Jheimbach LLC

27/05/2008
Tiến sĩ Robert L. Martin
Phó giám đốc
Phòng Công nghệ sinh học và đánh giá thông báo GRAS (HFS-255)
Văn phòng phê duyệt Premarket
Trung tâm về an toàn thực phẩm và dinh dưỡng ứng dụng
Cục quản lý về Thực phẩm và Dược phẩm
5100 Paint Branch Parkway
College Park, MD 20740
Kính gửi Bob:
Căn cứ theo đề xuất 21 CFR 170.36 (62 FR 18960; 17/04/1997), BioGaia AB tại
Stockholm, Thụy Điển, thông qua tôi với tư cách cơ quan của mình, đưa ra thông báo về việc sử
dụng vi khuẩn sinh học được mô tả trong tài liệu thông báo đính kèm được miễn yêu cầu phê
duyệt tiếp thị trước Liên bang Đạo luật Thực phẩm, Dược phẩm và Mỹ phẩm vì BioGaia AB đã
xác định rằng việc bổ sung dự kiến của chế phẩm sinh học vào thực phẩm thông thường được
chứng nhận an toàn (GRAS) dựa trên các quy trình khoa học. Theo yêu cầu, ba bản sao của
thông báo được cung cấp. Xin lưu ý rằng chữ ký của bốn thành viên của Hội đồng chuyên gia
xuất hiện ở trang 92 của tài liệu. Nếu bạn có bất kỳ câu hỏi nào liên quan đến thông báo này, xin
liên hệ với tôi theo số 804-742-5548 hoặc email jh@jheimbach.com
Trân trọng,

Tiến sĩ James T. Heimbach, F.A.C.N.

Chủ tịch

Encl
 Chứng nhận an toàn (GRAS)
Xác định chủng Lactobacillus reuteri DSM 17938

Chuẩn bị cho
BioGaia AB
Stockholm, Thụy Điển

Được chuẩn bị bởi

Jheimbach LLC
Port Royal VA

Tháng 5, 2008
 Mục lục
DANH MỤC CÁC BẢNG III
DANH MỤC CÁC HÌNH IV
1. YÊU CẦU KHAI THÁC GRAS 1
1.1. Tên và địa chỉ của bên thông báo 1
1.2. Tên của chủng vi khuẩn GRAS 1
1.3. Mục đích sử dụng và tiếp xúc với người tiêu dùng 1
1.4. Cơ sở để xác định GRAS 2
1.5. Tính khả dụng của thông tin 2
2. NHẬN DIỆN SINH VẬT 3
2.1. Tên của sinh vật GRAS 3
2.2. Mô tả về sinh vật GRAS 3
2.3. Đặc tính của chủng DSM 17686 và DSM 17938 5
2.3.1. Loại bỏ plasmid pLR581 5
2.3.1.1. Xác định Plasmid trong L.reuteri ATCC 55730 5
2.3.1.2. Cô lập gen kháng Tetracycline 5
2.3.1.3. Sự tương đương đáng kể của các dòng mẹ và dòng con 6
2.3.2. Loại bỏ plasmid pLR585 6
2.3.2.1. Xác định gen kháng Lincomycin 6
2.3.2.2. Cô lập gen kháng Lincomycin 7
2.3.2.3. Sự tương đương đáng kể của dòng mẹ và cả hai dòng con cái 7
2.4. Quy trình sản xuất 9
2.5 Thông số kỹ thuật 10
3. SỬ DỤNG VÀ TIẾP XÚC 12
3.1. Danh mục thực phẩm bổ sung L reuteri 12
3.2. Lượng dự kiến hàng ngày của L reuteri 12
4. AN TOÀN 14
4.1. An toàn của các vi khuẩn axit lactic và các loài Lactobacillus 14
4.2. Lịch sử sử dụng chủng L reuteri DSM 17938 và chủng mẹ 16
4.3. Thông số an toàn 16
4.3.1. Khả năng bám dính các tế bào ruột 16
4.3.2. Khả năng làm giảm chất nhày 17
4.3.3. Nhiễm trùng 18
4.3.4. Sự hiện diện của các gen kháng kháng sinh và Likelibood của Transferase 20
4.3.5. Tác động đến mầm bệnh 26
4.3.6. Sản xuất D (-) axit lactic 26
4.4. Các nghiên cứu về L reuteri 28
4.4.1. Nghiên cứu trên động vật 28
4.4.2. Nghiên cứu trên con người 46
4.4.2.1. Các nghiên cứu ở người lớn 46
4.4.2.1.1. Nghiên cứu về BioGaia L reuteri DSM 17938 ở người lớn 46
4.4.2.1.2. Các nghiên cứu về L reuteri ATCC 55730 của BioGaia ở người lớn 49
4.4.2.1.3. Các nghiên cứu về các chủng L reuteri khác ở người lớn 60
4.4.2.2. Nghiên cứu ở trẻ em 67
4.4.2.2.1. Các nghiên cứu về BioGaia L reuteri ATCC 55730 ở trẻ em 67
4.4.2.2.2. Các nghiên cứu về các chủng L reuteri khác ở trẻ em 72
4.4.2.3. Nghiên cứu ở trẻ sơ sinh 74
4.4.2.3.1. Các nghiên cứu về L reuteri ATCC 55730 của BioGaia ở trẻ sơ sinh 74
4.4.2.3.2. Các nghiên cứu về các chủng L reuteri khác ở trẻ sơ sinh 84
4.5. Xem lại các bài viết liên quan đến sự an toàn của L reuteri 84
4.6. Đánh giá trước đây về L reuteri ATCC 55730 của FDA 84
4.6.1. McNeil thông báo và phản ứng thành phần chế độ ăn uống mới 84
4.6.2. Nghiên cứu bổ sung kể từ thông báo NDI 85
4.7. Đánh giá về sự an toàn của L reuteri bởi một cơ quan có thẩm quyền 86
5. ĐÁNH GIÁ AN TOÀN VÀ CHỨNG NHẬN GRAS 86
5.1. Giới thiệu 88
5.2. Đánh giá an toàn 89
5.3. Chứng nhận chung về sự an toàn của L reuteri 91
5.4. Kết luận của Hội đồng chuyên gia 92
