‫מעבדה ‪ :1‬קינטיקה אנזימטית‬

‫תקציר‬
‫במעבדה זו‪ ,‬נלמד על העקרונות הבסיסים של קינטיקה אנזימטית דרך אפיון האנזים בוטיריל‪-‬כולין‪-‬אסטרז )‪ ,(BChE‬אשר‬
‫מתנהג לפי חוק מיכאליס‪ -‬מנטן‪ .‬במהלך המעבדה נמדוד את פעילות האנזים בריכוזים שונים של סובסטראט‪ ,‬בנוכחות ובהיעד‬
‫מעכב‪ .‬מהנתונים האלה נחשב פרמטרים שונים כגון‪ Vmax, Km, Ki, turnover number :‬ונלמד להבין את משמעותם‬
‫המעשית‪ .‬נעקוב אחרי פעילות האנזים בעזרת ריאקציה ספונטנית שנייה‪ ,‬המתרחשת עם תוצר פעילות האנזים (הראקציה‬
‫הראשונה)‪ ,‬ומשחררת חומר שבולע באורך גל הנראה‪ .‬ריאקצית צבע זו מאפשרת מדידה קלה בספקטרופוטומרטר והערכה‬
‫כמותית של פעילות האנזים‪.‬‬

‫רקע ביולוגי‬
‫ידועים שני סוגים של כולין אסטראזות‪ )1 :‬אצטילכולין אסטראז )‪ (AChE‬שתפקידו הפיזיולוגי הוא פירוק האצטילכולין במרווח‬
‫הסינפטי‪ )2 ,‬בוטירילכולין אסטראז (‪ )BChE‬שנמצא גם בסרום וברקמות‪ ,‬ועוזר לגוף לפרק חומרים רעילים‪ ,‬לפני שהם מגיעים‬
‫למערכת העצבים‪ .‬ל ‪ BChE‬אין סובסטראט טבעי בגוף‪ ,‬ולכן תפקידו בגוף עדיין לא מובן עד הסוף‪ .‬עם זאת‪ ,‬מחקרים מצביעים‬
‫על שורה ארוכה של השפעות תאיות‪.‬‬

‫שני האנזימים‪ AChE ,‬ו‪ ,BChE-‬שייכים לקבוצת "אנזימי‪-‬סרין"‪ ,‬המאופיינים בשלישיה קטליטית בתוך האתר הפעיל‪ :‬שייר‬
‫סרין [‪ ,]Ser‬שייר ‪ His‬פעיל וגלוטמאט ]‪( ]Glu‬איור מס' ‪ .)1‬אצטיל כולין אסטראז מפרק ביעילות אצטיל כולין וכמעט שאינו‬
‫מפרק בוטיריל כולין‪ ,‬ואילו ‪ BChE‬פועל ביעילות דומה על שניהם‪ .‬אנזימי‪-‬סרין אלה נבדלים גם בתלות הפעילות בריכוז‬
‫הסובסטרט‪ AChE .‬מעוכב בעודף אצטיל כולין (עודף סובסטרט)‪ ,‬בעוד ש‪ BChE-‬פועל לפי קינטיקה קלאסית של‬
‫‪ Michaelis-Menten‬ואינו מעוכב ע"י עודף סובסטרט‪.‬‬

‫איור מס' ‪ :1‬פעילות של כולין אסתראז והאתר הפעיל של ‪ (A) :BChE‬הידרוליזה של ‪ )B( ACh‬מנגנון‬
‫ההידרוליזה‪ (C) .‬האתר הפעיל‪ :‬שלישיה קטליטית המורכבת משלוש ח''א‪ .Ser [S], His [H], Glu [E]:‬קבוצת‬
‫האציל של הסובסטרט (כאן ‪ )ACh‬תואמת לכיס האציל [‪ ]A‬כאשר חנקן רבעוני בא באינטראקציה עם אתר חומצי של‬
‫]‪ .Trp [W‬הסובסטרט מועבר לתעלת (‪ )gorge‬האתר הפעיל ע''י אינטראקציה עם השיירים ]‪ Asp [D‬ו‪Tyr [Y]-‬‬
‫(‪.(peripheral binding site‬‬

