‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬

‫נועה לוי‬

‫חומצות אמינו‬

‫רוב החלבונים הם די קצרים‪ -‬הממוצע הוא ‪ 300-400‬חומצות אמינו‪ .‬חלבונים יכולים להיות מיוצרים‬
‫מגן אחד או מכמה גנים‪ .‬יכולים להיות מיוצרים משרשרת אחת ולעבור ביקוע לשתי שרשראות ועוד‪.‬‬

‫שיטות הפרדה וניחות‪ -‬יש להבחין בין שתי שיטות כאשר אחר משמשת לכמויות חומר קטנות והשנייה‬
‫לכמויות גדולות‪.‬‬

‫אנליטיות ‪ -‬יכולות להיות כמותיות (כמה חלבון יש בנוזל) או איכותיות (האם יש חלבון מסוים או‬ ‫‪.1‬‬
‫לא)‪ .‬נעבוד בשיטות אלה עם כמויות קטנות של חומר‪.‬‬
‫פרפרטיביות ‪ -‬מיועדות לטיהור חלבונים‪ .‬נשתמש בחומר בכמויות גדולות‪ .‬ההבדל הוא היכולת‬ ‫‪.2‬‬
‫לזקק ולנקות באופן מיטבי את החומר‪.‬‬

‫רוב הפעמים נשתמש בשילוב של שתי השיטות להגיע לתוצר מסוים‪ .‬השיטות מתבססות על תכונות‬
‫החלבון‪ .‬נעדיף לעבוד עם חלבונים שכיחים‪ ,‬זמינים וכאלו שניתן למדוד בקלות‪ .‬קל יותר לעבוד עם‬
‫חלבונים גדולים הניתנים לבידוד בקלות מהרקמות‪.‬‬

‫כימות חלבונים‪ -‬יכול להיות במקביל להפרדה‪ ,‬לפי זה נדע שאנחנו אכן מצליחים לבודד את החלבון‬
‫הספציפי‪ .‬לא תמיד נרצה להבדיל‪ -‬לפעמים נרצה רק לדעת כמה מהחלבון יש‪ .‬אך תמיד נרצה לדעת‬
‫האם החלבון הרלוונטי קיים ואם כן – כמה ממנו יש לנו? עם אנזימים קל מאוד למדוד‪ ,‬ניתן לו את‬
‫החומר עליו הוא עובד ונמדוד את התוצר‪ ,‬או תוצר צבוע וכך נוכל לעקוב אחרי השינויים והתהליך‬
‫המתרחש‪ .‬כך נדע אם כמות האנזים פרופורציונאלית ביחס לתוצר שנוצר‪ .‬כך שלא מודדים את האנזים‬
‫ישירות‪ -‬נמדוד את התוצר ואת היחס‪.‬‬

‫הנדסה קלונית‪ -‬חקר חלבון בעזרת הנדסה קלונית הוא יעיל ביותר לחקר של חלבונים על ידי‬
‫מיקרואורגניזמים‪ .‬מיקרואורגניזמים אשר גדלים ומשתכפלים מהר מאוד הם מצע מצוין למחקר מסוג‬
‫זה כי כך אפשר להשיג תוצאות מהירות ואחידות‪( .‬דוגמאות למצע‪ :‬שמרים‪ ,‬חיידקים ספציפיים)‪.‬‬

‫דוגמא‪ E-coli :‬זו בקטריה שקולטת בתוכה את הגן של החלבון המסוים‪ ,‬היא יודעת לתרגם‬
‫אותו ולשכפל אותו בכמויות גדולות מאוד וגם לארגן את החלבונים המיוצרים בצברים מרוכזים‪.‬‬
‫לאחר מכן‪ ,‬יש להוציא את החלבון החוצה‪ .‬כדי לעשות זאת עלינו "לפוצץ" את התאים על ידיד‬
‫שיטות אנזימטיות או מכניות‪ -‬למשל הקפאה‪ ,‬והפשרה המפוצצות את ממברנת התא או טחינה‬
‫של התא)‪.‬‬

‫כאשר שוברים תא זה יפגע בכל האיזון‪ ,‬הטמפרטורה לא תהיה בהומיאוסטזיס‪ ,‬ורמת החומציות תשתנה‬
‫גם כן‪ .‬לכן אם נבצע תהליכים על חלבון עלינו להיות בבקרה חזקה על התנאים החיצוניים‪ -‬טמפרטורה‬
‫מתאימה‪ PH ,‬פיזיולוגי‪ ,‬ולנטרל גורמים שעשויים להרוס את החלבון‪.‬‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫מדידת חלבונים ‪ :‬חלבונים אנזימטיים ‪ /‬חלבונים נונ‪-‬אנזימטיים‬

