НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

“КИЇВСЬКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМЕНІ ІГОРЯ

СІКОРСЬКОГО”

Факультет біотехнології і біотехніки

Кафедра екобіотехнології та біоенергетики

«ЗАТВЕРДЖУЮ»
Завідувач кафедри екобіотехнології
та біоенергетики
______________ Кузьмінський Є.В.
«31» серпня 2018 р.

Методичні вказівки до виконання

лабораторних робіт
з дисципліни «Біофізика»
для студентів спеціальності 162 біотехнології та біоінженерія

Рекомендовано кафедрою
екобіотехнології та біоенергетики
Протокол № 1 від «31» серпня 2018 р.

Київ 2018
 Лабораторна робота № 1.
Тема: Визначення відносної, характеристичної та питомої в’язкості.
Визначення молекулярної маси білків віскозиметричним методом
Мета: Набути навиків застосування віскозиметричного методу для
визначення молекулярної маси біологічних об’єктів.
Матеріали та прилади: термостат, віскозиметр Оствальда, секундомір,
розчини 20, 30, 40, 50% сахарози і білку з концентрацією 0,5, 1, 2, 4 і 8 мг/см3.

Теоретичні відомості
Рух макромолекул у розчині залежить від їхньої форми і розмірів.
Гідродинамічні методи (вимірювання в’язкості, дифузії, седиментації) дають
можливість вивчати певні характеристики руху і з їхньою допомогою визначати
загальну форму, ефективний розмір і молекулярну масу макромолекул. Для
описання форми біологічних макромолекул використовуються прості
гідродинамічні моделі: сфера, еліпсоїд обертання, жорсткий стержень.

Рис. 1.1. Фізичні моделі макромолекул. 1 – сфера з радіусом r, 2 – витягнутий

еліпсоїд обертання a>b, 3 – сплющений еліпсоїд обертання a<b, 4 – витягнута
стрижнеподібна макромолекула a>>b, а і b півосі еліпсоїда.

Макромолекули можуть бути достатньо гнучкими, утворюючи погано

впорядковані клубки чи жорсткі, витягнуті структури. Ці конформації
апроксимуються еліпсоїдами обертання з відповідними відношеннями півосей а/b
еліпсоїда. Міжмолекулярні взаємодії зумовлюють внутрішнє тертя та відповідну
в’язкість розчину.
В’язкість – це фізико-хімічна характеристика рідини, в якій відбувається рух
молекул під дією сил механічного зрушення. Під в'язкістю будь-якої рідини (або
газу) мають на увазі її властивість створювати опір, який виникає внаслідок
міжмолекулярних сил при зміщенні одного шару рідини відносно іншого.

2
Відповідно до закону Н'ютона, сила внутрішнього тертя F прямо пропорційна
градієнту швидкості du/dx і площі поверхні S шарів рідини, які стикаються:
𝑑𝑢
𝐹 = 𝜂⋅𝑆⋅ , (1.1)
𝑑𝑥
де  – коефіцієнт внутрішнього тертя або коефіцієнт в'язкості (залежить від природи
рідини і температури).
Якщо обидві частини рівняння (1.1) розділити на S, отримаємо:
𝑑𝑢
𝑃=𝜂⋅ , (1.2)
𝑑𝑥
де Р — напруження зміщення.
У системі СІ коефіцієнт в'язкості  вимірюється у Нcм -2 або Пас і
визначається як сила, яку необхідно затратити для підтримання одиничної різниці
швидкостей між паралельними площинами в 1 м 2, які розміщені на відстані 1 м.
Одиниця в'язкості в СГС – пуаз; 1 Нсм –2 = 10 пуазам.
Закон Н'ютона – основний закон деформації рідини. Але визначати в'язкість за
допомогою безпосереднього застосування цього закону важко у зв’язку з
експериментальними труднощами вимірювання градієнта швидкості du/dx. Крім
того, рух рідини має ламінарний характер лише при порівняно малих швидкостях, а
за значних – турбулентний (вихровий). Зокрема, рух крові в тонких кровоносних
судинах і капілярах має ламінарний характер, а в аорті інколи наближається до
турбулентного.
В'язкість рідин і розчинів біоорганічних сполук вимірюють в умовах
ламінарного потоку. Якщо при зміні швидкості протікання в межах ламінарності
в'язкість рідини залишається постійною (тобто швидкість протікання прямо
пропорційна прикладеній силі), то така рідина називається н'ютонівською. Якщо ж
в'язкість при цьому змінюється і швидкість протікання рідини не є пропорційною
прикладеній силі, то тоді рідина називається нен'ютонівською. Чисті рідини та
розбавлені розчини колоїдів, у яких частинки мають сферичну форму,
характеризуються н'ютонівською в'язкістю, а розчини з паличко- й ниткоподібними
частинками в більшості випадків характеризуються нен'ютонівською в'язкістю.
При витіканні рідини з капіляра об'ємна швидкість витікання v зв'язана з
напруженням зміщення Р такою залежністю:
𝑉 𝑃
𝑣= ≈ , (1.3)
𝑡 𝜂
де V – об'єм рідини, яка витікає за час t.
Для н'ютонівських рідин існує пропорційна залежність між об'ємною
швидкістю та напруженням зміщення:
𝑉 𝑃
𝜈= =𝐾 , (1.4)
𝑡 𝜂
де К – константа, яка залежить від довжини l і радіуса r капіляра:

3
 𝜋𝑟 4
𝐾= . (1.5)
8𝑙
Підставивши (1.5) в (1.4), отримаємо формулу Пуазейля для витікання певного
об'єму V рідини через капіляр:
𝜋𝑟 4 𝑃𝑡
𝑉= . (1.6)
8𝑙𝜂
Закону Н'ютона і формулі Пуазейля підпорядковуються рідини, які не мають
достатньо жорсткої внутрішньої структури. До них відносяться індивідуальні рідини
(вода, спирт та інші), справжні розчини низькомолекулярних сполук і розбавлені
розчини високомолекулярних сполук (розчини білків, нуклеїнових кислот,
полісахаридів тощо). Достатньо точно описується цими законами також протікання
по капіляру біологічних рідин – ліквору, лімфи і плазми крові.
Системи, які мають визначену або жорстку внутрішню структуру, наприклад,
гідрофільні колоїди, концентровані розчини високомолекулярних сполук, кров,
цитоплазма клітин та ін. не підпорядковуються закону Н'ютона. У таких системах
частинки дисперсної фази зв'язані міжмолекулярними силами Ван дер Ваальса в
одну суцільну тримірну структуру, охоплюючи весь об'єм, який займає дисперсна
система. Витікання таких аномально в'язких структурованих систем описується
рівнянням Бінгама, яке відрізняється від рівняння Н'ютона (1.2) на величину
граничного напруження Р0:
𝑑𝑢
𝑃 = 𝑃0 + 𝜂 . (1.7)
𝑑𝑥
При прикладенні граничного напруження Р0 тримірна структура. яка утримує
шари рідини, порушується і при цьому відбувається зміщення шарів. В'язкість таких
систем стає нен'ютонівською. Слід відмітити, що для високоструктурованих систем
(цитоплазма клітин та інші) в'язкість, як характерна ознака системи, може
оцінюватись тільки на прямолінійних відрізках графіка залежності об'ємної
швидкості від напруження зміщення.
Витікання рідини в капілярних віскозиметрах підпорядковується закону
Пуазейля. Відповідно до цього закону визначення в'язкості проводиться шляхом
вимірювання часу витікання рівних об'ємів двох рідин: стандартної, коефіцієнт
в'язкості якої відомий – 0, і досліджуваної, з невідомим коефіцієнтом в'язкості –.

Відносна в’язкість в:

𝜂 𝑡
𝜂в = = , (1.8)
𝜂0 𝑡0
де 0 – коефіцієнт в’язкості стандартної рідини, t – час витікання
досліджуваної рідини, t0 – час витікання стандартної рідини.
Питома в’язкість п – це відносний приріст в’язкості розчинника при внесенні
в нього розчинних речовин:
4
 𝜂−𝜂0 𝜂 𝑡
𝜂п = = −1= − 1, (1.9)
𝜂0 𝜂0 𝑡0
де  – коефіцієнт в’язкості розчину, 0 – коефіцієнт в’язкості стандартної
рідини, t – час витікання досліджуваної рідини, t0 – час витікання стандартної рідини.
Питома в’язкість є функцією двох змінних – ефективного розміру молекул і їх
концентрації. Вперше А.Ейнштейн отримав зв’язок питомої в’язкості п з
показниками макромолекул:

𝜂п ≅ 𝜈 ⋅ 𝑛0 ⋅ 𝑉 = 𝜈 ⋅ Ф, (1.10)

де n0 – число макромолекул в одиниці об’єму розчину, V – об’єм макромолекули, 

– інкремент в’язкості або фактор форми (коефіцієнт Сімхи), Ф = n 0V – об’єм
макромолекул, який вони займають у даному розчиннику. n0 можна виразити через
концентрацію:
𝑁0 𝐶
𝑛0 = , (1.11)
𝑀
де М – молекулярна маса макромолекули, N0 – число Авогадро.
Тоді питому в’язкість можна виразити:
𝜈⋅С⋅𝑉⋅𝑁0
𝜂п = . (1.12)
𝑀
Експериментально визначають питому в’язкість при різних концентраціях
речовини. Відношення питомої в’язкості до концентрації (С, моль/см3) – приведена
в’язкість пр:
𝜂
𝜂пр = п . (1.13)
С
Графічна екстраполяція величини приведеної в’язкості до нульової
концентрації дає характеристичну в’язкість []:

𝜂пр
[𝜂] = 𝑙𝑖𝑚 (1.14)
𝐶→0 С
[] – в’язкість при нескінченно великому розбавленні розчину, або
характеристичну в’язкість можна записати через параметри макромолекули:
𝑛⋅𝑉⋅𝑁0
[𝜂] = . (1.15)
𝑀
Зв’язок між характеристичною в’язкістю і молекулярною масою визначається
рівнянням Штаудінгера:
[𝜂] = 𝐾𝑀𝛼 , (1.16)
де К і  – константи, які характеризують макромолекулу.

5
 Рис.1.1. Схема капілярного віскозиметра ВПЖ-3 (пояснення в тексті).

Віскозиметр типу ВПЖ-3 (рис. 1.1) складається з капілярної трубки (5),

вимірювального резервуару (4), обмеженого двома мітками М1 і М2. Трубка
капілярна (5) розташована всередині корпусу (6) віскозиметра, який має два виводи
(8), (9). З віскозиметром поставляється насадка (1) з краном (2). Насадка (1)
з'єднується конусом (3). Вимірювання в'язкості віскозиметром засноване на
визначенні часу, за який певний об’єм рідини витече через капіляр з вимірювального
резервуару.
Хід роботи
1. Нижній отвір віскозиметра (7) занурюють в дослідуваний розчин.
2. За допомогою гумової груші всмоктують рідину вище мітки М1 так, щоб не
утворювалося повітряних пухирців.
3. Потім дають можливість рідині вільно опуститись від відмітки М1 до відмітки
М2 і за допомогою секундоміра фіксують час t опускання рідини.
4. Кожний розчин вимірюють не менше трьох разів. При цьому різниця в часі
опускання рідини від відмітки М1 до М2 не повинна перевищувати 0,2 с.

Вимірювання виконують, починаючи з чистого розчинника, і поступово

переходячи до розчинів із зростаючою концентрацією. Під час роботи необхідно

6
слідкувати за чистотою віскозиметра, а перед кожним вимірюванням промивати
розчином тієї ж концентрації, що буде досліджуватись.
5. Для кожної концентрації розчину визначають відносну, питому і приведену
в’язкість. Результати вимірювань і розрахунки вносять у таблицю.

Розчин-
Показник С1 С2 С3 С4 С5 С6
ник
t1, c
t2, c
t3,c
tcереднє,с
в
п
пр

6. Побудувати графік залежності приведеної в’язкості пр від концентрації С і з

цього графіка визначити величину характеристичної в’язкості.
Для контролю береться дистильована вода, для якої визначають час витікання
t0. Розрахунки виконувати за вищенаведеними формулами. При розрахунку
молекулярної маси припускається, що білок являє собою впорядковану глобулярну
структуру з константами:  = 1,7, К = 510-5.
Оформити висновки.