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 93
PHỤ LỤC 107
 Danh sách các bảng
Bảng 1. Đặc tính chủng L reuteri DSM 17938................................................................................ 11
Bảng 2. Các nghiên cứu kết hợp với người nhận L reuteri 1063 rifR, chủng R 1.4....................... 23
Bảng 3. Thông số huyết học của chuột được cho sử dụng L reuteri và L. rhamnosus................... 36
Bảng 4. Các nghiên cứu L reuteri trên động vật............................................................................... 37
Bảng 5. Các thông số huyết học sau khi dùng liều cao DSM 17938 và giả dược........................... 48
Bảng 6. Các nghiên cứu L reuteri ATCC 55730 ở người trưởng thành.......................................... 54
Bảng 7. Các nghiên cứu về các chủng khác của L reuteri ở người trưởng thành.......................... 63
Bảng 8. Các nghiên cứu về L reuteri ATCC 55730 ở trẻ em............................................................ 69
Bảng 9. Các nghiên cứu về các chủng khác của L reuteri ở trẻ em................................................. 73
Bảng 10. Các nghiên cứu về L reuteri ATCC ở trẻ sơ sinh.............................................................. 79
 Danh sách các hình
Hình 1. Phân tích Rep-PCRs của chủng bố mẹ và các chủng con...........................................................8
1. Yêu cầu miễn GRAS
1.1.Tên và địa chỉ của đơn vị khai báo
BioGaia AB
P.O. Box 3242
Kungsbroplan 3B
SE-103 64 Stockholm
Thụy Điển
Liên hệ: Tiến sĩ Bjorn Lindman, Quản lý chất lượng
Điện thoại: 46 8 555 293 13
Điện thoại thay thế: 46 8 555 293 01
Email: bl@biogaia.se

1.2. Tên của sinh vật GRAS

Đối tượng của Chứng nhận an toàn này (GRAS) là một chủng vi khuẩn sinh học
Lactobacillus reuteri. Chủng này được biết đến với tên thương mại là L reuteri Protectis. Nó
đã được gửi vào Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSMZ) và
được gọi là DSM 17938. Chủng này có nguồn gốc từ việc xóa bỏ hai plasmid, sử dụng
phương pháp tự nhiên, từ một chủng được gửi trong Bảo tàng giống vi sinh vật chuẩn Hoa
Kỳ (ATCC) năm 1995 và được gọi là ATCC 55730. Chủng ATCC 55730 cũng được đề cập
trong các tài liệu khoa học bởi các chỉ định SD 2112, ING 1 và MM 53, nhưng chỉ định
ATCC 55730 được sử dụng trong toàn bộ tài liệu này. Một sinh vật có nguồn gốc từ chủng
ATCC 55730 do xóa một plasmid đã được BioGaia gửi vào DSMZ dưới dạng DSM 17686.
Chủng này sau đó được sử dụng làm điểm khởi đầu cho việc loại bỏ plasmid thứ hai để tạo ra
chủng DSM 17938. Cả hai chủng được tạo ra, DSM 17686 và DSM 17938, về cơ bản tương
đương với chủng bố mẹ của chúng ở tất cả các khía cạnh khác ngoài vấn đề các plasmid này
(có chứa gen mã hóa cho kháng kháng sinh) và do đó có chung hồ sơ an toàn với chủng bố
mẹ. Hầu hết các nghiên cứu về chủng L reuteri này được thực hiện bằng cách sử dụng chủng
mẹ ATCC 55730.
1.3.Mục đích sử dụng và người tiêu thụ
Chủng L reuteri DSM 17938 dự định sẽ được thêm vào nhiều loại thực phẩm ở nồng độ
cần thiết để cung cấp 108 đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) L reuteri cho mỗi khẩu phần
thực phẩm, có thể lên tới 109 tại thời điểm sản xuất. Các loại thực phẩm mà L reuteri dự định
được thêm vào là phô mai đã qua chế biến, sữa chua, kem, nước ép trái cây và đồ uống, nước
giải khát, thanh năng lượng và kẹo cao su. Một số trong những thực phẩm thông thường này
có thể được tiêu thụ bởi trẻ sơ sinh và trẻ em và những loại khác có thể được nhắm mục tiêu
cụ thể cho trẻ sơ sinh và trẻ em. Cũng cần lên kế hoạch để kết hợp L reuteri trong một ống
hút ở cùng nồng độ 108 CFU, để lợi khuẩn có thể được tiêu hóa trong khi tiêu thụ bất kỳ đồ
uống nào. Tổng phơi nhiễm của người tiêu thụ ước tính từ những mục đích sử dụng này là
dưới 109 đến 1010 CFU/ngày.
1.4.Cơ sở để xác định GRAS
Xác định GRAS của BioGaia cho mục đích sử dụng của chủng L reuteri DSM 17938 dựa
trên các quy trình khoa học như được mô tả trong 21 CFR § 170.30 (b).