‫מדידת חלבונים אנזימטיים‪-‬‬

‫אנזימים‪ -‬קבוצה של חלבונים שיש לה פעילות קטליטית‪.‬‬ ‫‪‬‬

‫סובסטרט‪ -‬מולקולה שעליה פועל האנזים ומזרז תגובות הקשורות בה‪.‬‬ ‫‪‬‬
‫תגובות אנזימטיות ‪ -‬ניתן להגיב אנזימים עם סובסטרטים ידועים‪ ,‬ולפי כמות התוצר נוכל‬ ‫‪.1‬‬
‫להעריך את כמות האנזים שהגיב‪ .‬למעשה‪ ,‬במקום מדידת האנזים אנו נרצה למדוד את התוצר‪.‬‬
‫אם קשה למדוד את כמות התוצר ישירות‪ ,‬ניתן להשתמש באינדיקטורים שנצבעים בנוכחות‬
‫התוצר המתקבל‪ .‬כמות האנזים פרופורציונית לכמות התוצר המתקבל או לחילופין למידת‬
‫השינוי באינדיקטור שאותו בוחנים‪.‬‬
‫‪ - Reaction enzymatic coupled‬מדידת כמויות תוצר של אנזים אחר שהקשר בין כמותו‬ ‫‪.2‬‬
‫לבין כמות האנזים הנבדק ידוע לנו עובד על אותו עיקרון‪.‬‬

‫מדידת חלבונים נונ‪-‬אנזימטיים‪-‬‬

‫משתמשים בתכונות של החלבונים וביכולתם להיקשר לחומרים או משטחים מסוימים‪ .‬כאן לא חייבת‬
‫להיות ריאקציה כימית‪ ,‬ההיקשרות יכולה להתבצע באופנים שונים‪.‬‬

‫בנוירוטרנסמיטרים אשר נקשרים לרצפטורים ספציפיים‪ ,‬נוכל להעריך את כמות הנוירוטרנסמיטר על פי‬
‫כמות השינוי שחל ברצפטור לאחר ההיקשרות‪.‬‬

