“Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào

thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết

xuất hoạt chất điều trị ung thư”

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm

Mã số: 62 73 01 01
Họ và tên nghiên cứu sinh: Vũ Bình Dương
Họ và tên Người hướng dẫn:
1. GS.TSKH. Phan Đình Châu
2. TS. Triệu Duy Điệt
Cơ sở đào tạo: Học viện Quân y
 MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………… ….1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3
1.1. CÂY THÔNG ĐỎ .......................................................................................................3
1.1.1. Tên khoa học . ..................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ..........................................................3
1.1.3. Thành phần hóa học .........................................................................5
1.1.4. Tác dụng sinh học.............................................................................9
1.1.5. Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ...........................9
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT ....................................11
1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai .............................11
1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật ..........................................13
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt
chất trong nuôi cấy tế bào thực vật...................................................15
1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư........21
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật ......22
1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong
đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ................................ 28
1.3.4. Các phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ sinh khối tế bào
thông đỏ ............................................................................................29
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.31
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ......................31
2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất .................................................................31
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu.........................................................................31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................32
2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh khối thông đỏ.....................................32
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập một số chất
chính, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ .36
2.2.3. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu ..........................41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................42
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ........42
3.1.1. Tạo callus thông đỏ ........................................................................42
3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch ..............48
3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng ........................................52
3.1.4. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít..............................64
3.1.5. Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ ..............65
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT
PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO
THÔNG ĐỎ............................................................................................................................70
3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong sinh khối tế bào thông đỏ......70
3.2.2. Chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh
khối tế bào thông đỏ .........................................................................81
3.2.3. Chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ.....89
3.2.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu
sinh khối tế bào thông đỏ và hoạt chất .............................................97
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................104
4.1. QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ .......................104
4.1.1. Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ ...................................................104
 4.1.2. Về duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch .......108
4.1.3. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng ....................111
4.1.4. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít..........124
4.1.5. Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ .......................126
4.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN
LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO
THÔNG ĐỎ ........................................................................................................................126
4.2.1. Về nghiên cứu thành phần hóa học ..............................................126
4.2.2. Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh
khối tế bào thông đỏ .......................................................................129
4.2.3. Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ130
4.2.4. Về kết quả xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ .........133
KẾT LUẬN ....................................................................................................135
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................137
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................................................................138
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................139
PHẦN PHỤ LỤC ...........................................................................................155
 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt Chú thích
10-DAB 10-deacetylbaccatin III
2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
ACN Acetonitril
B5 Môi trường Gamborg
BAP 6-Benzyl amino purin
Bu (i) Isobutyl
Bz Benzoyl
CA Caffeic acid
cs Cộng sự
DCM Dichloromethan
DĐVN Dược điển Việt Nam
FA Ferulic acid
FE Fungal elicitor (elicitor từ nấm)
GA Gibberelic acid
HPOL Hydroperoxid lyase
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao
IAA Indole – 3 acetic acid
IBA Indole – 3 butyric acid
JA Jasmonic acid
KL Khối lượng
KLK khối lượng tế bào khô
Kn Kinetin
LQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp
MeOH Methanol
MJ Methyl jasmonic
MS Môi trường Murashige - Skoog
NAA 1-Naphtalen acetic acid
PhL Phenylalanin
PL Phụ lục
PVP Polivinyl pyrrolidon
SA Salicylic acid
SD Độ lệch chuẩn
SH Môi trường Hildebrandt
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SKTB Sinh khối tế bào
Tc Taxuyunnanine C
TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
USP United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ)
Xyl Xylosyl
 DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang

3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn 42
3.2 Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn. 43
3.3 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy 44
3.4 Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 45
3.5 Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 45
3.6 Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển 47
của callus
3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 47
3.8 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 48
3.9 Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 50
3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 51
3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 51
3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 52
3.13 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 53
3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế 55
bào
3.15 Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào 55
thông đỏ
3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào 56
thông đỏ
3.17 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát 57
triển tế bào
3.18 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 57
3.19 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 58
3.20 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào 59
Bảng Tên bảng Trang
3.21 Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm 60
lượng paclitaxel trong tế bào
3.22 Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm 60
lượng paclitaxel trong tế bào
3.23 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ 61
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào
3.24 Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 62
3.25 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 63
3.26 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường 64

3.27 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít 65

3.28 Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel 67

trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ

3.29 Khảo sát điều kiện pha động 71

3.30 Chương trình chạy sắc ký 73

3.31 Độ lặp lại của hệ thống 74

3.32 Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III 75

3.33 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel 76
3.34 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III 76

3.35 Kết quả xác định độ chính xác 77

3.36 Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III 78

3.37 Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử 78

3.38 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ 79

3.39 Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu 81
lá thông đỏ tự nhiên bằng HPLC
3.40 Số liệu phổ 13C-NMR của các các chất 1 – 6 85
Bảng Tên bảng Trang

3.41 Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 1 - 6 86

3.42 Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau 89
3.43 Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM 90
3.44 Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế 91
paclitaxel
3.45 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh 91
chế paclitaxel
3.46 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và 92
hiệu suất tinh chế paclitaxel
3.47 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 93
3.48 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 94
3.49 Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các 95
giai đoạn chiết xuất, tinh chế
3.50 Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 97
3.51 Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 98
3.52 Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông 98
đỏ
3.53 Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế 99
bào thông đỏ
 DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang

1.1 Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4

1.2 Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5
1.3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 14
1.4 Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 19
1.5 Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel 23
2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định 37
tính
3.1 Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 43
3.2 Callus trên các môi trường khác nhau 45
3.3 Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 46
3.4 Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 49
3.5 Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch 49
SH
3.6 Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 53
3.7 Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 54
3.8 Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong 66
Bioreactor
3.9 Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 69
3.10 Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết 70
lỏng -lỏng (a) và lỏng - rắn (b)
3.11 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha 72
động III sử dụng cột Luna L43
3.12 Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) 72
3.13 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b) 74
3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ 75
paclitaxel và baccatin III
Hình Tên hình Trang

3.15 Sắc ký đồ các mẫu phân tích 80

3.16 Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9 89
3.17 Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột 93
3.18 Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel 95
3.19 Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ 96
3.20 Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b) 99
Bảng Tên bảng
Trang
3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn ....................................................42
3.2. Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn...........................................................43
3.3. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy ...................................................44
3.4. Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy ..........................................45
3.5. Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus................................45
3.6. Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus...47
3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus ................................47
3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus ..............................48
3.9. Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH ..............50
3.10. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus .............................51
3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào ..................................51
3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus.........................52
3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào .............53
3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào .......55
3.15. Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ ...55
3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ ... 56
3.17. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát triển tế bào.. 57
3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào...................57
3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào. .......................58
3.20. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào. ................59
3.21. Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng
paclitaxel trong tế bào.................................................................................60
3.22. Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng
paclitaxel trong tế bào .............................................................................................. 60
3.23. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển
tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào...............................................61
3.24. Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát
triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào........................................62
3.25. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose.............................................63
3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường .....................64
3.27. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít ......................................65
3.28. Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel trong
các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ............................................................67
3.29. Khảo sát điều kiện pha động ........................................................................71
3.30. Chương trình chạy sắc ký.............................................................................73
3.31. Độ lặp lại của hệ thống.................................................................................74
3.32. Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III .................75
3.33. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel ..........................76
3.34. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III .......................76
3.35. Kết quả xác định độ chính xác .....................................................................77
3.36. Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III ...............................................78
3.37. Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử ....................................................78
3.38. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ .....................79
3.39. Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá thông
đỏ tự nhiên bằng HPLC ..............................................................................81
3.40. Số liệu phổ 13C-NMR của các các chất 1 – 6...............................................85
3.41. Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 1 - 6.......................................................86
3.42. Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau .......................89
3.43. Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM ......................................................90
3.44. Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế
paclitaxel ...............................................................................................................91
3.45. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh chế
paclitaxel .....................................................................................................91
3.46. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và hiệu
suất tinh chế paclitaxel................................................................................92
3.47. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 ........................................93
3.48. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 ........................................94
3.49. Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các giai đoạn
chiết xuất, tinh chế ......................................................................................95
3.50. Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ .......................................97
3.51. Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ...............................98
3.52. Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ .............98
3.53. Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào
thông đỏ ......................................................................................................99
 1

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1. Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) ............................................................. 4
1.2. Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ....................................... 5
1.3. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật.........................................................14
1.4. Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian............................................19
1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel .....................................................23
2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính ............37
3.1. Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus .........................43
3.2. Callus trên các môi trường khác nhau...........................................................45
3.3. Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian.........................................46
3.4. Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau....................................49
3.5. Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH ...........49
3.6. Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển........................................53
3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy..........................54
3.8. Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong Bioreactor ........66
3.9. Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ ..............................................69
3.10. Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết lỏng -
lỏng (a) và lỏng - rắn (b)............................................................................70
3.11. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha động III
sử dụng cột Luna L43 ................................................................................72
3.12. Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) .......................................72
3.13. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b). .............................................74
3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ paclitaxel
và baccatin III ............................................................................................75
3.15. Sắc ký đồ các mẫu phân tích .......................................................................80
3.16. Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9............................................................89
3.17. Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột ...................................................93
3.18. Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel ......................................................................95
 2

3.19. Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ.............................96

3.20. Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b)..............99
 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ

yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại
các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh
Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ. Từ
lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế
quản, nấc, tiêu hoá...; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc
của thân non dùng trị bệnh đau đầu... Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm
thấy các hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol),
cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung
thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol…. Tuy nhiên,
thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong
cây thấp. Theo tính toán của các nhà khoa học, để điều trị khỏi cho một
bệnh nhân cần sử dụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60
năm tuổi [125]. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ
nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn
đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125].

Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã nhân giống thành công và trồng
rộng rãi thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl
baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Hiện
nay, Bộ Khoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về
nghiên cứu chiết xuất phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ
nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thuốc
điều trị ung thư phục vụ cộng đồng. Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ
sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và
thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125].
 2

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào
trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm
mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các
hoạt chất [46], [53]. Công nghệ sinh khối tế bào có ưu điểm so với việc gieo
trồng ngoài tự nhiên là: thời gian từ khi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn,
không chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, dịch
bệnh, thời vụ; chất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thể
được cải thiện hơn so với trồng ngoài tự nhiên. Công nghệ này rất thích hợp
cho việc sản xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó
tổng hợp bằng con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong
cây tự nhiên. Từ công nghệ sinh khối tế bào thực vật, các nhà khoa học đã
cung cấp cho thị trường những sản phẩm có giá trị phục vụ cho ngành công
nghiệp Dược phẩm và thực phẩm [9], [53].

Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất
paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng
công nghệ sinh khối tế bào thực vật, đề tài: “Nghiên cứu quy trình tạo sinh
khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất
điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu:

1. Xây dựng được qui trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ qui mô phòng
thí nghiệm.
2. Xác định được thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một số chất
chính và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ
tạo ra.
 3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY THÔNG ĐỎ

Cây thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng được phân bố khắp các
vùng ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm. Có nhiều
loài thông đỏ trên thế giới trong đó 8 loài được ghi nhận bao gồm: thông đỏ
Châu Âu (T. baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia); thông đỏ
Canada (T. canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis), thông đỏ Nhật
Bản (T. cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T. floridana); thông đỏ
Mexico (T. globosa) và thông đỏ Himalaya (T. wallichiana) – loài thấy có ở
cao nguyên Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta. Ngoài ra, còn có hai giống lai
được công nhận: Taxus × media = T. baccata × T. cuspidata và Taxus ×
hunnewelliana = T. cuspidata × T. canadensis.
Tại Việt Nam chủ yếu là loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana
Zucc.) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành
phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (hình 1.1). Ngoài ra tại các vùng Sapa – Lào Cai,
Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai
Châu còn có thêm loài thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis) [1]. Trong luận án
này đề cập tới loài thông đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.) mọc ở Đà
Lạt được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu tạo sinh khối tế bào.

1.1.1. Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc., thuộc họ Thông đỏ-Taxaceae.

1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố

Thông đỏ (thông đỏ lá dài, thông đỏ nam, hồng đậu sam) là cây bụi hay
cây thân gỗ nhỏ nhiều cành, lá thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc,
thường vặn xoắn tại gốc lá tạo thành kiểu 2 hàng. Các lá có dạng thẳng hay
hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới. Các loài
phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc. Các nón đực dài
khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân. Các nón cái bị suy giảm
 4

mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt. Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo
hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt. Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm,
nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim ăn và nhờ đó mà hạt được phát
tán khi chim đánh rơi chúng [3].

Photo by: Vu Binh Duong

Hình 1.1. Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

*Nguồn: Tác giả chụp tại Đà Lạt, Lâm Đồng, tháng 5/2008
Tại Việt Nam, thông đỏ phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương,
Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến
1.700 m (hình 1.1). Khu phân bố là các hẻm núi, cạnh khe suối, nơi cây lá
rộng thường chiếm ưu thế, rất ít cây lá kim. Đây là dược liệu có trong sách
đỏ. Hiện nay, do nạn phá rừng bừa bãi nên quần thể thông đỏ tự nhiên hiện
chỉ còn đếm được ở con số hàng trăm cá thể. Mặt khác, vì đặc tính tái sinh
hẹp và thế hệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây
thông đỏ rất cao. Hiện nay, tại Đà Lạt đã có nhiều dự án nghiên cứu nhân
giống thành công bằng công nghệ nuôi cây mô và giâm cành. Kết quả đã phát
triển được hàng chục hecta thông đỏ để thu hái lá dùng trong chiết xuất 10-
DAB và các dẫn chất khác để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Tuy
 5

nhiên, thông đỏ vẫn là những cây đã được đưa vào sách đỏ thế giới và sách đỏ
Việt Nam để lưu ý bảo vệ [3].

1.1.3. Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chủ yếu từ lá, vỏ thân và cành của loài T.
wallichiana đã được nghiên cứu từ hơn một trăm năm nay bao gồm các nhóm
hoạt chất sau: alcaloid hoặc diterpenoid khung taxan, steroid, lignan,
biflavonoid và các dẫn xuất của đường [82], [136].

