"GENOME WIDE ASSOCIATION STUDY OF SHORT ACTING Β2 AGONISTS.

A
NOVEL GENOME-
WIDE SIGNIFICANT LOCUS ON CHROMOSOME 2 NEAR ASB3"

"BADANIE ASOCJACYJNE OBEJMUJĄCE CAŁY GENOM W PRZYPADKU

STOSOWANIA KRÓTKO DZIAŁAJĄCYCH
AGONISTÓW Β2. NOWY GENOMOWY LOCUS NA CHROMOSOMIE 2
W POBLIŻU ASB3"

Farmacja IV rok grupa A

Malwina Synak, Julia Teodorczyk, Klaudia
Płóciennik , Michał Filipek, Daria Pajor
 CZYM JEST ASTMA?
• Astma jest złożoną chorobą układu oddechowego
dotyczącą ponad 300 milionów ludzi na całym świecie, a
częstość jej występowania stale rośnie. Jest to najczęstsza
choroba przewlekła u dzieci. Kluczową cechą kliniczną
astmy jest odwracalna obturacja dróg oddechowych.
Odpowiedź na bronchodilator (BDR) mierzący zmianę w
zwężeniu dróg oddechowych przed i po podaniu krótko
działającego β2-agonisty, który działa w celu zmniejszenia
zwężenia oskrzeli poprzez stymulację receptorów β2-
adrenergicznych na mięśniach gładkich dróg
oddechowych.

β2-Agoniści są najskuteczniejszymi metodami leczenia

zarówno przewlekłej, jak i ostrej astmy, jednakże istnieje
duża zmienność międzyosobnicza w odpowiedzi na
wziewne β2-agonistów. Uważa się, że kluczowym
elementem powodującym zróżnicowanie BDR jest
genetyka.
 CZYM
JEST GWAS
?
Gen ASB3
• ASB3 (Ankyrin Repeat And SOCS Box Containing 3) jest genem
kodującym białko. Choroby związane z ASB3 obejmują
zapalenie nerwów. Wśród powiązanych z nim szlaków są:
obróbka i prezentacja antygenu za pośrednictwem MHC klasy
I oraz układ odporności wrodzonej. Ważnym paralogiem tego
genu jest ASB14.
• Białko kodowane przez ten gen jest członkiem rodziny białek z
powtórzeniami ankyrynowymi i białkami zawierającymi
pudełko SOCS (ASB). Zawierają sekwencję powtórzeń
ankyrynowych i domenę pudełkową SOCS. Pudełko SOCS
służy do sprzęgania supresora białek sygnalizacyjnych cytokin
(SOCS) i ich partnerów wiążących z kompleksem elonginy B i
C, prawdopodobnie kierując je do degradacji.
Locus: 2p 16.2
Liczba egzonów: 10
Rodzaj genu: kodujące białko
Organizm: Homo Sapiens
Cel badania
• Zbadanie, czy badanie
asocjacyjne całego
genomu (GWAS)
może zidentyfikować
nowe loci
farmakogenetyczne w
astmie.
 Populacja badana

• Projekt SHARP przeprowadził genotypowanie całego

genomu u dorosłych i dzieci, które uczestniczyły w
badaniach klinicznych NHLBI dotyczących astmy.
• Populacja SHARP obejmowała osoby, które
uczestniczyły w trzech badaniach:
• 315 dzieci uczestniczących w Childhood Asthma
Management Program (CAMP)
• 178 dzieci uczestniczących w Childhood Asthma
Research and Education (CARE) Network
• 231 osób dorosłych uczestniczących w ACRN
 Genotypowanie i środki kontroli jakości

❖Genotypowanie GWAS przeprowadzono stosując metodę Affymetrix

oraz używając ludzkiego SNP Array 6.0, obejmującego 906600 SNP.
❖Marker QC wykonano na wszystkich autosomalnych markerach
wyekstrahowanych z bazy danych genotypów i fenotypów dla każdej z
trzech grup oddzielnie.
❖Szczegóły analizy głównych składowych za pomocą oprogramowania
EIGENSTRAT przeprowadzono wśród uczestniczących białych
osobników w celu oceny potencjalnych podstruktur populacji.
❖Z analizy usunięto 62 osoby z powodu potencjalnej stratyfikacji
populacji.
 Wynik fenotypu
Pierwszorzędowym fenotypem końcowym była zmiana FEV 1 po dwóch lub
więcej rozpyleniach albuterolu wyrażona na jeden z dwóch sposobów:
FEV 1 po podaniu leku rozszerzającego oskrzela minus FEV 1 przed
lekiem rozszerzającym oskrzela , gdzie FEV 1 wyrażono jako procent (FEV 1 po leku rozszerzającym oskrzela minus FEV 1 przed lekiem
przewidywanego FEV 1 skorygowanego o zaciągnięcia podanego rozszerzającym oskrzela )/przed lek rozszerzający oskrzela FEV
leku rozszerzającego oskrzela

