוסידי – נקשר בד"כ חזק מאוד לאיבר המטרה שלו שהוא חיוני לתא ואינו משתחרר‬
‫גם לאחר מהול‪.‬‬
‫חומר בקטריוליטי – גורם לליזיס שמתבטא בירידת מספר התאים‪ ,‬חומר זה פוגע בעיקר‬
‫בסינתזה של דופן התא (פנצילין)‪.‬‬
‫חומר בקטריוסטטי – מעכב בד"כ סינתזה של חלבונים ע"י קישור לריבוזומים‪ ,‬קישור זה אינו‬
‫חזק וכשריכוז החומר יורד הריבוזומים חוזרים לתפקד והגידול חוזר‪.‬‬

‫אנטיביוטיקות‬
‫אלה הם חומרים המיוצרים ע"י מיקרואורגניזמים המעכבים או הורגים מיקרואורגניזמים‬
‫אחרים‪ .‬להגברת האפקט נעשות לפעמים מודיפיקציות כימיות במעבדה‪ .‬נוהגים למיין את‬
‫האנטיביוטיקות על סמך המבנה או הפעילות‪.‬‬
‫‪ – Broad-spectrum antibiotics‬אנטיביוטיקה שפועלת על גרם חיוביים וגרם שליליים‪.‬‬
‫‪ – Narrow-spectrum antibiotics‬אנטיביוטיקה שפועלת על קבוצה אחת בלבד‪.‬‬
‫אתרי המטרה העיקריים של האנטיביוטיקות הם‪ :‬פגיעה בדופן‪ ,‬בממברנה‪ ,‬ביצור חלבונים‬
‫וביצור חומצות גרעין‪.‬‬

‫חומרים הפוגעים בדופן‪ :‬פניצילינים‪.‬‬

‫פנצילין היא האנטיביוטיקה הראשונה שנמצאה במקרה ע"י פלמינג ומיוצרת ע"י הפטריה‬
‫‪ .Penicillium chrysogenus‬הפניצילינים מעכבים את סינתזת הדופן ביעילות ובספציפיות נגד‬
‫חיידקים כי מבנה הדופן קיים רק בפרוקריוטים ולא באוקריוטים‪.‬‬

‫חומרים הפוגעים בממברנת התא ‪ :‬פולימיקסין‪.‬‬

‫זהו פפטיד שיש לו קצה הידרופובי והוא מסיס בליפידים וקצה הידרופילי המסיס בתמיסות‬
‫מימיות‪ .‬הוא נקשר לפוספוליפידים שבממברנה ומערער את המבנה הדו שכבתי ולכן הוא יעיל‬
‫במיוחד כנגד גרם שליליים שהממברנה שלהם עשירה בפוספוליפידים‪.‬‬
 ‫חומרים שפוגעים ביצור חלבונים‪:‬‬
‫אמינוגליקוזידים – כמו הסטרפטומיצין והקנמיצין‪.‬‬
‫טטרציקלינים – משפחת תרופות חשובה ברפואה ובוטרינריה‪ ,‬עם תחום פעולה רחב מאוד‪.‬‬
‫כלורמפניקול – תרכובת בעלת פעילות רחבת טווח‪ ,‬אך לא נמצא בשימוש רחב בשל תופעות‬
‫הלוואי באדם‪.‬‬

‫חומרים הפוגעים ביצור חומצות גרעין‪.Quinolones:‬‬

‫זוהי משפחה של חומרים סינטטיים (לכן לא נחשבת כאנטיביוטיקה במובן הקלאסי) כמו חומצה‬
‫נלידיקסית וסיפרופלוקסצין המאוד שימושיות ברפואה ובוטרינריה‪.‬‬