1.1.3.1. Các hợp chất vòng taxan diterpenoid

Các hợp chất diterpenoid khung taxan (hình 1.2) là thành phần tiêu biểu
quan trọng nhất tạo nên hoạt tính của cây thông đỏ.
18

12
11 10 19
9

13
8 7
1
14
6
2 3
15 4 5
16

17
20

Khung 6-8-6 Khung 5-7-6

O
18 9
18 19 10
10 9 12 11 17
12 11 8 7
17 8
7 13 15 19 6

13 15 3 6 14 1 4 5
16
14 1 4 5
16 2
20
3
2
H
20

Khung 6-10-6 Khung 6-12

Hình 1.2. Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ
* Nguồn: Li C. và cs (2008) [82]

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được trên 50 chất diterpenoid
khung taxan trong loài Taxus wallichiana Zucc. [6]. Trong đó nhiều chất quen
thuộc có trong các loài khác thuộc chi Taxus như: paclitaxel (5), baccatin III
(1), 10-deacetyl baccatin III (3). Khung taxan diterpenoid là một khung gồm 20
 6

carbon, trong đó có 4 loại khung khác nhau gồm: khung 6-8-6, khung 5-7-6,
khung 6-10-6 và khung 6-12. Trong đó, các chất phân lập được đa số thuộc
khung 6-8-6 và 5-7-6.
Trong 4 bộ khung taxan thì các chất thuộc khung taxan 6-8-6 rất đáng
chú ý với nhiều các hoạt chất quan trọng như baccatin III, 10-DAB,
paclitaxel...
R3 O R2 R1

O
R4
AcO
R5 OBz

R1 R2 R3 R4 R5 TLTK
Baccatin III (1) OH H OAc OH OH [145]
19-Hydroxybaccatin III (2) OH OH OAc OH OH [95]
10-Deacetylbaccatin III (3) OH H OH OH OH [145]

Các hợp chất baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 19-hydroxybaccatin

III có nhiều trong lá thông đỏ. Đặc biệt, trong đó 10-deacetyl baccatin III có
hàm lượng khoảng 0,01 - 0,15% là nguồn nguyên liệu quý dùng để bán tổng
hợp paclitaxel và docetaxel [6].
R3 R2 O
NH R1

Ph O

HO O
O

HO OAc
R4

R1 R2 R3 R4 TLTK
10-Deacetyltaxol (4) OH OH OBz OBz [95]
Paclitaxel (taxol) (5) OH OAc OBz OBz [136]
10-deacetyltaxol-7-xylosid (6) O-Xyl OH OBz OBz [82]
7-Xylosyltaxol (7) O-Xyl OAc OBz OBz [123]
7-Xylosyl-10-Deacetyltaxol C (8) O-Xyl OH C5H11 OBz [122]
Cephalomannin (9) OH OAc OBu(i) OBz [118]
10-deacetylcephalomannin (10) OH OH OBu(i) OBz [95]
 7

Trong các hoạt chất tìm thấy tác dụng thì nhóm các chất thuộc bộ
khung 6-8-6 chiếm đa số, điển hình là paclitaxel (5). Paclitaxel được tìm ra
lần đầu tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs [136] trong loài thông đỏ Thái
Bình Dương (T. brevifolia), sau đó được phân lập ở tất cả các loài thông đỏ
khác, trong đó hàm lượng paclitaxel trong loài T.wallichiana khoảng 0,0045 –
0,015% [3].

1.1.3.2. Các chất khác

* Các terpenoid khác

Ngoài các taxan diterpenoid, trong thông đỏ còn có các terpenoid khác
như: rhodoxathin (11), vomifoliol (12), dehydrovomifoliol (13) và
deglycosylicariside B4 (14) [20], [104].
O

O
11

OH O O OH

OH OH

HO O O

12 13 14

* Lignan

Lignan là những hợp chất tiêu biểu của các loài thuộc chi Taxus nói
chung và loài T. wallichiana nói riêng, hầu hết các loài thông đỏ đều chứa các
lignan như: secoisolariciresinol (15), isotaxiresinol (16) và isolariciresinol
(17)… [49]. Trong nghiên cứu in vitro đã cho thấy rằng larciresinol và
isolarciresinol có tác dụng ức chế mạnh yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và
taxiresinol được cho là có tính bảo vệ cao chống lại các tổn thương dạ dày.
 8

O O
O
OH OH OH
OH OH
OH
OH OH OH

O OH O
OH OH OH

15 16 17

* Các biflavonoid
Các hợp chất flavonoid được tìm thấy ở đây chủ yếu trong thông đỏ là
các flavonoid dimeric kiểu amentoflavone như: Ginkgetin (18), sciadopitysin
(19)… [39], [115], [117].
O O
OH O

O O O O
O O
OH HO

OH O OH O
OH O OH O
18 19

* Các steroid
Các hợp chất steroid quen thuộc cũng được phát hiện trong loài T.
wallichiana như: β-sitosterol (20), stigmasterol (21)… mà hoạt tính của các
chất này đã được biết đến[20], [115], [142], [145].

HO HO
20 21

Ngoài ra các đường khử, acid kojic và tanin… đã được phát hiện trong
tất cả các loài thông đỏ [142] nhưng không mang nhiều ý nghĩa và không
được chú ý nghiên cứu nhiều, được xem là các tạp chất cần loại bỏ trong quá
trình phân tách.
 9

1.1.4. Tác dụng sinh học

Cao lá thông đỏ, cho chuột cống trắng cái uống liều 100 và 500 mg/kg,
trong những ngày 1-7 sau khi giao hợp, có tác dụng ức chế sự thụ thai đến
60% và 80% tương ứng [3].
Vỏ cây, lá và hạt thông đỏ có độc tính cao.
Alcaloid taxin từ thông đỏ gây các triệu chứng độc: nôn, tiêu chảy, mê
sảng, có tác dụng ức chế tim làm giảm lực co cơ tim, giảm nhịp tim và phong
bế nhĩ thất do tác dụng ức chế kênh natri và calci [3].
Phân đoạn flavonoid từ lá thông đỏ gồm 3 biflavonoid (sciadopitysin,
gingetin và sequoiaflavon) có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương và
giảm đau mà không gây ngủ.
Đặc biệt paclitaxel phân lập từ cây thông đỏ có tác dụng diệt tế bào ung
thư mạnh với các loại ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày, ruột.

1.1.5. Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ
1.5.1.1. Paclitaxel
Paclitaxel được phân lập lần đầu tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs
[136] từ loài thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia), sau đó chúng được
xác định cấu trúc hóa học và được đưa vào sử dụng đầu tiên trong điều trị ung
thư vào năm 1992 dưới tên biệt dược là Taxol.
* Cơ chế tác dụng chống ung thư của paclitaxel
Paclitaxel ức chế sự phân rã mạng lưới vi thể của thoi nhiễm sắc; nó
kích thích quá trình ghép các dimer của vi ống thành mạng lưới vi thể và ổn
định mạng lưới vi thể bằng cách ngăn chặn quá trình tháo xoắn của chúng.
Tính ổn định này ức chế sự tái tổ chức năng lượng bình thường của mạng lưới
vi thể, một hiện tượng chủ yếu của chức năng sống của tế bào trong kỳ trung
gian của quá trình phân bào, làm cho tế bào không phân chia và nhân lên
được. Ngoài ra, paclitaxel còn gây ra sự hình thành không bình thường các bó
của mạng lưới vi thể trong suốt chu kỳ của tế bào và tổ chức quá trình phân
chia thể sao của mạng lưới vi thể trong quá trình nhân đôi [79], [139].
 10

* Chỉ định [2]

- Điều trị ung thư buồng trứng tiến triển (> 1 cm) sau phẫu thuật. Ngoài
ra còn dùng trong điều trị ung thư buồng trứng đã di căn.
- Điều trị ung thư vú giai đoạn sớm, ung thư vú đã di căn.
- Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở giai đoạn không thể
phẫu thuật hoặc xạ trị. Ngoài ra, paclitaxel còn dùng để điều trị ung thư
Kaposi có liên quan đến bệnh AIDS.
* Chống chỉ định
- Chống chỉ định paclitaxel cho những bệnh nhân đã có phản ứng quá
mẫn cảm nặng với paclitaxel.
- Không được điều trị bằng paclitaxel ở những bệnh nhân có số lượng
bạch cầu trung tính dưới 1.500/mm3.
- Phụ nữ có thai hay cho con bú.
* Liều dùng
Dùng paclitaxel phải theo chỉ định của bác sĩ chuyên khoa điều trị ung
thư. Thông thường bệnh nhân phải điều trị theo phác đồ riêng cho từng loại
ung thư. Thông thường liều dùng là truyền tĩnh mạch 175 mg/m2, sau ít nhất 3
tuần truyền lại.
* Các dạng bào chế
Thuốc tiêm đóng lọ 30 mg/5 ml.
* Biệt dược
Các biệt dược nổi tiếng gồm: Taxol (BMS), Azatax, Abraxane.
1.5.1.2. Docetaxel
Docetaxel là dẫn chất khung taxan có cấu gần giống với paclitaxel
nhưng khả năng hòa tan tốt hơn. Docetaxel là sản phẩm bán tổng hợp từ các
chất khung taxan chiết được tự thông đỏ như baccatin III, 10-DAB và
paclitaxel [125].
 11

Cơ chế tác dụng của docetaxel tương tự như paclitaxel nhưng cường độ
tác dụng tốt hơn, thuốc ức chế sự phân rã mạng lưới vi ống của thoi nhiễm
sắc, đồng thời kích thích sự bó chặt các tubulin thành sợi vi ống bền vững, do
đó ức chế sự gián phân tế bào. In-vitro, docetaxel không ức chế sự tổng hợp
DNA, RNA hoặc protein của tế bào [2].
Docetaxel được chỉ định trong điều trị ung thư vú, ung thư phổi không
tế bào nhỏ, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư dạ dày, ung thư đầu và cổ tử cung.

1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai

1.2.1.1. Một số khái niệm cơ bản

Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào
thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn
mà không cần thâm canh gieo trồng. Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên
được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển
hóa thứ cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ nguyên [9], [73], [111].

Nguyên tắc của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng
(totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật. Khi được đưa vào môi
trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, các tế bào thực vật có thể phát
triển thành một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dòng tế
bào đó. Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo ra cây
từ đỉnh sinh trưởng được tách ra. Sau đó, cây được nhân nhanh tạo ra nhiều
mầm cây con, từ đó có thể kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn
chỉnh. Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây. Sau
đó, biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cùng cũng phát
triển thành một cây mới hoàn chỉnh [57], [112].

Khác với nuôi cấy mô, công nghệ sinh khối tế bào thực vật không nuôi
cấy tạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi các tế bào để tạo ra sinh khối và có thể
sử dụng cho chiết tách các hoạt chất sinh học. Quá trình này cũng bắt đầu từ
 12

việc tạo ra callus từ những mô khác nhau của thực vật. Sau đó, chúng được
làm mất tính biệt hóa và được thuần hóa trong môi trường dinh dưỡng thích
hợp. Cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống bình nuôi cấy (bioreactor).
Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, đặc tính của tế bào được giữ
nguyên như ban đầu. Các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với
tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên, trong đó có việc tổng hợp và tích lũy
hoạt chất [53], [59].

1.2.1.2. Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật
Công nghệ sinh khối tế bào thực vật không chịu tác động của các yếu tố
tự nhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai... do toàn bộ quy
trình tạo sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm hoặc nhà máy.
Điều này giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiên tới
năng suất, chất lượng sản phẩm và loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo
trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất [9], [19].
Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút
ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên. Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến
hành tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trong môi
trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian. Tuy nhiên, sau khi đã lựa chọn
được điều kiện, môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất một mẻ sinh
khối thường khoảng từ 15 - 50 ngày. Như vậy, thời gian đã rút ngắn rất nhiều
so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục
vụ sản xuất [9]. Theo Guilk và cs (2006) trong nghiên cứu xây dựng quy trình
tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid
nhân indole, thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày [56]. Trong khi
sản xuất sinh khối thông đỏ Châu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thích hợp
cho 1 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường lỏng là 28 ngày [107].
Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ sinh khối tế bào thực
vật rất ổn định. Vì các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, thành phần
môi trường, cường độ ánh sáng... đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho tế
 13

bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định. Do đó, sản phẩm thu được có
chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP [7],
[57], [59].
Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá
trình sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng cao hơn so với nuôi trồng
ngoài tự nhiên, nên kỹ thuật này phù hợp với các dược liệu có hàm lượng hoạt
chất thấp hoặc các chất rất khó tổng hợp hóa học được như: taxol, vinblastin,
vincristin, shikonin, reserpin... Nghiên cứu về sinh khối tế bào thông đỏ cho
thấy khi sử dụng các biện pháp kích thích làm tăng hoạt chất thì hàm lượng
hoạt chất cao hơn trong cây tự nhiên từ 10 - 15 lần [148]. Khosroushahi [72]
khi nuôi cấy tế bào thông đỏ đã tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy. Kết
quả hàm lượng paclitaxel đã cải thiện rất nhiều so với ban đầu.
Đối với các dược liệu quí hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá
thành sản xuất sẽ thấp hơn. Vì trong thời gian ngắn có thể tạo ra một khối
lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí cho nuôi cấy thấp [111], [132].
1.2.1.3. Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào, đó là thành
phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ oxy hòa
tan, pH môi trường và đặc điểm cấu tạo của hệ thống bình nuôi cấy). Chi phí
đầu tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật
khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy
(bioreactor) cần phải thiết kế riêng cho phù hợp với từng loại tế bào [109],
[119]. Hàm lượng các hoạt chất trong sinh khối tế bào còn thấp, đặc biệt là
với các tế bào có nhiều nhóm hoạt chất cùng tồn tại thì việc kích thích tăng
riêng rẽ hàm lượng từng nhóm chất rất khó khăn [9]. Những khó khăn trên
đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu khắc phục.
1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật
Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật thường được tiến hành theo năm
giai đoạn kế tiếp nhau [9] (hình 1.3).
 14

* Giai đoạn 1: Tạo callus

Callus là dòng tế bào ban đầu, chưa biệt hóa được tạo ra trong phòng
thí nghiệm, tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương
của cây. Callus được hình thành từ các mô, các tế bào được tách ra từ cơ thể
thực vật nhờ tác động của chất kích thích sinh trưởng. Trong giai đoạn này,
ngoài thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thì kỹ thuật vô khuẩn
được xem là yếu tố quan trọng nhất [9].