Контрольні запитання для підготовки до роботи

1.Дати визначення в’язкості рідини. Охарактеризувати види в’язкості (відносна,

характеристична, питома).
2. Охарактеризувати закон Н’ютона як основний закон деформації рідин.
3. За яких умов визначають в’язкість розчинів біоорганічних полук? Н’ютонівські і
нен’ютонівські рідини.
4. Навести формулу Пуазейля і дати характеристику рідин, які вона описує.
5. Навести рівняння Штаудінгера. Як описується зв’язок питомої в’язкості п з
показниками макромолекул.
6. Привести схему і пояснити принцип роботи капілярного віскозиметра ВПЖ-3.

7
 Лабораторна робота №2
Тема: Стандартна вільна енергія і константа рівноваги хімічної реакції.
Мета: Визначити зміну стандартної вільної енергії за константою рівноваги.
Матеріали та прилади: фотоколориметр МКМФ-1 або спектрофотометр,
мірні колби (25 дм3), піпетки на 0,1; 0,2; 1; 2 та 5 см3, циліндри на 20 см3, 0,1 н соляна
кислота, гліцин, хлорид натрію, вода дистильована, розчин молочної кислоти С=0,1
моль/дм3, розчин Fe(NO3)3 С=0,012 моль/дм3.
Приготування буферного розчину, рН 2. Розчин №1 – 0,1н соляна кислота.
Розчин №2 – 7,507 г гліцину, 5,85 г хлориду натрію розчиняють у воді й доводять
об’єм до 1 дм3. 519 см3 розчину №2 доводять до 1 дм3 розчином №1.

Теоретичні відомості
Біологічні об'єкти підпорядковуються законам термодинаміки, тому це
дозволяє оцінювати енергетичний баланс у системі, а також напрямок біологічних
процесів. У біологічних об'єктах більшість хімічних реакцій протікає при постійних
температурах і тисках, тому робота, яка виконується, визначається через зміну
вільної енергії Гіббса (ΔG). Об'єднання першого та другого закону термодинаміки
дозволяє визначити ΔG як
G = H − T S (1.1)
де G — зміна ентальпії, S – зміна ентропії, Т – температура.
Вільна енергія має ряд важливих властивостей, які можна використовувати
для характеристики хімічних перетворень у клітині. Якщо зміна вільної енергії для
певної реакції від'ємна ( G < 0), то така реакція перебігає довільно. У даному разі
спостерігається виділення вільної енергії, і такий процес називається екзергонічним.
Якщо перебіг реакції відбувається зі збільшенням вільної енергії
( G > 0), тобто для її проходження необхідна додаткова енергія, то така реакція
називається ендергонічною. У біологічних об'єктах, як правило, перебіг
ендергонічних реакцій поєднаний у проміжних стадіях з екзергонічними реакціями.
За величиною зміни вільної енергії Гіббса можна визначити наближення
реакції до стану рівноваги (у рівноважному стані G = 0 ). Положення рівноважної
термодинаміки застосовуються для вивчення хімічних перетворень. Нехай
відбувається проста хімічна реакція типу
A+ B C (1.2)
Вільна енергія GA для речовини А залежить від концентрації [А] цієї речовини
(за умови розбавленого розчину) за такою формулою:
GA = GA0 + RT ln[ A] (1.3)

8
де G A0 – стандартна вільна енергія речовини А, яка визначена за стандартних умов
(концентрація С = 1 моль/ дм3, тиск р =105 Па (1 атм), Т=298 К; рН 7). Тоді зміна
вільної енергії G для реакції (1.2) буде
G = GC − (GA + GB ) = GC0 + RT ln[C ] − (GA0 + RT ln[ A] + GB0 +
[C ]
+ RT ln[ B]) = (GC0 − GA0 − GB0 ) + ln
[ A][ B]
0
Різниця стандартних вільних енергій продуктів реакції GC і початкових
0 0
речовин G A і GB є зміна стандартної вільної енергії G усієї реакції (1.2). Тоді
0

отримаємо такий вираз для зміни вільної енергії реакції (1.2):

[C ]
G = G 0 + RT ln (1.4)
[ A][ B]
З часом хімічна реакція досягає стану рівноваги і G = 0 . За цієї умови з
виразу (1.4) визначається зміна стандартної вільної енергії:
[C ] p
G 0 = − RT ln (1.5)
[ A] p [ B] p
де [А]р, [В]р і [С]р – концентрація речовин у стані рівноваги реакції (1.2). У
хімічній кінетиці константа рівноваги Кр визначається таким співвідношенням:
[C ] p
Kp = (1.6)
[ A] p [ B] p

Тоді зв'язок зміни стандартної вільної енергії G , з константою рівноваги Кр

0

буде таким:
G 0 = − RT ln K p (1.7)
Це формула Вант-Гоффа.
З даної формули видно: чим більша константа рівноваги, тим більше від'ємне
значення стандартної вільної енергії. У табл. 1.1 наведено співвідношення між
стандартною вільною енергією G та константою рівноваги Кр.
0

Таблиця 1.1
Кр G 0 при 298 К Кр G 0 при 298 К
0,001 17133 1,0 0
0,01 11422 10,0 -5711
0,1 5711 100,0 -11422
1000,0 -17133

9
 Якщо в реакції (1.2) у початковий момент є 1 моль/дм3 речовини А і 1 моль/
дм3 речовини В, а G =–17133 Дж/моль, тоді можна зробити висновок, що рівновага
0

значно зміщена в напрямку утворення речовини С. Таким чином, у хімічних реакціях

з великим від'ємним значенням G рівноважна концентрація продуктів реакції
0

значно переважає концентрацію реагентів.