‫‪C‬‬
‫ידועה חשיבות קלינית לקביעת הרמה ופעילות האנזימטית של ‪ BChE‬בסרום ‪ )1:‬בתחום ההרדמה‪ ,‬פעילות ‪ BChE‬קובעת את‬
‫קצב הפירוק של )‪ ,succinylcholine (SCh‬חומר המשמש כמרפה שרירים (‪ )myorelaxant‬בזמן ההרדמה; רמה נמוכה מדי‬
‫של פעילות ‪ BChE‬לא מאפשרת פירוק מספיק מהר של ‪ ,SCh‬עלולה להביא לסכנת מוות בעת התאוששות מהרדמה בעקבות‬
‫חוסר יכולת של שרירי הנשימה להתכווץ‪ )2 .‬תרכובות אורגנו‪-‬זרחניות (‪ )Organophosphates‬מעכבות אנזימי‪-‬סרין‬
‫ומשמשות כחומרי לוחמה כימית וכקוטלי חרקים‪ .‬מדידת רמת העיכוב של בוטיריל כולין אסטראז בסרום משמשת כאמצעי עזר‬
‫לדיאגנוזה של הרעלה ברעל עצבים‪ .‬בנוסף‪ ,‬חומרים מקבוצת ‪ glycoalcaloids‬אשר מצויים במאכלים צמחיים ממשפחת‬
‫‪ Solanaceae‬כגון תפוחי אדמה ועגבניות‪ ,‬מעכבים גם הם את פעילות ה‪.BChE-‬‬