* Giai đoạn 2: Duy trì nuôi cấy callus trong môi trường thạch mềm

Việc duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào
thích nghi hoàn toàn với điều kiện sống mới (tách ly hoàn toàn ra khỏi cơ thể
mẹ). Đồng thời, nó làm cho tế bào có hình thái mềm, xốp, có đủ sức sống và
đặc biệt làm mất khả năng biệt hoá thành các cơ quan bộ phận khác. Điều này
tạo thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang môi trường nuôi cấy lỏng.

c
b
a

Hình 1.3. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật
a - Tạo callus; b - Duy trì nuôi cấy callus; c - Nuôi cấy trong môi trường
lỏng; d - Khuếch đại qui mô nuôi cấy; e - Thu hoạch sinh khối.
* Nguồn: Nguyễn Văn Long [7]
* Giai đoạn 3: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng
Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm
lượng hoạt chất của sinh khối. Trong giai đoạn này, phải khảo sát đầy đủ các
 15

yếu tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, nhằm mục
đích cho sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối
cao nhất [7], [116].
* Giai đoạn 4: Nâng cấp quy mô nuôi cấy (scale-up)
Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để
tăng khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các bình
nuôi cấy có thể tích khác nhau tùy theo quy mô. Ở giai đoạn này, các yếu tố về
điều kiện sản xuất như loại bình nuôi cấy, kiểu cánh khuấy, phân áp oxy hòa tan
là những yếu tố cần phải khảo sát. Trong quy trình sản xuất taxol và shikonin,
người ta đã sử dụng các bioreactor 10.000 và 75.000 lít [119], [125].
* Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào
Thu hoạch khối tế bào là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy. Thông
thường, các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào nên phương pháp lọc
lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm. Tuy nhiên, có một số trường hợp
hoạt chất lại được giải phóng ra ngoài môi trường nên việc thu hồi các hoạt
chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém [111]. Các hoạt chất sau khi tách
chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng sinh học và bào chế sản phẩm.

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt
chất trong nuôi cấy tế bào thực vật

1.2.3.1. Môi trường nuôi cấy

* Loại môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường là một trong hai nhóm yếu tố quyết định thành
công của quá trình tạo sinh khối. Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế
bào phát triển. Đồng thời, môi trường cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh
lý, sinh hóa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất. Các nhà
khoa học đã thiết lập được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những
thành phần và tỷ lệ muối vô cơ khác nhau [47]. Môi trường thường được sử
dụng nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS). Bên
cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như B5, Nitsch, White... [46].
 16

* Vai trò của một số yếu tố trong môi trường nuôi cấy
- Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát
triển khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây.
Các đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose... ,
có thể sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong quá trình nuôi cấy [130].
Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển
của tế bào mà còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp. Vì khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy làm tăng áp lực thẩm
thấu và tác động vào tế bào thì nó kích thích làm tăng tổng hợp các phytoalexin
[11], [102]. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào Coleus blumei Benth. cho thấy
khi dùng saccharose 7,5% trong môi trường nuôi cấy, thì hàm lượng hoạt chất
là 3,3 g/l, nếu dùng saccharose 2,5% thì hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94].
Vì vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu hóa loại và nồng độ đường nhằm đảm
bảo cho tế bào phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.

- Hormon thực vật

Hormon thực vật hoặc các chất kích thích sinh trưởng rất cần thiết đối
với các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế
bào. Hormon thực vật thường dùng trong sinh khối gồm 2 nhóm chính:

+ Nhóm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1-

naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric
acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50
µM dùng làm chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào. Đặc biệt,
trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất không thể thiếu nhất là ở
giai đoạn nuôi cấy tạo callus [11], [44], [64].

+ Nhóm cytokinin: gồm kinetin và benzyladenin có vai trò làm tăng

sinh tổng hợp nguyên liệu di truyền, kích thích quá trình sinh trưởng làm cho
tế bào phát triển nhanh hơn. Các chất này thường được sử dụng kết hợp với
nhóm auxin như 2,4-D, NAA. Mỗi loại tế bào thực vật khác nhau yêu cầu
 17

nồng độ hormon thực vật khác nhau cho sự phát triển của tế bào cũng như tạo
các sản phẩm thứ cấp của nó. Việc lựa chọn các chất kích thích sinh trưởng
thích hợp nhất đối với mỗi loại thực vật là một khâu trong quá trình nghiên
cứu tạo sinh khối [44], [119].

Ngoài 2 nhóm trên, các chất khác: acid gilberilic và các ethylen... cũng
có thể được sử dụng để kích thích tăng tổng hợp hoạt chất [67].

- Các biện pháp kích thích làm tăng hàm lượng hoạt chất
Các kỹ thuật phổ biến để tăng tích lũy hoạt chất là: dùng các chất kích
thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) hoặc các tiền chất cho quá trình sinh
tổng hợp hoạt chất, kỹ thuật nuôi cấy 2 pha, nghiệm pháp gen kích hoạt, bất
động tế bào, nuôi cấy 2 giai đoạn... Trong đó, các elicitor chất làm tăng hàm
lượng hoạt chất thường được sử dụng. Elicitor là các chất có bản chất hoá học
khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác dụng kích thích tạo các sản phẩm
chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào
thực vật, trong đó có việc kích thích làm tăng sinh tổng hợp các hoạt chất.
Bình thường, hệ thống tự bảo vệ trong tế bào được khởi động khi có tác nhân
có hại tác động vào tế bào [22], [65].
Những chất có khả năng kích thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi
là các elicitor. Elicitor liên kết với receptor trên màng tế bào. Các tín hiệu của
elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp (kênh ion,
GTP, phân tử oxy hoạt động, inositol 1,4,5 - trisphosphate, các enzym, các chất
trung gian dẫn truyền ...) dẫn đến kết quả cuối cùng kích thích sinh tổng hợp các
sản phẩm chuyển hoá thứ cấp, nhằm bảo vệ tế bào, trong đó có các hoạt chất
sinh học [65]. Elicitor được chia làm 2 loại:
+ Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): gồm các chất (nội sinh hay ngoại
sinh) có nguồn gốc từ các cơ thể sống: thực vật, vi sinh vật, nấm... Elicitor
ngoại sinh (exogenous elicitor) là những thành phần đã có hoạt tính kích thích
tổng hợp hoạt chất. Elicitor nội sinh (endogenous elicitor) là sản phẩm tương
 18

tác của chính các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra. Đây là các chất
kích thích sinh tổng hợp hoạt chất thực sự [102].
+ Elicitor vô sinh (abiotic elicitor): là các chất các yếu tố không có
nguồn gốc từ cơ thể sống gồm các chất hoá học tổng hợp (acid salicylic, acid
benzoic, acid ferulic, acid jasmonic...), các yếu tố vật lý (ánh sáng, tia tử
ngoại, nhiệt độ ...), ion kim loại nặng và những tổn thương cơ học... [102].
Khi tiến hành nghiên cứu sử dụng các elicitor, cần phải lựa chọn được
loại và nồng độ elicitor cũng như thời gian tiếp xúc của từng loại elicitor thích
hợp cho từng loại tế bào.

- Các nguyên tố đa lượng

Bao gồm các loại muối của nitơ, phospho, kali, calci, magnesi và sulfua.
Đây là các nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao. Nếu
cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ để sinh trưởng và phát triển, thì để nuôi
cấy thành công những tế bào chưa biệt hóa, đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn
nitơ và các ion vô cơ như phospho, kali, calci, magne, mangan và sulfua. Trong
đó, nguồn nitơ thường chiếm tỷ lệ cao [85]. Nguồn nitơ được đưa vào dưới
dạng các muối amoni hoặc nitrat như NH4NO3, NaNO3 hoặc kết hợp với các
muối khác như NH4H2PO4 và Ca(NO3)2. Tuy nhiên, việc cân đối giữa tỷ lệ
NH4+ /NO3- rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất có trong
sinh khối tế bào [11]. Theo S. Lui và cs [86] trong sinh khối tế bào sâm Hoa
Kỳ (Panax notoginseng Wall.) hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệ NH4+/NO3-
giảm. Nhưng nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây độc cho tế bào và hàm
lượng saponin lại giảm.

- Các nguyên tố vi lượng

Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, đồng, molybden và coban ở
dạng vi lượng. Các vi khoáng chất là những thành phần không thể thiếu đối với
tế bào thực vật. Các chất này đóng vai trò như là các coenzym tham gia vào các
quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào. Đặc biệt, chúng tham gia vào kích hoạt các
enzym của quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất [86], [99].
 19

- Các phụ gia hữu cơ

Một lượng nhỏ các loại vitamin (myoinositol, thiamin, acid nicotinic,
pyridoxine, riboflavin...) đóng vai trò là các coenzym tham gia các quá trình
chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào. Các
acid amin (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có
thể dùng) và các phụ gia hữu cơ khác (dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein,
nước dừa, một số dịch chiết từ thực vật...) cũng chứa các yếu tố tăng trưởng góp
phần kích thích tế bào phát triển. Vì vậy, chúng được thêm vào môi trường nuôi
cấy, góp phần làm tế bào phát triển tốt hơn [65].

1.2.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

* Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới tốc độ phát triển của tế bào và sinh
tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp. Tốc độ phát triển của các tế bào sinh vật
nói chung và tế bào thực vật trong công nghệ sinh khối nói riêng đều theo một
đường cong phát triển. Đường cong này gồm có 4 pha (hình 1.4) [18].

Khối
lượng
tế bào
(g)

Thời gian (ngày)

Pha thích ghi Pha phát triển Pha dừng Pha ly giải

Hình 1.4. Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian
* Nguồn: theo Alan H.S. (1992) [18]
- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase): tại pha này, các
tế bào thực vật gần như không phát triển, nó đang thích nghi với điều kiện và
môi trường nuôi cấy mới.
 20

- Pha phát triển (exponent phase): ở pha này các tế bào đã trải qua thời
gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm lũy thừa, khối tế bào
phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn. Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy
đủ chất dinh dưỡng, tế bào có thể phát triển tối đa.
- Pha dừng (stationary phase): các tế bào gần như không phát triển và
nhân lên nữa. Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tới hằng định. Trong
pha này, các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp.
Pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao. Vì vậy, cần
phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào, nhằm
kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp [119], [125].
- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase): trong pha này các
tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm. Biểu hiện bên ngoài là thay
đổi màu sắc tế bào và môi trường nuôi cấy, pH môi trường thay đổi. Như vậy,
cần phải xác định điểm kết thúc của quá trình nuôi cấy, đó là thời điểm trước
khi chuyển sang pha ly giải. Khi đó sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất,
hàm lượng hoạt chất cao nhất và không bị lãng phí môi trường [9].
* Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào
thực vật và sự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp. Mỗi loại tế bào thực
vật có một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định. Nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế
bào ngừng phát triển hoặc chết đi, nhiệt độ quá cao sẽ gây chết tế bào. Trong
khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật, thường có một nhiệt độ tối ưu. Tại
nhiệt độ này, sự phát triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa. Tuy nhiên, khác
với vi khuẩn và vi nấm, tế bào thực vật thường thích nghi ở khoảng nhiệt độ
thấp từ 20 - 280C [7], [69].
* pH môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và sinh tổng hợp của
hoạt chất sinh học vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Tuy nhiên, mô thực vật
có khả năng thích nghi lớn với sự thay đổi của pH. Trong môi trường nuôi
 21

cấy, pH có thể được điều chỉnh bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá
môi trường nuôi cấy. pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng
hợp các chất chuyển hoá thứ cấp [32], [55].
* Nồng độ oxy hoà tan
Nhìn chung, sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí đều cần sự có mặt
của oxy. Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử
hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật. Tốc độ
phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy. Trong thực tế, các
tế bào thực vật phát triển tương đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp
cho tế bào không cần cao [37], [119].

1.3. SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL

1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư
Paclitaxel là một trong những loại thuốc chống ung thư thành công nhất
được phát triển trong 50 năm qua. Bình quân mỗi năm doanh số bán hàng trên
toàn thế giới của paclitaxel trên 1,5 tỷ USD - số liệu năm 1999 của Bristol
Myers Squibb (công ty độc quyền nhãn hiệu Taxol). Tuy nhiên nếu như
paclitaxel chỉ được chiết xuất từ các loài thông đỏ thì không thể đáp ứng được
nhu cầu điều trị ung thư cho nhân loại bởi: thông đỏ là loại cây có tốc độ sinh
trưởng chậm, mỗi năm bình quân cây phát triển thêm từ 2-3 cm đường kính,
không những thế hàm lượng hoạt chất trong cây rất thấp (0,001-0,05%). Để
được 1 kg hoạt chất cần 10.000 kg vỏ cây hoặc 3000 cây thông đỏ [125] và
điều trị một bệnh nhân ung thư khỏi bệnh cần chặt hạ khoảng tám cây thông
đỏ 60 tuổi. Ngoài ra, chiết xuất paclitaxel cũng đòi hỏi một hệ thống thiết bị
phức tạp và kỹ thuật tinh chế đặc hiệu sử dụng công nghệ tiên tiến và đắt tiền.
Trong khi việc tổng hợp toàn phần paclitaxel và các chất dẫn chất chỉ mang
giá trị khoa học mà không có giá trị ứng dụng thực tiễn do các hợp chất này
có cấu trúc hoá học phức tạp gồm nhiều loại đồng phân như hình học, quang
học [61]. Cho tới nay mới chỉ nghiên cứu việc bán tổng hợp paclitaxel và
docetaxel từ các chất trung gian như baccatin III hoặc 10-deacetylbaccatin III
 22

chiết xuất trong lá của các loài Taxus. Với những khó khăn trên, việc tạo ra
được nguồn paclitaxel và các dẫn chất tương tự thay thế có tính ổn định, bền
vững và thân thiện với môi trường là rất cần thiết. Công nghệ sinh khối tế bào
thực vật là phương pháp có nhiều lợi thế bởi: công nghệ không phải chịu ảnh
hưởng của thời tiết, mùa hoặc lây nhiễm, thời gian tạo nguồn ngắn, hàm
lượng hoạt chất có thể được cải thiện so với nuôi trồng tự nhiên [130]. Đây là
công nghệ đang được ứng dụng phổ biến trong sản xuất paclitaxel và các dẫn
chất từ tế bào các loài thông đỏ (Taxus sp.).

1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Hiện nay công nghệ sinh khối tế bào thực vật đã áp dụng trong nghiên
cứu và sản xuất paclitaxel từ các loài thông đỏ. Trong nhiều thập kỉ qua, các
nghiên cứu về sinh tổng hợp paclitaxel và các dẫn chất bằng việc nuôi cấy tế
bào các loài thông đỏ đã được tiến hành như T. brevifolia, T. baccata, T.
cuspidata, T. chinensis, T. canadensis, T. yunnanensis, T. x media. Trong đó
điển hình là các nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp hoạt chất cũng như
các biện pháp nhằm cải thiện hàm lượng paclitaxel trong sinh khối như: tối ưu
hóa điều kiện nuôi cấy, sàng lọc các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất
cao, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, các biện pháp kích thích tăng sinh tổng
hợp hoạt chất như sử dụng các chất kích thích sinh hoạt chất và các tiền chất,
cũng như kỹ thuật nuôi hai pha, nuôi cấy hai giai đoạn và kỹ thuật bất động tế
bào [119], [125].

