‫שחר אברמוביץ' ‪42834770‬‬

‫תהילה בוקרה‪-‬שתיוי ‪39240231‬‬

‫גבור בני ‪40590697‬‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬דוח מס' ‪ - 4‬עקומת גידול של חיידקים‬

‫מטרת הניסוי‪-‬‬
‫א‪ .‬הבחנה בין שלבי הגידול המנתי השונים‬
‫ב‪ .‬עמידה על ההבדלים בשלבי הגידול בין סוגי מצעים שונים‪.‬‬

‫שלבי הגידול המנתי –‬

‫א‪ -LAG1 .‬שלב בו התרבית מסתגלת לתנאי הגידול החדשים‪ ,‬מייצרת אנזימים‬
‫חדשים הדרושים לגידול במצע זה‪ ,‬ומגיעה לנפח מינימלי לתחילת הכפלת‬
‫כרומוזום‪ .‬שלב זה מתקיים כאשר החיידק מועבר ממצע עשיר אל מצע עני או‬
‫לחילופין אם נלקח משלב העמידה ( יפורט בהמשך)‪ .‬בשלב זה לא נצפה שינוי‬
‫בקריאת ה ‪ -OD‬או בספירה החיה של החיידקים‪.‬‬
‫ב‪ LAG2- .‬שלב בו החיידק מכפיל עצמו מבחינת נפח‪ ,‬מסיים את הכפלת‬
‫הכרומוזום ובעקבות כך את יצירת המחיצה‪ .‬סיום שלב זה יהיה ברגע החלוקה‬
‫הראשונה‪ .‬שלב זה יראה עליה בקריאת ה‪ ( OD-‬יראה כמו השלב הלוגריתמי)‬
‫אך ללא שינוי בספירה החיה‪.‬‬
‫ג‪ -LOG .‬שלב בו קיימת חלוקה אקספוננציאלית של התרבית‪.‬‬
‫בשלב זה עלייה ב‪ OD-‬ובספירה החיה‪.‬‬
‫ד‪ .‬שלב העמידה‪ -‬שלב בו התרבית אינה מכפילה עצמה עוד עקב שינויים‬
‫בתנאי הגידול ( עלייה בריכוז ההפרשות ו‪/‬או ירידה בריכוז אחד מחומרי המזון‪-‬‬
‫בד"כ חמצן)‪ .‬קריאת ה‪ OD-‬והספירה החיה לא משתנים ‪.‬‬
‫ה‪ .‬שלב התמותה‪-‬לאחר זמן עמידה רב נצפית ירידה בספירה החיה ובקריאת‬
‫ה ‪ -OD‬משמע שלב תמותה של התרבית‬

‫צפי הניסוי‪:‬‬
‫‪.1‬ציפינו כי במצע העשיר יהיה קצב הגידול מהיר יותר מאשר במצע‬
‫הגידול העני‪ ,‬זאת משום שעל החיידק במצע העני לסנתז לעצמו‬
‫חומרי בניין ובכך לא משקיע את כל האנרגיה בגדילה‪.‬‬
‫‪ .2‬מאחר והחיידקים שאותם בדקנו נלקחו מתרבית בשלב העמידה‪,‬‬
‫ציפינו לראות בהתחלה שלב בו אין גידול (שלב ה ‪ )Lag‬בו מסתגלים‬
‫למצע‪ .‬בהתאם ציפינו לראות כי במצע ה‪ LB-‬שלב ההסתגלות יהיה‬
‫קצר יותר מאשר ב ‪ M9‬מהסיבות שצוינו כבר‪.‬‬
‫‪.3‬מכיוון שערכנו את הניסוי לאורך כ‪ 7 -‬שעות‪ ,‬ציפינו לראות לקראת‬
‫הסוף בשני המצעים שלב בו העכירות נשארת קבועה‪ -‬שלב העמידה‬
‫בו החיידקים אינם מתחלקים יותר‪.‬‬
‫‪.4‬לא נצפה לראות בתוצאות את שלב התמותה‪ ,‬מכיוון ששלב התמותה‬
‫מתחיל זמן רב לאחר שלב העמידה כאשר החיידקים מתחילים‬
‫להתפרק‪.‬‬
 ‫‪.5‬מאחר ונפח החיידק עומד ביחס הפוך לפקטור העכירות נצפה כי‪:‬‬
‫פקטור העכירות יהיה קבוע בתחילה ואז ירד בשלב ה ‪ Lag2‬כי‬
‫החיידק יגדיל את נפחו‪ .‬בשלב האקספוננציאלי נצפה לראות פקטור‬
‫עכירות קבוע יחסית‪ .‬בשלב העמידה נצפה לגדילת ערך הפקטור כי‬
‫בשלב זה החיידק מקטין את נפחו (מסתיימת הגדילה בנפח והחלוקה‬
‫ממשיכה)‪ .‬בשלב התמותה נצפה לראות פקטור זהה לזה של שלב‬
‫העמידה‪ ,‬לאחר מכן מכן נצפה לירידה בפקטור ואז התייצבות‪.‬‬
‫‪.6‬נצפה כי זמן הדור במצע העשיר יהיה קטן יותר מזה שבמצע העני‬
‫מהסיבות שכבר הוזכרו‪.‬‬