У даній роботі на прикладі однієї з простих реакцій наведено спосіб

визначення константи рівноваги Кр і розрахунок за її величиною зміни стандартної
вільної енергії G . Вибрано реакцію молочної кислоти СН3–СНОН–СООН
0

+3
(Н2Лакт) з тривалентним залізом Fe , оскільки в результаті такої реакції
утворюється забарвлений продукт, який просто реєструється на фотоколориметрі.
Реакція записується так:
Fe3+ +nH 2 Лакт  Fe(HЛакт)3-n
n +nH .
+
(1.8)
Константа рівноваги
[Fe(HЛакт)3-n n ][H ]
+ n
Kp= . (1.9)
[Fe3+ ][H 2 Лакт]n

Щоб знайти Кр необхідно знати n, [H ] , [Fe(HЛакт) n ] , [Fe ] , [H 2 Лакт] ,

+ 3-n +3

3-n
тобто рівноважні концентрації вільної Н Лакт, комплексу Fe(HЛакт) n ,
2
незакомплексованого заліза та координаційне число n.
Координаційне число п визначається, виходячи з константи нестійкості
3-n
комплексу Fe(HЛакт) n , K í åñêî ì ï
[Fe3+ ][HЛакт − ]n
K нескомп = . (1.10)
[Fe(HЛакт)3-n
n ]
Далі логарифмуємо формулу (1.10)
[Fe3+ ]
lgK нескомп =lg + n lg[HЛакт − ].
[Fe(HЛакт) n ]
3-n

або
[Fe3+ ]
lg =lgK нескомп − n lg[HЛакт − ]. (1.11)
[Fe(HЛакт) n ]
3-n

n ]
[Fe(HЛакт)3-n
lg −
, а на осі абсцис – lg[HЛакт ] ,
3+
Якщо на осі ординат відкласти [Fe ]
тоді тангенс кута нахилу одержаної прямої при однаковому масштабі чисельно буде
дорівнювати n. Концентрація речовин визначається за допомогою фотоколориметра
або спектрофотометра.

10
 Методика роботи на фотоколориметрі МКМФ-1. Фотоколориметр вимірює
оптичну густину D (або світлопропускання Т) розчину відносно розчинника,
оптична густина якого береться за нуль. Робочий діапазон вимірювання: довжиною
хвиль – від 400 до 720 нм; за оптичною густиною – від 0 до 1,8; за світло
пропусканням – від 5 до 100%. Прилад має оптичний і електронний блоки, які
об’єднані загальним корпусом. Оптичну схему фотоколориметра МКМФ-1 наведено
на рис. 1.1. Світловий потік від джерел світла 1 направляється конденсором 2 через
фільтр 3, колімаційну лінзу 4, кювети 5 або 6, захисне скельце 8 на фотоелемент 9.
Перед фотоелементом встановлено шторку-перемикач 7. На рис. 1.2. зображено
конструкцію фотоколориметра МКМФ-1.

Рис.1.1. Оптична схема фотоколориметра МКМФ-1 (позначення в тексті)

Порядок виконання роботи на приладі

1. Увімкнути фотоколориметр перемикачем мережі 3. При цьому засвітиться
світловипромінювальний діод 2. Прогріти прилад 1 год.
Розмістити в утримувачі 7 робочий світлофільтр (рис 1.2.). наповнити кювету
дистильованою водою (або відповідним розчинником), розмістити кювету в
кюветному відділенні 8 і зачинити кришку кюветного відділення.

11
 Рис. 1.2. Фотоколориметр МКМФ-1:
1 – мікроамперметр; 2 – світловипромінювальний діод; 3 – перемикач
мережі; 4 – рукоятка установки нуля; 5 – рукоятка установки 100% Т; 6 –
світлозахисна кришка кюветного відділення; 7 – утримувач робочих
світлофільтрів; 8 – кюветне відділення; 9 – утримувач робочих світлофільтрів; 10 –
кришка

2. Настроювання фотоколориметра. Обертанням рукоятки установки нуля 4

привести стрілку мікроампер метра 1 на нульову відмітку шкали коефіцієнта
пропускання Т так, щоб положення стрілки збіглося з її дзеркальним відображенням
і зі штрихом відмітки. При цьому світловий потік необхідно перекрити шторкою або
заглушкою світлового потоку. Потім відчинити шторку або зняти заглушку і
обертаючи рукоятку установки 100%Т добитися зміщення стрілки мікроамперметра
на відмітку «100» шкали коефіцієнта пропускання так, щоб положення стрілки
збіглося з її дзеркальним відображенням і зі штрихом відмітки, яке відповідає
нульовому значенню оптичної густини (або 100% Т).
3. Визначення коефіцієнта пропускання Т або оптичної густини D
досліджуваних розчинів. Відчинити кришку кюветного відділення, вилити воду,
заповнити кювету досліджуваним розчином, розмістити її в кюветному відділенні й
зачинити кришку кюветного відділення. Зняти відлік зі шкали коефіцієнта
пропускання або оптичної густини, записати його. Періодично проводити перевірку
100% за шкалою коефіцієнта пропускання або нуль за шкалою оптичної густини.

12
 Вимірювання оптичної густини кожного досліджуваного розчину
рекомендується проводити не менше трьох разів і вирахувати середнє арифметичне
значення. Час безперервної роботи приладу не більше 8 год.

Хід роботи
Завдання 1. Визначення константи рівноваги Кр
Одержати криву залежності оптичної густини від загальної концентрації
молочної кислоти при постійній концентрації Fe 3+ і постійному рН. Загальна
концентрація кислоти має бути приблизно у 100 разів більша від загальної
концентрації тривалентного заліза.
До 1 см3 0,012 моль/дм3 розчину тривалентного заліза, налитого в колбу на
25 см3, додати певну кількість молочної кислоти Н2Лакт (згідно з табл. 1.2.) і
розбавити розчин буфером (рН=2) до 25 см3. Розчин перемішати та виміряти
оптичну густину Dx на фотоколориметрі, як описано вище. Для вимірювання
використати світлофільтр з λ=520 нм і кювету товщиною 20 мм. Отримані значення
Dx занести в табл. 1.2.
Таблиця 1.2
Залежність оптичної густини Dx розчинів (рН 2) лактату заліза від
концентрації молочної кислоти ([Н2Лакт] позначено [L], D0-Dx позначено ∆D)
[ L]
V(0,1М) , Dx Dx
100
№ Н2Лакт, Dx ∆D –lg[L] lg
см3 Моль/ D D
дм3
1 0,1
2 0,5
3 1,0
4 2,0
5 5,0
6 6,0
7 10,0
8 15,0
9 17,0
10 20,0

На базі даних табл. 1.2 побудувати графік залежності оптичної D густини від
концентрації молочної кислоти [Н2Лакт]/100 (рис. 1.3).