1.3.2.1. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel

Paclitaxel được hình thành chủ yếu từ nguyên liệu ban đầu là các phân
tử geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (hình 1.5).
Việc nghiên cứu tìm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thông
đỏ, góp phần cung cấp các hiểu biết về phản ứng cũng như các enzyme tham
gia phản ứng. Từ đó giúp các nhà khoa học nghiên cứu các biện pháp kích
 23

hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine,
sử dụng elicitor, các chất kích hoạt enzym [41], [125].

Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel

* Nguồn: Sonia M. (2011) [125]
 24

1.3.2.2. Lựa chọn các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất cao

Dòng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng
cũng như sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Đặc biệt, khi nuôi cấy
trong môi trường lỏng, các tế bào có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng hoạt
chất khi nuôi cấy các dòng tế bào khác nhau. Điều này là do có sự khác biệt
về gen dẫn đến sự khác biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất. Vì vậy,
trong quá trình nghiên cứu phải tạo ra được những dòng tế bào phát triển
nhanh có khả năng tạo hoạt chất với hàm lượng cao. Bunakova và cs [30] khi
nghiên cứu nuôi cấy 9 dòng dòng tế bào T. baccata khác nhau thì chỉ có một
dòng cho thấy sự cải thiện sản lượng (23,2 µg/g khối lượng khô). Trong một
nghiên cứu khác của cùng một nhóm, dòng tế bào được Brunakova lựa chọn
và nhân bản vô tính sau 20 tháng kích hoạt tạo callus, hàm lượng paclitaxel
trong tế bào đạt tới 0,0109% [31].

1.3.2.3. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động và ảnh hưởng trực
tiếp tới tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp hoạt chất. Trong
nuôi cấy các loại thông đỏ, 2 môi trường thường được sử dụng là SH và B5.
Tuy nhiên, các thành phần thường được thay đổi để tốc độ phát triển của tế
bào tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất. Các thành phần này thường là:
* Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào, mà
còn ảnh hưởng đến các con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa
thứ cấp. Bởi hydratcarbon trong môi trường tạo ra áp suất thẩm thấu. Khi áp
suất thẩm thấu tăng, tác động vào tế bào, sẽ làm tăng tổng hợp các
phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản phẩm thứ cấp [72],
[97], [60].
* Các hormon thực vật

Hormon thực vật hoặc chất kích thích sinh trưởng là chất rất cần thiết
đối với sự phát triển cũng như biệt hóa của các dòng tế bào, đặc biệt là khi tế
 25

bào đã tách ra khỏi cơ thể ban đầu. Trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ,
thường sử dụng 2 nhóm chất kích thích sinh trưởng chính là auxin (NAA; 2,4-
D; 2,4,5-T, picloram) và cytokinin (kinetin, BAP). Thông thường, 2 nhóm
chất này được sử dụng kết hợp với nhau. Các hormon thực vật được sử dụng
với nồng độ cao ở giai đoạn pha phát triển với mục đích tăng sinh tế bào. Tuy
nhiên, khi chuyển sang môi trường nuôi cấy để sản xuất hoạt chất, thì hàm
lượng các hormon thực vật sử dụng với nồng độ thấp hơn [27], [72].

* Các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)
Chất kích thích tăng hoạt chất đã được sử dụng như một chất quan trọng
trong việc tăng hàm lượng paclitaxel và các dẫn chất trong nuôi cấy tế bào của
các loài thông đỏ. Một số loại elicitor đã được sử dụng như: dịch chiết tế bào của
các loài vi khuẩn (Penicillium minioluteum, Botrytis cinerea, Verticillium
dahlliae, Gilocladium delicquecesens); chitosan glutamate; lichenan; các
polysaccharid phức hợp từ thành tế bào vi khuẩn, các acid ferulic, arachidonic và
benzoic; các elicitor vô sinh như: La+3, V+2, Co+2, Ag+ [119]. Trong đó, acid
jasmonic và dẫn chất (methyl jasmonat, ethyl jasmonat) đã được chứng minh là
một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình dẫn truyền các tín hiệu điều
chỉnh gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hoạt chất [102]. Vì vậy, các chất
này đã được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong việc tăng sinh hoạt chất. Y.
Yukimune và cs [144] thêm 100 µM MJ vào ngày thứ 14 của chu kỳ nuôi cấy tế
bào T. baccata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel tăng từ 0,4 mg/l lên 48,3 mg/l và
baccatin III tăng từ 0,4 mg/l lên 53,6 mg/l so với nhóm chứng. Nghiên cứu của
Wang [135] ở loài T. chinensis cho thấy, khi thêm 100 µM MJ vào ngày thứ 7,
thì sau 14 ngày nuôi cấy, tất cả các hoạt chất đều tăng hơn so với nhóm không
dùng MJ (paclitaxel tăng từ 412 µg/g lên 3,153 µg/g, bacatin III từ 7 µg/g lên 69
µg/g, 10-deacetyl baccatin III từ 203 µg/g lên 456 µg/g).

* Tiền chất (precursor)

Một chiến lược trong việc tăng sinh hoạt chất là sử dụng các tiền chất
trong quá trình nuôi cấy, giúp làm giảm thời gian sinh tổng hợp các hoạt chất.
 26

Tuy nhiên, việc bổ sung tiền chất phải dựa trên hiểu biết về con đường sinh
tổng hợp của hoạt chất đó. Với paclitaxel, quá trình sinh tổng hợp bắt đầu từ
các phân tử isopentenyl diphosphat trải qua nhiều phản ứng trung gian để tạo
ra khung cơ bản taxan (10-deacetyl baccatin III, baccatin III) trước khi phản
ứng với phenylalanin dạng Coenzyme A để tạo ra cấu trúc cơ bản của
paclitaxel (hình 1.5) [125]. Vì vậy, các nhà khoa học đã bổ sung tiền chất
phenylalanin vào môi trường nuôi cấy, nhằm tăng nhanh việc hình thành sản
phẩm paclitaxel. Khi nuôi cấy loài T. baccata, người ta đã bổ sung
phenylalanin kết hợp với sử dụng AgNO3, VSO4, CoCl2 để kích thích tăng
sinh tổng hợp hoạt chất. Kết quả, hàm lượng paclitaxel cao hơn gấp 5-6 lần
(13,75 mg/l) so với nhóm chứng (2,5 mg/l) [72].

1.3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, thường sử dụng các chiến
lược nhằm tăng sinh hoạt chất cho tế bào. Các chiến lược đó bao gồm:

* Nuôi cấy 2 giai đoạn (two stage culture system)

Quá trình phát triển của tế bào trải qua 4 giai đoạn khác nhau: giai đoạn
thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn suy tàn. Trong
đó, giai đoạn phát triển là giai đoạn tế bào tăng sinh nhanh, tạo ra khối lượng
lớn tế bào; còn giai đoạn ổn định diễn ra quá trình sinh tổng hợp hoạt chất. Vì
vậy, hiện nay người ta đã sử dụng hệ thống nuôi cấy 2 giai đoạn, với 2 môi
trường khác nhau cho giai đoạn phát triển và giai đoạn ổn định. Trước hết,
cần tạo được môi trường thuận lợi ở giai đoạn phát triển, để tế bào phát triển
tốt nhất, thu được khối lượng tế bào cao nhất. Khi tế bào chuyển sang giai
đoạn ổn định, sẽ chuyển sang môi trường mới, giúp duy trì và kéo dài giai
đoạn ổn định, nhằm làm cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất được kéo dài
hơn. Ngoài ra, trong giai đoạn này có thể bổ sung các tiền chất và các elicitor
góp phần kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất ở mức cao nhất. Chiến lược
này đã được sử dụng thành công để cải thiện việc sản xuất paclitaxel và
baccatin III khi nuôi cấy các loài thông đỏ trong môi trường lỏng. Khi nuôi
 27

cấy dòng tế bào T. baccata, J. Palazon và cs [108] đã sử dụng môi trường B5

có bổ sung saccharose (0,5%), fructose (0,5%), NAA (2,0 mg/l), BAP (0,1
mg/l) giúp tăng trưởng, sau đó chuyển giao môi trường saccharose 3%,
picloram 2,0 mg/l và kinetin 0,1 mg/l, để tạo thành paclitaxel và baccatin III.
Kết quả, hàm lượng paclitaxel đạt 1,58 mg/l, baccatin III đạt 0,32 mg/l, cao
hơn so với khi sử dụng một loại môi trường.

* Nuôi cấy 2 pha (two phase culture):

Nuôi cấy 2 pha là sử dụng thêm pha không tan trong môi trường nuôi
cấy, nhằm hấp phụ các chất chuyển hóa sinh ra trong quá trình nuôi cấy, mà
các chất này thông thường có tác dụng ức chế ngược quá trình sinh trưởng
cũng như tổng hợp hoạt chất. Hệ thống nuôi cấy 2 pha đã ứng dụng thành
công trong sản xuất sinh khối tế bào thông đỏ. Trong đó, pha thứ 2 có thể
dùng là chất rắn hấp phụ hoặc dung môi không đồng tan với môi trường. Tuy
nhiên, các chất rắn có nhiều ưu điểm hơn và hay được sử dụng hơn. Kwon và
cs [80] đã bổ sung Amberlite XAD không ion (một dạng polymer không tan
trong nước) vào ngày thứ 16 trong chu kỳ nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Kết
quả, hàm lượng paclitaxel thu được tăng lên 40-70%. Ngoài sử dụng chất rắn
hấp phụ, người ta còn sử dụng chất lỏng hữu cơ như dibutyl phthalat,
glycerol, dầu silicon, ether, parafin,… Tuy nhiên, việc bổ sung các chất lỏng
hữu cơ có thể gây độc và làm chết tế bào. Vì vậy, cần phải nghiên cứu đầy đủ
về độc tính, cách sử dụng để thu được hiệu quả tốt nhất.

* Bất động tế bào (Immobilization)

Bất động tế bào là quá trình làm giảm sự chuyển động của tế bào trong
môi trường nuôi cấy. Khi bất động tế bào sẽ làm mật độ tế bào cao hơn, khả
năng tiếp xúc tế bào – tế bào tăng, bảo vệ được tế bào dưới chuyển động của
dòng môi trường khi khuấy trộn và ngăn ngừa rửa trôi tế bào trong khi vận
hành liên tục. Với những ưu điểm này, bất động tế bào đã làm tăng quá trình
sinh tổng hợp hoạt chất, tế bào phát triển tốt hơn [29]. Để tạo ra sự bất động tế
bào, người ta sử dụng các chất tạo gel khác nhau như alginat, carrageenan,
 28

polyacrylamid, agarose, polyurethan,… Trong nuôi cấy tế bào T. baccata,

Bentebibel và cs [23] đã sử dụng calci alginat để làm bất động các tế bào
trong sản xuất paclitaxel và baccatin III. Kết quả cho thấy, sự bất động tế bào
đã nâng cao hàm lượng hoạt chất từ 2-3 lần so với nuôi cấy tế bào không làm
bất động. Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào loại chất cũng như nồng
độ chất tạo gel cho vào môi trường nuôi cấy. Khi sử dụng alginat ở các nồng
độ 1,5%, 2% và 2,5% thì hàm lượng paclitaxel lần lượt đạt là 13,20 mg/l,
10,85 mg/l và 11,90 mg/l; còn hàm lượng baccatin III đạt tối đa 4,62 mg/l khi
sử dụng alginat 2,5%.

Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy tế bào còn phải khảo sát ảnh hưởng
của các yếu tố khác như nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ khí hòa tan, thời gian một
chu kỳ nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy cũng như các biện pháp kích hoạt
gen để tăng sinh tổng hợp hoạt chất.

1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong
đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ

Để đánh giá chất lượng của sinh khối tế bào thông đỏ cũng hiệu quả
của các khảo sát lựa chọn quy trình sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus sp.), cần
phải xây dựng các phương pháp định lượng các hoạt chất chính trong sinh
khối tế bào thông đỏ như paclitaxel, baccatin III, 10-DAP, cephalomanin…
Hiện nay phương pháp phân tích đồng thời các hoạt chất trong thông đỏ
thường sử dụng HPLC. Trong đó, đáng chú ý phải sử dụng cột chuyên dụng
cho phân tích thông đỏ như: Curosil - PFP (250×4,6 mm; 5 µm); Kromasil
C18 (250×4,6 mm; 5 µm); Phenyl Dynamax 60A0 (250×4,6 mm; 8 µm); Cột
Luna L43 (250 x 4,6 mm; 5 µm)…[14], [81]. Ngoài ra, dectector PDA cũng
thường được sử dụng nhằm tăng giới hạn phát hiện, đồng hợp hạn chế các
nhầm lẫn cho chồng píc. Trong nghiên cứu phải xây dựng phương pháp định
lượng các hoạt chất trong sinh khối thông đỏ để tìm ra các điều kiện thích hợp
cho từng loại mẫu cụ thể như: cách thức xử lý mẫu, điều kiện pha động, cột.
Ngoài ra, phương pháp phải được thẩm định độ chính xác, độ đúng, độ ổn
 29

định… Trong nuôi cấy loài thông đỏ Trung Quốc, Yan [138] đã sử dụng cột
Kromasil C18 (250×4,6 mm; 5 µm), detector PDA mảng diod, với hệ pha động
CH3OH-H2O (65:35, tt/tt) để định lượng paclitaxel, baccatin III và
cephalomanlin trong sinh khối. Một số nghiên cứu khác sử dụng cột chiết pha
rắn để loại tạp chất trong mẫu trước khi định lượng [25]. Pha động hay sử
dụng để định lượng paclitaxel và các dẫn chất taxan thường là hỗn hợp
MeOH, ACN và nước cất với chế độ gradient [54].