‫נוירוטרנסמיטרים‪ -‬מוליך עצבי ‪ -‬מולקולה העוברת בין תא עצב לתא מטרה כלשהו‬ ‫‪‬‬
‫דרך הסינפסה‪.‬‬
‫שיטות ‪ -Immunoassays‬נוגדנים נקשרים לאלמנטים אנטיגניים של אורגניזמים זרים‬ ‫‪.1‬‬
‫שחודרים לגוף‪ .‬אלו נוגדנים בעלי אפיניות (רגישות) גבוהה מאוד לאנטיגנים מסוימים‪ .‬לכן ניתן‬
‫להעריך כמות חלבון (נוגדן) מסוים גם על פי כמות ה"תקיפות" החיסוניות‪ .‬שינוי צבע של חומר‬
‫זר שחודר לגוף אחרי שנתקף מהנוגדן יכול להעיד על כמות הנוגדן‪ ,‬כל שינוי שניתן למדוד יכול‬
‫להעניק לנו את המידע הרלוונטי‪.‬‬
‫אלו הן שיטות המשתמשות במניפולציה אפיניטיבית הן מבוססות על ריגושיות של חלבונים‬
‫שונים ולגורמים שונים ועל פי מידת הריאקטיביות של כל חלבון נבדק‪ .‬ניתן להפיק עליו מידע‪,‬‬
‫חוץ מכמות‪ ,‬למשל רגישות או ספציפיות – נבדוק האם יש תקיפה של עוד גורמים מלבד גורם‬
‫האפיניות הנבדק – חשוב בייצור תרופות‪ .‬ניתן להצמיד את הנוגדן לאנזים שמפיק צבע ולדעת‬
‫מה הייתה כמות הנוגדן מראש לפי כמות מחוללי האפיניות שנצבעו‪.‬‬
‫‪ -ELISA- Enzyme linked immunosorbent assay‬מטרתה לקחת חלבון לא ידוע‪,‬‬
‫ולנסות לזהות את החלבון שמעניין אותנו‪ -‬שיטה מאוד רגישה‪ .‬נוגדנים יודעים לזהות חלבונים‬
‫מאוד ספציפיים‪.‬‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫יש משטח שיכול לספוח נוגדנים‪ .‬הוא סופג אותם ומקבע את הנוגדנים הספציפיים‬ ‫א‪.‬‬
‫לחלבון מסוים עליו‪.‬‬
‫קשירת האנטיגן‪ -‬אם נכניס תערובת שיש בה יותר מחלבון אחד‪ -‬רק אחד מהם יקשר‬ ‫ב‪.‬‬
‫לנוגדנים המקובעים על המשטח‪ .‬אחרי כן‪ ,‬נבצע שטיפה ואז כל החלבונים האחרים‬
‫יתנקו ורק החלבון הרלוונטי יישאר‪ .‬בשלב זה עוד לא יודעים לכמת את החלבון ‪-‬‬
‫הנוגדן לכן מדובר בגילוי בלתי ספציפי – הצלחנו לאשר את קיומו של חלבון מסוים‬
‫באמצעות כך שראינו שהאנטיגן נקש אך אין לנו מידע על החלבון‪.‬‬
‫כימות אנזימטי של הנוגדן‪ -‬לאחר מכן מוסיפים חלבון נוסף שמקושר לאנזים לגילוי‬ ‫ג‪.‬‬
‫הספציפי של החלבון‪ .‬הנוגדן השני יהיה צבוע או מקושר לאנזים צובע שנוכל לזהות‪ .‬זה‬
‫נקרא "סנדוויץ' '" וכדי לקרוא כמה נוגן יש נשתמש בסובסטרט והם מייצרים צבע אחר‬
‫ומשים את צבעם וכך ניתן לדעת כמה חלבונים מראש היו שם‪.‬‬
‫ננצל את הצימוד שקורה טבעי ונספור את הנוגדן‪/‬אנזים שקל לנו לזהות‪ .‬ברגע שיפסיק‬
‫להתווסף צבע נדע שזו כמות הנוגדן המקורי שהייתה‪ ,‬לפי הכמות מהנוגדן שהוספנו‬
‫שנוצלה נוכל לחשב כמה נוגדן מקורי היה לנו מראש‪ .‬זהו גילוי כמותי – ספציפי‬
‫שנעשה על ידי צימוד נוגדנים‪.‬‬
‫הכימות נעשה על פי הנוגדן השניוני ולא הראשוני‪.‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2‬‬
‫כימות חלבון לפי ‪ -Absorbance Spectroscopy‬זוהי מדידת‬ ‫‪.2‬‬
‫כמויות לפי תחומי בליעה של אור – ספקטרום ‪ .UV‬חלבונים בולעים‬
‫הרבה אור (בממוצע אורך גל של ‪ 280‬ננומטר – לרוב טווח בין ‪200-‬‬
‫‪ .)400‬התכונה נובעת מהימצאותן של טבעות ארומטיות בקצוות בצידי‬
‫החומצות האמינו המרכיבות את החלבונים‪ .‬זוהי תכונה אינרטית של‬
‫החלבון עצמו‪.‬‬
‫חוק בר‪-‬למברט‪ -‬ניקח אור‪ ,‬ונאיר איתו‪ ,‬הוא‬
‫יפגע במים וחלק מעוצמתו פגעה וחלק ממנה‬
‫יצאה‪ .‬נשתמש ביחס בין העוצמה של האור‬
‫שפגע לעוצמת האור שעברה והיא ביחס‬
‫לריכוז החומר וביחס לתכונת החומר הספציפי‪.‬‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫זה יהיה מדד טוב לכל החלבונים בתמיסה‪ ,‬לעומת אליזה שהיא לחלבון אחד ספציפי‪ .‬כאן לא‬
‫נוכל להבדיל בין החלבונים השונים אלא נקבל את הממוצע של התערוב‪ .‬חשוב שנכיר שיש‬
‫תכונות בליעה לאורכי גל מסוימים ועל ידי מדידת העוצמה של האור שפגע אל מול האור שעבר‬
‫נוכל לדעת ריכוז‪ .‬התכונות האלו משמשות אותנו להפרדת חלבונים‪.‬‬
‫‪Extinction/Absorptivity coefficient‬קבוע הבליעה האינהרנטי של החלבון‪ .‬חשוב לזכור‬
‫שלרוב הוא נובע מקבוצות הצד של החלבון‪.‬‬
‫יש השפעה של המרחק שעובר האור על עוצמת הבליעה ולכן הנוסחה מתחשבת בפרמטר‬

‫המרחק‪.‬‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫המלחה החוצה‪ -Salting out -‬הפרדת חלבונים על פי מסיסות של‬