‫‪Substrates‬‬

‫‪Reversible inhibitors‬‬
‫)‪(Alzheimer’s therapies‬‬

‫‪Irreversible inhibitors‬‬
‫‪(Organophosphates-‬‬
‫)‪nerve gases‬‬

‫מעכבי כולינאסתראזות ומחלת האלצהיימר‬

‫מחלת האלצהיימר הינה מחלה כרונית ניוונית של תאי עצב במוח‪ ,‬שגורמת לאובדן זיכרון ותפקוד קוגניטיבי ואחראית לשני‬
‫שליש ממקרי הדמנציה‪ .‬נמצא שהמערכת העצבית המושפעת ביותר במהלך המחלה היא המערכת הכולינרגית‪ ,‬המעבירה‬
‫סיגנלים באמצעות המולקולה )‪ .Acetylcholine (ACh‬שלל חומרים נבדקו להגברת רמת ה‪ ACh-‬בדרכים שונות במטרה‬
‫להקל על תסמיני המחלה‪ .‬בבדיקות קליניות‪ ,‬רק מעכבים של האנזים ‪ AChE‬ו ‪ BChE‬הראו השפעה חיובית מובהקת על‬
‫התפקוד הקוגניטיבי של החולים‪ .‬עיכוב ההידרוליזה מגביר את ריכוז ה‪ ACh-‬במרווח הסינפטי ומצליח לפצות על חלק מהחסרים‬
‫שנגרמים על ידי המחלה‪ .‬לאנזימים ‪ BChE‬ו‪ AChE-‬שני אתרים הקשורים לפעילותו‪peripheral anionic subsite )1( :‬‬
‫)‪ (PAS‬ו‪ .esteratic subsite )2( -‬אתר (‪ )1‬אחראי על הקישור הראשוני של הסובסטרט ‪ ACh‬לאנזים‪ ,‬ע"י תפיסת קבוצת‬
‫האמין הרביעוני (‪ .)RN+(CH3)3‬לאחר מכן‪ ,‬הקבוצה האסתרית עוברת הידרוליזה ע"י אתר (‪ .)2‬מעכבים פוטנציאליים של‬
‫האנזים יכולים לפעול כנגד כל אחד משני האתרים הללו‪ .‬חלקם נקשרים לשני האתרים ומביאים לתגובת עיכוב משולבת‪ .‬בכל‬
‫אופן‪ ,‬קישורם של המעכבים ידוע כקישור הפיך‪.‬‬
‫גזי עצבים הינם תרכובות זרחן אורגניות‪ ,organophsphate (OP) -‬כגון ‪ Sarin, Soman, Tabum‬ו‪ ,VX -‬אשר פותחו‬
‫במקור כנשק לוחמה כימי‪ .‬חומרים אלו הינם מעכבים של האנזים ‪ .AChE‬במהלך הפירוק האסתרי‪ ,‬יוצרים גזים אלו קשר‬
‫קוולנטי עם האתר הקטליטי של החלבון‪ -‬קישור שהינו בלתי הפיך אשר מביא לעיכוב מוחלט של האנזים‪ .‬מצב זה הינו קטלני‬
‫היות וחוסר פירוק של ‪ ACh‬מביא בין היתר לאיבוד השליטה על שרירי הנשימה וכתוצאה מכך לחנק‪ .‬אלו השורדים הרעלה זו‪,‬‬
‫סובלים מנזק עצבי קבוע‪.‬‬
‫המולקולה ‪( Donepezil‬ידועה גם בשם ‪ )Aricept‬הינה די‪-‬פפטיד הנמצא בשימוש בחולי אלצהיימר‪ .‬מולקולה זו הינה מעכב‬
‫הפיך של ‪ AChE + BChE‬אשר נקשרת לאתר האניוני‪ .‬המולקולה מביאה לשיפור בתסמיני המחלה וכן מביאה לעיכוב יצירת‬
‫משקעי אמילואיד‪-‬בטא ברקמות המוח של החולים‪.‬‬
‫המולקולה ‪( Galantamine‬הידועה גם בשמות ‪ Razadyne‬ו‪ )Nivalin-‬הינה אלקלואיד (תרכובת אורגנית המכילה בסיס חנקני)‬
‫אשר מופק מהצמח ‪ Galanthus woronowii‬ומשמשת לטיפול במקרים קלים עד בינוניים של מחלת האלצהיימר‪ .‬החומר הינו‬
‫מעכב תחרותי הפיך של האנזים ‪ AChE‬אשר נקשר לאתר האניוני וכן לאזור נוסף בחלבון המכיל חומצות ארומתיות‪ .‬מעבר‬
‫לכך‪ ,‬המולקולה נקשרת גם לקולטנים של ‪( ACh‬הקולטנים הניקוטיניים)‪ .‬קישור זה מעלה את הרגישות של הרצפטורים ל‪-‬‬
‫‪ ACh‬ובכך מוסיף ליכולת המולקולה לשפר את תסמיני המחלה‪ .‬מלבד העיכוב של ‪ Galantamine ,AChE‬מעכב את האנזים‬
‫‪ BChE‬אולם בצורה פחות פוטנטית (יכולת עיכוב מופחתת פי ‪ 5‬ביחס ליכולת העיכוב של ‪.)AChE‬‬

‫במעבדה הראשונה‪ ,‬אנחנו נקבע את ‪ Km‬ו‪ Vmax -‬של בוטיריל כולין אסטראז מנוקה ואת קבוע העיכוב )‪ (Ki‬של‬
‫‪ Galantmine‬או ‪.Donepezil‬‬

‫פעילות האנזים נמדדת בעזרת בוטירילתיאוכולין (‪ )BTC‬כסובסטרט‪ .‬תוצר הפירוק הוא תיאוכולין‪ .‬התיאול מחזר ‪5, 5’ Dithiobis-‬‬
‫‪ .(DTNB( 2-nitrobenzoic acid‬תוצר החיזור‪ ,TNB ,‬בולע אור ב‪ .414 nm -‬מקדם הבליעה המולארי הוא ‪13,660 M-1 cm-1‬‬

‫‪butyrylthiocholine + H2O thiocholine + butyric acid‬‬

‫מדידת פעילות האנזים נעשית ב‪ microplate reader -‬שהוא ספקטרופוטומטר ממוחשב היכול לעקוב בו זמנית אחרי ‪96‬‬
‫ריאקציות‪ .‬במעבדה נמדוד את הקצב של ‪ 8‬ריאקציות (ריכוזי סובסטרט שונים)‪ ,‬כל אחת ב‪ 4-‬חזרות (קווארדופליקאטים)‪.‬‬
‫התוכנה מעבדת את ערכי הבליעה ומחשבת את קצב עלייתה‪ ,‬והפלט נותן את קצב הריאקציה הממוצע )‪ )A414/min‬שהיה בזמן‬
‫המדידה‪ ,‬בכל בארית‪ .‬הנתונים מועברים לתוכנת ‪ EXCEL‬לשם עיבוד נוסף‪.‬‬
 ‫מהלך הניסוי‬