1.3.4. Các phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ sinh khối tế bào
thông đỏ

Việc chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ thường gặp
nhiều khó khăn do trong thành phần hóa học có chứa nhiều chất có cấu trúc
hóa học gần giống nhau. Vì vậy, để tinh chế đạt tiêu chuẩn dược dụng (>97%)
phải sử dụng các phương pháp tinh chế đắt tiền như: sắc ký cột, sắc ký điều
chế, do đó tốn thời gian cũng như dung môi hóa chất và hiệu suất thu được
thấp [75]. Cho đến nay đã có nhiều tác giả đã nghiên cứu đưa ra các phương
pháp đơn giản, ít tốn kém hơn để tinh chế paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế
bào [43], [62], [66], [113].
Thông thường paclitaxel được chiết xuất trong sinh khối bằng các dung
môi hữu cơ như: methanol, hexan, cloroform, aceton… trong đó methanol tỏ
ra là dung môi có hiệu quả nhất (hiệu suất >95%, hàm lượng paclitaxel đạt
0,5%). Sau khi thu được dịch chiết thô tiến hành giai đoạn tinh chế sơ bộ bằng
nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có xử lý hấp phụ bằng than hoạt tính,
đất sét hoạt tính. Đặc biệt, nghiên cứu tinh chế dựa vào nguyên lý kết tinh
phân đoạn và kết tủa dựa vào sự thay đổi độ tan của paclitaxel trong các dung
môi khác nhau. Các tác giả đã đề ra được phương pháp tinh chế mới đơn giản
hơn và độ tinh khiết thu được của sản phẩm đã được cải thiện đáng kể. Kim
và cs [75] nghiên cứu về phương pháp tinh chế paclitaxel từ sinh khối, bằng
cách xử lý dịch chiết xuất với các chất hấp phụ khác nhau và sử dụng 2 hỗn
hợp dung môi ở 2 giai đoạn kết tủa khác nhau. Kết quả đã lựa chọn được chất
 30

hấp phụ tối ưu là đất sét hoạt tính với tỷ lệ là 50% (kl/kl) ở nhiệt độ 400C, lựa
chọn được hỗn hợp dung môi DCM : n-hexan cho giai đoạn kết tủa 1 với hiệu
suất thu được >95% và độ tinh khiết của sản phẩm >25%. Ở kết tủa giai đoạn
2 hỗn hợp dung môi MeOH : H2O cho sản phẩm có độ tinh khiết >65% và
hiệu suất là >85%. Ngoài ra nhiều tác giả cũng nghiên cứu các điều kiện ảnh
hưởng tới quá trình tinh chế bằng hỗn hợp dung môi, kết tinh phân đoạn như:
nhiệt độ kết tinh, thời gian kết tinh, pH dung môi, điều kiện khuấy trộn…
[43], [62], [63], [66].
Một phương pháp khác trong nghiên cứu tinh chế paclitaxel là sử dụng
chất tạo mixen gắn hoạt chất vào phần giữa của cấu trúc mixen, sau đó chiết
paclitaxel ra khỏi mixen bằng dung môi hữu cơ và thực hiện tiếp giai đoạn kết
tủa bằng hỗn hợp dung môi. Kim và cs [74] đã sử dụng phương pháp tinh chế
ban đầu paclitaxel bằng tạo ra mixen sau đó tiếp tục tinh chế bằng kết tủa
phân đoạn. Kết quả nghiên cho thấy chiết paclitaxel từ sinh khối bằng dung
môi MeOH, sau 4 lần cho hiệu suất là 99%. Khi chuyển dịch chiết paclitaxel
thô vào chất lỏng N-cetylpyridin chlorid (chất tạo mixen), sau đó chiết với
MtBE (methyl t-butyl ether), dịch chiết sẽ được kết tủa với hexan thì hiệu suất
thu được là 80% với độ tinh khiết của paclitaxel đạt 65,8%.
Như vậy có thể thấy rằng quá trình chiết xuất phân lập paclitaxel từ
sinh khối tế bào thông đỏ đã được nghiên cứu rất nhiều, trong đó đặc biệt chú
ý đến các điều kiện của giai đoạn tinh chế nhằm làm tăng độ tinh khiết của
sản phẩm trước khi sử dụng các biện pháp tinh chế đặc biệt khác như HPLC,
sắc ký cột... để thu được paclitaxel đạt tiêu chuẩn dược dụng.
 31

CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất
- Mẫu cành non cây thông đỏ 10 tuổi (Taxus wallichiana Zucc.) thu
thập tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng 4 năm 2008. Được Viện Sinh thái tài
nguyên sinh vật -Viện khoa học công nghệ VN thẩm định (xem phụ lục 1).
- Các hóa chất dùng để pha chế môi trường nuôi cấy của hãng Sigma
đạt tiêu chuẩn cho nuôi cấy tế bào thực vật. Các chất chuẩn paclitaxel
(99,98%), baccatin III (99,78%), acid 1-naphtalen acetic (99,95%), 6-benzyl
amino purin (99,81%) của Sigma.
- Các hoá chất dùng trong chiết xuất, phân lập, phân tích kiểm nghiệm
của Merck.
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn vô khuẩn dùng cho nuôi cấy
tế bào của Học viện Quân y.
- Tủ nuôi cấy vi sinh, model LHC – 4A1 (hãng Esco – Singapo).
- Hệ thống máy lắc, model: ISF-4-W (Hãng Kuhner – Thụy Sĩ).
- Tủ tạo không khí sạch -Lamine (Narie – Đức).
- Máy hấp tiệt trùng Hirayama – model HV-110 (Nhật).
- Máy sắc ký lỏng hịêu năng cao detector PDA - UV 2 kênh
Gradient(Waters): 2695D, buồng gia nhiệt, hệ thống bơm mẫu tự động.
- Máy lắc siêu âm (Soniclean 500 UT).
- Máy cất nước 2 lần Hamilton WSC 14D (Đức).
- Máy ly tâm tốc độ 30.000 vòng/phút (Universal 320) (Đức).
- Máy cất quay chân không Tokyo Rikakikai model N-100 (Nhật)
- Tủ ấm 37oC (Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh tốc độ 20.000 vòng/phút, model MikRo 22R (Hettich,
Đức).
 32

- Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt Memmert GmbH + Co.KG D-91126

Schwabach FRG (Đức).
- Máy Fraction collector DC-1200 (Nhật).
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Boetus-HMK (Đức).
- Máy đo năng suất quay cực JASCO DIP-370 (Nhật).
- Máy quang phổ UV Speccord 40 (Đức).
- Máy quang phổ IR Hitachi-730-30 (Nhật).
- Máy đo phổ khối LC-MSD Agilent 6310 Ion Trap (Mỹ).
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 (Đức).
- Sắc ký cột: chất nhồi cột loại pha thuận là silica gel cỡ hạt 70–230
mesh (40-63 μm) và 230–400 mesh (63 – 200 μm) (Merck); chất nhồi cột loại
pha đảo là YMC RP-18 resin cỡ hạt 30–50 μm (Fuji Silysia Chemical Ltd.).
- Cân phân tích Satorius độ chính xác 0,1g và 0,01 mg (Đức).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh khối thông đỏ

Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ được tiến hành theo các nguyên
tắc của Enaksha, Parc, Cusido [42], [48], [120]. Cành non thông đỏ được xử
lý tiệt khuẩn, cắt thành lát nhỏ, cấy vào môi trường thạch để tạo callus. Sau
khi tạo thành, callus sẽ được duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch. Quá
trình nuôi cấy tạo và duy trì callus trong môi trường thạch cần phải xác định
được môi trường, thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ chất kích thích sinh trưởng
phù hợp. Sau đó, cấy chuyển tế bào sang môi trường lỏng có sử dụng máy lắc.
Ở giai đoạn này, cần xác định thời gian, pH, nhiệt độ, chất kích thích sinh
trưởng phù hợp cho sinh khối thông đỏ phát triển. Đồng thời, cần xác định
được loại, nồng độ, thời điểm cho tiếp xúc, thời gian tiếp xúc với chất kích
thích làm tăng hoạt chất. Sau khi đã xác định được môi trường và điều kiện
nuôi cấy tốt nhất, phát triển qui mô nuôi cấy lên hệ thống bình nuôi cấy với
các điều kiện như trong môi trường lỏng. Thu hoạch sinh khối nghiên cứu
 33

thành phần hóa học, chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hoạt chất, xây
dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu và hoạt chất.

2.2.1.1. Nuôi cấy tạo callus thông đỏ

Nuôi cấy callus thông đỏ được tiến hành theo phương pháp của
Enaksha và cs [48] gồm các bước cơ bản sau:
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
- Vô trùng mẫu cấy.
- Tách các mô ra khỏi mẫu cấy.
- Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy khảo sát.
- Nuôi cấy trong môi trường thạch ở điều kiện vô khuẩn và không có
ánh sáng.
Đánh giá: khảo sát khả năng tạo callus trên các môi trường khác nhau
dựa trên các chỉ tiêu:
+ Hình thái của callus: tế bào phát triển đều, sáng màu, không bị nhiễm
nấm mốc.
+ Khối lượng callus khô.
Để xây dựng quy trình nuôi cấy tạo callus thông đỏ, khảo sát các thông
số sau:
- Khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn mẫu tự nhiên
- Khảo sát thời gian tiệt khuẩn mẫu
- Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy tạo callus thông đỏ
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
- Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng

2.2.1.2. Duy trì nuôi cấy callus trong môi trường thạch.
Callus sau khi tạo được trong môi trường thích hợp, tiến hành cấy
chuyển trong môi trường thạch nhằm mục đích cho tế bào phát triển nhanh,
thích nghi với môi trường, đồng thời hạn chế quá trình biệt hóa của tế bào mô,
các tổ chức [48], [52]. Các bước tiến hành gồm:
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
 34

- Cấy callus vào trong môi trường.

- Nuôi cấy trong điều kiện vô khuẩn, không ánh sáng ở nhiệt độ thích
hợp. Sau từng khoảng thời gian nhất định lấy mẫu ra kiểm tra và đánh giá
theo các chỉ tiêu.
* Các chỉ tiêu đánh giá: Hình thức tế bào, khối lượng tế bào khô, tỷ lệ
tăng trưởng (là tỷ lệ giữa khối lượng (g) tế bào khô thu hoạch trên khối lượng
(g) tế bào đưa vào nuôi cấy ban đầu).
Trong giai đoạn này, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát
triển của callus và khả năng biệt hóa [38], [90], [102] bao gồm:
- Đánh giá sự thích nghi của callus thông đỏ trong môi trường thạch
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
- Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

2.2.1.3. Nghiên cứu nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng
Nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng dựa theo
phương pháp mô tả của Khosroushahi và Yan [72], [138].
- Chuẩn bị môi trường lỏng để nuôi cấy
- Cấy tế bào vào môi trường lỏng với tỷ lệ nhất định.
- Nuôi trong điều kiện vô khuẩn, không có ánh sáng.
- Sau khoảng thời gian nuôi cấy, tiến hành thu hoạch tế bào, rửa sạch,
sấy khô, đánh giá các chỉ tiêu.
* Các chỉ tiêu đánh giá: khối lượng tế bào thông đỏ khô (sấy khô tế bào
thông đỏ ở 450C đến khối lượng không đổi). Qui đổi số gam tế bào khô trong 1
lít môi trường (g/l); tỷ lệ sinh trưởng (khối lượng tế bào khô thu được sau khi
nuôi cấy so với khối lượng tế bào cho vào ban đầu).
Trong giai đoạn này, khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ
phát triển cũng như hàm lượng hoạt chất trong tế bào:
- Đánh giá khả năng thích nghi của tế bào thông đỏ trong môi trường
lỏng
 35

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của tế
bào trong môi trường lỏng
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy đến sự phát triển của tế bào
thông đỏ trong môi trường lỏng
- Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển
khối tế bào thông đỏ
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển tế bào thông đỏ

- Khảo sát lựa chọn chất kích thích sinh trưởng thích hợp để nuôi cấy tế
bào thông đỏ trong môi trường lỏng: lựa chọn loại chất kích thích sinh trưởng;
lựa chọn nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp

2.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất
trong nuôi cấy tế bào thông đỏ

Khảo sát các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) trong
nuôi cấy tế bào thông đỏ được tiến hành theo phương pháp của Luo và Moon
[90], [97].
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Cấy tế bào vào môi trường, nuôi cấy trong điều kiện xác định
- Bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy ở thời điểm nhất định, tiếp
tục nuôi cấy
- Sau khoảng thời gian nuôi cấy, tiến hành thu hoạch tế bào, rửa sạch,
sấy khô, đánh giá các chỉ tiêu:
- Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng tế bào khô (g/l) và hàm lượng hoạt chất
chính paclitaxel trong tế bào.
- Định lượng paclitaxel trong sinh khối bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (phương pháp định lượng đã được nghiên cứu xây
dựng và thẩm định, sẽ trình bày ở phần sau của luận án)
Trong quá trình nghiên cứu, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel [50], [72], [91], [146] gồm:
- Khảo sát lựa chọn chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất
 36

- Khảo sát lựa chọn nồng độ chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất
trong sinh khối tế bào thông đỏ
- Khảo sát thời điểm cho tế bào thông đỏ tiếp xúc với elicitor
- Khảo sát lựa chọn thời gian cho tế bào tiếp xúc với elicitor

- Khảo sát kết hợp bổ sung đường vào giữa chu kỳ nuôi cấy với elicitor

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung giữa chu kỳ nuôi cấy.

2.2.1.5. Nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít

Sau khi đã khảo sát lựa chọn được các điều kiện nuôi cấy, cũng như
thành phần môi trường cho nuôi cấy tế bào thông đỏ, tiến hành cấy chuyển
các tế bào từ các bình nón trên máy lắc như trên sang hệ thống bình nuôi cấy
5 lít [141]. Sau thời gian nuôi cấy xác định, bổ sung thêm đường và elicitor
thích hợp. Khi kết thúc chu kỳ nuôi cấy, thu hoạch tế bào. Xác định khối
lượng tế bào, tỷ lệ tăng trưởng và hàm lượng paclitaxel trong tế bào và ngoài
môi trường.

2.2.1.6. Thu hoạch sinh khối thông đỏ

Thu hoạch hỗn hợp gồm tế bào và môi trường, lọc qua giấy lọc, thu lấy
sinh khối. Sinh khối được rửa sạch với nước cất. Sau đó, sinh khối được sấy
khô tới khối lượng không đổi [7]. Xác định hàm lượng paclitaxel và các chất
kích thích sinh trưởng tồn dư (NAA và BAP) trong các mẫu bằng HPLC [4],
[88], [129], đóng túi bảo quản.