‫חלבון‪ -‬כמות המלח של תערובת מאוד משפיעה על המסיסות של חלבון‪.‬‬
‫ברגע שיש הרבה מלח‪ ,‬מולקולות המים "עסוקות" ונקשרות למלח‪,‬‬
‫והחלבון יצא מהתמיסה כי הממס "עסוק" ולא ימיס אותו ולכן החלבון‬
‫ישקע‪ .‬אם נגדיל מאוד את כמות ההמלחה החלבון ישקע‪ .‬ההבדל בין‬
‫המסיסויות השונות של חלבונים מאפשר לנו להשתמש בשיטה להפרדה‬
‫בין חלבונים שונים על ידי ריכוזי מלח שונים‪ .‬השיטה מתבססת על העובדה שחלבונים שונים שוקעים‬
‫בריכוזי מלח שונים‪ ,‬בהתאם למסיסותם‪ .‬חלבונים מסיסים יותר יצאו אחרונים כי הקשר שלהם עם המים‬
‫חזק יחסית‪ ,‬ואילו חלבונים שמסיסותם נמוכה יצאו קודם כי הקשר שלהם עם המים חלש ומועט יחסית‪.‬‬
‫ניתן לבצע את השיטה במספר שלבים‪ ,‬ביניהם נשנה את רמת המלח במים וכך נוכל להפריד מספר‬
‫חלבונים שונים‪ .‬זהו עקרון גס מאוד וכיום לא נראה אותו בשימוש רב‪.‬‬

‫כרומטוגרפיה‪ -‬כרומו=צבע‪ .‬במקור הייתה הפרדת חומרים על פי צבעים‪ .‬כיום‬

‫‪ -‬ניקח תערובת של חלבונים ונמוסס אותה בבופר נוזלי‪ .‬התמיסה שנוצרה‬
‫נקראת "הפאזה הניידת" – ‪ .mobile phase‬את הפאזה הזו נשים בקולונה‬
‫שיש בה חומר סופח הנקרא "הפאזה המקובעת" – ‪.stationary phase‬‬
‫החלבונים יזוזו על פני הקולונה ויצרו קשרים ואינטראקציות עם החומר הסופח‬
‫בקולונה בהתאם לתכונות של החלבונים וכך יתחלקו לפי עקרונות מסוימים‬
‫שנגדיר‪:‬‬
‫גודל‬ ‫‪.1‬‬ ‫קוטביות‬ ‫‪.2‬‬ ‫מסיסות‬ ‫‪.3‬‬ ‫‪ .4‬משיכה אלקטרונית‬
‫כל אחד מהחלבונים יגיב אחרת בכל קולונה‪ ,‬אך התכונות השונות של החלבונים יאפשרו לנו להפריד‬
‫בין החלבונים בעזרת המגע עם הקולונה מסוגים שונים לפי המאפיין של החלבון‪.‬‬
‫אלוציה‪ -‬יציאה של חלבונים מהקולונה‪ ,‬זהו לרוב תהליך טבעי‪ ,‬אבל אם הקשרים שנוצרו בקולונה‬
‫חזקים מדי‪ ,‬לעיתים נצטרך להתערב באופן מלאכותי ולבצע זאת על ידי שינוי ‪ ,pH‬הוספת חלבונים‬
‫מסוימים‪ ,‬ניקל אבץ ועוד‪ .‬כל אחד מאלו ישפיע על חלבונים שונים ונוסיף את החומרים הרלוונטיים‬
‫בהתאם לצורך שלנו‪.‬‬