Việc xác định tình trạng an toàn và tình trạng GRAS của việc bổ sung dự định vào thực
phẩm của chủng L reuteri DSM 17938 đã được đưa ra thông qua các thảo luận của Hội đồng
chuyên gia bao gồm Bác sĩ Berthold V. Koletzko, Tiến sĩ Daniel J. O'Sullivan, Tiến sĩ Mary
Ellen Sanders, và Tiến sĩ John A. Thomas, những người đã xem xét một chuyên khảo được
chuẩn bị bởi JHeimbach LLC cũng như các thông tin khác có sẵn cho họ. Những cá nhân này
có đủ điều kiện bằng đào tạo khoa học và kinh nghiệm để đánh giá sự an toàn của thực phẩm
và các thành phần thực phẩm bao gồm các vi sinh vật sinh học. Họ đã xem xét và đánh giá
các thông tin có sẵn công khai và khả năng phơi nhiễm của con người với L reuteri DSM
17938 từ mục đích sử dụng của nó, và kết luận cá nhân và tập thể rằng không có bằng chứng
nào về thông tin có sẵn về chủng L reuteri DSM 17938, chủng mẹ ATCC 55730, hoặc các
chủng L reuteri khác, chứng minh hoặc gợi ý những căn cứ hợp lý để nghi ngờ mối nguy
hiểm cho người lớn hoặc trẻ sơ sinh hoặc trẻ em trong các điều kiện dự định sử dụng của
chủng L reuteri DSM 17938.
Theo ý kiến của Hội đồng chuyên gia, các nhà khoa học có trình độ khác đang xem xét
cùng một dữ liệu công khai sẽ đưa ra kết luận tương tự. Do đó, chủng Lactobacillus reuteri
DSM 17938 được GRAS theo quy trình khoa học trong điều kiện sử dụng đã được mô tả.
1.5.Thông tin sẵn có
Dữ liệu và thông tin làm cơ sở cho quyết định GRAS sẽ được gửi đến FDA theo yêu cầu
hoặc có sẵn để xem xét và sao chép của FDA vào thời điểm hợp lý tại văn phòng của Tiến sĩ
James T. Heimbach, Chủ tịch, JHeimbach LLC, 923 Water Street, PO Box 66, Port Royal,
Virginia 22535, điện thoại 804-742-5548 và e-mail jh@jheimbach.com.
2. Nhận diện sinh vật
2.1. Tên của sinh vật GRAS

Đối tượng của Chứng nhận an toàn này (GRAS) là một chủng vi khuẩn sinh học
Lactobacillus reuteri. Chủng này được biết đến với tên thương mại là L reuteri Protectis. Nó
đã được gửi vào Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) vào
ngày 30 tháng 1 năm 2006 và được gọi là DSM 17938. Chủng này có nguồn gốc từ việc xóa
hai plasmid từ chủng ban đầu được gửi trong Bảo tàng giống vi sinh vật chuẩn Hoa Kỳ
(ATCC) vào ngày 6 tháng 12 năm 1995 và được gọi là ATCC 55730. Chủng ATCC 55730
cũng được đề cập đến trong các tài liệu khoa học bởi các chỉ định SD 21121, ING 1 và MM
532, nhưng chỉ định ATCC 55730 được sử dụng trong toàn bộ tài liệu này. Một sinh vật có
nguồn gốc từ chủng ATCC 55730 do xóa một plasmid đã được BioGaia gửi vào DSMZ dưới
dạng DSM 17686. Chủng này sau đó được sử dụng làm điểm khởi đầu cho việc loại bỏ
plasmid thứ hai để tạo ra chủng DSM 17938. Cả hai chủng được tạo ra, DSM 17686 và DSM
17938, về cơ bản tương đương với chủng bố mẹ của chúng ở tất cả các khía cạnh khác ngoài
việc sở hữu các plasmid này (có chứa gen mã hóa cho kháng kháng sinh) và do đó có chung
hồ sơ an toàn với chủng bố mẹ. Hầu hết các nghiên cứu về chủng L reuteri này được thực
hiện bằng cách sử dụng chủng mẹ ATCC 55730.
2.2. Mô tả về sinh vật GRAS
Lactobacillus reuteri là một loại vi khuẩn gram dương là thành viên trong phân loại rộng
của vi khuẩn axit lactic (LAB). LAB là một nhóm các vi khuẩn liên quan đến chức năng trao
đổi chất thông thường – sự sản xuất axit lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển
hóa carbohydrate - và các đặc điểm sinh lý phổ biến. LAB là Gram dương, không gây bệnh,
catalase âm tính và không có cytochromes (Holzapfel và cộng sự 2001). Chúng là loại sinh
vật không kỵ khí ưu tiên nhưng yếm khí không bắt buộc, dung nạp axit và khử trùng nghiêm
ngặt. Mặc dù chúng không phải là một nhóm phân loại được xác định nghiêm ngặt, nhưng
LAB thường được xem là bao gồm các chi liên quan phát sinh loài sau, có một số đặc điểm
sinh hóa và sinh thái chung (Axelsson 1998): Aerococcus, Alloicoccus, Camobacterium,
Dolosigranulum, Enterococcus Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenoccus, Vagococcus và Weissella. Do sự tương đồng về
sinh hóa, sinh lý học và sinh thái học, chi Bifidobacterium thường được coi là LAB, mặc dù
nó không liên quan đến phát sinh gen (Axelsson 1998). Ngoại trừ có thể có một số chủng
Enterococcus, hầu hết các chủng LAB được coi là có ít hoặc không có khả năng gây bệnh
(Donohue và Salminen 1996; Adams 1999). LAB có một lịch sử sử dụng lâu dài trong thực
phẩm lên men và không lên men và đã được ghi nhận về khả năng ức chế các vi sinh vật
khác có khả năng gây bệnh thực phẩm hoặc làm hỏng thực phẩm (Adams, 1999; Donohue và
Salminen 1996). Hơn nữa, một số LAB có mặt khắp nơi như các thành phần nhỏ trong biểu
mô ruột và đường tiêu hóa của con người ở mọi lứa tuổi. Tất cả các yếu tố này dẫn đến kết
luận hợp lý rằng hầu hết các chủng LAB

1 Chất lắng đọng ATCC ban đầu của vi khuẩn đã được đưa vào bộ sưu tập "Kho cất giữ" (hoặc SD)
vào ngày 29 tháng 11 năm 1994 và do đó đã nhận được chỉ định SD 2112; chỉ định đã được thay đổi
khi nó được chuyển đến bộ sưu tập công cộng.