13
 Рис. 1.3. Залежність оптичної густини D від концентрації молочної
кислоти [H2Лакт]/100

З рисунка видно, що крива залежності D від концентрації Н2Лакт досягає

насичення і має горизонтальну ділянку. Наявність горизонтальної ділянки на кривій,
отриманій у даних умовах (рН=const,[ Fe+3 ]=const, [ Fe+3 ]<<[Н2Лакт]), дозволяє
стверджувати, що відбулося повне зв’язування іона Fe+3 у комплексі [ Fe( HЛакт)n]3−n
.
Оптичну густину розчину при досягненні горизонтальної ділянки позначити
через D0, а оптичну густину за тієї або іншої концентрації Н2Лакт, коли ще немає
повного зв’язування заліза в комплекс, позначити через D x. Оскільки оптична
густина пропорційна концентрації забарвленого комплексу, тоді
Dx [ Fe( HЛакт − )3n−n ]
= . (1.12)
D0 − Dx [ Fe3+ ]
Провести заміну у формулі (1.11), підставивши вираз (1.12), де концентрації
речовин виражені через оптичні густини.
Отримаємо такий вираз
Dx
− lg = lg К нескомп − n lg[ НЛакт − ]
D0 − Dx
або (1.13)
Dx
lg = n lg[ НЛакт − ] − lg К нескомп
D0 − Dx
Далі за отриманими значеннями Dx і D0 виконати необхідні обчислення,
Dx
одержані дані занести в табл. 1.2 і побудувати графік залежності lg від
D0 − Dx
lg[Н 2 Лакт] (рис.1.4). З нахилу цієї лінійної залежності знаходимо величину n, де
n=tgα. За значенням рН=2 знаходимо, що [H + ]=10−2 . Для розрахунку константи

14
рівноваги Кр необхідно використати такий розподіл молочної кислоти в різних
хімічних формах: [Н2Лакт]=Сзаг – n [Fe(HЛакт - )3-n
n
–[НЛакт -]–[ HЛакт 2- ], де Сзаг –
загальна концентрація молочної кислоти. Оскільки рН=2, а Н2Лакт – слабка кислота,
то [НЛакт-] і тим більше [ HËàêò2- ] настільки малі, що ними можна знехтувати. Якщо
n [Fe(HЛакт - )3-n
n ]
<<[Н2Лакт], тоді [Н2Лакт] ≈ Сзаг.

Рис.1.4. Графічне знаходження координаційного числа n

Підставивши у формулу (2.9) відповідні значення, отримаємо

Dx (10−2 )
tg 
Dx [ H + ]tg
Kp = = , (1.14)
( D0 − Dx )(Cзаг )tg ( D0 − Dx )(Cзаг )tg
де Сзаг – загальна концентрація молочної кислоти для даної величини.

Завдання 2. Визначення зміни стандартної вільної енергії за константою

рівноваги
Визначити константу рівноваги лактатного комплексу заліза (завдання 1). Для
розрахунку зміни стандартної вільної енергії використати формулу (1.7).
Зробити висновки.

Контрольні запитання для підготовки до роботи

1. Яз величина енергії Гіббса характеризує хімічні перетворення у клітині.
2. Доведіть зв'язок зміни стандартної вільної енергії Гіббса G з константою
0

рівноваги Кр.
3. Як визначається координаційне число п сполуки заліза у даній лабораторній
роботі.
4. Опишіть хід роботи.
5. Як розраховуються Кр та G в даній лабораторній роботі.
0

6. Поясніть принцип роботи фотокалориметра.

15
 Лабораторна робота №3

Тема: Визначення концентрації водневих іонів і рК амінокислот

Мета: Визначення концентрації водневих іонів і рК амінокислот
Матеріали та прилади: 0,1 н розчини гліцину, 0,1 Н розчин КОН, 0,1 Н
розчин НСl; мірні піпетки; склянки на 50 см3, рН-метр.

Теоретичні відомості
Концентрація іонів водню суттєво впливає на перебіг різноманітних
біологічних процесів. Так, багато реакцій окиснення і відновлення органічних
речовин в організмі змінюють свій напрямок при зміні концентрації іонів водню.
Визначення концентрації іонів водню необхідне також у зв'язку з тим, що їх
концентрація впливає на ступінь іонізації молекул, які беруть участь у багатьох
біохімічних процесах. До таких процесів відносяться ферментативні реакції,
конформаційні зміни білків і нуклеїнових кислот, зміна поведінки молекул при
електрофоретичному і хроматографічному розділенні та інші.
Електролітичну дисоціацію води можна представити:

Н2О  Н+ +ОН- , (2.1)

тоді константа дисоціації води:
К = [H+][OH-] / [H2O]. (2.2)
У розбавлених розчинах концентрація молекул води стала і дорівнює числу
грамів води в 1 дм3 розчину, поділеному на молекулярну масу, тобто 1000/18 = 55,5
моль/дм3. Іонний добуток води (Кв) можна знайти за рівнянням:
Кв = [H+][OH-]. (2.3)
Величина іонного добутку води значною мірою залежить від температури
(дисоціація води збільшується за підвищення температури). При кімнатній
температурі Кв=10-14. Величина Кв дозволяє характеризувати всі розчини
(нейтральні, кислі, лужні) за концентрацією іонів водню. Для зручності запису
концентрації іонів водню Соренсен у 1920 р. ввів так звану шкалу рН, яка складена
на основі іонного добутку води Кв. Шкала рН є способом позначення концентрації
іонів водню в будь-якому водному розчині, кислотність якого лежить в межах 1 М
Н+ і 1 М ОН-. Термін рН визначається виразом:

pН = – lg [Н+] або [H+] = 10-pH. (2.4)