2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập một số chất
chính, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ

2.2.2.1. Nghiên cứu định tính và định lượng hoạt chất trong sinh khối tế
bào thông đỏ
* Định tính các nhóm hợp chất trong sinh khối
- Định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng:
 37

Tiến hành bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo quy trình về
phương pháp nghiên cứu cây thuốc [15] được mô tả theo sơ đồ hình 2.1.
Các dung dịch chiết xuất được sử dụng để làm các phản ứng gồm:
Dung dịch A: chia làm 3 phần:
Phần 1: Thêm dd KOH ÖXuất hiện màu đỏ Ö Có anthraquinon
Phần 2: Thêm HCl + Mg Ö Xuất hiện màu đỏ ÖCó flavonoid
Phần 3: Bốc hơi ÖCó cặn mỡ béo Ö Có acid béo

Bột dược liệu

+ Ether

Dịch chiết ether Bã dược liệu

+ KOH 10% + Alcol 900

Dd kiềm Dịch chiết ether Dịch chiết alcol Bã dược liệu

Acid hoá (Dung dịch D)

+ H2SO4 0,2% + HCl 1%, t0s
Lọc thu tủa
Hoà tan trong alcol Rửa bằng nước

Dd alcol Dd H2SO4 0,2% Dịch chiết ether Dịch chiết acid Bã dược liệu

(Dung dịch A) (Dung dịch B) (Dung dịch C) (Dung dịch E)

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính

Dung dịch B: chia làm 5 phần, thử với thuốc thử chung của alcaloid
+ Phần 1: Phản ứng với thuốc thử Mayer
+ Phần 2: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
+ Phần 3: Phản ứng với thuốc thử Bertrand
+ Phần 4: Phản ứng với thuốc thử acid picric bão hoà.
+ Phần 5: Phản ứng với thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch C: chia làm 3 phần, cô cạn:
+ Phần 1: Thêm dd H2SO4 Ö Xuất hiện màu xanh da trời Ö Có caroten
 38

+ Phần 2: Làm phản ứng Libermann Ö Xuất hiện màu tím đỏ Ö Có

phytosterol
+ Phần 3: Cô bốc hơi Ö Có mùi thơm Ö Có tinh dầu
Dung dịch D chia làm 5 phần :
+ Phần D1: Thêm 4 lần thể tích nước, kiềm hoá (dd KOH 10%), lọc thu
cắn dịch lọc để riêng.
Cắn: Làm phản ứng Libermann Ö vòng tròn màu xanh lục Ö Có sterol
Dịch lọc: acid hoá bằng dd HCl Ö Xuất hiện tủa. Hoà tan tủa trong
alcol . Chia dung dịch làm 2 phần .
9 Phần 1: Thêm dd KOH Ö Xuất hiện màu đỏ Ö Có anthraquinon
9 Phần 2: Thêm HCl + Mg Ö Xuất hiện màu đỏ Ö Có flavonoid
+ Phần D2: Acid hoá bằng H2SO4 2% sau đó làm phản ứng với các thuốc thử
chung của antranoid.
+ Phần D3: thêm đồng thể tích nước , sau đó chia làm 2 phần:
Phần 1: Thêm natri acetat (tinh thể) + dd FeCl3 Ö Xuất hiện màu xanh
đen Ö Có tannin
Phần 2: Thêm Na2CO3 (tinh thể) Ö Sủi bọt Ö Có acid hữu cơ
+ Phần D4: Cô cạn, thêm thuốc thử Fehling Ö Xuất hiện tủa màu đỏ gạch Ö
Có đường khử
+ Phần D5 thêm 6 lần thể tích nước, chia 2 phần:
Phần 1: Thêm acid Ö Xuất hiện màu đỏ .
Ö Có anthocyanidin
Phần 2: Thêm kiềm Ö Xuất hiện màu xanh
Dung dịch E: chia làm 3 phần :
Phần 1: Kiềm hóa (NH4OH loãng), lắc với ete, dịch chiết ete lắc với
H2SO4 2%. Sau đó làm phản ứng với thuốc thử alcaloid
Phần 2: Làm phản ứng với thuốc thử Fehling Ö Xuất hiện kết tủa đỏ
gạch Ö Có đường khử
Phần 3: thêm Natri acetat (tinh thể) + FeCl3 Ö Xuất hiện màu xanh đen
Ö Có tanin
 39

- Định tính paclitaxel và baccatin III bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, có
so sánh kết quả với các chất chuẩn paclitaxel và baccatin III. Song song làm
với mẫu thông đỏ tự nhiên.
* Định lượng các hoạt chất trong sinh khối tế bào
Trong sinh khối thông đỏ có nhiều các taxan. Tuy nhiên, trong luận án
này nghiên cứu phương pháp định lượng paclitaxel và baccatin III là những
hoạt chất chính có ý nghĩa trong nghiên cứu định lượng, xây dựng TCCS,
chiết xuất cũng như sử dụng vào việc khảo sát quy trình nuôi cấy.
- Xây dựng phương pháp định lượng paclitaxel và baccatin III
Tiến hành xây dựng phương pháp định lượng paclitaxel và baccatin III
bằng HPLC [21], [83], với các điều kiện sau:
+ Detector PDA 228 nm.
+ Pha động : ACN – Nước (gradient).
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.
+ Cột C18 (Phenyl Dynamax và Curosil – PFP).
Trong quá trình xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng tiến
hành khảo sát các yếu tố: phương pháp chiết, cột, độ đặc hiệu và tính tương
thích của phương pháp, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ ổn định.
- Định tính và định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế
bào thông đỏ bằng phương pháp HPLC xây dựng được.

2.2.2.2. Nghiên cứu chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính
trong sinh khối
* Chiết xuất, phân lập
Sinh khối thông đỏ khô được xay nhỏ và chiết với methanol [75] bằng
thiết bị chiết siêu âm. Dịch methanol của các lần chiết gộp lại, lọc và cất loại
dung môi thu được cắn dịch methanol. Cắn này được hòa vào nước và chiết
phân đoạn lần lượt với các dung môi n-hexan, ethyl acetat và n-butanol, cất
loại dung môi thu được các cắn tương ứng. Các cắn được tiến hành phân tách
 40

thô bằng sắc ký cột pha thuận (chất hấp phụ là silica gel) và các phân đoạn
được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo (chất hấp phụ là YMC RP-18).
* Xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được xác định dựa vào các số
liệu phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (ESI-MS), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR: 1H, 13C-NMR, các phổ DEPT
90, DEPT 135) và hai chiều (2D NMR: HSQC, HMBC, COSY và NOESY),
so sánh, đối chiếu với số liệu đã công bố trong các tài liệu tham khảo.

2.2.2.3. Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ sinh khối tế bào thông đỏ

Chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ được tiến hành theo
phương pháp chiết bằng siêu âm [75]. Khi đã được dịch chiết tiến hành tinh
chế qua 2 giai đoạn: giai đoạn tinh chế bằng thay đổi dung môi hòa tan [71],
[100], tiếp đó là tinh chế bằng sắc ký cột [120]. Cách tiến hành như sau:
* Chiết xuất paclitaxel
- Chiết giai đoạn 1: Khối tế bào được chiết nhiều lần bằng siêu âm với
các dung môi theo tỷ lệ nhất định, sau đó được lọc chân không thu dịch chiết.
Gộp các dịch chiết, cô dưới áp suất giảm đến thể tích dịch chiết còn khoảng
30% ban đầu. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất, số lần chiết để được
hiệu suất cao nhất, thời gian chiết ngắn.
- Chiết giai đoạn 2: Dịch chiết cô đặc ở giai đoạn 1 được chiết với dung
môi DCM. Chiết lặp lại ít nhất 3 lần, dịch chiết thô được gộp lại và cô dưới áp
suất giảm thu được cặn.
* Tinh chế sơ bộ paclitaxel
- Xử lý hấp phụ dịch thô: Cặn thu được ở giai đoạn 2 được hòa tan
trong dung môi nhất định, loại tạp bằng than hoạt. Dịch chiết đã loại tạp và
dịch rửa than hoạt được cô dưới áp suất giảm tới tới cặn. Khảo sát tỷ lệ than
hoạt xử lý hấp phụ.
- Kết tủa giai đoạn 1: Cặn được hòa tan lại trong DCM, thêm từ từ n-
hexan vào, khuấy đều để yên cho kết tủa. Lọc lấy kết tủa sấy khô. Khảo sát
 41

ảnh hưởng của hỗn hợp dung môi tới hiệu suất và hàm lượng paclitaxel thu
được.
* Tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột
- Tủa thu được ở giai đoạn trên được hòa tan trong một lượng tối thiểu
dung môi chạy cột, sau đó cho chạy qua cột với các điều kiện thích hợp.
- Từ sắc ký, gộp các phân đoạn chứa paclitaxel, cô bớt dung môi, kết tinh
lại paclitaxel bằng dung môi thích hợp. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC.
- Để đánh giá hiệu quả của mỗi giai đoạn trong quá trình chiết xuất dựa
vào các chỉ tiêu sau:
+ Hiệu suất chiết của từng giai đoạn: là lượng paclitaxel chiết được trong
sản phẩm so với lượng paclitaxel trong nguyên liệu ban đầu đưa vào chiết của
giai đoạn đó.
+ Hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được: là % paclitaxel chiết
được so với khối lượng thu được ở mỗi giai đoạn chiết xuất hoặc tinh chế.

2.2.2.4. Phương pháp xây dựng TCCS của Thông đỏ sinh khối
Xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ theo phương pháp của
DĐVN IV [1] và Dược điển Mỹ 30 [130] với các chỉ tiêu sau:
- Hình thức: kiểm tra bằng cảm quan
- Độ ẩm: Theo quy định của DĐVN IV, PL - 12.16.
- Tro toàn phần: Theo quy định của DĐVN IV, PL – 9.8.
- Tro không tan trong acid: Theo quy định của DĐVN IV, PL – 9.7.
- Định tính: paclitaxel và baccatin III bằng HPLC.
- Định lượng paclitaxel và baccatin III theo phương pháp đã xác định ở
mục 2.2.2.1.

2.2.2.5. Kiểm nghiệm chất lượng paclitaxel

- Tiến hành định lượng paclitaxel theo phương pháp trong chuyên luận
paclitaxel trong USP 30.

2.2.3. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu

- Kết quả nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel.
 42

CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.1.1. Tạo callus thông đỏ
3.1.1.1. Lựa chọn chất sát khuẩn mẫu cấy
Chuẩn bị môi trường SH để nuôi cấy. Mẫu cấy sau khi thu hái được rửa
sạch bằng nước, ngâm trong nước xà phòng khoảng 10 phút, rửa sạch lại bằng
nước cất. Tiệt khuẩn bằng các chất sát khuẩn khác nhau: dung dịch NaClO
1%, dung dịch H2O2 30% và dung dịch HgCl2 0,07%, sử dụng riêng lẻ hoặc
kết hợp với tween 80 (0,01%) trong thời gian 10 - 25 phút. Sau đó tráng lại
bằng nước cất vô khuẩn. Cắt mẫu thành những lát nhỏ, kích thước 2 x 2 x 1
mm, khối lượng khoảng 100 mg. Cấy mẫu vào môi trường thạch SH bổ sung
NAA (0,5 mg/l) và kinetin (0,1 mg/l). Nuôi cấy trong điều kiện vô khuẩn và
không có ánh sáng. Sau 35 ngày nuôi cấy trong môi trường kết quả tỷ lệ tạo
thành callus được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn
Tỷ lệ
Tỷ lệ tạo
Tỷ lệ không tạo
Số thành
STT Chất sát khuẩn nhiễm thành
mẫu callus
khuẩn (%) callus
(%)
(%)
1 NaClO 100 56 33 11
2 HgCl2 100 37 36 27
3 H2O2 100 43 42 15
4 NaClO + Tween 80 100 44 35 21
5 HgCl2 + Tween 80 100 29 33 38
6 H2O2 + Tween 80 100 35 49 16

Kết quả bảng 3.1 cho thấy: sử dụng dung dịch HgCl2 0,07% kết hợp với
tween 80 (0,01%) cho tỷ lệ nhiễm khuẩn thấp nhất là 29% đồng thời tỷ lệ tạo
thành callus cao nhất đạt 38%.
 43

A B C

D E F
Hình 3.1. Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus
A- Mẫu tự nhiên; B-Mẫu cấy; C, F-Callus; D-Mẫu bị nhiễm, E-Mẫu bị chết

3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn

Sau khi lựa chọn được chất sát khuẩn là HgCl2 và tween 80, khảo sát
ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn đến tỷ lệ tạo thành callus thông đỏ bằng
cách lựa chọn các mức thời gian tiệt khuẩn là 13, 15, 17, 19, 21, 23 phút. Sau
35 ngày nuôi cấy trên môi trường SH, tỷ lệ tạo thành callus được trình bày ở
bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn.
Thời gian Số mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ không Tỷ lệ tạo
tiệt khuẩn cấy nhiễm khuẩn tạo thành thành callus
(phút) (%) callus (%) (%)
13 100 43 32 25
15 100 29 33 38
17 100 25 30 45
19 100 19 48 33
21 100 12 59 29
23 100 6 81 13
 44

Kết quả bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy: với thời gian tiệt khuẩn 17 phút,
tỷ lệ tạo thành callus cao nhất đạt 45% và tỷ lệ mẫu không tạo thành callus thấp
nhất đạt 30%.
3.1.1.3. Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy
Lựa chọn được 4 loại môi trường (thành phần như bảng 3.3) để nuôi
cấy callus là SH, MS, B5 và White có bổ sung NAA (0,5 mg/l) và kinetin
(0,1mg/l). Sau 35 ngày nuôi cấy callus thông đỏ, tính tỷ lệ tạo thành callus
trên các môi trường khác nhau, kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.3. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy (Đơn vị: mg/l)
Thành phần Môi trường Môi trường Môi trường Môi trường
MS White B5 SH
(NH4)2SO4 - - 134 -
MgSO4× 7H2O 370 720 500 400
Na2SO4 - 200 - -
KC1 - 65 - -
CaC12× 2H2O 440 - 150 200
KNO3 1900 80 3000 2500
Ca(NO3)2× 4H2O - 300 - -
NH4NO3 1650 - - -
NaH2PO4× H2O - 16,5 150 -
NH4H2PO4 - - - 300
KH2PO4 170 - - -
FeSO4× 7H2O 27,8 - 27,8 15
Na2EDTA 37,3 - 37,3 20
MnSO4× 4H2O 22,3 7 10 10
ZnSO4× 7H2O 8,6 3 2 0,1
CuSO4× 5H2O 0,025 - 0,025 0,2
Fe2(SO4)3 - 2,5 - -
CoC12× 6H2O 0,025 - 0,025 0,1
KI 0,83 0,75 0,75 1,0
H3BO3 6,2 1.5 3 5
Na2MoO4× 2H2O 0,25 - 0,25 0,1
Saccharose 30.000 20.000 20.000 30.000
Myo-Inositol 100 - 100 1,000
Nicotinic Acid 0,5 0,5 1,0 0,5
Pyridoxin HC1 0,5 0,1 1,0 0,5
Thiamin HC1 0,1 0,1 10 5
Ca-Pantothenat - 1 - -
Glycin 2 3 - -
 45