‫‪ -Ion exchanged chromatography‬מפרידה חלבונים לפי המטען‬ ‫א‪.‬‬

‫החשמלי‪ .‬אם החלבון שנרצה הוא קטיוני‪ ,‬נשתמש בקולונה שהיא אניונית‬
‫מאוד כדי שהיא תקשור את המטענים הללו‪ .‬חוזק הקשר ייקבע על פי כמות‬
‫המטענים שיש על החלבון‪ .‬ההפרדה נעשית על פי זמני ההשהיה של‬
‫החלבונים‪ .‬ככל שחלבון טעון יותר שלילי‪/‬חיובי (בהתאם לקולונה שנבחרה‬
‫להפרדה הספציפית) הוא ייקשר יותר ולכן יצא אחרון כי הוא נקשר לחומר‬
‫הסופח חזק יותר‪ .‬מי שטעון פחות‪ ,‬או כמו הקולונה שנבחרה יצא ראשון כי הוא לא נקשר חזק‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫או בכלל‪ .‬לעיתים החלבון נקשר לקולונה בצורה חזקה מדי‪ ,‬ואז נשתמש בשיטת ההמלחה‬
‫החוצה‪ ,‬על ידי הכנסת מומסים והעסקה של הסולבנט‪.‬‬
‫‪ -Eluant‬תמיסת בופר שנועדה לשחרר את החומרים היוניים שנשארו‪ .‬תהליך‬ ‫‪‬‬
‫השחרור נקרא אילוציה‪ ,‬לא כל אילוציה דורשת ‪ ,eluant‬חלק מהחומרים יעברו‬
‫אילוציה טבעית כל עוד הם לא טעונים חזק מדי ואז החיבור שלהם לסולבנט לא חזק‬
‫מדי גם כן‪.‬‬
‫‪ - Hydrophobic interaction chromatography‬הפרדת חלבונים לפי תכונות של‬ ‫ב‪.‬‬
‫הידרופוביות‪ .‬חלבונים הידרופוביים יצאו בסוף‪ ,‬הכלל– ‪ –like solves like‬חלבון הידרופובי‬
‫ייקשר יותר חזק לסולבנט הידרופובי‪ .‬המולקולות ההידרופיליות יצאו ראשונות‪ .‬נשתמש בשיטה‬
‫כשנרצה להפריד חלבונים לא פולריים‪ .‬בתנאי מליחות גבוהה‪ ,‬קבוצות בלתי פולריות ייקשרו‬
‫לחומרים הידרופוביים‪ .‬הקבוצות הפולריות יעזבו את הקולונה ראשונות‪.‬‬
‫‪Size exclusion chromatography (gel‬‬ ‫ג‪.‬‬
‫)‪ -filtration‬הפרדת חלבונים על פי גודל וצורה‪ .‬את‬
‫החלבונים נכניס למיכל שיש בו בידים חלולים (דמוי חרוזים) ‪,‬‬
‫חלבונים קטנין יסתבכו בבידים ולכן יתעכבו ביציאתם החוצה‪,‬‬
‫לעומת החלבונים הגדולים שלא יסתבכו ויצאו מהקולונה‬
‫במהירות יותר‪.‬‬
‫‪Affinity‬‬ ‫ד‪.‬‬
‫‪-chromatography‬‬
‫כרומטוגרפית נוגדנים –‬
‫נשתמש בתכונות הקשירה‬
‫של חלבונים לחומרים שונים‬
‫שיש להם רגישות אליהם‪,‬‬
‫למשל נוגדנים‪ .‬החומרים‬
‫החזקים ביותר יצאו‬
‫אחרונים‪ ,‬כי הם ייקשרו‬
‫לאנטיגנים שבסולבנט‪.‬‬
‫‪Electrophoresis Separates by Charge and Size‬‬ ‫ה‪.‬‬
‫– הפרדת חלבונים באלקטרופיזה‪ -‬בשיטה זו נפריד חלבונים‬
‫על פי גודל ומטען חשמלי‪ .‬בוחנים את התנועה של מטענים‬
‫בשדה חשמלי‪ .‬נכניס את התערובת למטריקס סולידי‪ -‬דמוי ג'ל‪,‬‬
‫שדרכו יעברו החלבונים‪ .‬נהוג להשתמש בג'ל ‪PAGE-‬‬
‫‪ Polyacrylamide‬ובתוכו בידים לפי הגודל הרצוי‪ .‬ההפרדה‬
‫נעשית על פי הגודל וקצב ההתקדמות של‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫החלבון בג'ל (המוביליות של החלבון)‪ .‬מוביליות החלבון נקבעת על פי המטען שלו‪ .‬בשונה‬
‫מהשיטה הקודמת‪ ,‬כאן יצאו החלקים הקטנים קודים ורק לאחר מכן החלבונים הגדולים‪.‬‬
‫מוביליות ש ל חלקיקים קטנים טובה יותר מזו של חלקיקים גדולים ולכן החלבונים הקטנים‬
‫יעברו בצורה יעילה ומהירה יותר בג'ל ולכן הם יצאו ראשונים‪ .‬נשאף שהמטען החשמלי של כל‬
‫החלבונים יהיה זהה כדי שהם ינועו באותו הכיוון‪ .‬לרוב הג'ל יהיה בעל ‪ pH‬גבוהה מאוד‪,‬‬
‫והחלבונים יהיו טעונים שלילית וינועו לכיוון הקוטב החיובי (נרצה לסדר שהקוטב החיובי יהיה‬
‫מפנה למטה)‪.‬‬

‫אחרי ההפרדה באלקטרופיזה עלינו להוציא את החלבונים כדי שנוכל לנתח אותם‪ .‬נעשה זאת‬
‫במספר שיטות‪:‬‬