Якщо концентрації іонів [Н+] = [ОН-] = 10-7 М, такий розчин називається

нейтральним (рН = –lg [10-7] = 7). Коли [H+] > [OH-], тобто рН<7, розчин називається
кислим, і навпаки, якщо [H+] < [OH-], тобто рН>7, розчин буде лужним.
16
 Точні вимірювання рН в лабораторіях проводять за допомогою електродів з
вибірковою чутливістю до іонів Н+. В приладі – рН-метрі – сигнал від цього
електрода посилюється і порівнюється з сигналом, який генерується розчином з
точно відомою величиною рН.
Характерною особливістю кислот є те, що у водному розчині вони прагнуть
відщепити свій протон. Чим сильніша кислота, тим сильніше виражена ця тенденція.
Здатність будь-якої кислоти НА відщеплювати протон і утворювати спряжену з нею
основу А– характеризується константою рівноваги оборотної реакції НА  Н+ + А-:

К’ = [H+][A-]/[HA]. (2.5)

Тобто НА та А– складають супряжену пару, НА є супряженою кислотою

(донором протонів), а А– – супряженою основою (акцептором протонів).

[ Н + ]  [ А− ]
Константа дисоціації речовини записується як K= . Звідси
[HA]
[HA]
знаходимо: [ Н + ] = K 
[ А− ]
Прологарифмувавши цей вираз, отримуємо рівняння Гендерсона-Хассельбаха
для розрахунку рН :
[ А− ]
рН = рК + lg (2.6)
[ HA]
З цього рівняння видно, що рК – це те значення рН, за якого концентрація
кислоти дорівнює концентрації основи, [НА] = [А-].
«Силу» кислоти характеризують величиною рК. Для сильних кислот величини
рК від’ємні. Наприклад, для НСl К = 103 і рК = –3. Ми будемо розглядати досить
слабкі кислоти й основи, для яких К<<1. Наприклад, для НNО2 К = 4∙10 -4 і рК = 3,4.
Амінокислоти мають різноманітні групи, що здатні до дисоціації.
Усі групи амінокислот, що здатні до іонізації, можуть бути подані в
протонованій формі, тобто їх дисоціацію можна розглядати як кислотну (рис. 2.1).

17
 Рис. 2.1. Дисоціація гліцину

Оскільки всі амінокислоти містять принаймні дві групи, що здатні до

дисоціації, то крива титрування має вигляд, наведений на рис. 2.2.
Як видно з рис. 2.2., два значення рК знаходяться порівняно далеко одне від
одного. Значення pH ізоелектричної точки знаходять за формулою:
1
рН i = ( pK1 + рК 2 )
2

Рис. 2.2. Крива титрування амінокислот (пояснення в тексті)

Точці Б відповідає рНі, що характеризує нейтральний розчин амінокислоти, п

18
– кількість еквівалентів доданої кислоти чи лугом

На рис. 3.2. рК1 відповідає дисоціації карбоксильної групи, коли є рівновага

двох форм цієї групи А і Б (рис. 2.1), їх співвідношення таке:

 А = 1 , а рК –
Б
2

дисоціації аміногрупи, коли є рівновага двох форм Б і В (рис. 2.1) зі

співвідношенням:
 Б  = 1.
 В
Таблиця 2.1
Титрування кислотою або лугом

№ Vi, см3 ∑ Vi, см3 п рН розчину

1 0,0 0,0 0,000
2 0,5 0,5 0025
3 0,5 1,0 0,050
4 0,5 1,5 0,075
5 0,5 2,0 0,100
6 2,0 40 0,200
7 2,0 6,0 0,300

Зауваження. Оскільки концентрація розчинів кислоти, лугу і гліцину виражені

в г-екв./л, то число еквівалентів n доданої кислоти чи лугу визначають з простого
співвідношення :
n = ∑ Vi \V (1.22)
де n – еквівалент доданої кислоти чи лугу; V – початковий об'єм амінокислоти;
Vi – об'єм доданої кислоти чи лугу; ∑ Vi – сума об'ємів доданих кислоти чи лугу.

Завдання 1. Титрування гліцину

1. У склянку ємністю 50 см3 за допомогою піпетки набрати 20 см3
(початковий об'єм) 0,1 н розчину гліцину. Виміряти його рН.
2. Протитрувати цей розчин 0,1 н КОН. Для цього в склянку з розчином
гліцину піпеткою додати 0,5 см3 лугу. Суміш перемішати скляною паличкою і
виміряти рН. Операцію повторити, кожного разу додаючи до розчину гліцину
порцію лугу об’ємом 0,5 см3. Після четвертого вимірювання об’єм лугу збільшити
до 2 см3. Титрування припинити, коли об'єм внесеного в скляночку роз чину лугу
дорівнюватиме 20 см3.
3. Старанно промити електроди дистильованою водою.

19
 4. Аналогічно протитрувати 20 см3 0,1 н розчину гліцину розчином 0,1 н
соляної кислоти.
5. Результати двох титрувань занести в табл. 2.1.
6. Після закінчення титрування старанно промити електроди
дистильованою водою. Електроди не повинні довгий час залишатись сухими, тому
їх тримають у дистильованій воді, яка, за умови, що електроди добре відмиті, має
рН 5,6 – 6,0.

Завдання 2. Визначення константи дисоціації гліцину

1. Використовуючи дані таблиць, побудувати графік, аналогічний
наведеному на рис. 2.2.
2. Знайти на графіку значення рК1 і рК2 .
3. Розрахувати константи дисоціації гліцину за формулою (2.6).
Зробити висновки.

Контрольні запитання для підготовки до роботи

1. Дати визначення константі дисоціації та іонному добутку води.
2. Шкала рН як спосіб позначення іонів водню. Нейтральний, кислий та лужний
розчин.
3. Пояснити принцип роботи рН- метра.
4. Навести і охарактеризувати криву титрування амінокислот.
5. Навести і охарактеризувати рівняння Гендерсона-Хассельбаха.

20
 Лабораторна робота №4
Тема: Вивчення властивостей буферних систем.
Мета: вивчення властивостей буферних систем на прикладі фосфатно-
цитратних буферних розчинів
Матеріали та прилади: рН-метр, аналітичні ваги, мірні колби на 100 см3,
стакани, піпетки, метилоранж, фенолфталеїн, Na 2HPO4.12Н2О, дистильована вода,
лимонна кислота, 0,1н HCl.