‫תוצאות הניסוי‪:‬‬
‫‪LB‬‬ ‫‪M9‬‬ ‫זמן‬
‫ריכוז חיידקים (‪)bac/ml‬‬ ‫‪.O.D‬‬ ‫ריכוז חיידקים (‪)bac/ml‬‬ ‫‪.O.D‬‬ ‫(‪min‬‬
‫)‬
‫‪108*1.16‬‬ ‫‪0.161‬‬ ‫‪** 108*2.66‬‬ ‫‪0.266‬‬ ‫‪0‬‬
‫‪108*1.70‬‬ ‫‪0.17‬‬ ‫‪15‬‬
‫‪108*1.89‬‬ ‫‪0.189‬‬ ‫‪** 108*1.95‬‬ ‫‪0.195‬‬ ‫‪30‬‬
‫‪108*1.33‬‬ ‫‪0.133‬‬ ‫‪45‬‬
‫‪108*2.10‬‬ ‫‪0.21‬‬ ‫‪108*1.2‬‬ ‫‪0.12‬‬ ‫‪60‬‬
‫‪108*2.97‬‬ ‫‪0.297‬‬ ‫‪75‬‬
‫‪108*4.35‬‬ ‫‪0.435‬‬ ‫‪108*2.25‬‬ ‫‪0.225‬‬ ‫‪91‬‬
‫‪108*5.37‬‬ ‫‪0.537‬‬ ‫‪105‬‬
‫‪108*3.31‬‬ ‫‪0.331‬‬ ‫‪106‬‬
‫‪8‬‬
‫‪10 *7.37‬‬ ‫‪0.737‬‬ ‫‪122‬‬
‫‪108*9.73‬‬ ‫‪0.973‬‬ ‫‪108*3.98‬‬ ‫‪0.398‬‬ ‫‪136‬‬
‫‪108*9.07‬‬ ‫‪0.907‬‬ ‫‪250‬‬
‫‪109*1.73‬‬ ‫‪1.729‬‬ ‫‪251‬‬
‫‪109*2.03‬‬ ‫‪2.034‬‬ ‫‪299‬‬
‫‪109*1.43‬‬ ‫‪1.427‬‬ ‫‪302‬‬
‫‪9‬‬
‫‪10 *2.14‬‬ ‫‪2.137‬‬ ‫‪331‬‬
‫‪109*1.48‬‬ ‫‪1.481‬‬ ‫‪333‬‬
‫‪9‬‬
‫‪10 *2.15‬‬ ‫‪2.153‬‬ ‫‪341‬‬
‫‪109*2.19‬‬ ‫‪2.193‬‬ ‫‪109*1.61‬‬ ‫‪1.61‬‬ ‫‪362‬‬
‫‪109*2.32‬‬ ‫‪2.232‬‬ ‫‪377‬‬
‫‪109*1.62‬‬ ‫‪1.623‬‬ ‫‪392‬‬
‫‪9‬‬
‫‪10 *2.24‬‬ ‫‪2.237‬‬ ‫‪394‬‬
‫‪109*2.23‬‬ ‫‪2.226‬‬ ‫‪421‬‬
‫‪109*1.59‬‬ ‫‪1.59‬‬ ‫‪424‬‬
‫‪9‬‬
‫‪10 *2.25‬‬ ‫‪2.25‬‬ ‫‪442‬‬
‫‪109*1.60‬‬ ‫‪1.602‬‬ ‫‪444‬‬
‫**שתי נקודות אלו לא הוכנסו לגרף בשל סטייה מהערכים הצפויים‪-‬בתיאום‬
‫עם המדריך‬
‫•התוצאות מופיעות גם בגרפים (מילימטרי וחצי לוגריתמי) בסוף‬
‫הדו"ח‪.‬‬
‫‪9‬‬
‫•ריכוז החיידקים חושב ע"פ הפקטור שניתן ע"י המדריך‪.F=10 -‬‬
 ‫* זמן הדור שחושב מהגרף החצי לוגריתמי‪ LB- 30 :‬דקות‪ M9- 50 ,‬דקות‪.‬‬
‫תוצאות הספירה החייה‪:‬‬
‫‪ LB 100‬דקות‬ ‫‪ LB 15‬דקות‬ ‫‪ M9 136‬דקות‬ ‫‪ M9 30‬דקות‬
‫‪3‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪21‬‬ ‫‪1‬‬ ‫אחדות‬
‫‪63‬‬ ‫‪17‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪15‬‬ ‫עשרות‬
‫‪524‬‬ ‫‪102‬‬ ‫‪493‬‬ ‫‪105‬‬ ‫מאות‬