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy

Số mẫu Tỷ lệ tạo
Môi Số mẫu
STT tạo thành thành p
trường cấy
callus callus (%)
1 MS 100 12 12% p3-1<0,05
2 SH 100 45 45% p3-2<0,05
3 B5 100 73 73% *
4 White 100 15 15% p3-4<0,05
(Chú thích: * - lô nghiên cứu được so sánh với các lô tương ứng khác)

Kết quả bảng 3.4 cho thấy: Trong 4 môi trường nghiên cứu tạo callus,
B5 là môi trường cho tỷ lệ tạo thành callus cao nhất đạt 73% (với p<0,05) tiếp
đến, môi trường SH cho tỷ lệ tạo callus là 45%. Hai môi trường White và MS
cho tỷ lệ tạo callus thấp hơn là 15% và 12%. Như vậy B5 là môi trường phù
hợp cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ.

a b

Hình 3.2. Callus trên các môi trường khác nhau

a: Môi trường B5; b: môi trường MS

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus

STT Môi trường Số mẫu Khối lượng

p
cấy callus (mg)
1 MS 50 14,3 ± 1,5 p3-1<0,05
2 SH 50 20,1 ± 2,1 p3-2<0,05
3 B5 50 24,5 ± 2,2 *
4 White 50 12,9 ± 1,5 p3-4<0,05
 46

Hình thái callus trên các môi trường khác nhau cũng khác nhau. Tế bào
nuôi cấy trong môi trường B5 và SH, callus mọc sáng và lớn hơn so với callus
nuôi cấy ở môi trường MS và White (hình 3.2). Kết quả xác định khối lượng
callus phát triển trong các môi trường khác nhau trình bày ở bảng 3.5.
Trong 4 môi trường khảo sát, tốc độ phát triển của tế bào tốt nhất trong
môi trường B5 với tỷ lệ tăng trưởng sau 35 ngày cao hơn so với các môi
trường còn lại (với p< 0,05 ).

3.1.1.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Sau khi lựa chọn được môi trường nuôi cấy callus phù hợp là B5, khảo
sát tốc độ phát triển của callus trong khoảng thời gian từ ngày thứ 10 đến
ngày thứ 50. Kết quả khảo được thể hiện ở hình 3.3.
(mg) 400

350

300

250
Khoi luong

200

150

100

50

0
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Thoi gian (ngày)

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian
Từ kết quả hình 3.3 cho thấy: sau 35 ngày nuôi cấy callus thông đỏ đạt
khối lượng cao nhất. Như vậy chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ là 35 ngày.

3.1.1.5. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng

* Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng

Lựa chọn 4 chất kích thích sinh trưởng thuộc 2 nhóm: auxin (2,4-D và
NAA nồng độ 1 mg/l) và cytokinin (kinetin, BAP nồng độ lần lượt là 0,1 mg/l
 47

và 0,5 mg/l) phối hợp với nhau và được thêm vào môi trường B5, nuôi cấy
trong thời gian 35 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển
của callus
số mẫu Khối lượng
STT Lô nghiên cứu p
cấy callus (mg)
1 2,4-D + kinetin 50 17,8 ± 1,4 P3-1<0,05
2 2,4-D + BAP 50 19,8 ± 2,7 P3-2<0,05
3 NAA + kinetin 50 24,8 ± 2,5 *
4 NAA + BAP 50 21,2 ± 1,8 P3-4<0,05

Trong 4 cặp chất kích thích sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy tế bào
thông đỏ thì cặp phối hợp giữa NAA và kinetin cho tốc độ phát triển của tế
bào cao hơn so với 3 cặp còn lại (p<0,05).

* Ảnh hưởng của nồng độ NAA

Sau khi đã lựa chọn được cặp chất kích thích sinh trưởng là NAA và
kinetin sử dụng cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ, tiến hành khảo sát ảnh
hưởng của nồng độ NAA tới tốc độ phát triển của tế bào. Tiến hành nuôi cấy
callus thông đỏ trong môi trường B5 bổ sung kinetin nồng độ 0,1 mg/l phối
hợp với NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l nuôi cấy trong 35
ngày. Kết quả trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus
Nồng độ Khối lượng
số mẫu
STT NAA callus p
cấy
(mg/l) (mg)
1 0,5 50 23,6 ± 2,1 P4-1< 0,05
2 1,0 50 24,1 ± 2.3 P4-2< 0,05
3 1,5 50 25,0 ± 1,8 p4-3 < 0,05
4 2,0 50 26,8 ± 1,9 *
5 2,5 50 25,6 ± 1,7 p4-5 > 0,05
Kết quả bảng 3.6 cho thấy: khi tăng nồng độ NAA tốc độ phát triển của
tế bào càng tăng và đạt khối lượng lớn nhất ở nồng độ 2,0 mg/l, với p<0,05.
Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA tới 2,5 mg/l thì khối lượng tế bào
 48

tăng không đáng kể (p>0,05). Như vậy, nồng độ NAA phù hợp cho nuôi cấy
tạo callus là 2,0 mg/l.
* Ảnh hưởng của nồng độ kinetin
Nuôi cấy tạo callus trong môi trường B5 có bổ sung NAA (2,0 mg/l) và
kết hợp kinetin với các mức nồng độ khác nhau từ 0,1 đến 0,5 mg/l. Kết quả
sau 35 ngày nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus
Nồng độ Khối lượng
số mẫu
STT kinetin callus p
cấy
(mg/l) (mg)
1 0,1 50 24,5 ± 1,8 p1-2 <0,05
2 0,2 50 27,9 ± 2,3 *
3 0,3 50 26,1 ± 1,9 p2-3 >0,05
4 0,4 50 25,9 ± 2,4 p2-4 >0,05
5 0,5 50 26,2 ± 2,2 p2-5 >0,05
Khi nồng độ kinetin từ 0,3 đến 0,5 mg/l thì khối lượng callus sau 35
ngày nuôi cấy thay đổi không đáng kể (p>0,05) so với mẫu nuôi khi dùng
nồng độ 0,2 mg/l. Như vậy, nồng độ kinetin phù hợp cho nuôi cấy tạo callus
là 0,2 mg/l.

3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch

Sau khi callus đã tạo trong môi trường thạch mềm, các tế bào còn cứng
và tiếp tục biệt hóa thành các cơ quan tổ chức khác như thân, rễ… Vì vậy, cần
có giai đoạn duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch trong một thời gian nhất
định, đảm bảo tế bào không còn biệt hóa, ngoài ra tế bào phải có hình thái
mềm, xốp thích hợp cho việc nuôi cấy trong môi trường lỏng.

3.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường và số lần cấy chuyển

Tiến hành cấy chuyển callus (khoảng 5 g) từ môi trường thạch B5 sang
môi trường B5 và SH có bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA (2,0 mg/l)
và kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l). Tiến hành cấy chuyển 4 lần (mỗi
lần nuôi cấy là 35 ngày). Sau các lần cấy chuyển, theo dõi hình thái, tính chất
 49

biệt hóa của tế bào và xác định tỷ lệ tăng trưởng. Kết quả được trình trong
hình 3.4 và hình 3.5.

a b

Hình 3.4. Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau
(a) – Môi trường B5 (b) – Môi trường SH

A B C

D E F
Hình 3.5. Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH
A: cấy chuyển lần 1; B: cấy chuyển lần 2; C: cấy chuyển lần 3,
D: cấy chuyển lần 4; E,F: cấy chuyển lần 5
Callus thông đỏ duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch B5 tế bào phát
triển chậm, thậm chí còn bị chết, một số bị biệt hoá thành mầm và chồi (hình
3.4). Trong khi các tế bào nuôi cấy ở môi trường SH tế bào phát triển tốt,
không có hiện tượng biến màu (hình 3.5). Như vậy, SH là môi trường phù hợp
 50

với sự phát triển callus thông đỏ ở giai đoạn duy trì nuôi cấy. Kết quả nghiên
cứu cấy chuyển nhiều lần của callus thông đỏ trong môi trường SH được trình
bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9. Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH

Tỷ lệ tăng
Lần cấy
Hình thái tế bào Khả năng biệt hóa trưởng
chuyển
(lần)
Lần 1 Tế bào cứng Biệt hóa thành mầm, thân 1,87
Tế bào cứng, có một số Biệt hóa thành các mô
Lần 2 2,25
đã mềm mại sẹo
Lần 3 Tế bào mềm mại Không còn biệt hóa 2,78
Lần 4 Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,51
Lần 5 Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,72

Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy: ở lần cấy chuyển đầu tiên, tế bào còn
cứng, một số có dấu hiệu biệt hóa thành các cơ quan chuyên biệt như rễ, thân.
Sau lần cấy thứ 2, 3 các tế bào đã ít biệt hóa hơn. Tuy nhiên, tế bào vẫn chưa
mềm mại. Tiếp tục cấy chuyển đến lần thứ 4 và 5 thì tế bào hoàn toàn không
còn khả năng biệt hóa, các tế bào mềm, xốp, khối lượng tế bào tăng nhiều.

Tốc độ sinh trưởng của tế bào qua các lần cấy chuyển cũng thay đổi. Ở
những lần cấy chuyển thứ nhất, tế bào phát triển chậm. Tuy nhiên, các lần cấy
chuyển tiếp thứ 4 và 5 tốc độ tế bào phát triển nhanh và ổn định hơn với tỷ lệ
tăng trưởng lần lượt là 3,51 và 3,72 lần. Như vậy, tế bào thông đỏ sau lần cấy
chuyển thứ 5 thì tốc độ phát triển ổn định và không bị biệt hoá thành các mô,
cơ quan.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose trong môi trường
SH bổ sung NAA (2,0 mg/l) và kinetin (0,2 mg/l.) Khảo sát ở các nồng độ 10;
 51

15; 20; 25; 30; 35 và 40 g/l. Sau 35 ngày nuôi cấy, kết quả được trình bày
trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus

Nồng độ số mẫu Khối lượng Tỷ lệ tăng

STT saccharose cấy callus (g) trưởng p
(g/l) ( x ±SD) (lần)
1 10 10 1,16 ± 0,15 2,48 p3-1<0,05
2 15 10 1,25 ± 0,13 2,65 p3-2<0,05
3 20 10 1,75 ± 0,16 3,72 *
4 25 10 1,54 ± 0,13 3,29 p3-4<0,05
5 30 10 1,26 ± 0,11 2,68 p3-5<0,05
5 35 10 1,22 ± 0,14 2,60 p3-6<0,05
7 40 10 1,12 ± 0,13 2,38 p3-7<0,05

Kết quả bảng 3.10 cho thấy: khi nuôi cấy callus trong môi trường thạch ở
nồng độ saccharose 20 g/l, tốc độ phát triển của callus tốt nhất (p<0,05) với
tốc độ tăng trưởng đạt 3,72 lần.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của
callus, sử dụng môi trường nuôi cấy SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin
(0,2 mg/l) và saccharose (20 g/l), pH = 5,6. Tiến hành nuôi cấy trong điều
kiện không có ánh sáng trong thời gian 35 ngày, ở các khoảng nhiệt độ từ 18
đến 280C. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào
Số Khối lượng Tỷ lệ tăng
Nhiệt độ mẫu callus (g)
STT trưởng p
( 0C ) cấy ( x ±SD) (lần)
1 18 – 20 10 1,25 ± 0,11 2,46 p3-1 <0,05
2 20 – 22 10 1,38 ± 0,15 3,04 p3-2 <0,05
3 22 – 24 10 1,77 ± 0,44 3,72 *
4 24 – 26 10 1,42 ± 0,12 3,11 p3-4<0,05
5 26 – 28 10 1,18 ± 0,14 2,62 p3-5<0,05
 52

Kết quả bảng 3.11 cho thấy khối lượng callus thông đỏ trong nhóm
nuôi cấy ở khoảng nhiệt độ từ 22-240C cao hơn các nhóm khác (p<0,05) với
tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,72 lần. Như vậy, nhiệt độ phù hợp cho giai đoạn nuôi
cấy tạo callus và duy trì callus thông đỏ khoảng 22-240C.

3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Để đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến tốc độ phát triển
của tế bào thông đỏ trong giai đoạn duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch
mềm, sử dụng môi trường nuôi cấy SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin
(0,2 mg/l), saccharose (20 g/l) và ở môi trường có pH là 5,0; 5,3; 5,6; 5,9; 6,2
và 6,5. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus
Số Khối lượng Tỷ lệ tăng
STT pH mẫu callus (g) trưởng p
cấy ( x ±SD) (lần)
1 5,0 10 0,96 ± 0,09 2,14 p3-1 < 0,05
2 5,3 10 1,41 ± 0,11 2,98 p3-2 < 0,05
3 5,6 10 1,79 ± 0,14 3,79 *
4 5,9 10 1,62 ± 0,13 3,44 p3-4< 0,05
5 6,2 10 1,28 ± 0,09 2,74 p3-5 < 0,05
6 6,5 10 0,68 ± 0,07 1,55 p3-6 < 0,05

Kết quả bảng 3.12 cho thấy: tốc độ phát triển của callus thông đỏ ở môi
trường có pH 5,6 là cao nhất với tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,79 lần (p < 0,05). Ở
môi trường có pH 6,5, tế bào không phát triển, chuyển mầu nâu sẫm và có
hiện tượng tế bào bị chết.