Теоретичні відомості
В живих системах внутрішньоклітинні та зовнішньоклітинні рідини мають
характерну і постійну величину рН, яка підтримується за допомогою різних
біологічних чинників. Перша лінія захисту живих організмів, яка перешкоджає зміні
їх внутрішнього рН, забезпечується буферними системами. Буфери –являють собою
водні розчини, які здатні перешкоджати зміні їх рН при додаванні невеликої
кількості кислоти або основи. Буферна система складається з слабкої кислоти (донор
протона) і супряженої з нею основи.
Прикладом буферної системи може слугувати суміш оцтової кислоти і ацетат-
іону за однієї і тої ж концентрації; вона утворюється в розчині при досягненні
середньої точки кривої титрування.

Кількість еквівалентів доданого лугу

Рис.3.1. Крива титрування оцтової кислоти. В середній точці кривої
титрування концентрації донора і акцептора протонів однакові рН = рК ’ оцтової
кислоти. В області рН від 3,76 до 5,76 система має буферні властивості.

Крива титрування оцтової кислоти має пряму ділянку, яка поширюється

приблизно на 1 одиницю рН по обидві сторони середнього значення. При збільшенні
концентрації іонів водню (або гідроксилу) на даній ділянці відбувається невелика
зміна величини рН. Ця плоска ділянка є буферною областю супряженої кислотно-
21
основної пари. Величина, яка характеризує здатність буферного розчину протидіяти
зміщенню реакції середовища при додаванні сильних кислот або основ, називається
буферною ємністю розчину. Буферна ємність В вимірюється кількістю кислоти або
лугу (моль), додавання якої до 1 л буферного розчину змінює рН на одиницю. В
середній точці буферної області, де концентрація донора протона дорівнює
концентрації акцептора буферна ємність системи максимальна, тобто більша
кількість іонів водню викликає мінімальну зміну рН. Особливість цієї точки тому,
що рН = рК’. Робоча ділянка буферної системи, тобто здатність протидіяти зміні рН
при додаванні кислот і лугів, має довжину біля 1 рН з кожної сторони від точки рН
= рК. Поза цим інтервалом буферна ємність швидко спадає до 0. Інтервал рН = рК
1 називається зоною буферної дії. Для кожної cупряженої кислотно-основної пари
характерна своя область рН, в якій вона може бути буферною системою.
Кількісне співвідношення між рН, рК’ і здатністю системи працювати як
буфер виражається рівнянням Гендерсона- Хасельбаха:
рН = рК’ + lg [A-]/[HA], (3.1)

lg [A-]/[HA] =1 при [A-] = [AH].

Це рівняння показує, що рК дорівнює рН у випадку, коли половина молекул
НА знаходиться в дисоційованій формі, тобто коли концентрація кислоти дорівнює
концентрації основи. “ ’ ” значить, що рК відноситься до молярної концентрації.
Значення рКа кислоти кількісно характеризує її силу.
Механізм дії буферної системи полягає у тому, що, наприклад, один з
компонентів системи – донор протона, або слабка кислота містить резервні зв’язані
іони водню, які можуть бути звільнені для нейтралізації іонів ОН- з утворенням Н2О.
Такий процес відбувається тому, що рівновага на якийсь момент порушується і член
[H+][OH-] стає меншим за 10-14. Порушена рівновага швидко відновлюється і
добуток [H+][OH-] знову стає рівним 10-14, що приводить до пониження концентрації
іонів Н+. Але тепер відношення [H+][OH-] стає меншим за величину К’, і як наслідок
відбувається подальша дисоціація кислоти НА для відновлення порушеної
рівноваги. У такий спосіб і інший компонент буферної системи – супряжена основа
зв’язується з доданими іонами Н+. В цьому випадку обидві реакції іонізації
регулюють одна одну і приходять до стану рівноваги. Здатність розчину
функціонувати як буфер – це наслідок двох оборотних реакцій, що перебігають, і
встановлення рівноваги, визначеної константами К в і К’.
Фосфатна буферна система, яка відіграє важливу роль у підтримці рН
внутрішньоклітинної рідини, є спряженою кислотно-основною парою, яка
складається з іона Н2РО4–– донора протонів і іона НРО42– – акцептора протонів. Ця
буферна пара здатна створювати опір змінам рН в межах від 6,1 до 7,7 і

22
забезпечувати буферну ємність внутрішньоклітинній рідині, рН якої змінюється у
інтервалі 6,9-7,4.
Хід роботи
Завдання 1.
1. Розрахувати масу Na2HPO4∙12Н2О, яка необхідна для приготування 0,2 М
розчину Na2HPO4. Приготувати 100 см3 0,2 М розчин Na2HPO4.
2. Розрахувати масу лимонної кислоти, яка необхідна для приготування 0,1 М
розчину. Приготувати 100 см3 0,1 М розчину лимонної кислоти С6Н8О7.Н2О.
3. Приготувати суміш 16,5 см3 0,2 М розчину Na2HPO4 і 3,5 см3 0,1 М розчину
лимонної кислоти.
4. Виміряти рН утвореного розчину.
5. Виміряти рН дистильованої води.
6. Додати до суміші і до дистильованої води 2-3 краплі метилоранжу, а потім
краплями 0,1 н розчин соляної кислоти до появи рожевого забарвлення. Порівняти
кількість кислоти, яка необхідна для появи рожевого забарвлення у воді та у
буферному розчині.
7. Дослід повторити, додаючи до суміші та води фенолфталеїн і 0,1 н розчин NaOH
до появи рожевого забарвлення.
8. Спостереження пояснити.

Завдання 2.
1.Приготувати суміш 12,6 см3 0,2 М розчину Na2HPO4 та 7,4 см3 0,1 М розчину
лимонної кислоти.
2.Виміряти рН утвореного розчину.
3.Виміряти рН 0,1н розчину соляної кислоти.
4.Розвести суміш і розчин соляної кислоти у 10 разів.
5.Виміряти рН розведених розчинів.
6.Спостереження пояснити.
Зробити висновки.