‫‪ -Western blotting‬ניקח את הג'ל האלקטרופורזי ונעביר אותו על גבי ממברנה דקה‬ ‫‪)1‬‬
‫המורכבת מפולימר שיש לו אופי נוגדני אפיני לחלבון הספציפי שנרצה לזהות‪ .‬בשיטה זו‬
‫נתבסס על זיהוי לפי אפיניות נוגדנית‪ .‬אחרי שנעביר את הג'ל על הממברנה הדקה‪ ,‬נשטוף‬
‫את הממברנה מהחלבונים שלא נקשרו לנוגדן‪ ,‬ונשאר רק עם החלבון הרלוונטי‪ .‬אחרי‬
‫השטיפה נוסיף מגיב גילוי ‪ detection reagent -‬ובעזרת שימוש בקרני ‪ X-ray‬נגלה את‬
‫החלבון הספציפי על פי חוזק הכתם שנגלה‪ .‬לרוב נשתמש בכמה שלבים‪ -‬כלומר ריאגנט‬
‫הזיהוי יהיה נוגדן שניוני שקשור לאנזים צובע‪ .‬הזיהוי הסופי יהיה על פי הזיהוי של הנוגדן‬

‫השניוני שיעיד על החלבון הרלוונטי לנו‪.‬‬

‫‪ – SDS-PAGE‬הפרדת חלבונים על פי מסה – נשתמש בדטרגנט‬ ‫‪)2‬‬

‫הטעון שלילית שנקרא ‪ .SDS=sodium dodecyl sulfate‬את ה‪SDS‬‬
‫נוסיף לחלבונים והוא יעשה להם דנטורציה (=שינוי מבנה מרחבי של‬
‫החלבון) בה יאמצו לעמם החלבונים צורה ישרה ואחידה‪ ,‬ללא תלות‬
‫במטען הפנימי שהיה להם לפני‪ .‬ה‪ SDS‬נקשר לכל שתי חומצות אמינו‬
‫– ש כאמור הן הקובעות את מטען החלבון‪ ,‬והן אלו שיקלטו את המטען‬
‫השלילי של ה‪ .SDS-‬נקבל מצב בו נוכל להפריד את החלבונים על פי‬
‫מסתם בלבד‪ ,‬וכל עוד אין ערפלן משלב זה זהו למעשה שיטת ‪gel-‬‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫‪ . filtration‬למעשה חוץ מההפרדה‪ ,‬נוכל לזהות את סוג החלבון על ידי ההשוואה למסות‬
‫החלבון שידועות לנו כי קיים יחס טוב מאוד בין הלוגריתם של המסה של החלבון לבית‬
‫המובילות שלו‪ .‬על פי המובילות נוכל לקבוע את המסה של החלבון ולהשוות אותה למסה‬
‫של חלבונים שאנו מכירים‪.‬‬
‫החומר ‪ SDS‬לא מפריד קשרים קוולנטיים‪ ,‬הוא לא גורם לחיזור קשרים‬ ‫‪‬‬
‫די‪-‬סולפידיים אלא עושה רק דנטורציה‪ .‬הוא כן יפריד שרשראות של חלבונים‬
‫הבנויים ממספר שרשראות שונות‪ .‬אם נרצה לזהות את השרשראות שהיו נשתמש‬
‫במניפולציות כימיות כמו חיזור ציסטאינים וכך נוכל לדעת האם היו שרשראות‬