2 Tại một thời gian, phòng thí nghiệm đã chỉ định tên chủng dựa trên nguồn gốc của chủng và tiền tố
MM được sử dụng cho các chủng có nguồn gốc từ "sữa mẹ".
an toàn để sử dụng trong thực phẩm thông thường có thể được tiêu thụ bởi tất cả các thành
viên của dân số nói chung.
Lactobacillus là một chi LAB không gây bệnh bao gồm hơn 112 loài được công nhận
tính đến tháng 11 năm 2007 (EFSA 2007). Lactobacilli phát triển trong điều kiện oxy giảm
trong môi trường sống nơi có nhiều chất dinh dưỡng. Chúng được sử dụng trong các ứng
dụng thương mại cho quá trình lên men các sản phẩm bơ sữa, trái cây, rau và thịt (Aguirre và
Collins 1993; Gasser 1994). Một số loài Lactobacillus được tìm thấy trong đường tiêu hóa
của người khỏe mạnh ở mọi lứa tuổi. trong đó chúng là một trong những vi khuẩn "bình
thường" (Saxelin và cộng sự 1996b; Goldin và cộng sự 1992). Giống như các loài
Lactobacillus khác, L reuteri có hình que, đo đường kính khoảng 0,7 đến 1,0 µm và chiều dài
2,0 đến 5,0 µm (Cogan 1996). Nó xảy ra theo cụm, đơn lẻ hoặc theo cặp.
Lactobacilli có thể là đồng nhất hoặc dị hợp tử. Loại thứ nhất chuyển hóa carbohydrate
thành axit lactic thông qua con đường glycolytic, trong khi loại thứ hai chuyển đổi
carbohydrate bằng phosphoketolase để tạo ra axit lactic, axit axetic, rượu ethyl và carbon
dioxide. L reuteri là một vi khuẩn lên men dị hợp tử bắt buộc (Cogan 1996; Kandler và cộng
sự 1980). Các nghiên cứu gần đây về L reuteri ATCC 55730 đã xác định rằng cả con đường
Embden-Meyerhof và con đường phosphoketolase đều được sử dụng bởi chủng này để lên
men glucose hoặc sucrose (Arskold và cộng sự 2008). Dòng chính là thông qua con đường
sau, trong khi con đường cũ được sử dụng như một ống dẫn. Trong giai đoạn tăng trưởng
theo cấp số nhân, hơn 70% dòng đi qua con đường phosphoketolase; con số này tăng lên
84% nếu chất nền chỉ gồm sucrose. Phân tích bộ gen của ATCC 55730 đã xác nhận sự hiện
diện của gen cho cả hai con đường glycolytic (Arskold và cộng sự 2008).
L reuteri được tìm thấy trong đường tiêu hóa của một số loài, bao gồm cả con người
(Kandler và Weiss 1986). Thật vậy, L reuteri là loài Lactobacillus duy nhất được báo cáo cư
trú ở đường tiêu hóa của tất cả các động vật có xương sống và động vật có vú, từ chim đến
người (Casas và Dobrogosz 2000). L reuteri đã được phân lập ở dạng sống từ mọi bộ phận
của đường tiêu hóa - khoang miệng, dạ dày, ruột non và ruột kết, cũng như từ các mẫu phân
và từ âm đạo (Reuter 2001). L reuteri cũng được tìm thấy trong sữa của người mẹ; như đã
thảo luận dưới đây chủng ATCC 55730, chủng mẹ của chủng DSM 17938, được phân lập từ
nguồn này. Sinkiewicz và Nordstrom (2005; chỉ trừu tượng) đã nghiên cứu sự xuất hiện của
L reuteri (cũng như các loại sữa khác và bifidobacteria) trong sữa từ các bà mẹ cho con bú ở
khu vực thành thị và nông thôn của Thụy Điển, Đan Mạch, Israel, Nam Phi, Hàn Quốc, Nhật
Bản và Nhật Bản Peru. Nhìn chung, 12% bà mẹ có số lượng L reuteri có thể phát hiện được
trong sữa của họ, với tỷ lệ mắc bệnh ở nông thôn cao hơn khu vực thành thị.
Chủng loại sau này được chỉ định là L reuteri đã được phân lập từ ruột của một người
trưởng thành bởi Lerche và Reuter (1962) và được chỉ định là chủng tham chiếu của L.
fermentum tuýp sinh học Ilb (Hansen 1968). Chủng này đã được Reuter ký gửi vào năm 1964
tại ATCC với tên là L.fennentum Beijerinck và gán số ATCC 23272; sau đó nó đã được
chuyển đến DSMZ với số DSM 20016. Kandler và cộng sự (1980) đã mô tả tuýp sinh học
này là L reuteri, một loài mới được chỉ định của lên men dị hợp Lactobacillus theo tương
đồng DNA-DNA. Trong khi L reuteri và L. fennentum giống nhau về kiểu hình, chúng khác
nhau về kiểu hình phân tử trong việc sở hữu các loại peptidoglycan khác nhau (Klein và cộng
sự 1998). Chủng mẹ tạo ra chủng là đối tượng của quyết định GRAS này, ATCC 55730 đã
phân lập từ sữa của một phụ nữ cho con bú ở Huancayo, Peru, tại Đại học nông nghiệp "La
Molina" ở Lima (Johnson và cộng sự 2006); nó được xác định và mô tả đặc điểm bởi Casas
và Dobrogosz (1996).