Контрольні запитання для підготовки до роботи:

1. Яке значення мають кислотно-основні буферні системи в біологічних
системах.
2. Охарактеризуйте рівняння Гендерсона-Хасельбаха.
3. Поясніть механізм дії буферної системи.
4. Як залежить буферна ємність від рН?
5. Наведіть типову криву титрування і дати пояснення її характерним
ділянкам.

23
24
 Лабораторна робота №5
Тема: Гемоліз і плазмоліз еритроцитів

Мета: Дослідити явища плазмолізу та гемолізу еритроцитів при дії гіпо- та

гіпертонічних розчинів.
Матеріали та обладнання: мікроскоп, NaCl, дистильована вода, препарат
крові, стакани, циліндри.

Теоретичні відомості
Хаотичний безладний рух молекул, який зумовлює броунівський рух і дифузію,
призводить до рівномірного розподілу компонентів у системі. Якщо ж між
розчинником і розчином або між двома розчинами різної концентрації, помістити
напівпроникну перегородку, то розчинник проходить через неї з розбавленого
розчину в більш концентрований. Така однобічна дифузія розчинника через
напівпроникну мембрану, яка відокремлює розчин від чистого розчинника або
розчину більш низької концентрації, називається осмосом. Осмос завжди
направлений від чистого розчинника до розчину або від розбавленого (осмотичного)
розчину до концентрованого. Осмос характеризується величиною осмотичного
тиску. Осмотичним тиском розчину називається той найменший тиск, який, окрім
тиску самого розчинника, слід прикласти до розчину, щоб запобігти переміщенню
розчинника до розчину через мембрану, яка відокремлює розчин та розчинник і є
непроникною для молекул розчиненої речовини.
Осмотичний тиск розчину дорівнює:
p = і  C  R  T  103 (4.1.)
де С – молярна концентрація розчину, Т – температура, R – газова постійна, і –
ізотонічний коефіцієнт (і>1), який показує, у скільки разів збільшується кількість
часток при дисоціації порівняно з недисоційованою речовиною.
Для неелектролітів (наприклад, для сахарози) ізотонічний коефіцієнт і = 1. Для
розчинів електролітів величина і залежить від числа іонів, на які розділяється
молекула, і від ступеня дисоціації.
Лінійна залежність осмотичного тиску від концентрації розчину та від
температури має місце тільки для ідеальних розчинів, в яких розчинена речовина не
дисоціює на дві або більше складових часток і не зазнає асоціації, що приводить до
зменшення числа розчинених часток.
У медицині осмотичний тиск виражають або в мм.рт.ст., або в атм.
Еритроцити є зручною моделлю для дослідження стійкості мембран під
впливом зовнішніх факторів (іонний склад, температура, поверхнево-активні
речовини тощо).
Гемолізом називають руйнування плазматичної мембрани еритроцитів, що
супроводжується виходом з них гемоглобіну в плазму крові, яка при цьому
забарвлюється в червоний колір і стає прозорою («лакова кров»). Руйнування
еритроцитів може бути спричинено зменшенням осмотичного тиску, що спочатку
призводить до набухання, а потім до руйнування еритроцитів – осмотичний гемоліз.
Мірою осмотичної стійкості (резистентності) еритроцитів є концентрація NaCl, при
якій починається гемоліз. У розчині 0,34 % NaCl руйнуються всі еритроцити. Під час
25
деяких захворювань осмотична стійкість еритроцитів зменшується і гемоліз
відбувається при високих концентраціях NaCl у плазмі.
Хімічний гемоліз відбувається за дії речовин (ефір, хлороформ, спирти, бензол,
жовчні кислоти, сапонін тощо), що руйнують білково-ліпідну мембрану
еритроцитів; механічний виникає при сильних механічних впливах на кров,
термічний – при заморожуванні і розморожуванні крові, біологічний – при
переливанні несумісної крові, за дії імунних гемо лізинів тощо.
Найпростіший метод визначення осмотичного тиску клітинного вмісту –
плазмолітичний. Відомо, що плазмоліз спричиняють тільки гіпертонічні розчини,
тоді як у ізо- і гіпотонічних розчинах плазмоліз не спостерігається.

Хід роботи
1) Готують розчини NaCl з концентраціями 0,2%, 0,9% та 4%.
2) На предметне скельце наносять декілька краплин розчину хлориду натрію
та краплю крові. Накривають покривним скельцем та спостерігають в мікроскоп за
поведінкою еритроцитів.
3) Повторити дослід з іншими розчинами NaCl.
4) Замалювати зовнішній вигляд еритроцитів в трьох розчинах.
5) Зробити висновок, за яких концентрацій відбулися явища плазмолізу та
гемолізу.
6) Розрахувати значення осмотичного тиску в трьох розчинах і порівняти зі
значенням осмотичного тиску еритроцитів (Осмотичний тиск крові в середньому
становить 7,4 атм чи 72,82·104 Па).

Список рекомендованої літератури

1. Кузьмінський Є.В. Біофізика / Є.В. Кузьмінський, Н.Б. Голуб. – К.:

Видавничий дім «Комп’ютерпрес», 2007. – 424с. – ISBN 978-966-8846-14-4.
2. Біофізика: Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт для студентів
напряму 0929 „Біотехнологія”/Під заг. ред. Є.В.Кузьмінського. – К.: ІВЦ
„Видавництво «Політехніка»”, 2004 – 72с.
3. Зима В.Л. Біофізика. Практикум / В.Л. Зима, М.С. Мірошниченко, Т.Л.
Давидовська, В.В. Ганчурін, Ю.І. Прилуцький. – К.: Видавничо-поліграфічний
центр» Київський університет», 2003. – 139с. – ISBN 966-594-358-8.
4. Біофізика [Текст] : підручник для студентів біолог., методичних та фізичних
вузів / П. Г. Костюк, В.Л. Зима, І. С. Магура та ін.; За ред. П. Г. Костюка. - К. :
Обереги, 2001. - 544 с. ISBN 966-513-021-8
1. Практикум по общей химии. Биофизическая химия. Химия биогенных елементов
/А.В.Бабков, В.А.Попков, С.А.Пузаков, Л.И.Трофимова, под.ред. В.А.Попкова,
А.В.Бабкова.- М.:Высшая школа, 2001, 237с.

26
.

27