Тема № 1.

БІОТЕХНОЛОГІЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ЯДЕР

ТВАРИННИХ КЛІТИН

Більшість досліджень, виконаних з гібридизації соматичних клітин

еукаріотичних організмів (переважно ссавців) у клітинній культурі,
переконливо довели, що в гібридній клітині, які має змішаний геном у
зв’язку з гетерогенною природою батьківських клітин, відбуваються
стабільні зміни в експресії генів синкаріона порівняно з процесом експресії у
вихідних батьківських клітинах. Так, при злитті клітин щурячої гепатоми, що
синтезує і екскретує альбумін, з мишачими фібробластами, що не секретують
цей білок, були отримані гібридні клітини, частина клонів яких синтезували
альбумін тільки пацюка, чи тільки миші, або альбуміни обох вихідних
батьків (пацюка і миші).
На підставі результатів наданого й інших подібних експериментів з
гібридизації соматичних клітин було висловлене припущення про те, що в
клітинах ссавців є речовини, здатні прямо чи побічно впливати на клітинне
ядро, змінювати його функціональний стан за допомогою позитивної або
негативної регуляції експресії певної частини генів. Однак комплекс
об’єктивних причин (гетерогенність генома найчастіше зі значним дефіцитом
хромосом, а також із хромосомними перебудовами, що відбулися, які
знаходяться в оточенні гетерогенної цитоплазми), властивих методу
гібридизації соматичних клітин, не дозволив ідентифікувати речовини, що
беруть участь в експресії генома, а також установити їхню хімічну будову і
механізм дії. До цього часу вчені мали у своєму розпорядженні дані про те,
що речовини, які містяться в цитоплазмі тварин, беруть участь у регулюванні
експресії генів клітинного ядра.
Виявилося, що в ядрах попередньо вилучених з диференційованої
клітини і поміщених у цитоплазму яйцеклітини починалися процеси
клітинного диференціювання і в багатьох випадках розвивався нормальний
організм, тобто ядра спеціалізованих клітин містили повний обсяг необхідної
для розвитку повноцінного організму інформації. Так, злиття ядер,
вилучених з клітин кишкового епітелію пуголовка, з позбавленої ядра
яйцеклітиною в багатьох випадках приводило до розвитку жаби. Ці
експерименти, виконані на амфібіях, показали, що цитоплазма регулює
активність ядра; у спеціалізованих клітинах багато функцій ядра
гальмуються компонентами цитоплазми. Інгібуючий вплив, що надходив до
ядра з боку цитоплазми диференційованої клітини, опинившись у
придатному за хімічним складом цитоплазматичному оточенні (яйцеклітина),
усувається, і в ядрах можуть знову проходити процеси, що визначають
клітинну диференціацію. Експерименти з трансплантації ядер були проведені
на амфібіях. У розробці методів пересадки клітинних ядер ссавців істотну
роль відіграло використання цитохалазинів ‒ речовин, синтезованих
грибами.
 Ймовірно, цитохалазин В, руйнуючи структуру мікрофіламентів,
сприяє унікальному розташуванню ядра, коли воно залишається з’єднаним із
клітиною тонкою стеблинкою цитоплазми. При центрифугуванні в більшості
таких клітин розривається «пуповина» стеблинки й утворюються
енуклейовані (без’ядерні) клітини (цитопласти); ядра, що відокремилися при
центрифугуванні (каріопласти, чи міні-клітини), оточені тонким шаром
цитоплазми і плазматичною мембраною.
Ефективність енуклеації контролюють, забарвлюючи (наприклад, за
методом Гімза) клітинний моношар, що знаходиться на поверхні однієї з
чашок або дисків.
Наступна операція, спрямована на одержання популяції цитопластів, —
відділення їх від цілих клітин, що залишилися, тому що в деяких випадках
(лінія клітин мишачої гепатоми Hepa-2) ефективність енуклеації не
перевищує 50 %. З цією метою, енуклейовані (цитопласти) і цілі клітини, що
містяться на поверхні пластикових чашок і скляних дисків, знімають,
обробляють трипсином, внаслідок чого в 1 мл сольового розчину з
фосфатним буфером містилося 106 цілих клітин і цитопластів. Клітинно-