‫עמידות לאנטיביוטיקות‪:‬‬
‫‪ .1‬כאשר אתר המטרה של האנטיביוטיקה חסר באופן טבעי באורגניזם‪( .‬למשל‬
‫המיקופלסמה שהם חיידקים חסרי דופן יהיו עמידים לפנצילין)‪.‬‬
‫‪ .2‬חוסר חדירות לאורגניזם (למשל רוב הגרם שליליים עמידים לפנצילין ‪ G‬כי הוא אינו‬
‫חודר את הממברנה החיצונית ולכן אינו מגיע לדופן)‪.‬‬
‫‪ .3‬שינוי מבנה האנטיביוטיקה ע"י האורגניזם (למשל פרוק הפנצילין ע"י האנזים לקטמז)‪.‬‬
‫‪ .4‬מוטציות באורגניזם שגורמות לשינוי אתרי המטרה של האנטיביוטיקות‪.‬‬

‫חיפוש אחר אנטיביוטיקות חדשות‬

‫כיום‪ ,‬מחפשים חומרים חדשים מן הטבע‪ ,‬או מתכננים באופן ממוחשב מולקולות שיכולות לפגוע‬
‫או לעכב מסלולים ספציפיים‪ .‬כמו כן מנסים גם לפתח תרופות חדשות שהם אנלוגים‬
‫לאנטיביוטיקות קיימות‪ ,‬כך שמודיפיקציות כימיות ישפרו את הפעילות‪.‬‬
‫הצורך בתרופות חדשות נובע מכך שקיימת קורלציה חזקה בין כמות האנטיביוטיקה בשימוש‬
‫רפואי לאחוז החיידקים שפיתחו עמידות לאותה אנטיביוטיקה‪ .‬התפתחות מוגברת של חיידקים‬
‫עמידים נובעת משימוש מוגזם ולא מוצדק באנטיביוטיקה וכן מהשימוש השוטף באנטיביוטיקות‬
‫בחקלאות (חיות‪ ,‬דגים‪ ,‬צמחים) הן לטיפול ולמניעה של מחלות והן כהורמוני גדילה‪.‬‬
‫הבעיה היא כלל עולמית ויש מקומות שיש בהם הגבלות חמורות לגבי שימוש באנטיביוטיקות‬
‫בחקלאות‪.‬‬

‫שיטות לקביעת הרגישות של חיידקים לאנטיביוטיקות‬

‫א‪ – Tube Dilution .‬מהולים במבחנות‪.‬‬
‫קביעת הריכוז המינימלי הדרוש לעיכוב הגידול של תרבית חיידקים – ‪MIC – Minimal‬‬
‫‪.Inhibition Concentration‬‬
 ‫מכינים מהולים כפולים של אנטיביוטיקה‬
‫ומכניסים לכל מבחנה חיידקים בריכוז של כ‪105-‬‬
‫חיידקים במ"ל‪ .‬מדגירים ל‪ 24-‬שעות ול‪ 48-‬שעות‬
‫ובודקים מהו הריכוז הנמוך ביותר שבו אין‬
‫צמיחה של חיידקים‪ .‬המבחנה שהיא הריכוז‬
‫הנמוך ביותר שבו אין גידול חיידקים היא מבחנת‬
‫ה‪.MIC-‬‬

‫של‬ ‫דיפוזיה‬ ‫–‬ ‫הדסקיות"‬ ‫"שיטת‬ ‫ב‪.‬‬

‫האנטיביוטיקה באגר‪.‬‬
‫על צלחות של קרקע מזון (בד"כ מיוחדת לבדיקה‬
‫זו כדי שחיידקים מסוימים לא יעקפו את העיכוב‬
‫שנגרם מתוספת האנטיביוטיקה באמצעות מצע‬
‫הגידול) זורעים כ‪ 106-‬חיידקים‪ ,‬זריעת דשא‪ .‬על‬
‫החיידקים מניחים דסקיות הספוגות באנטיביוטיקה בריכוז ידוע‪.‬‬
‫האנטיביוטיקה עוברת בדיפוזיה מהדסקית אל האגר‪.‬‬
‫חיידקים הרגישים לאותה התרופה לא יצמחו מסביב‬
‫לדסקית‪.‬‬
‫מדגירים ל‪ 24-‬שעות ובודקים את הקוטר שמסביב‬
‫לדסקית שבו אין צמיחת חיידקים‪ .‬לפי טבלת סטנדרט‬
‫מסחרית קובעים אם החיידק רגיש או עמיד לאותה‬
‫תרופה‪.‬‬
 ‫מהלך העבודה‪:‬‬
‫א‪ .‬טכניקות בסיסיות‬
‫תרגול של עבודה סטרילית‪ ,‬זריעת בידוד‪ ,‬זריעת דשא‪ ,‬זריעת נחש והכרת מורפולוגיה של מושבות‬
‫חיידקים‪.‬‬
‫חיידקים‪B.cereus E.coli :‬‬
‫זריעת בידוד‬
‫‪ 6‬צלחות ‪LB‬‬ ‫חומרים (לזוג)‪:‬‬
‫‪ 2‬מבחנות עם ‪ 1ml‬מרק ‪LB‬‬
‫מטושים סטריליים‬
‫מחט בקטריולוגית‬
‫טיפים סטריליים‬
‫פיפטורים‬