‫קביעת קצב הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטראט בהעדר מעכב‬

‫הכינו שורת מבחנות המכילות ‪ 900µl‬של תמיסת ‪ (Stock solution 7.5mM) BTC‬בהתאם לריכוזים –המופיעים בטבלה‬
‫מספר ‪ .1‬הטעינו קוואדרופליקאטים של בארות לפי הסדר הבא‪ 50µl :‬מכל ריכוז ‪ 50µl ,BTC‬מים‪ ,‬ו‪ 100µl -‬בופר המכיל‬
‫‪ ,DTNB‬לפי טבלה ‪.2‬‬
‫הוסיפו את האנזים (‪ )stock solution concentration: 20 µg/ml‬לבארות מיד לפני הכנסת הפלטה למכשיר‪.‬‬
‫בעזרת המדריך‪ ,‬תקראו ב‪ 12 :OD414-‬מדידות עם ‪ 10‬שניות בין מדידה למדידה (‪ (interval‬בקורא פלטות‪.Magellan -‬‬
‫המכשיר מתוכנת מראש למדידות המעבדה‪.‬‬

‫קביעת קצב הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטראט בנוכחות מעכב‬

‫חזרו על הניסוי המתואר לעיל כאשר תערובות הריאקציה מכילות‬
‫‪ Galantamine HCl‬בריכוז של ‪ 2.0 µM‬או ‪ Donepezil‬בריכוז של ‪.0.4 µM‬‬
‫בעזרת המדריך‪ ,‬תקראו ב‪ 12 :OD414 -‬מדידות עם ‪ 10‬שניות בין מדידה למדידה (‪ (interval‬בקורא פלטות‪ .Magellan -‬המכשיר מתוכנת‬
‫מראש למדידות המעבדה‪.‬‬

‫טבלה ‪ :1‬מיהול של הסובסטראט [יש למלא את הטבלה במסגרת הדוח המכין למעבדה]‬

‫‪Sample ID‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪8‬‬

‫)‪BTC concentration (μM‬‬ ‫‪250‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪750‬‬ ‫‪1,000‬‬ ‫‪2,500‬‬ ‫‪3,500‬‬ ‫‪5,000‬‬ ‫‪7,500‬‬

‫)‪Volume of 7.5 mM BTC (μl‬‬

‫)‪Volume of Water (μl‬‬

‫טבלה ‪ :2‬תלות מהירות הראקציה של ‪ Butyrylcholine esterase‬בריכוז הסובסטראט‪ ,‬בהעדר מעכב‪.‬‬

‫‪BTC‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫)‪Vol. (μl‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Avg.‬‬
‫)‪(μM‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫)‪DTNB(a‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪Rate ±‬‬
‫‪BTC‬‬ ‫‪H2O‬‬ ‫)‪(1mM‬‬ ‫‪BChE‬‬ ‫‪std. dev.‬‬
‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪Nmol‬‬
‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬
‫‪± SD‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪2‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪3‬‬ ‫‪150‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪4‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪5‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪6‬‬ ‫‪700‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪7‬‬ ‫‪1000‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪8‬‬ ‫‪1500‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬

‫‪(a) DTNB in 250 mM K-phosphate buffer pH 8‬‬

 ‫טבלה ‪ :3‬תלות מהירות הראקציה של ‪ Butyrylcholine esterase‬בריכוז הסובסטראט‪ ,‬בנוכחות מעכב‬
‫‪BTC‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫)‪Vol. (μl‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Avg.‬‬
‫)‪(μM‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫)‪DTNB(a‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪Rate ±‬‬
‫‪BTC‬‬ ‫‪Gal,‬‬ ‫)‪(1mM‬‬ ‫‪BChE‬‬ ‫‪std. dev.‬‬
‫‪2μM‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪Nmol‬‬
‫‪Or‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬
‫‪Don,‬‬ ‫‪± SD‬‬
‫‪0.4μM‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪2‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪3‬‬ ‫‪150‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪4‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪5‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪6‬‬ ‫‪700‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪7‬‬ ‫‪1000‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪8‬‬ ‫‪1500‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬

‫‪(a) DTNB in 250 mM K-phosphate buffer pH 8‬‬

‫הגדרות‪:‬‬
‫יחידת אנזים‪ :‬כמות האנזים המפרק ‪ 1 mol‬של סובסטרט בדקה‪.‬‬
‫פעילות ספציפית‪ :‬מספר יחידות האנזים במג' חלבון‪.‬‬
‫‪ :TURNOVER NUMBER‬מספר מולים של הסובסטרט שמפורקים בדקה ע"י מול אחד של אנזים‪.‬‬
‫המסה המולקולארית של בוטירילכולין אסטראז היא ‪.440 kDa‬‬
‫הפעילות הספציפית של האנזים המסחרי היא ‪.13 Units/mg protein‬‬

‫עיבוד נתונים‬
‫העבירו את הפלט ל ‪ EXCEL -‬והפכו את ערכי הבליעה ל ‪ .nmols -‬שימו לב כי בפלטת ‪ ,ELISA‬האור עובר דרך ‪ 0.5‬ס"מ‬
‫ולא ‪ 1‬ס"מ כמקובל‪.‬‬
‫‪ .1‬מלאו את טבלאות ‪ 2‬ו‪ 3 -‬והציגו אותן בדו"ח‪ .‬אין צורך להציג את העמודות המציינות את הנפחים של החומרים שהוכנסו‬
‫לבארות‪.‬‬
‫‪ .2‬חשבו את מהירות הריאקציה )‪ (nmol/min‬עבור כל ריכוז‪ .‬הוסיפו דוגמאת חישוב מפורטת‪.‬‬
‫‪ .3‬ציירו בעזרת ‪ EXCEL‬גרף ‪ 1‬המראה את התלות של ‪ V‬ב‪ ]S[ -‬בהעדר מעכבב ובנוכחותו‪ .‬העריכו את ‪ Vmax‬עבור האנזים‬
‫ואת ‪ Km‬ללא ובנוכחות מעכב‬
‫‪ .4‬הציגו טבלה ‪ 4‬של ‪ 1/V‬הממוצע ו‪ 1/[S] -‬עם וללא מעכב‪ ,‬וגרף ‪ 2‬המראה את התלות של ‪ 1/V‬ב‪ 1/[S] -‬בהעדר מעכב‬
‫ובנוכחותו‪ .‬הכריחו את הגרף לחתוך באותה נקודה בציר ‪ ,Y‬ועשו אקסטרפולציה לקבלת נקודת חיתוך גם בציר ‪ .X‬הציגו‬
‫משוואת קו ישר ו‪.R2 -‬‬
‫‪ .5‬לפי התוצאות בהעדר מעכב‪ ,‬קבעו את מספר יחידות האנזים‪ ,‬את הפעילות הספציפית (השוו לאנזים המסחרי) ואת ה‪-‬‬
‫‪ .Turnover number‬קבעו את ‪ Vmax, Vmax apparent, Km apparent, Km, Ki‬לפי גרף ‪.2‬‬
‫‪ .6‬יש להציג את כל דוגמאות החישוב הרלוונטיות‪.‬‬
‫‪.‬‬
‫דיון‪ :‬יש להתייחס בדיון לטיב התוצאות‪ ,‬בהשוואה לצפוי באופן תיאורטי ובהשוואה למקור ספרותי‪ .‬יש לציין את המקורות בהם‬
‫נעזרתם (דוגמאות לצורת הצגת מקורות נכונהת ניתן למצוא בחוברת מעבדה ‪ .)0‬יש להתייחס לכל התוצאות ולתת הסברים‬
‫מנומקים‪.‬‬

‫דו"ח מכין‪ :‬הכינו את הדו"ח ומלאו את טבלה מספר ‪1‬‬

 ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪11‬‬ ‫‪12‬‬

‫‪A‬‬
‫ללא מעכב‬

‫‪B‬‬

‫‪C‬‬

‫‪D‬‬

‫‪E‬‬

‫‪F‬‬ ‫בנוכחות מעכב‬

‫‪G‬‬

‫‪H‬‬