цитопластичну суміш нашаровують на 14 мл лінійного градієнта
ренографіну-76, який знаходиться в центрифужній пробірці, об’ємна
концентрація якого змінюєтьсяся від 15 до 30 %, і центрифугують при 1000 g
і температурі 25 оС протягом 5 хв. Чітко розмежовані шари цілих клітин і
цитопластів видаляють з центрифужної пробірки і використовують за
призначенням.
Отримані в градієнті щільності ренографіну-76 цитопласти не
забарвлюваються трипановим синім, що слугує контролем ефективності
поділу. Вони зберігають здатність знову прикріплюватися до поверхні
культуральної чашки і можуть використовуватися надалі для
реконструювання життєздатних клітин шляхом злиття з гетерологічними
каріопластами.
 Методи енуклеації, що застосовуються для одержання каріопластів,
відрізняються від тих прийомів, що забезпечують успіх при одержанні
цитопластів.
Клітини, призначені для виділення каріопластів, за 2 дні до енуклеації
висівають на вирізані з культуральних флаконів пластикові пластинки, які
перед поміщенням у 50-мілілітрову центрифужну пробірку, заповнену
звичайним поживним середовищем, складають так, щоб їхні поверхні з
прикріпленими клітинами знаходилися зовні. Мишачі фібробластні лінії А9
центрифугують при 9,5 тис. g і 35 оС протягом 15 хв. Призначення цієї
процедури зводиться до того, щоб в осаді каріопластів, який має бути
отриманий, зменшити кількість цілих клітин. Після відокремлення слабко
прикріплених до субстрату клітин, пластинки з клітинами моношару, що
залишилися, переносять у пробірки, де концентрація цитохалазину В з
розрахунку на 1 мл звичайного поживного середовища досягає 10 мкг.
Вміст пробірок інкубують при 37 оС протягом 15 хв; тривалість
центрифугування при 35 оС і 7 тис. об./хв — 45 хв. Надосадову рідину, що
утворилася, зливають, а осад, представлений в основному каріопластами,
ресуспендують в звичайному поживному середовищі.
У виготовлених за описаною методикою препаратах каріопластів
знаходяться фрагменти цитоплазми, каріопласти, що загинули, та цілі
клітини. Відокремлення фрагментів цитоплазми проводиться осадженням у
градієнті фіколау 1–6% концентрації при 1 g і 37 о С протягом 90 хв у
зволоженій атмосфері, що містить 5 % СО2 . Фрагменти цитоплазми, що
знаходяться у верхньому шарі, відсмоктують і видаляють, а осад
каріопластів, що утворився після вилучення і розведення поживним
середовищем, знову осаджують центрифугуванням і ресуспендують у
свіжому живильному середовищі. Цілі клітини (їх 0,4–4 %) видаляють
шляхом дворазового 90-хвилинного інкубування суспензії каріопластів у
культуральних чашках.
Інкубування протягом 3 годин дозволяє різко зменшити забруднення
каріопластів цілими клітинами, що обов’язково для усіх експериментів з
трансплантацією ядер.
Наступна операція — відокремлення життєздатних каріопластів від
тих, що загинули. Вона включає ресуспендування осаду в поживному
середовищі до концентрації 107 міні-клітин у 1 мл, нашаровування суспензії
на Ficoll-paque (розчин містить 5 % фіколу і 9 % діатризоату натрію), що
знаходиться в центрифужних пробірках, і обережне додавання зверху 1 мл
середовища таким чином, щоб додане середовище і суспензія каріопластів
утворили два самостійних шари. Наступне центрифугування при 800 об./хв
(130 g) протягом 75 хв при кімнатній температурі дозволяє одержати осад,
що на 99 % складається із загиблих каріопластів; в ітозі ‒ на межі
живильного середовища і Ficoll-paque знаходиться шар, що складається на 98
% з життєздатних каріопластів.
Для очищення каріопластів використовують й інші методи, зокрема
частки танталу розміром 1–3 мкм. До часу енуклеації практично всі клітини
містять більш ніж по 12 часток танталу. У зв’язку з тим, що щільність
танталу більш ніж у 15 разів перевершує щільність клітини, компоненти, що
містять частки танталу, осаджуються значно швидше каріопластів, у яких
тантал відсутній. Очищення каріопластів іноді здійснюється за допомогою
цитофлуориметра-сортера.