‫דיון ומסקנות‪:‬‬
‫•בגרף החצי לוגריתמי ניתן לראות את ההבדלים בעקומות גידול של‬
‫‪ E.coli‬במצעים השונים‪.‬‬
‫•בעקומת ה ‪ LB‬ניתן להבחין בשלב ה ‪ LAG‬אך במצע ‪ M9‬שלב ה‬
‫‪ LAG‬לא נראה בגלל סטיות אשר בעצת המדריך לא הוכנסו לגרף‪.‬‬
‫•אורך שלב ה ‪ ,LAG‬תלוי בגורמים שונים כגון‪ :‬מאיזה מצע הועברו‬
‫החיידקים ולאיזה מצע‪ ,‬ובאיזה שלב גידול היו מצויים החיידקים‬
‫כאשר הועברו למצע החדש (כלומר שיטת המיצוי)‪.‬‬
‫• חישוב זמן הדור בכל מצע נעשה ע"י בדיקה בשלב האקספוננציאלי‬
‫של הגידול‪ ,‬שבה מוצאים שתי נקודות שבאחת ה ‪ O.D‬כפול פי ‪2‬‬
‫מבשניה‪ .‬בודקים את משך הזמן בין שתי הנק' ומקבלים את זמן‬
‫הדור‪.‬‬
‫במקרה שלנו‪:‬‬
‫במצע ‪ LB: O.D.=0. 4‬בזמן ‪ 90‬דקות‬
‫‪ O.D.=0.8‬בזמן ‪ 120‬דקות‬
‫זמן דור= ‪ 30=120-90‬דקות‬
‫במצע ‪ M9: O.D.=0.4‬בזמן ‪ 150‬דקות‬
‫‪ O.D.= 0.8‬בזמן ‪ 200‬דקות‪.‬‬
‫זמן דור=‪ 50=200-150‬דקות‪( .‬תשובה עבור שאלת סיכום ‪) 1‬‬
‫•בהתאם לצפי‪ ,‬יש שינוי באורך זמן הדור בין המצעים אשר בא‬
‫לידי ביטוי בגרף של שלבי הגידול השונים‪ .‬ב‪( M9-‬המצע העני) ל‪-‬‬
‫‪ E.coli‬נדרשת תקופה הסתגלות ארוכה יותר‪ .‬שלה ה‪ Lag1-‬ארוך‬
‫יותר מכיוון שיש צורך לסנתז יותר אנזימים‪ .‬במצע העשיר לעומת‬
‫זאת‪ ,‬יש צורך בסנתוז של פחות אנזימים (נמצאים במצע)‪ ,‬ושלב‬
‫זה קצר יותר יחסית‪ .‬שלב הגידול ה‪ log-‬קצר יותר ב‪( M9-‬מעט‬
‫חומרי מזון ביחס ל‪ ,)LB-‬והכניסה לשלב העמידה מוקדמת יותר‪,‬‬
‫גם תוצאות אלו תאמו את הצפי‪.‬‬
‫(תשובה לשאלת סיכום ‪.)2‬‬
 ‫= ‪f‬‬ ‫‪C‬‬
‫‪OD‬‬ ‫• חישוב פקטור עכירות נעשה ע"פ הנוסחה‪:‬‬
‫= ‪f‬‬ ‫‪C‬‬
‫‪OD‬‬
‫=‬ ‫‪1.57⋅108‬‬
‫‪0.17‬‬
‫חישוב לדוגמא‪= 9.23 ⋅ 10 8 :‬‬
‫ממוצע ריכוז חיידקים חיים‬
‫‪bac‬‬
‫פקטור ( ‪) ml‬‬ ‫‪bac‬‬ ‫זמן הזריעה‬ ‫סוג המצע‬
‫( ‪) ml‬‬
‫‪9.23 ⋅ 108‬‬ ‫‪108*1.57‬‬ ‫לאחר ‪ 15‬דקות‬
‫‪LB‬‬
‫‪9.03 ⋅ 108‬‬ ‫‪108*4.85‬‬ ‫לאחר ‪ 100‬דקות‬
‫‪6.24 ⋅ 108‬‬ ‫‪108*1.18‬‬ ‫לאחר ‪ 30‬דקות‬
‫‪9M‬‬
‫‪3.18 ⋅ 109‬‬ ‫‪1081*2.64‬‬ ‫לאחר ‪ 136‬דקות‬