W sumie 724 osoby rasy białej były dostępne z BDR. Zastosowanie dwóch
odrębnych, ale pokrewnych fenotypów było jedną ze strategii włączonych do
tego badania w celu zmniejszenia zmienności odpowiedzi fenotypowej na lek.
Strategia replikacji SNP

❖Na podstawie wartości P zidentyfikowano 100 najważniejszych SNP, które były

powiązane z dwiema definicjami BDR.
❖Zidentyfikowano SNP, które były wspólne dla tych dwóch list i ograniczono analizę
do 50 SNP ze wspólnej listy, które były najsilniej związane z odpowiedzią β-
agonisty.
❖Łączna wartość P dla każdego z tych 50 SNP była mniejsza lub równa 2 × 10-4 .
❖ Genotypowanie populacji replikacji przeprowadzono przy użyciu platformy
Sequenom.
❖Spośród 50 SNP zgłoszonych do genotypowania 42 (82%) zostało pomyślnie
genotypowanych i dostępnych do analizy.
Analiza populacji replikacji
• U każdego z 439 uczestników zdiagnozowano umiarkowaną do
ciężkiej postaci astmę zgodnie z kryteriami Amerykańskiego
Towarzystwa Piersiowego. Osoby badane nie miały istotnych
współistniejących schorzeń i nie przyjmowali żadnych innych
leków na astmę podczas badania.

• W ciągu 6 tygodni przed badaniem nie osoby badane nie

przyjmowały doustnych ani wziewnych kortykosteroidów.

• Kryteria diagnozy obejmowały FEV1 na poziomie 40– 85%

przewidywanej wartości normalnej po co najmniej 8 godzinach
bez użycia wziewnego krótko działającego agonisty β oraz co
najmniej 15% wyjściowej poprawy FEV1 w odpowiedzi na
βagonistę.
 Analiza populacji replikacji składała się z uogólnionych modeli
liniowych, które oceniały związek pomiędzyposzczególnymi
wybranymi SNP a zmianą FEV1 z uwzględnieniem wieku, płci i
wzrostu.
Wszystkie genotypy zostały modelowane addytywnie, a
średnie genotypowe obliczono przy użyciu najmniejszych
kwadratów.
Analiza
statystyczna Replikacja pierwotnego wyniku została zdefiniowana jako
nominalna wartość P poniżej 0,05 w grupie replikacji z oceną
wpływu we właściwym kierunku.

Test wykorzystano do obliczenia wartości P, łącząc wartości P

dla CAMP/CARE/ACRN i populacji replikacji.
Wyniki
• Do analizy fenotypowej i genotypowej ACRN, CAMPi CARE włączono łącznie 724
ochotników. W tabeli przedstawiono również charakterystykę populacji replikacji.
Populacja ta, wybrana na podstawie odpowiedzi BDR, której kryteria wstępu
obejmowały górną granicę FEV1, miała niższą wartość początkową FEV1 w
porównaniu z populacjami SHARP i znacznie większą BDR. Wiek osób w populacji
replikacji był podobny do wieku osób w grupieACRN.

ACRN = Asthma Clinical Research Network;

CAMP = Childhood Asthma Management
Program;
CARE = Childhood Asthma Research and
Education;
SHARP = SNP Health Association Resource
(SHARe) Asthma Resource Project.
 • Po wykluczeniu polimorfizmów
pojedynczych nukleotydów o częstości
GWAS w występowania alleli <5% i uwzględnieniu
populacji SNP, które były dostępne we wszystkich
trzech próbkach, do analizy dostępnych było
SHARP łącznie 444 088 polimorfizmów
pojedynczych nukleotydów.
Na wykresach przedstawiono związek między uwzględnianymi polimorfizmami a zmianą FEV1 (wyrażony jako zmiana
FEV1 jako procent wyjściowego FEV1 i procent przewidywanego FEV1) w odpowiedzi na albuterol.

Wykresy wartości P według chromosomów dla zmiany FEV1 w odowiedzi na lek rozszerzający oskrzela.
(A) Zmiana w FEV1 jako procent przewidywanych
(B) Zmiana w FEV1 jako procent wyjściowego FEV1
Obie metody wyrażania BDR pokrywały się w 85%.

Do replikacji wybrano 50 najlepszych polimorfizmów

pojedynczego nukleotydu na podstawie najniższych
wartości P .

42 z 50 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu

przeszło kontrolę jakości genotypu w populacji
replikacji.

