‫מעבדה מס' ‪6‬‬

‫מטבוליזם של גליקוגן בכבד‬

‫רקע‪:‬‬
‫הגליקוגן משמש כמקור גלוקוז ברקמות השונות‪ ,‬בעיקר בשריר ובכבד‪ .‬בע"ח זקוקים לרמה‬
‫קבועה של גלוקוז בדם כדי לשמור על תפקודה של מע' העצבים‪ .‬כמו כן אחראי הגלוקוז על‬
‫תהליכי הפקת האנרגיה בגוף‪.‬‬
‫סינתזת גליקוגן מתבצעת ע"י האנזימים‪ :‬גליקוגן סינטטז ו‪ .Branching Enzyme -‬פירוק גליקוגן‬
‫מתבצע ע"י גליקוגן פוספורילז ועמילו ‪ 1,6‬גלוקוזידאז‪.‬‬
‫רמת הסינתזה והפירוק של הגליקוגן נקבעת על ידי רמת הגלוקוז בדם‪.‬‬
‫האנזים הרגולטורי הוא גליקוגן סינטטז שפעילותו יורדת ע"י זירחון המבוצע ע"י פרוטאין‬
‫קינאז‪ .‬פרוטאין קינאז נמצא תחת בקרה הורמונלית‪ .‬מעבר לצורה פעילה של סינטטז‬
‫מתבצעת ע"י סינטטז פופטאז הגורם לדהפוספורליזציה‪ .‬בקרה נוספת המשפיע על פעילותו‬
‫של סינטטז פוספט‪ :‬מעוכב ע"י רמות גבוהות של גליקוגן ומזורז ע"י גלוקוז‪.‬‬

‫מטרת המעבדה‪:‬‬
‫לבחון את ההשפעה של צום על המטאבוליזם של גליקוגן בכבד‪.‬‬
‫לצורך זה הורעבו אפרוחים במשך ‪ 24‬שעות לפני תחילת הניסוי‪ ,‬ונלקחו אפרוחים שלא‬
‫הורעבו כביקורת‪.‬‬
‫ביצענו שני ניסויים ובדקנו את המשתנים הבאים‪:‬‬
‫‪ .1‬רמת הגלוקוז בדם‬
‫‪ .2‬רמת הגליקוגן בכבד‬

‫ניסוי א'‪:‬‬
‫קביעת הגלוקוז בדם‬

‫שיטות העבודה‪:‬‬
‫הכנו ‪ 10‬מבחנות‪ ,‬כאשר מבחנות ‪ 1,2‬הכילו פלסמה מהולה מאפרוח רעב‪ ,‬מבחנות ‪3,4‬‬
‫הכילו פלסמה מהולה מאפרוח שבע‪ ,1‬מבחנה ‪ 5‬הכילה מים מזוקקים לכיול הספקטרופומטר‬
‫‪µg‬‬
‫‪,) 100‬‬ ‫ושאר המבחנות הכילו מיהולים שונים של סטנדרט גלוקוז בריכוז תחילתי של (‬
‫‪ml‬‬
‫אשר ישמשו לעקומת כיול‪ .‬ע"מ לקבוע את רמת הגלוקוז במבחנות השתמשנו בריאגנט‬
‫אנזימטי לקביעת גלוקוז המכיל גלוקוז אוכסידז המבצע את התגובה הבאה‬
‫‪ +‬ח' גלוקונית גלוקוז‬ ‫‪H2O2‬‬
‫ופראוכסידז המבצע את התגובה הבאה ‪ ,O + 0.5O2 2→ H 2O2 H‬כמו כן הוספנו‬
‫לריאגנט אורתו‪-‬דיאניזידין שמתחמצן ע"י החמצן שמתקבל ונותן בליעה ב‪.450nm -‬‬
‫הוספנו ‪1‬מ"ל מהריאגנט לכל אחת מהמבחנות לאחר שביצענו פרהאינקובציה‪ 5(,‬דקות‪,‬כדי‬
‫להכיו את המערכת לקליטת האנזים בתנאים אופטימלים עבורו) ולאחר ‪ 30‬דקות אינקובציה‬
‫הפסקנו את הריאקציה ע"י הוספת ‪ -0.15M HCl‬מוריד את ה‪ pH -‬וכך מפסיק את פעילות‬
‫האנזים‪ .‬קראנו את בליעת החמרים במבחנות בספקטרופומטר‪ ,2‬והכנו עקומת כיול‬
‫ממבחנות ‪ ,6-10‬ובעזרת עקומת הכיול קבענו את כמות הגלוקוז‪.‬‬