 Bath và cộng sự (2005) đã đưa DNA từ L reuteri ATCC 55730 lên trình tự bộ gen của
súng bắn gen 4x để xác định và mô tả các protein ngoại bào, tức là các protein được liên kết
bề mặt tế bào để điều hòa sự hấp thu dinh dưỡng, cảm nhận môi trường, bám dính vào bề mặt
ruột. Phân tích sinh học tiếp xúc với 126 gen mã hóa protein ngoại bào giả định trong bộ
gen. Loại protein lớn nhất có chức năng dự đoán là enzyme, được mã hóa bởi 44 gen, tiếp
theo là protein vận chuyển (13 gen), protein có chức năng tổng hợp (6 gen), bộ điều chỉnh
hoặc thành phần truyền tín hiệu (4 gen), protein được bảo tồn chức năng chưa biết (35 gen)
và protein không có chức năng chưa biết (24 gen). Hầu hết các protein này được phân phối
rộng rãi (50 phổ biến, 33 ở tất cả các vi khuẩn gram dương, 13 ở tất cả LAB và 7 ở tất cả các
loại vi khuẩn Lactobacilli), nhưng 24 chưa được xác định ở các vi khuẩn khác.
Khả năng L reuteri vượt qua các điều kiện axit khắc nghiệt của dạ dày (với pH lúc đói
khoảng 1.5 và pH lúc no trong khoảng từ 3.0 đến 5.0) sau khi uống (Wall và cộng sự 2007)
có thể góp phần vào khả năng ảnh hưởng đến sinh lý của con người. Trong các nghiên cứu về
ảnh hưởng của sốc axit đối với chủng L reuteri ATCC 55730, Wall và cộng sự (2007) phát
hiện ra rằng một số biểu hiện gen được điều chỉnh tăng để cung cấp sự bảo vệ. Tham số trong
số này là clpL, mã hóa A1Pase với hoạt động của chaperone, lr1516, mã hóa một esterase giả
định và lrl 797, mã hóa một cách chính thức một phosphatidylglycerophosphatase. Các
nghiên cứu đột biến cho thấy thiệt hại đối với các gen này dẫn đến một biến thể với khả năng
giảm nghiêm trọng để sống sót trong điều kiện pH thấp.
Như được thảo luận chi tiết hơn trong Phần 4.3.4, một súng bắn gen 21x trình tự của L
reuteri DSM 17938 đã dự đoán tổng cộng 2.299 gen tiềm năng, có khả năng chiếm hơn 98%
hàm lượng gen của chủng (O'Sullivan 2008). Một phân tích về chú thích bộ gen đã không tiết
lộ bất kỳ gen hoặc cụm gen được biết là có liên quan đến độc lực hoặc kháng kháng sinh.
2.3. Đặc tính của chủng DSM 17686 và DSM 17938
2.3.1. Loại bỏ plasmid pLR581
2.3.1.1. Xác định plasmid trong L reuteri ATCC 55730
L reuteri ATCC 55730 thể hiện tính kháng với kháng sinh tetracycline. Roos và Rosander
(2005) đã thực hiện một súng bắn toàn bộ trình tự bộ gen của L reuteri ATCC 55730. Sau khi
chú thích tất cả các khung đọc mở trong trình tự bộ gen, 4 đường viền đã được tìm thấy để
chứa các gen liên quan đến plasmid. Những đường viền này được xây dựng với số lượng
chạy trình tự cao hơn, cho thấy số lượng bản sao tăng so với các gen nằm trên nhiễm sắc
thể. 4 plasmid có kích thước 8.1 kb (pLR580), 12.9 kb (pLR581), 18.3 kb (pLR585) và 24.9
kb (pLR584).
2.3.1.2. Cô lập gen kháng Tetracydine
Roos và Rosander (2005) sau đó đã đưa L reuteri ATCC 55730 vào sự hình thành tế bào
trần, tương tự như một báo cáo trước đây về việc xử lý L reuteri (Vescovo và cộng sự 1984),
để có được một chủng được loại bỏ gen kháng tetracycline. Phương pháp xử lý này là một
quá trình thay thế hơn là một phương pháp công nghệ sinh học, trong đó vi khuẩn bị bỏ đói
các chất dinh dưỡng và tạm thời bị áp lực, gây ra sự mất tự nhiên của các plasmid không cần
thiết. Sau khi ủ trong bộ đệm tế bào trần, thu được nhiều khuẩn lạc hơn gấp trăm lần trên các
đĩa MRS với sucrose so với trên không có sucrose, cho thấy sự hình thành dạng tế bào trần
hiệu quả. Roos và Rosander (2005) đã kiểm tra 200 khuẩn lạc từ các đĩa sucrose để tăng
trưởng hoặc không tăng trưởng trên môi trường thạch MRS có và không có tetracycline. Bảy
khuẩn lạc không phát triển được mạ lại và phát triển trên MRS với tetracycline, cho thấy
những khuẩn lạc này là gen ứng viên sai. Tuy nhiên, một khuẩn lạc phát triển tốt trên tấm
MRS đối chứng nhưng hoàn toàn không phải trên tấm MRS với tetracycline. Khuẩn lạc này
được mạ lại và được coi là một gen ứng viên thực sự; tức là, một trong số đó đã không thể
hiện kháng tetracycline.