Властивості цитопластів і каріопластів.

Установлено здатність цитопластів синтезувати білки, підтримувати
реплікацію вірусу везикулярного стоматиту і поліовіруса, синтез РНК і білка,
контрольований вірусом сказу, звільняти вірус SV40 із трансформованих
клітин. Цитопласти містять усі види органел, властиві нормальній клітині,
зберігають характерну для цілих клітин здатність прикріплюватися до
субстрату й утворювати складчасту мембрану, пересуватися і здійснювати
піноцитоз.
Навколо каріопластів знаходиться шар, на частку якого припадає
близько 10 % клітинної цитоплазми, що містить компоненти
ендоплазматичного ретикулума, деяка кількість мітохондрій і рибосом;
центріолі в каріопластів, на відміну від цитопластів, відсутні.
Близько 10 % каріопластів деяких клітинних ліній здатні відновлювати
весь обсяг утраченої при енуклеації цитоплазми і знову перетворюватися на
життєздатні клітини.
Здатність каріопластів регенерувати втрачену в процесі енуклеації
цитоплазму і формувати життєздатні колонії клітин залежить від кількості
цитоплазми, що оточує ядро. У фракції каріопластів, біля ядер яких
зосереджено 2–4 % тієї кількості цитоплазми, що міститься в інтактній
клітині (дрібні каріопласти), тільки один з 106 очищених елементів може
сформувати життєздатну колонію клітин.

Трансплантація ядер і реконструювання клітин.

Після енуклеації клітин моношар цитопластів у пластикових чашках
діаметром 60 мм чи скляних дисках діаметром 14 мм інкубують у поживному
середовищі при 37 оС протягом 1–2 години, а потім ‒ 20 хв і охолоджують до
4 оС. При цій температурі моношар двічі відмивають розчином Ерла (рН 8,0),
потім 20 хв. обробляють 0,5 мл охолодженого розчину Ерла з вірусом
Сендай, інактивованим опроміненням протягом 5 хв (ультрафіолетовою
лампою на відстані 15 см), після чого шар цитопластів знову двічі
промивають тим же розчином, який потім видаляють.
Каріопласти, суспендовані в сольовому розчині на фосфатному буфері,
додають до моношарової культури цитопластів з таким розрахунком, щоб на
один цитопласт припадало 100 каріопластів. Для адсорбування каріопластів
на цитопластах, покритих вірусними частками, інкубують при 4 оС протягом
45 хв; через кожні 3–5 хв чашки злегка погойдують.
Для злиття каріопластів і цитопластів чашки чи скляні диски
переносять у термостат і витримують там при 37 оС протягом 45 хв. Після
закінчення цього часу моношар на чашках кілька разів інтенсивно
відмивають розчином Ерла чи поживним середовищем без сироватки, щоб
видалити каріопласти, які не злилися. Потім у чашки наливають поживне
середовище, придатне для культивування того типу клітин, що були
використані як донори каріопластів. Цитопласти, що не злилися з ядрами,
гинуть і приблизно через 2 дні відокремлються від поверхні чашки.

Для одержання незабруднених цитопластами культур рекомендується

центрифугування гібридних клітин у градієнті щільності ренографіну.
!!!Використання поліетиленгліколю для стимулювання процесу
злиття каріопластів і цитопластів при конструюванні клітинних гібридів
обмежене через його токсичність, що значно перевищує токсичність вірусу
Сендай.
Для ідентифікації гібридних клітин, визначення ефективності
трансплантації ядер і наявності батьківських клітин у гібридній популяції
використовують мутантні клітинні лінії.
Ефективність реконструювання клітин за рахунок злиття
каріопластів і цитопластів залежить від багатьох факторів: так,
тільки близько 10 % цитопластів, отриманих шляхом енуклеації клітин
пацюка лінії НТС, зливалися з каріопластами, виділеними з клітин миші
лінії А9. Коли гібридизації піддавали цитопласти, отримані з фібробластів
курячих ембріонів, і каріопласти, що являли собою перебуваючі у спокої
ядра еритроцитів, ефективність реконструювання перевищувала 90 %.
Висока ефективність злиття ізольованих перебуваючих у спокої ядер
еритроцитів птахів з енуклейованими цитопластами, а також досвід щодо
активування ядер еритроцитів птахів, зокрема курей, шляхом злиття цих
еритроцитів із клітинами HeLa чи з іншими клітинами, що мають активний
метаболізм, дозволили досліджувати роль ядерно-цитоплазматичних
взаємодій в експресії генів гібридних еукаріотичних клітин. Виявилося, що
не всі гібриди, що утворилися, були життєздатними. Приблизно 9 %
реконструйованих клітин можуть рости і ділитися. У гібридних клітинах
відразу після злиття починаються морфологічні зміни. Через кілька днів
реконструйовані гібридні клітини майже не відрізняються від вихідних
батьківських, які було використано як донори ядер.