‫* הממוצע חושב ע"י ממוצע בין ‪ 3‬תוצאות הספירה החיה כפול המיהול‬
‫שלהן‪.‬‬

‫•ניתן לראות ע"פ חישוב הפקטורים שבמצע ה ‪ LB‬אכן פקטור‬

‫העכירות כמעט ולא השתנה‪ ,‬כפי שציפינו‪ ,‬שכן מדובר בשתי מדידות‬
‫שהראשונה בסוף שלב ה ‪ lag‬והשנייה בשלב האקספוננציאלי‪ .‬ב ‪9M‬‬
‫עלייה בחצי סדר גודל‪ ,‬מה שניתן להסבר ע"י טעות בספירה החיה‬
‫שיכלה להיגרם ע"י מס' סיבות‪ :‬טעות בקריאת מכשיר ה ‪ ,OD‬טעות‬
‫במיהול או זיהום כתוצאה מעבודה לא סטרלית‪.‬‬
‫• ישנו שוני בעכירות המקסימלית שאליה הגיע הגידול במצעים‬
‫השונים‪ .‬הבדל זה נובע מההבדל בכמות ובסוג חומרי המזון שיש בכל‬
‫מצע עבור החיידקים‪ .‬במצע העשיר החיידק יוכל לגדול לכמות גדולה‬
‫יותר (יעבור זמן רב יותר עד שיגמרו כל חומרי המזון במצע) מה‬
‫שיוביל לעכירות גבוהה יותר‪( .‬תשובה לשאלת סיכום ‪.)3‬‬
‫•את הספירה החיה ביצענו פעמיים‪ -‬פעם עבור שלב גידול ה ‪LAG‬‬
‫ופעם עבור שלב הגידול האקספוננציאלי‪ .‬ולכן נכון לחשב את פקטור‬
‫העכירות של החיידקים עפ"י ריכוז החיידקים כפי שנמצא ספירות‬
‫החיות בכל שלב ושלב‪ .‬העכירות אינה מבדילה בין חלוקה לבין גדילת‬
‫נפח החיידק וכן בין חיידקים חיים למתים‪ -‬ועל כן נשלב בחישוב‬
‫הפקטור את שיטת הספירה החיה‪.‬‬
 ‫שאלות סיכום‪:‬‬