‫דיסולפידיות בחלבון ואם כן‪ -‬כמה כאלו היו‪.‬‬
‫הפרדה על פי ‪Isoelectric‬‬ ‫‪)3‬‬
‫)‪ – sing (IEF‬השיטה מתבססת על‬ ‫‪focu‬‬
‫העובדה שלחלבונים שונים יש נקודות‬
‫איזואלקטריות שונות הנקבעות על פי‬
‫חומצות האמינו הצדדיות שלה ן‪ .‬אם‬
‫שווה לנקודה האיזואלקטרית של‬ ‫ה‪pH-‬‬
‫חלבון‪ ,‬המטען של החלבון יהיה שווה‬
‫ל‪ 0-‬ולכן החלבון יעמוד בשדה חשמלי ולא יזוז‪ .‬לכן אם נכניס חלבונים‬
‫לשדה חשמלי ונשלוט בערכי ה‪ pH‬נוכל לעקוב אחרי הערך בו החלבון מפסיק את תזוזתו‪,‬‬
‫זה ייתן לנו מידע על הנקודה האיזואלקטרית של החלבון הנבדק וכך נאתר א ת החלבון‬
‫הספציפי‪ .‬ברוב הפעמים‪ ,‬נשתמש בשיטה זו בג'ל בעל שדה חשמלי הנקרא – פוליאמפוליט‪.‬‬
‫בחלק מהפעמים לאחר‬ ‫‪‬‬
‫ההפרדה האיזואלקטרית‬
‫נשתמש בשיטת ה‪SDS--‬‬
‫‪ PAGE‬ונפריד את‬
‫החלבונים שוב על פי המסה‪ .‬כך נוכל לקבל הערכות מדויקות יותר‪.‬‬
‫הפרדת חלבונים על ידי אלקטרוצנטריפוגה‪ -‬זוהי הפרדת חלבונים על פי מסתם‪.‬‬ ‫‪)4‬‬
‫העקרון קובע שמולקולות כבדות יותר ישקעו מהר יותר בצנטריפוגה‪ .‬מסובבים את‬
‫הצנטריפוגה מהר מאוד עד תאוצה של מיליון ‪ .G‬קצב השקיעה יושפע גם על ידי הצפיפות‬
‫והצורה‪ .‬חלבונים בעלי צפיפות גבוהה יותר ישקעו מהר יותר‪ .‬בנוסף‪ ,‬ככל שלמולקולה יש‬
‫יותר שטח פנים כך יש לה יותר חיכוך ולכן תשקע לאט יותר‪ .‬קבוע הסדימנטציה נמדד‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫‪−3‬‬
‫שניות(‪ .‬והוא המדד לגודל ולצורה של החלקיק על פי קצב השקיעה‬
‫‪01‬‬ ‫ביחידות סוודברג (‬
‫תחת גרביטציה מסוימת וביחידת זמן מסוימת‪ .‬לפי החישוב של קבוע הסדימנטציה‪ ,‬נזהה‬
‫ונקבע מהו החלבון הנבדק בהתאם להשוואה לקבוע הסדימנטציה שאנו מכירים מראש‬
‫לכל חלבון‪ .‬קבוע הסדימנטציה אינו גודל קבוע‪ ,‬כך שאם שחיבור כמה קבועים של חלבונים‬
‫שונים לא ייתן את הערך של החלבון המשולב שנוצר‪ .‬זוהי תכונה משתנה לכל חלבון‪.‬‬
‫לחומצות גרעין‪ RNA ,DNA ,‬וריבוזומים – קבועי סדימנטציה גבוהים במיוחד‪.‬‬