‫‪1‬‬
‫קיבלנו פלסמה מהולה פי ‪ 50‬לשני האפרוחים‬
‫‪480nm 2‬‬
 ‫תוצאות‪:‬‬
‫‪D‬‬ ‫כמ ות גלוק וז‬ ‫' מבח נה מס‬
‫)‪(µg‬‬
‫‪0.053‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.334‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.473‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪0.638‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪0.773‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪10‬‬

‫עקומת כיול המתארת את כמות הבליעה‬

‫כפונקציה של כמות הגלוקוז‬
‫כמות בליעה (‪(OD‬‬

‫‪1‬‬
‫‪y = 0.0087x - 0.069‬‬
‫‪0.8‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪R = 0.9774‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪150‬‬
‫כמות הגלוקוז (‪)mg‬‬

‫חישובים‪:‬‬
‫הצבת ערך הבליעה שהתקבל במשוואת הישר וחילוץ ערך ‪ – X‬כמות הגלוקוז‪.‬‬
‫ממוצע בליעה של אפרוח רעב ‪ ,-0.53OD‬לפי עקומת כיול = ‪68.85µg‬‬
‫ממוצע בליעה של אפרוח שבע ‪ ,0.4545OD-‬לפי עקומת כיול=‪60.172µg‬‬
‫לחישוב הממוצע הכפלנו את הבליעה שהתקבלה עבור ‪0.5‬מ"ל פי ‪ ,2‬חיברנו לבליעה של‬
‫‪1‬מ"ל וחילקנו ב‪.2 -‬‬
‫חישוב רמת גלוקוז עבור אפרוח רעב ב ‪mg%: 68.85*100*50/1000=344.25‬‬
‫חישוב רמת גלוקוז עבור אפרוח שבע ב ‪mg%: 60.172*100*50/1000=300.86‬‬
‫פירוט החישוב‪ :‬הכפלנו את כמות הגלוקוז ב‪ µg -‬ב‪ 100 -‬כדי לקבל תוצאה באחוז‪ ,‬חילקנו‬
‫ב‪ 1000 -‬ע"מ להפוך ל‪ mg -‬והכפלנו ב‪ 50 -‬כיוון שקיבלנו פלסמה מהולה פי ‪.50‬‬
‫מסקנות‪:‬‬
‫ציפינו לקבל רמת גלוקוז דומה בין אפרוחים שהורעבו לאלה שלא הורעבו‪ .‬מאחר ובאפרוח‬
‫רעב חסר גלוקוז ובאפרוח שבע הגלוקוז התפלמר לגליקוגן ואינו מצוי בדם כגלוקוז חפשי‪.‬‬
‫בספרות ‪%200-240mg‬‬
‫קיבלנו ערך שונה בין האפרוחים כנראה בגלל שונות גנטית בניהם‪.‬‬
‫קיבלנו ערך גבוה מהספרות ולכך כמה הסברים‪:‬‬
‫‪)1‬האפרוח נכנס ללחץ לפני שהרגו אותו ולכן עלתה רמת הגלוקוז בדמו‪ .‬הערך הגבוה יותר‬
‫התקבל בקרב האפרוח הרעב וזאת משום שאותות הרעב ניכרו בו‪.‬‬
‫‪)2‬הניסוי לא נערך בתנאי מעבדה ספרותיים‪ ,‬חלו אי דיוקים בזמני האינקובציה‪ ,‬אי דיוקים‬
‫בנפחים של סטנדרט גלוקוז וריאגנט אנזימתי‪ ,‬אי דיוקים בקריאת הבליעה‪.‬‬
 ‫ניסוי ב'‪:‬‬
‫קביעת גליקוגן בכבד‬
‫קיבלנו כבד של אפרוח רעב ושבע‪ ,‬אשר בוצעה בו הידרוליזה בעזרת ‪( KOH 33%‬פותח‬
‫קשרים פפטידים בחלבונים ואסטרים בשומנים ולא פוגע בקשרים הגליקוזידים‪ ,‬מאחר ואנו‬