‫‪1+2+3‬בדו"ח עצמו‬

‫‪ .4‬אכן הבחנו בתקופת ‪( Lag‬בשני הגרפים‪ -‬אך התייחסנו רק לחצי‬

‫לוגריתמי‪ ,‬כפי שהוסבר בשאלה ‪ .)1‬תקופת ה‪ Lag-‬היא התקופה בה‬
‫החיידקים מסתגלים למצע הנתון‪ ,‬תקופה זו שונה ממצע למצע ומחיידק‬
‫לחיידק‪ ,‬ב‪ LB-‬תקופת ההסתגלות היא קצרה יותר מכיוון שלחיידק אין‬
‫הגבלה של נוטריינטים ולכן יכול לסנתז אנזימים בקצב מקסימלי‪ ,‬לעומת‬
‫זאת במצע עני ניתן לצפות לתקופת הסתגלות ארוכה יותר מכיוון שהוא‬
‫מוגבל יותר בנוטריינטים‪ .‬בגרף ה‪ O.D-‬כנגד זמן ניתן לראות רק את תקופת‬
‫ה ‪ ,-Lag1‬אך ה‪ Lag2-‬נראית כחלק מהגידול האקספוננציאלי‪ .‬בתקופה זו‬
‫נפח החיידק גדל לנפחו המקסימלי (הכנת התא לחלוקה והכפלת המטען‬
‫הגנטי‪ ,‬בדומה להכפלת הריכוז בשלב ה‪ ,)Log-‬לכן נראה עלייה ב‪ ,O.D-‬אך‬
‫בפועל החיידק עדיין לא התחלק לשני תאים‪ .‬כדי להבחין בתקופת ה‪Lag2-‬‬
‫יש לבצע במקביל זריעות חיות אשר יראו שהגדילה היא רק ב‪O.D-‬‬
‫(בעקבות הגדלת הנפח) ולא במס' החיידקים‪.‬‬
‫‪.5‬העכירות אינה מקיימת יחס ישר עבור מספר החיידקים החיים מכיוון‬
‫שהיא מכילה בתוכה את מס' החיידקים המתים ‪ ,‬הפרשות ושאר "‬
‫גופיפים" בדוגמא‪.‬פקטור הגידול הינו מדד המורכב מריכוז החיידקים‬
‫חלקי קריאת ה‪ OD-‬בשלבים השונים של הגידול יחס זה אינו נשמר‪:‬‬
‫‪ -LAG1‬הריכוז נשמר ואיתו גם קריאת ה‪ OD-‬מכאן שהפקטור לא‬
‫משתנה‪.‬‬
‫‪ -LAG2‬הריכוז נשמר אך ה‪ OD-‬עולה מכאן שהפקטור הולך וקטן‪.‬‬
‫‪ -LOG‬הריכוז וה ‪ -OD‬עולים כך שהפקטור גדל בערכו עם הכניסה‬
‫לשלב זה ומאותו הרגע נשאר קבוע‪.‬‬
‫שלב העמידה‪ -‬תחילה הריכוז מעט עולה ( בכניסה לשלב בלבד) וה‪-‬‬
‫‪ OD‬נשאר קבוע כך שבתחילה נצפית עליה מתונה בפקטור ובהמשך‬
‫נשאר קבוע‪.‬‬
‫כאשר מדברים על חיידקים מאותו מין ניתן לומר שהפקטורים יהיו‬
‫דומים בכל שלב ושלב של הגידול‪ .‬נתון זה מאפשר לנו לקבוע את‬
‫ריכוז החיידקים רק מידיעת הפקטור וקריאת ה‪ ( OD-‬בתנאי גידול‬
‫זהים)‪ .‬אם הדבר לא היה כך היינו צריכים לבצע עקומת כיול עבור כל‬
‫ניסוי בספקטרופוטומטר‪.‬‬
‫קריאת ה‪ OD-‬הנה מדד עבור ריכוז החיידקים ונפחם ולכן פקטור‬
‫‪C‬‬ ‫‪C‬‬ ‫‪1‬‬
‫=‪F‬‬ ‫=‬ ‫=‬ ‫העכירות שווה‪:‬‬
‫‪O.D. C ⋅ V V‬‬
‫זוהי המשמעות הפיזיקלית של הפקטור‪ -‬ככל שנפח החיידק יהיה‬
‫גדול יותר כך הפקטור יקטן‪ .‬בניסוי שלנו ניתן להסיק כי הפקטור עבור‬
‫מצע ה‪ M9-‬בשלביו השונים יהיה קטן מהפקטור עבור מצע ה‪LB-‬‬
‫בשלביו השונים‪.‬‬
‫‪.6‬בדפים מצורפים‪.‬‬
 ‫לסיכומו של דו"ח‪:‬‬
‫במעבדה זו מדדנו ערכי ‪ .O.D‬ובכך יכולנו לצייר על פני גרף מ"מ וחצי‬
‫לוגריתמי את עקומת גידול החיידקים‪.‬‬
‫הבנו כי גרף החצי לוגריתמי מראה בצורה טובה יותר את המעבר בין שלב‬
‫ה ‪ LAG‬לשלב האקספוננציאלי‪.‬‬
‫בעזרת העקומות שבנינו ראינו את הגידול לשלביו כפי שציפינו‪.‬‬
‫מהסתכלות בגרפים ניתן היה לראות את ההבדלים בקצב הגידול של אותו‬
‫סוג חיידק במצעים שונים (האחד עשיר והשני מוגדר עני)‪.‬‬
‫ע"י ביצוע ספירות חיות בדקנו פקטורי עכירות בשלבים השונים של הגידול‬
‫וראינו כי קיים יחס הפוך בין נפח החיידק לעכירות‪.‬‬