‫זריעת דשא‬ ‫מהלך העבודה (עבודה אישית לכל סטודנט)‪:‬‬

‫‪ .1‬על צלחת ‪ LB‬זרע זריעת בידוד של אחד מהזנים הנ"ל‪.‬‬
‫‪ .2‬הכן תרחיף לא עכור של ‪ E.coli‬בסליין‪ ,‬הוצא ‪ 0.1‬מ"ל‬
‫מהתרחיף לצלחת ‪ LB‬וזרע זריעת דשא‪.‬‬
‫‪ .3‬הרם מושבה בודדת מצלחת ה‪ E.coli -‬וזרע זריעת נחש בצלחת‬
‫‪.LB‬‬
‫הדגר את הצלחות ואחת המבחנות (כולל את המבחנה עם שארית‬
‫המרק) ב‪ 37°C-‬למשך ‪ 24‬שעות והעבר לקור‪.‬‬

‫ב‪ .‬בידוד ישיר של חיידקים והעשרה של חיידקים‪.‬‬

‫חיידקים מהפלורה הנורמלית של הגוף‪.‬‬
‫חומרים (לזוג)‪ 2 :‬צלחות ‪LB‬‬
‫‪4‬מטושים סטריליים‬

‫מהלך עבודה (עבודה אישית לכל סטודנט)‪:‬‬

‫‪ .1‬חלק את הצלחת באמצעות סימון בטוש על חלקה התחתון ל‪ 4 -‬חלקים‪.‬‬
‫‪ .2‬קח בעזרת מטוש חומר מהפה ומהעור (ניתן לקחת גם מאיזורים נוספים)‪.‬‬
‫‪ .3‬זרע זריעת דשא את החומר שאספת על גבי צלחת ‪.LB‬‬
‫‪ .4‬הדגר את הצלחות ב‪ 37°C-‬למשך ‪ 24‬שעות והעבר לקור‪.‬‬
‫חיידקים מהאוויר‬
‫חומרים (לזוג)‪ 4 :‬צלחות ‪.T.P‬‬
 ‫מהלך העבודה (עבודה בזוגות)‪:‬‬
‫‪ .1‬פתח ‪ 2‬צלחות ‪ .T.P‬למשך ‪ 20‬דקות בחצר‪ .‬אחת במצב מאוזן והשנייה במצב מאונך ‪.‬‬
‫‪ .2‬פתח ‪ 2‬צלחות ‪ .T.P‬למשך ‪ 20‬דקות ליד האש‪ .‬אחת במצב מאוזן והשנייה במצב מאונך ‪.‬‬
‫‪ .3‬הדגר את הצלחות ב‪ 37°C-‬למשך ‪ 24‬שעות והעבר לקור‪.‬‬

‫ג‪ .‬צביעת גרם‬

‫חיידקים‪Sarcina lutea S.aureus B.cereus E.coli :‬‬
‫גנציאן ויולט (צבע כחול)‬ ‫חומרים‪:‬‬
‫תמיסת לוגול ((‪KI+I2‬‬
‫אתנול ‪70%‬‬
‫פוקסין בסיסי (צבע ורוד‪-‬אדום)‬
‫שמן אימרסיה‬
‫זכוכיות נושאות‬
‫מחט בקטריולוגית‬
‫פינצטה‬