Z 42 SNP, które zostały genotypowane, 5 SNP było

powiązanych z oceną efektu w tym samym kierunku,
co połączone wyniki stowarzyszenia SHARP.
• ACRN = Astma Clinical Research Network
• CAMP = Program zarządzania astmą dziecięcą
• CARE = Badania i edukacja w zakresie astmy w dzieciństwie
• Chr = chromosom
• SHARP = SNP Health Association Resource (SHARe) Projekt
dotyczący zasobów astmy
• SNP = polimorfizm pojedynczego nukleotydu.
• W 2 tabeli zawarte są wartości P i oszacowanie
efektu dla połączonej populacji SHARP i populacji
replikacji. Oprócz tego przedstawiono ogólną
łączną wartość P dla SHARP i populacji replikacji.
Chociaż polimorfizmy pojedynczych nukleotydów
były wyszukiwane przy użyciu dwóch różnych
fenotypów odpowiedzi rozszerzającej oskrzela,
analiza replikacji, obejmująca te pięć
polimorfizmów, obejmowała polimorfizmy
zarówno w obrębie 100 najlepszych SNP, jak i
związane z obydwoma fenotypami odpowiedzi
rozszerzającej oskrzela.
• Spośród 5 polimorfizmów, które replikowały w
populacji replikacji, łączna wartość P dla czterech
z 5 SNP była istotna statystycznie.
• Aby wyjaśnić potencjalne różnice związane z wyjściową FEV 1 ,
ponownie przeanalizowaliśmy nasze cztery najlepsze SNP w
grupie SHARP.
• Każdy z SNP pozostawał znaczący po skorygowaniu wartości wyjściowej
FEV1 z wartością P prawie identyczną jak w pierwotnej analizie GWAS.
• Wszystkie pięć replikowanych SNP znajdowało się w pojedynczym
regionie chromosomu 2p16.2.
• Wystąpiła niewielka nierównowaga sprzężeń między SNP.
Wykres przedstawia najważniejsze polimorfizmy SNP w badaniu asocjacji odpowiedzi rozszerzającej oskrzela

Na wykresie przedstawiono ujemne wartości LogP sprzężeń czterech najwyższych polimorfizmów SNP w
połączonej analizie populacji SHARP i replikacyjnej "populacji astmy".
• Najbliższy gen kodujący to gen kodujący powtórzenie ankyrynowe
ASB3 i białko zawierające pudełko SOCS (tłumiące sygnalizację
cytokin).
• Dla każdego ze znaczących 4 SNP wystąpiło ok. 20% zmniejszenie
średniej odpowiedzi BDR u osób homozygotycznych dla allelu
drugorzędowego w porównaniu z homozygotycznymi dla allelu
głównego.
Najmniejsze kwadraty ukazują wykresy FEV1 w odpowiedzi na lek rozszerzający oskrzela według liczby
kopii allelu pomocniczego dla populacji w badaniu SHARP i astmie.

BDR = odpowiedź rozszerzania oskrzeli

SHARP = SNP Health Association Resource (SHARe) Astma Resource

Project; Projekt dotyczący zasobów astmy

SNP = polimorfizmy pojedynczych nukleotydów.

Wnioski
• Przeprowadzono analizę GWAS na fenotypy rozszerzające
oskrzela w populacji SHARP. Następnie zidentyfikowano
główne powiązania genów wspólne w analizie GWAS i
odkryto, że trzy z tych SNP były powiązane z BDR w populacji
replikacji na poziomie genomowym. Wszystkie te SNP
znajdowały się w tym samym regionie na chromosomie 2, co
sugeruje, że zidentyfikowano nowy region genomowy
związany z ostrym BDR.
Wnioski
• Oprócz potencjalnego bezpośredniego powiązania regulacyjnego
z ASB3, zidentyfikowane SNP mogą wpływać na BDR w inny
sposób. Zauważyliśmy, że górny SNP, rs350,729, znajduje się
blisko dwóch czynników transkrypcyjnych, JUND i CEBPB. JUND nie
był związany z astmą, ale może odgrywać ważną rolę w przeroście
serca i odpowiedzi na leki, co przyczynia się do poprawy funkcji mięśni.
Chociaż CEBPA jest często zaangażowany w proliferację mięśni gładkich
dróg oddechowych, CEBPB może regulować CEBPA i jest wysoce
regulowany przez β-agonistyczny formoterol.
Bibliografia

• "Genome-Wide Association Study of Short-Acting β2-Agonists. A Novel Genome-

Wide Significant Locus on Chromosome 2 near ASB3" Elliot Israel, Jessica Lasky-
Su, Amy Markezich, Amy Damask, Stanley J. Szefler, Brooke Schuemann, Barbara
Klanderman, Jody Sylvia, Shamsah Kazani, Rongling Wu, Fernando Martinez,
Homer A. Boushey, Vernon M. Chinchilli, Dave Mauger, Scott T. Weiss and Kelan
G. Tantisira
DZIĘKUJEMY ZA
UWAGĘ