Gen ứng viên nhạy cảm với tetracycline được phân tích bằng phản ứng chuỗi polymerase
(PCR; Roos và Rosander 2005). Cả lr2004 (một gen mã hóa protein sao chép trong plR581)
và lrl996 (tetW) đều thiếu, trong khi các gen đại diện cho 3 plasmid khác vẫn được tìm thấy
trong ứng cử viên, chỉ ra rằng nó chỉ được lấy từ plasmid chứa tetW.
2.3.1.3. Sự tương đương đáng kể của các dòng mẹ và con gái
Roos và Rosander (2005) đã phát hiện ra rằng plasmid pLR581 chứa 13 gen khác ngoài
tetW. Những gen này và chức năng giả định của chúng đã được xác định, và không có gen
nào được cho là có tầm quan trọng đối với tác dụng sinh học của chủng. Các palindromic-
PCR extindenic lặp đi lặp lại (rep-PCRs) so sánh các dòng bố mẹ và con gái giống hệt với
các mồi đã chọn, cho thấy cả hai chủng con gái là một biến thể thực sự của L reuteri ATCC
55730 và không phải là chất gây ô nhiễm, md mà loại bỏ của plR581 không ảnh hưởng đến
rep-PCR. Roos và Rosander (2005) đã so sánh hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng bố
mẹ và con gái. Không có sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc hoặc tế bào được phát
hiện. Ngoài ra, mô hình lên men của 2 chủng được so sánh bằng api 50 cm, trung bình và
không có sự khác biệt nào có thể được phát hiện (Roos và Rosander 2005). Cuối cùng, việc
sản xuất reuterin là cùng một đại lượng cho 2 chủng.
Như một kiểm tra cuối cùng về việc xóa kháng tetracycline, Roos và Rosander (2005) đã
so sánh nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tetracycline đối với các dòng bố mẹ và con
gái. MIC được tìm thấy lần lượt là 256 và 6 µg/ml, chứng minh rằng một mình tetW chịu
trách nhiệm về khả năng kháng tetracycline của L reuteri ATCC 55730 và việc chữa bệnh đã
thành công.
Chủng được chữa khỏi, giống hệt với chủng bố mẹ ngoại trừ việc loại bỏ plasmid
plR581, đã được gửi tại DSMZ và được chỉ định Lactobacillus reuteri DSM 17686. Như đã
được xác nhận bởi thử nghiệm được thực hiện bởi Roos và Rosander (2005), nó đã được xác
nhận tương đương chủng mẹ và bằng chứng chứng minh sự an toàn của L reuteri ATCC
55730 cũng có thể áp dụng tương tự cho chủng DSM 17686.
2.3.2. Loại bỏ Plasmid pLRS85
2.3.2.1. Xác định gen kháng Lincomycin
Trong một sàng lọc vi khuẩn axit lactic trong đó hơn 200 vi khuẩn phân lập từ 90 các
nguồn khác nhau đã được thử nghiệm, bao gồm 74 mẫu chủng Lactobacillus, Kastner và
cộng sự (2006) đã tìm thấy rằng L reuteri ATCC 55730 dường như thể hiện tính kháng với
lincomycin và clindamycin và có chứa gen kháng lnuA. Roos và Rosander (2006) đã xác
định MIC cho lincomycin và clindamycin cho nhiều chủng L reuteri, bao gồm ATCC 55730,
DSM 17686 (SD2112s), DSM 20016, ATCC 55148 (11284), ATCC PTA4659 (MM2-3),
ATCC PTA 5289 (FJl) và ATCC PTA 6485 (MM4-1A). Các chủng ATCC 55730 và chủng
con gái DSM 17686 (sự tiến hóa được mô tả ở trên trong Mục 2.3.1) đều được tìm thấy có
khả năng kháng lincomycin nhưng không kháng clindamycin.
 Sử dụng thông tin trình tự bộ gen được mô tả trong Phần 2.3.1.1 ở trên, Roos và
Rosander (2006) đã tìm kiếm gen kháng lincomycin lnuA và xác định nó là khung đọc mở
lr2105 trên plasmid pLR585, plasmid 18.3 kb được xác định trước đó. Họ phát hiện ra rằng
plasmid này cũng chứa các gen mã hóa protein kháng đa kháng sinh (lr2089) và một nhà xuất
khẩu kháng sinh polyketide (lr2096 và lr2097). Roos và Rosander (2006) cũng xác định rằng
không có gen nào trong plasmid có mối liên hệ rõ ràng hoặc mức độ quan trọng đối với các
đặc điểm sinh học đã biết của L reuteri ATCC 55730.
2.3.2.2. Cô lập gen kháng Lincomycin
Roos và Rosander (2006) đã bắt đầu với chủng con gái (DSM 17686) đã được tách
pLR581 và đưa nó vào sự hình thành tế bào trần để có được một chủng được tách pLR585,
sử dụng một giao thức tương tự như được sử dụng để chữa bệnh L reuteri ATCC 55730 từ
plasmid pLR581 chứa tetW như mô tả ở trên. Sau quá trình hình thành tế bào trần, một khuẩn
lạc được phát hiện phát triển tốt trên tấm MRS nhưng hoàn toàn không có trên tấm MRS với
lincomycin.
Các plasmid được phân tích bằng PCR (Roos và Rosander 2006). Cả pLR585 và pLR581
đều không có, trong khi hai plasmid khác vẫn được tìm thấy. Kết quả này đã xác nhận rằng
chủng mới đã được chữa khỏi từ cả tetW-plasmid pLR581 và lnuA-plasmid pLR585. Sự
vắng mặt của lnuA cũng được xác nhận bằng PCR.