‫מהלך העבודה (עבודה אישית לכל סטודנט‪ ,‬לבחירה שני חיידקים)‪:‬‬

‫‪ .1‬נקה היטב באלכוהול את זכוכית הנושא‪.‬‬
‫‪ .2‬הכן דוגמאות של חיידקים על זכוכית הנושא‪.‬‬
‫‪ .3‬ערוך קיבוע באש‪.‬‬
‫‪ .4‬הצף את הדוגמאות בגניציאן ויולט והמתן ‪ 1‬דקה‪.‬‬
‫‪ .5‬שטוף בעדינות במי‪-‬ברז‪.‬‬
‫‪ .6‬שים תמיסת לוגול והמתן ‪ 1‬דקה‪.‬‬
‫‪ .7‬שטוף באלכוהול ‪.70%‬‬
‫‪ .8‬שטוף במי‪-‬ברז‪.‬‬
‫‪ .9‬הצף בפוקסין בסיסי והמתן ‪ 30‬שניות‪.‬‬
‫‪ .10‬שטוף בעדינות במים‪ ,‬יבש המשטח באוויר‪.‬‬
‫‪ .11‬הסתכל במיקרוסקופ תאר וצייר אשר ראית‪.‬‬

‫ד‪ .‬בדיקת רגישות חיידקים לאנטיביוטיקה‬

‫חומרים ‪:‬‬
‫חיידקי ‪ Staphylococcus aureus‬וחיידקי ‪E.coli‬‬
‫דסקיות אנטיביוטיקה‬

‫מהלך העבודה ‪:‬‬

‫‪ .1‬זרע זריעת דשא (בעזרת מטוש סטרילי) ‪ 0.1‬מ"ל ממיהול של ‪ S.aureus‬ושל ‪ E.coli‬והנח‬
‫בזהירות את דסקיות האנטיביוטיקה שקיבלת‪.‬‬
‫‪ .2‬הדגר בטמפרטורה ‪ 37°C‬במשך ‪ 24‬שעות והעבר לקור‪.‬‬
‫החיידק נחשב רגיש אם‪:‬‬

‫הקוטר שווה או מעל‬ ‫ריכוז (‪)µg/ml‬‬ ‫אנטיביוטיקה‬

‫‪ 23‬מ"מ‬ ‫‪15‬‬ ‫אריתרומיצין ‪E‬‬

‫‪ 16‬מ"מ‬ ‫‪5‬‬ ‫מתיצילין ‪MET‬‬
‫‪ 20‬מ"מ‬ ‫‪20‬‬ ‫אמוקסיצילין ‪AMC‬‬
‫‪ 21‬מ"מ‬ ‫‪5‬‬ ‫ציפרופלוקסצין ‪CIP‬‬

‫מנגנוני פעולה‪:‬‬
‫אריתרומיצין ‪ ,E‬פגיעה בסינתיזת חלבונים‬
‫ציפרופלוקסצין ‪ ,CIP‬פגיעה בסינתיזת דנ"א‬
‫מתיצילין ‪ ,MET‬פגיעה בסינתיזת הדופן‬
‫אמוקסיצילין ‪ ,AMC‬פגיעה בסינתיזת הדופן‪.‬‬

‫גידול חיידקים בתרבית‬ ‫‪.5‬‬

‫גידול של חיידקים ניתן לקבוע ע"י העלייה במסה של התאים או בעליה במספר התאים‪ .‬התרבות‬
‫החיידקים‪ -‬גידול מספרם באוכלוסיה הוא ע"י חלוקה‪.‬‬
‫דרך חלוקת החיידקים היא חלוקת התא לשניים והיא נקראת חלוקה בינארית‪ .‬בחלוקה זו תא‬
‫האם נחלק לשני תאי‪-‬בת זהים בעלי גודל זהה ובעלי קיום עצמי‪.‬‬