‫מעוניינים לפתוח את הקשרים הגליקוזידים בעזרת עמילוגלוקוזידז)‪ .‬קררנו את המבחנות‬
‫בעזרת אתנול קר ע"מ להשקיע את הגליקוגן (האתנול סופח מולק' מים וע"י כך גורם‬
‫לשקיעת הגליקוגן)‪ .‬עירבבנו וחיכינו ‪ 10‬דקות בכלי עם קרח‪ .‬סרכזנו בצנטריפוגה ושפכנו את‬
‫הנוזל העליון (מעוניינים במשקע‪ ,‬כי הוא מכיל את הגליקוגן) והמסנו באופן מוחלט את‬
‫המשקע ע"י הוספת מים מזוקקים ועירבוב‪ .‬הוספנו אתנול קר‪ ,‬ערבבנו‪ ,‬סרכזנו ושפכנו את‬
‫הנוזל העליון‪ .‬לבסוף המסנו את המשקע ב‪ 2.5 -‬מ"ל מים מזוקקים‪ .‬מהלנו את המבחנה‬
‫מהאפרוח הרעב בלבד פי ‪( 5‬לפי הוראת המדריך)‪ ,‬תמיסות אלו שמשו אותנו להמשך‬
‫הניסוי‪ .‬הכנו ‪ 10‬מבחנות‪ ,‬כאשר מבחנות ‪ 1,2‬הכילו תמיסת גליקוגן מהולה מאפרוח רעב‪,‬‬
‫מבחנות ‪ 3,4‬הכילו תמיסת גליקוגן מהולה מאפרוח שבע‪ ,‬מבחנה ‪ 5‬הכילה מים מזוקקים‬
‫לכיול הספקטרופומטר ושאר המבחנות הכילו מיהולים שונים של סטנדרט גליקוגן (ריכוז‬
‫‪µg‬‬
‫‪ ,) 200‬אשר ישמשו לעקומת כיול‪ .‬ע"מ לקבוע את רמת הגליקוגן במבחנות‬ ‫תחילתי של‬
‫‪ml‬‬
‫השתמשנו בריאגנט אנזימטי לקביעת גליקוגן המכיל גלוקוז אוכסידז‪ ,‬פראוכסידז בתוספת של‬
‫האנזים עמילוגלוקוזידאז שיגרום לפירוק הגליקוגן לגלוקוז (פותח קשר גליקוזידי‬
‫אלפא ‪ .1-4‬גם כאן הוספנו לריאגנט אורתו‪-‬דיאניזידין‪ .‬הגליקוגן מתפרק לגלוקוז בעזרת‬
‫עמילוגלוקוזידז‪ ,‬ומשהתקבל גלוקוז פירוקו לחומר הבולע ב‪ 480nm -‬נעשה לפי המפורט‬
‫בניסוי א' בעזרת אותו ריאגנט אנזימטי‪.‬‬
‫הוספנו ‪1‬מ"ל מהריאגנט לכל אחת מהמבחנות לאחר שביצענו ‪ 5‬דקות פרהאינקובציה‪,‬‬
‫ולאחר ‪ 30‬דקות אינקובציה הפסקנו את הריאקציה ע"י הוספת ‪ .0.15M HCl‬קראנו את‬
‫המבחנות בספקטרופומטר‪ ,3‬והכנו עקומת כיול ממבחנות ‪ ,6-10‬ובעזרת עקומת הכיול נקבע‬
‫את רמת הגליקוגן‪.‬‬
‫תוצאות‪:‬‬
‫שכחנו להוסיף סטנדרט גליקוגן (סובסטראט) ולכן לא נצפתה תגובה של הריאגנט האנזימטי‪-‬‬
‫(לאנזימים לא היה סובסטראט לפעול עליו) ולא היתה קריאת ספקטרופוטומר (אפסית)‪,‬‬
‫משום כך לקחנו תוצאות מזוג אחר‪.‬‬
‫ולהלן התוצאות‪:‬‬
‫‪OD‬‬ ‫כמות גל יקוגן‬ ‫' מבח נה מס‬
‫)‪(µg‬‬
‫‪0.201‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.365‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.502‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪0.652‬‬ ‫‪160‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪0.74‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪10‬‬