2.3.2.3. Sự tương đương đáng kể của chủng cha mẹ và cả hai chủng con
Các mẫu tái PCR so sánh chủng bố mẹ (ATCC 55730) và cả hai chủng con đều giống hệt
nhau đối với các mồi đã chọn (Hình 1). cho thấy cả hai chủng con gái đều là biến thể thực sự
của L reuteri ATCC 55730 và không gây ô nhiễm, và việc loại bỏ pLR581 một mình hoặc
pLR581 và pLR585 cùng nhau không ảnh hưởng đến rep-PCR (Roos và Rosander 2006).
 4.4.2.3. Các nghiên cứu ở trẻ sơ sinh
4.4.2.3.1. Các nghiên cứu của BioGaia về L.reuteri ATCC 55730 ở trẻ sơ sinh
Bảng 10 ở cuối phần tóm tắt các nghiên cứu được thảo luận chi tiết hơn ở bên dưới.
Karvonen và cộng sự (2001; chỉ có ở dạng tóm tắt) đã nghiên cứu tính an toàn của L.
reuteri đã nghiên cứu tính an toàn của L reuteri ATCC 55730 ở trẻ sơ sinh được cho uống
105, 107, hoặc 109 cfu/ngày L reuteri trong 20 ml sữa mẹ hoặc sữa công thức trong 30 ngày.
Chín mươi trẻ đủ tháng khỏe mạnh được phân ngẫu nhiên vào một nhóm giả dược (được bú
sữa mẹ hoặc sữa công thức không bổ sung L. reuteri) hoặc một trong ba nhóm thử nghiệm;
nghiên cứu đã bị mù đôi. Các triệu chứng bụng và độ đặc của phân đã được ghi nhận, và
không có tác dụng phụ nào được ghi nhận. Các tác giả kết luận rằng an toàn khi cung cấp L
reuteri ATCC 55730 với liều lên đến 109 cfu/ngày cho trẻ sơ sinh.
Một nghiên cứu ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược đã được Alsheikh và
Weizman (2003; chỉ có ở dạng tóm tắt) để đánh giá tính an toàn của L. reuteri ATCC 55730
và Bifidobacterium lactis Bb12 trong giai đoạn sơ sinh. Tổng số 60 trẻ sơ sinh đủ tháng khỏe
mạnh từ 3-65 ngày tuổi được chỉ định dùng sữa công thức có bổ sung 109 cfu/ngày L. reuteri
hoặc B. lactis hoặc không trong 60 ngày. Các đặc điểm tăng trưởng, cho ăn, phân và hành vi
được theo dõi bằng khám sức khỏe hàng tuần. Không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm
về tăng trưởng (cân nặng, chiều dài, vòng đầu), cho ăn, phân (gắng sức và đầy hơi), hoặc
hành vi (khóc và bồn chồn). Không có tác dụng phụ nào được ghi nhận và các tác giả kết
luận rằng cả hai chế phẩm sinh học đều an toàn về mặt lâm sàng và không ảnh hưởng đến sự
tăng trưởng.
Asli và cộng sự (2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sữa công thức bổ sung hai chủng lợi
khuẩn đối với tỷ lệ bệnh truyền nhiễm cấp tính, tăng trưởng, bú, phân, hành vi và các tác
dụng phụ ở trẻ nhà trẻ. Một thử nghiệm tiền cứu, ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả
dược (chỉ có ở dạng tóm tắt) đã được thực hiện với 194 trẻ đủ tháng khỏe mạnh từ 4-10 tháng
tuổi, được chỉ định nhận 109 cfu/ngày L. reuteri ATCC 55730, Bifidobacterium lactis Bb12,
hoặc giả dược trong 12 tuần. Trẻ sơ sinh được theo dõi ngay từ đầu và ở 4, 8 và 12 tuần bằng
một cuộc khám sức khỏe bao gồm các biện pháp tăng trưởng; một cuộc phỏng vấn qua điện
thoại hàng tuần cũng được sử dụng. Trẻ sơ sinh được cho ăn công thức bổ sung probiotic có
ít cơn sốt hơn và ít bệnh đường tiêu hóa hơn. Tác dụng này rõ ràng hơn với L. reuteri.
Không có ảnh hưởng đáng kể đến bệnh đường hô hấp. Đối với nhóm L. reuteri, số lần đến
gặp bác sĩ ít hơn đáng kể, số ngày vắng mặt tại trung tâm chăm sóc ban ngày ít hơn và ít sử
dụng kháng sinh hơn so với hai nhóm còn lại. Không có sự khác biệt đáng kể nào được ghi
nhận giữa các nhóm về sự tăng trưởng, hoặc các đặc điểm của cách cho ăn, phân và hành vi
(khóc và bồn chồn). Không có tác dụng phụ nào được ghi nhận ở bất kỳ đối tượng nào.
Tiếp theo nghiên cứu trước đó (Karvonen và cộng sự 2001), Karvonen và cộng sự, trong
công trình chưa được xuất bản (Karvonen và cộng sự 2005), đã khám phá thêm về tính an
toàn của L reuteri ATCC 55730 ở trẻ sơ sinh. Họ đã hoàn thành 3 thử nghiệm tiền cứu ngẫu
nhiên, ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược liên tiếp, mỗi thử nghiệm trong 28
ngày, với L. reuteri suppleme "bắt đầu trong vòng 3 ngày đầu tiên sau sinh. Trong thử
nghiệm đầu tiên, 76 trẻ đủ tháng khỏe mạnh được nhận hoặc giả dược (sữa mẹ hoặc sữa công
thức), hoặc L. reuteri 105, 107 hoặc 109 cfu/ngày hòa tan trong sữa mẹ hoặc sữa công thức.