‫עקומת גידול של חיידקים‪ -‬דרך נוחה לבדיקה של עליית מספר החיידקים ביחידת נפח היא ע"י‬
‫התרבית ניתן לבדוק‬ ‫מדידת השינוי בעכירות של תרחיף החיידקים‪ .‬את השינוי בעכירות‬
‫בספקטרופוטומטר‪ ,‬בבדיקת הצפיפות האופטית‪-‬‬
‫)‪ - Optical Density(OD‬של התרחיף‪ .‬נבדוק את איבוד האור העובר דרך התרחיף‪.‬‬
‫עם‬ ‫כמות האור העוברת דרך תרחיף התאים נמצאת ביחס הפוך למספר התאים‪ .‬כלומר‪,‬‬
‫עליית מספר התאים בתרחיף פחות אור עובר דרך התרבית‪.‬‬
‫לצורך מעקב על גידול התרבית ניתן להכין עקומת גידול ‪ -O.D- Optical Density:‬כנגד הזמן‪.‬‬

‫חומרים לזוג‬
‫‪ 1‬ארלנמייר עם ‪ 45‬מ"ל ‪ LB‬סטרילי‬
‫טיפים של ‪ 1‬מ"ל (תכלת) סטריליים‬
 ‫קיווטות חד פעמיות‬
‫ביקרים ליד כל ספקטרופוטומטר‬

‫מהלך העבודה‬

‫הוצא ‪ 1‬מ"ל ‪ LB‬מהמרק הסטרילי לקיווטה נקיה‪ -‬תשמש כ‪.blank -‬‬ ‫(‪)1‬‬
‫הוסף את החיידקים שקיבלת במבחנה אל המרק הסטרילי וערבב היטב‪.‬‬ ‫(‪)2‬‬
‫בדוק מיד את עכירות התרבית בזמן ‪ : 0‬העבר ‪ 1‬מ"ל מהבקבוק‪ ,‬באופן סטרילי‪ ,‬לקיווטה‬ ‫(‪)3‬‬
‫וקרא עכירות התרחיף בספקטרופוטומטר‪ .‬רשום את התוצאה במחברת‪.‬‬
‫חזור בזמנים ‪ 20,40,60,80‬דקות על תהליך הקריאה בספקטרופוטומטר‪.‬‬ ‫(‪)4‬‬
‫בסיום העבודה יש לזרוק את הפסולת הביולוגית למיכל הצהוב‪.‬‬ ‫(‪)5‬‬

‫לדו"ח‪:‬‬
‫תארו את תוצאות הזריעות‪ -‬דשא‪ ,‬נחש‪ ,‬בידוד?‬ ‫‪)1‬‬
‫מהי מורפולוגית המושבות של החיידקים שזרעתם בזריעת הבידוד? יש לציין‬ ‫‪)2‬‬
‫את שם החיידק‪ ,‬גודל המושבה‪ ,‬צבע‪ ,‬צורה‪ ,‬שוליים‪ ,‬התרוממות‪.‬‬
‫היכן צמחו יותר חיידקים‪ -‬חוץ‪/‬פנים‪ ,‬מאוזן‪/‬מאונך? הסבירו את התוצאות‪.‬‬ ‫‪)3‬‬
‫צירו את החיידקים שצבעתם בצביעת גרם‪ .‬יש לציין את שם החיידק‪,‬‬ ‫‪)4‬‬
‫מורפולוגיית התא הבודד‪ ,‬סידור בצברים (אם קיים) וכן האם הוא גרם‬
‫חיובי‪/‬שלילי‪.‬‬
‫לאיזו מהאנטיביוטיקות שניתנו‪ ,‬החיידק ‪ Staph.aureus‬רגיש? לאיזו‬ ‫‪)5‬‬
‫מהאנטיביוטיקות שניתנו‪ ,‬החיידק ‪ E.coli‬רגיש?‬
‫הצג עקומת גדילה של החיידקים עפ"י ה‪ .O.D -‬שנבדק‪ .‬באיזה שלב גידול‬ ‫‪)6‬‬
‫נמצאים החיידקים?‬
‫מספר זהה של חיידקים נזרע ב‪ 10 -‬מבחנות שהכילו מיהולים כפולים של‬ ‫‪)7‬‬
‫האנטיביוטיקה פניצילין‪ ,‬מריכוז התחלתי של ‪( 1000µg/ml‬מבחנה מס' ‪.)1‬‬
‫לאחר יום‪ ,‬מבחנות ‪ 6-10‬היו עכורות‪ .‬מהו ה‪?MIC -‬‬