‫אפיניות‬ ‫מסיסות‬ ‫‪PI‬‬ ‫מטען‬ ‫גודל‬ ‫מסה‬

‫חשמלי‬
‫‪– Elisa‬‬ ‫‪Salting‬‬ ‫‪Isoelectric‬‬ ‫‪Ion‬‬ ‫‪Gel‬‬ ‫‪SDS PAGE‬‬
‫כימות‬ ‫‪out‬‬ ‫‪focusing‬‬ ‫‪exchange‬‬ ‫‪filtration‬‬
‫חלבונים‬ ‫)‪(IEF‬‬ ‫‪d‬‬
‫‪chromato‬‬
‫‪graphy‬‬
‫‪Affinity‬‬ ‫‪Hydropho‬‬ ‫אלקטרופורז‬ ‫אלקטרופורז‬ ‫אלקטרוצנט‬
‫‪chromato‬‬ ‫‪bic‬‬ ‫ה‬ ‫ה‬ ‫ריפוגה‬
‫‪graphy‬‬ ‫‪interactio‬‬
‫‪n‬‬
‫‪chromato‬‬
‫‪graphy‬‬

‫ריצוף חלבונים‬

‫‪ - Sanger sequencing‬ריצוף חלבון‪ -‬קביעת רצף‬

‫חומצות האמינו המרכיבות אותו‪ .‬השיטה פותחה על ידי סנגר‪-‬‬
‫כשריצף את האינסולין ולאחר מכן את ה‪ .DNA‬משתמשים‬
‫בשיטה שלו גם בטכנולוגיות המתקדמות ביותר‪ .‬חלבונים היום‬
‫לא ממש נרצף‪ ,‬אלא נקבע בשיטות אחרות‪.‬‬
‫העקרון על פיו פועל סנגר‪ -‬הוא רוצה לקבוע מה הרצף של‬
‫חומצות האמינו אחת אחרי השנייה‪ .‬למעשה‪ ,‬מה שהוא עשה‬
‫זה לקחת חומר ‪DNFB‬‬
‫‪ dinitroflourobenzene-2,4‬שיודע להיקשר לקבוצות הטרמינליות של חלבונים‪ .‬אם נעשה זאת על‬
‫חלבון רגיל‪ ,‬ה‪ DNFB‬ייקשר רק פעם אחת‪ ,‬כי יש קבוצה טרמינלית אחת‪ .‬סנגר הבין שלמעשה אם‬
‫נשבור את החלבון בצורה רנדומלית‪ ,‬בצורה לא שלמה‪ ,‬נשבור קשרים פפטידים‪ .‬אם נשבור רנדומלית‪,‬‬
‫יהיה בממוצע שבר אחרי כל חומצה אמינית‪ .‬למעשה הוא ביצע שבירה חלקית‪ ,‬סימן את הכל בעזרת‬
‫‪ DNFB‬שהיא בעלת צבע צהוב‪ ,‬וכאשר היא נקשרת נוכל לזהות אותה‪ ,‬ברגע שנקשרת הקבוצה נוכל‬
‫לבודד אותה ונוכל לדעת מי היא החומצה האמינית‪ ,‬כלומר זהו הסמן של החומצה הטרמינלית‪ .‬נבצע‬
‫'מחזור ‪ – 2026‬סמסטר ב‬
‫נועה לוי‬

‫זאת בשלבים וכל פעם נזהה את החומצה הטרמינלית וכך למעשה נרצף את החלבון‪ .‬זהו הבסיס‬
‫לשיטה שעובדת גם היום‪.‬‬

‫‪ -Edman degeneration‬מתבססת על הטכניקה של סנגר והיא השיטה שבה משתמים היום‪.‬‬

‫נשתמש חומר שנקרא ‪ PTIC‬שמגיב עם החומצה האמינית ה‪ N-‬טרמינלית ואחרי כן הוא מוציא את‬
‫החומצה אליה הוא נקשר‪ ,‬החומר המשולב הזה נקרא ‪ triazolinone derivative‬וזה כבר‬
‫החומר שהוספנו מחובר לחומצה האמינית הטרמינלית ואת החומר שיצא נזהה על ידי השיטות המוכרות‬
‫לנו‪/ mass spectrometry -‬שימוש בג'ל ועוד‪ .‬נבצע את הפעולה הזו בחזרתיות וכך כל פעם נחשוף‬
‫קצה "חדש"‪ ,‬כלומר נחשף ה‪ N-‬טרמינל הבא ברצף ונוכל לרצף את החלבון כולו מקצה ‪ N‬לקצה ‪.C‬‬
‫זוהי תגובה מאוד רגישה‪ .‬האינטראקציות האלו מוגבלות עד כ‪ 100-‬פעמים למולקולה‪ ,‬וככל‬
‫שמתקדמים היעילות פוחתת ולכן אי אפשק לבצע זאת על חלבונים גדולים מאוד‪ -‬יש לחתוך אותם‬
‫להרבה פפטידים קטנים המסודרים ומעט חופפים כדי שנוכל לסדר אותם בהמשך‪ .‬כדי לחתוך את‬
‫החלבון יש מספר שיטות‪ :‬שיטות אנזימטיות (למשל טריפסין‪ -‬בעל ספציפיות גבוהה ביותר וחותך את‬
‫הקשר הפפטידי הין ליזין וגליצילין) או כימיות‪ .‬התגובה שמתבצעת נקראת תגובה קובעת רצף‪ .‬אחרי‬
‫שניתחנו כל שרשרת פפטידים בפני עצמה‪ ,‬נרכיב אותם ונבצע ‪ Assembly‬כלומר נרכיב ונסיק מזה‬
‫מידע על נראות החלבון השלם‪ -‬כלומר על הרצף שבונה אותו‪.‬‬

‫ריצוף חלבון על ידי ‪ -Mass spectroscopy‬שיטה‬

‫הנפוצה לשימוש בימינו‪ .‬בה אפשר לרצף ללא חלבון‬
‫"מנוקה"‪ .‬הריצוף מתבצע על ידי התחשבות במסה של‬
‫פפטידים שלמים שנחתכים על ידי אנזימים כמו טריפסין‬
‫– ולפי המשקלים השונים של האנזימים שנחתכו מחלבון או פפטיד אב נקבע מה היה החלבון המקורי‪.‬‬
‫כך נקבע מה היה החלבון המקורי‪ .‬זה לא היה אפשרי בעבר כי יינון ואידוי של מולקולות היו שוברות‬
‫את המולקולות הביולוגיות ולכן היו צריכים להמציא שיטות יינון אחרות שאפשרו את התהליך הזה‪.‬‬