Trong thử nghiệm thứ hai, 35 trẻ sơ sinh đủ tháng khỏe mạnh được uống bột giả dược trong 5
giọt dầu hoặc 108 cfu/ngày L. reuteri trong 5 giọt dầu. Trong thử nghiệm thứ ba, 43 trẻ sinh
non (tuổi thai 31-36 tuần) nhưng nếu không thì trẻ khỏe mạnh nặng 1500-2500 g được dùng
giả dược dầu hoặc L. reuteri 107 hoặc 109 cfu/ngày trong hỗn dịch dầu. Trong cả ba thử
nghiệm, kết quả chính là an toàn, đặc biệt là sự vắng mặt của các phản ứng bất lợi bao gồm
các triệu chứng ở bụng như khó chịu ở dạ dày, đau hoặc chuột rút. Các triệu chứng bụng ở trẻ
đủ tháng được bổ sung giả dược và L. reuteri không khác nhau; Ở nhóm trẻ sinh non nhiều
triệu chứng ở bụng hơn được báo cáo ở nhóm dùng L. reuteri dùng liều thấp so với nhóm
chứng, nhưng điều này không thấy ở nhóm dùng liều cao và không được coi là liên quan đến
việc bổ sung L.reuteri. Bổ sung L. reuteri không dẫn đến mức tổng số lactobacilli cao hơn
đáng kể so với trẻ sơ sinh được điều trị bằng giả dược. Mức tổng số lactobacilli sau 28 ngày
bổ sung L. reuteri là bình thường đối với trẻ sơ sinh không có dấu hiệu phát triển quá mức.
Không có tác dụng phụ nào liên quan đến L. reuteri được quan sát thấy ở bất kỳ trẻ nào được
nghiên cứu ở bất kỳ liều nào và với bất kỳ hệ thống phân phối nào.
Cũng trong năm 2005, Weizman và cộng sự thực hiện một thử nghiệm tiền cứu, ngẫu
nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược để xác định khả năng của L. reuteri ATCC 55730
hoặc B. lactis Bb12 trong việc giảm tỷ lệ nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh khỏe mạnh tại các trung
tâm chăm sóc trẻ em. Tổng số 201 trẻ đủ tháng khỏe mạnh từ 4-10 tháng tuổi (trung bình =
6,8 tháng) ở 14 trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày chỉ được cho uống sữa công thức Mater
Premium (n=60) hoặc với 107 cfu/ml L. reuteri (n=68) hoặc B. lactis (n=73) trong 12 tuần.
Không có sự khác biệt giữa các nhóm về tuổi, cân nặng khi sinh, tuổi thai, giới tính, cho con
bú trước đó, anh chị em, vật nuôi, hút thuốc của cha mẹ hoặc đông đúc. Mỗi người tham gia
đều được khám sức khỏe ban đầu và vào 4, 8 và 12 tuần. Cha mẹ đã hoàn thành bảng câu hỏi
hàng ngày bao gồm cho ăn (số bữa ăn, phản ứng với thức ăn, lượng sữa công thức hàng ngày,
số lần nôn trớ và nôn trớ), hành vi (quấy khóc, thức đêm, bồn chồn) và đặc điểm phân (số lần
đi tiêu, phân, độ đặc của phân, có máu trong phân và khí) và được yêu cầu báo cáo về bất kỳ
triệu chứng nào, bao gồm hô hấp (chảy nước mũi, ho, khó thở), tiêu hóa (phân có nước), các
đợt sốt, vắng mặt, thăm khám phòng khám, kê đơn bất kỳ loại thuốc nào, và các phản ứng
phụ. Nhiệt độ trực tràng cũng được đo hàng ngày. Bất kỳ bệnh nào được báo cáo đều phải
được bác sĩ nhi khoa trong nhóm nghiên cứu kiểm tra hàng ngày. Công thức tiêu thụ đã được
ghi lại; lượng L. reuteri hàng ngày là 1,2x109 cfu/ngày.
Không có sự khác biệt nào về đặc điểm nuôi dưỡng hoặc bệnh đường hô hấp. Các tiêu chí
chính là các cơn sốt và tiêu chảy và thời gian. Trẻ sơ sinh nhận được L reuteri khỏe mạnh
hơn đáng kể trên cả 4 tiêu chí so với nhóm chứng và có ít ngày bị sốt hơn, ít đến phòng khám
hơn và ít kê đơn thuốc kháng sinh hơn. "Tác dụng phụ" được đặc biệt đưa vào như là các
thước đo kết quả. Các tác giả tuyên bố rằng "các tác dụng phụ không được nhận thấy ở bất kỳ
người nào trong số những người tham gia." Không có sự khác biệt về các thông số tăng
trưởng về trọng lượng, chiều dài hoặc chu vi vòng đầu. Các tác giả kết luận rằng, dựa trên sự
an toàn của L reuteri như được chỉ ra trong nghiên cứu khác, sự xuất hiện tự nhiên của
lactobacilli trong ruột người và trong nghiên cứu này không có bất kỳ tác dụng phụ hoặc bất
kỳ ảnh hưởng nào đến tăng trưởng, 1,2x109 cfu/ngày L. reuteri an toàn khi dùng cho trẻ sơ
sinh.
Connolly và cộng sự (2005) đã báo cáo về một thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm, mù
đôi, có đối chứng với giả dược, trong đó 108 CFU L. reuteri ATCC 55730 hoặc giả dược
được tiêm mỗi ngày từ ngày đầu tiên sau sinh cho trẻ sơ sinh có tiền sử gia đình dị ứng.