‫‪480nm 3‬‬
 ‫‪.1‬תמיסת גליקוגן מרוכזת מאפרוח רעב‪ -0.5ml :‬בליעה ‪OD 0.205‬‬
‫‪ -1ml‬בליעה ‪OD 0.362‬‬ ‫‪.2‬‬
‫(ממוצע – ‪OD(0.386‬‬
‫‪.3‬תמיסת גליקוגן מהולה מאפרוח שבע‪ -0.5ml :‬בליעה ‪OD 0.629‬‬
‫‪ -1ml‬בליעה ‪OD 0.818‬‬ ‫‪.4‬‬

‫עקומת כיול המתארת בליעה כפונקציה‬

‫של כמות גליקוגן‬

‫‪1‬‬
‫‪y = 0.0034 x + 0.0825‬‬
‫בליעה‪OD‬‬

‫‪0.8‬‬
‫‪0.6‬‬ ‫‪R 2 = 0.991‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪150‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪250‬‬
‫כמות גליקוגן ( ‪)mg‬‬

‫חישובים‪:4‬‬
‫חישוב כמות גליקוגן של אפרוח רעב לפי עקומת כיול ‪µg89.26 :‬‬
‫(נעשה ממוצע בין שתי הבליעות של ‪ 1‬מ"ל ושל ‪ 0.5‬מ"ל מאחר ושתיהן נמצאות בטווח‬
‫עקומת הכיול)‬
‫חישוב כמות גליקוגן של אפרוח שבע לפי עקומת כיול ‪µg160.73 :‬‬
‫(נלקחה רק הבליעה של חצי מ"ל‪ ,‬מאחר ו‪1 -‬מ"ל יצא מטווח העקומה)‬
‫חישוב רמת גליקוגן ב‪ -‬כבד ‪ mg/gr‬עבור אפרוח רעב‪0.4463=89.26/1000*2*2.5 :‬‬
‫חישוב רמת גליקוגן ב‪ -‬כבד ‪ mg/gr‬עבור אפרוח שבע‪=160.73/1000*2*5*2.5 :‬‬
‫‪4.018‬‬
‫הסבר החישוב‪:‬‬
‫הכפלה ב‪ 2.5 -‬מאחר ומהלנו את המשקע פי ‪ 2.5‬מ"ל מים מזוקקים‪ ,‬הכפלה ב‪ 5 -‬כי מהלנו‬
‫את המבחנה מהאפרוח השבע פי ‪ 5‬לפי הוראת המדריך‪ ,‬הכפלה נוספת ב‪ 2 -‬מאחר וקיבלנו‬
‫חצי גר' כבד והחישוב הוא עבור גר' כבד‪ ,‬חלוקה ב‪ ,1000 -‬ע"מ להפוך ‪ µg‬ל‪.mg -‬‬
‫מסקנות‪:‬‬
‫ניתן לראות שרמת הגליקוגן באפרוח השבע גבוהה מאשר ברעב‪ ,‬וזאת מאחר שהגלוקוז‬
‫שהתקבל מהמזון של האפרוח השבע התפלמר לגליקוגן ואילו גליקוגן באפרוח השבע‬
‫התפרק לגלוקוז ע"מ לספק לו אנרגיה‪.‬‬
‫הערך הספרותי עבור אפרוח שבע ‪ :‬כבד ‪10-20mg/gr‬‬
‫אנחנו קיבלנו כבד ‪ , 4.018mg/gr‬התוצאה הנמוכה מוסברת בכך ש‪:‬‬
‫‪)1‬האנזים עמילוגלוקוזידז מפרק קשרים אלפא ‪( 1-4‬קשרים ישרים)‪ ,‬ייתכן והגליקוגן היה מאוד‬
‫מסועף (אלפא ‪ )1-6‬ולכן לא כולו התפרק‪.‬‬

‫‪ 4‬עקרון החישובים מפורט בניסוי הקודם‬

‫‪ )2‬בניסוי היה צריך אחרי כל המסה עם אתנול לקרר בקרח במשך ‪ 10‬דקות‪ .‬הקירור נעשה רק‬
‫פעם אחת‪ ,‬יתכן שלא כל הגליקוגן שקע‪.‬‬
‫‪ )3‬אי דיוקים בנפחים‪ ,‬בזמן האינקובציה‪ ,‬בהמסת המשקע ובקריאת הבליעה‪.‬‬