3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng

Sau khi callus thông đỏ được nuôi cấy trong môi trường thạch mềm, tế
bào đã mềm mại, xốp, màu sắc tươi sáng và không còn khả năng biệt hóa
được cấy chuyển sang môi trường lỏng trên hệ thống bình lắc (shaker). Quá
trình cấy chuyển sang môi trường lỏng SH được tiến hành trong điều kiện vô
khuẩn. Nuôi cấy tế bào trong bình nón dung tích 250 ml (thể tích môi trường
 53

50 ml) điều kiện không có ánh sáng, tốc độ lắc 130 vòng/phút. Tiến hành
khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tới tốc độ phát triển của tế bào cũng như
hàm lượng hoạt chất.
3.1.3.1. Kết quả đánh giá khả năng thích nghi của tế bào
Với mục đích tạo được khối tế bào thích nghi và phát triển tốt, ổn định
trong môi trường lỏng SH, tiến hành cấy chuyển khoảng 10 g callus từ môi
trường thạch SH sang môi trường lỏng SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), BAP
(1,0 mg/l), saccharose (20 g/l), pH = 5,6, nhiệt độ 240C. Duy trì nuôi cấy trong
thời gian 14 ngày, cứ sau 14 ngày lại cấy chuyển sang môi trường mới. Sau các
lần cấy chuyển cân xác định khối lượng tế bào khô, tốc độ phát triển cũng như
quan sát hình thái tế bào. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 và hình 3.6.

a b c

Hình 3.6. Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển
a: Cấy lần thứ 1 b: Cấy lần thứ 2 c: Cấy lần thứ 3
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào
Tỷ lệ tăng
Lần cấy Khối lượng tế bào
trưởng
chuyển (n=10) (g) ( X ± SD) p
(lần)
1 15,44±1,16 1,51±0,11 p3-1< 0,05
2 21,93±1,05 2,20±0,10 p3-2< 0,05
3 28,25±1,32 2,83±0,13 *
4 28,90±1,27 2,89±0,12 p3-4> 0,05
5 29,27±1,44 2,92±0,14 p3-5> 0,05
Kết quả ở bảng 3.13 và hình 3.6 cho thấy: ở các lần cấy chuyển thứ 2
và thứ 3, tốc độ phát triển của tế bào tăng hơn so với các lần trước (p<0,05).
 54

Tuy nhiên, tốc độ phát triển của tế bào tăng thêm không đáng kể (p>0,05) khi
cấy chuyển đến lần thứ 4 và thứ 5. Về hình thái tế bào: ở các lần cấy chuyển
thứ 1 và thứ 2 phát triển chậm màu sắc đậm hơn. Tuy nhiên, khi cấy chuyển
sang lần thứ 3, 4 thì tế bào phát triển nhanh, xốp, các tế bào sáng hơn.

3.1.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Từ kết quả nuôi cấy trong môi trường thạch, lựa chọn môi trường
lỏng SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), BAP (1,0 mg/l), saccharose (20 g/l), pH
= 5,6 để khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy khi cấy chuyển sang môi
trường lỏng. Sau ngày thứ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 thu hoạch tế
bào, sấy khô, xác định khối lượng tế bào. Kết quả được thể hiện ở hình 3.7.

Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
30
K h ố i lư ợ n g tế b ào tư ơ i (g )

25

20

15
K L khô
10

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Th i g ian nuôi c y (ng ày)

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy
Kết quả hình 3.7 cho thấy: tế bào thông đỏ phát triển tăng dần theo thời
gian và đạt cao nhất ở ngày thứ 14, sau đó khối lượng tế bào giảm dần. Như
vậy, thời gian cho 1 chu kì nuôi tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng là 14
ngày. Sau 14 ngày nếu muốn duy trì tế bào phải cấy chuyển sang môi trường
nuôi cấy mới có đủ chất dinh dưỡng.

3.1.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu

Khảo sát lượng mẫu tế bào thông đỏ đưa vào nuôi cấy ban đầu (so với thể
tích môi trường) ở các tỷ lệ 10; 15; 20; 25 và 30% (kl/tt). Sau 14 ngày nuôi cấy
xác định tỷ lệ tăng trưởng của các mẫu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14.
 55

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế
bào
Tỷ lệ Khối lượng Tỷ lệ sinh
Số mẫu
STT mẫu tế bào trưởng p
cấy
(%) (g) ( X ± SD) (lần)
1 10 10 17, 25 ± 0,57 1,73 ± 0,06 p3-1< 0,05
2 15 10 24,59 ± 0,89 2,48 ± 0,08 p3-2< 0,05
3 20 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,07 *
4 25 10 28,78 ± 2,81 2,89 ± 0,09 p3-4>0,05
5 30 10 25,02 ± 2,05 2,60 ± 0,11 p3-5< 0,05

Kết quả bảng 3.14 cho thấy: ở tỷ lệ mẫu cấy 20 – 25% thì tốc độ phát triển
của tế bào thông đỏ đạt cao hơn (2,83 - 2,89 lần) so với các nhóm còn lại (với
p<0,05). Ở tỷ lệ mẫu cấy 25% tốc độ phát triển của tế thay đổi không đáng kể so
với mẫu ở tỷ lệ 20% (với p>0,05), trong khi lượng mẫu sử dụng lại nhiều hơn. Do
vậy sử dụng tỷ lệ mẫu cấy 20% là thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ.

3.1.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Nuôi cấy tế bào thông đỏ (tỷ lệ 20%) trong môi trường SH có bổ sung
NAA (2,0 mg/l), BAP (1,0 mg/l), saccharose (20 g/l), điều chỉnh pH môi
trường từ 5,2 đến 6,2. Sau 14 ngày nuôi cấy, lọc lấy tế bào, xác định khối
lượng tế bào khô và tỷ lệ sinh trưởng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.15.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế
bào thông đỏ

Số mẫu Khối lượng tế Tỷ lệ sinh

STT pH p
cấy bào (g) ( x ±SD) trưởng (lần)
1 5,2 10 25,51 ± 1,45 2,55 ± 0,14 p3-1 < 0,05
2 5,4 10 27,19 ± 1,44 2,72 ± 0,15 p3-2 < 0,05
3 5,6 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,13 *
4 5,8 10 27,43 ± 0,87 2,74 ± 0,14 p3-4 < 0,05
5 6,0 10 26,02 ± 2,05 2,60 ± 0,12 p3-5 < 0,05
6 6,2 10 24,67 ± 1,52 2,46 ± 0,06 p3-6 < 0,05
 56

Kết quả bảng 3.15 cho thấy: khi nuôi cấy trong các môi trường pH khác
nhau thì tốc độ sinh trưởng của tế bào thay đổi. Ở khoảng pH từ 5,4 – 5,8 tốc
độ phát triển tốt. Với pH=5,6 tế bào phát triển tốt nhất với tỷ lệ sinh trưởng
đạt 2,83 lần (p< 0,05).

3.1.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Sau khi đã chọn được pH môi trường nuôi cấy thích hợp, tiến hành
khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đối với tốc độ phát triển của tế bào.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.16.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào
thông đỏ
số Khối lượng tế
Nhiệt độ Tỷ lệ sinh
STT 0 mẫu p
( C) bào (g) ( x ±SD) trưởng (lần)
cấy
1 18 10 19,34 ± 0,92 1,93 ± 0,08 p4-1 < 0,05
2 20 10 22,35 ± 0,83 2,24 ± 0,10 p4-2 < 0,05
3 22 10 26,78 ± 1,22 2,67 ± 0,12 p4-3 < 0,05
4 24 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,11 *
5 26 10 27,35 ± 1,09 2,72 ± 0,10 p4-5 < 0,05
6 28 10 25,02 ± 1,27 2,50 ± 0,12 p4-6< 0,05

Kết quả bảng 3.16 cho thấy: ở nhiệt độ 240C tốc độ phát triển của tế
bào tốt nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt 2,83 lần (p<0,05). Như vậy nhiệt độ
thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng là 240C.

3.1.3.6. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng

* Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng

Sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA
nồng độ 2,0 mg/l) sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các chất nhóm cytokinin
(BAP nồng độ 1,0 mg/l và kinetin 0,2 mg/l). Nuôi cấy tế bào trong môi
trường lỏng SH. Sau 14 ngày, lọc lấy tế bào cân xác định khối lượng tế bào
khô và tỷ lệ tăng trưởng tế bào. Kết quả trình bày ở bảng 3.17.
 57

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát
triển tế bào
số Khối lượng tế
Chất kích thích Tỷ lệ sinh
STT mẫu p
sinh trưởng bào (g) ( x ±SD) trưởng (lần)
cấy
1 NAA 10 21,93 ± 1,05 2,19 ± 0,10 p4-1 < 0,05
2 IBA 10 19,34 ± 0,81 1,92 ± 0,08 p4-2 < 0,05
3 NAA + Ki 10 26,02 ± 2,05 2,60 ± 0,11 p4-3 < 0,05
4 NAA + BAP 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,11 *
5 IBA + BAP 10 22,34 ± 0,83 2,23 ± 0,09 p4-5 < 0,05
6 IBA + Ki 10 20,23 ± 1,27 2,02 ± 0,11 p4-6< 0,05
Kết quả bảng 3.17 cho thấy: trong số các chất kích thích sinh trưởng được
sử dụng, cặp chất NAA và BAP cho tốc độ phát triển tế bào tốt nhất (đạt 28,29 g
và tỷ lệ sinh trưởng đạt 2,83 lần). Sự khác biệt so với các nhóm khác có ý nghĩa
thống kê với p < 0,05.
* Ảnh hưởng của nồng độ BAP
Nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng SH, bổ sung NAA (2,0
mg/l), saccharose (20 g/l) và BAP ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 3
mg/l. Sau 14 ngày nuôi cấy, xác định khối lượng tế bào khô và tỷ lệ sinh
trưởng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.18.
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào

Nồng độ Số Khối lượng tế

bào (g) Tỷ lệ sinh
STT BAP mẫu p
trưởng (lần)
(mg/l) cấy ( x ±SD)
1 0,5 10 20,62 ± 1,41 2,06 ± 0,07 p4-1 < 0,05
2 1,0 10 28,29 ± 1,36 2,82 ± 0,11 p4-2 < 0,05
3 1,5 10 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,10 p4-3 < 0,05
4 2,0 10 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06 *
5 2,5 10 32,98 ± 1,33 3,28 ± 0,08 p4-5 > 0,05
6 3,0 10 33,24 ± 1,63 3,30 ± 0,09 p4-6> 0,05
7 3,5 10 33,61 ± 1,27 3,34 ± 0,08 p4-6< 0,05
 58

Kết quả của bảng 3.18 cho thấy: khi tăng nồng độ BAP từ 0,5 đến 2,0
mg/l thì tốc độ phát triển của tế bào tăng lên, trong đó tại nồng độ 2,0 mg/l thì
tốc độ sinh trưởng của tế bào đạt cao đạt 3,27 lần (p< 0,05). Nếu tiếp tục tăng
nồng độ BAP lên 2,5 mg/l và 3,0 mg/l thì tốc độ phát triển tế bào tăng không
đáng kể (p>0,05). Như vậy nồng độ BAP thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông
đỏ trong môi trường lỏng là 2 mg/l.

* Ảnh hưởng của nồng độ NAA

Nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng SH có bổ sung BAP (2,0
mg/l), saccharose (20 g/l), đồng thời thêm NAA ở các nồng độ khác nhau 1,0;
2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 mg/l. Sau 14 ngày nuôi cấy, thu hoạch tế bào, xác định khối
lượng tế bào tươi, khô và tỷ lệ tăng trưởng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19.

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào.

Nồng độ Số Khối lượng Tỷ lệ sinh

STT NAA mẫu tế bào (g) trưởng p
(mg/l) cấy ( x ±SD) (lần)
1 1,0 10 25,35 ± 1,51 2,53 ± 0,07 p3-1 < 0,05
2 2,0 10 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06 p3-2 < 0,05
3 3,0 10 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10 *
4 4,0 10 40,68 ± 1,46 4,05 ± 0,08 p3-4> 0,05
5 5,0 10 40,90 ± 1,79 4,07 ± 0,06 p3-5 > 0,05
6 6,0 10 41,11 ± 1,71 4,09 ± 0,09 p3-6> 0,05

Kết quả bảng 3.19 cho thấy: cho thấy khi tăng nồng độ NAA từ 1,0 đến
3,0 mg/l thì tốc độ phát triển của tế bào tăng lên, trong đó tại nồng độ 3,0 mg/l
thì tốc độ sinh trưởng của tế bào đạt cao đạt 4,01 lần (p< 0,05). Tuy nhiên, nếu
tiếp tục tăng nồng độ NAA từ 3,0 mg/l đến 6,0 mg/l thì tốc độ phát triển tế bào
tăng không đáng kể ( p>0,05). Như vậy, nồng độ NAA thích hợp cho nuôi cấy
tế bào thông đỏ là 3 mg/l.
 59

3.1.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường

Sau khi lựa chọn được nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp,
nuôi cấy tế bào trong môi trường SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0
mg/l) và saccharose theo nồng độ 15, 20, 25, 30, 35 g/l. Sau 14 ngày nuôi cấy
kết quả được trình bày trong bảng 3.20.

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào.

Nồng độ số
Khối lượng Tỷ lệ sinh
STT saccharose mẫu tế bào (g) p
trưởng (lần)
(g/l) cấy ( x ±SD)
1 15 10 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,08 p4-1 < 0,05
2 20 10 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10 p4-2 < 0,05
3 25 10 44,33 ± 2,22 4,41 ± 0,11 p4-3 < 0,05
4 30 10 51,61 ± 2,16 5,14 ± 0,09 *
5 35 10 46,75 ± 1,29 4,65 ± 0,12 p4-5>0,05

Kết quả bảng 3.20 cho thấy: khi sử dụng saccharose nồng độ 30 g/l tốc
độ phát triển tế bào cao nhất với khối lượng tế bào đạt 51,61 g/l và tỷ lệ tăng
trưởng đạt 5,14 lần (p<0,05). Như vậy, nồng độ saccharose thích hợp cho
nuôi cấy tế bào thông đỏ là 30 g/l.

3.1.3.8. Khảo sát lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất

* Lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)

- Khảo sát lựa chọn loại elicitor

Nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường SH với thành phần đã khảo
sát ở trên. Sau 12 ngày, bổ sung các elicitor gồm MJ, JA, acid caffeic, acid
ferulic nồng độ 150 µM và dịch chiết nấm men nồng độ 100 µg/g. Kết quả
đánh giá ảnh hưởng của từng elicitor đến tốc độ phát triển tế bào và hàm
lượng paclitaxel được trình bày trong bảng 3.21.
 60

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm
lượng paclitaxel trong tế bào
Khối lượng tế
STT Loại elicitor n Paclitaxel (mg/l)
bào khô (g)
1 Mẫu chứng 10 52,41±2,43 6,48±0,17 p3-1< 0,05
2 JA 10 36,83±2,10 8,84±0,21 P3-2< 0,05
3 MJ 10 38,98±1,98 9,39±0,20 *
4 Acid ferulic 10 45,22±2,21 7,53±0,14 p3-4< 0,05
5 Acid caffeic 10 46,39±1,86 7,64±0,18 p3-5< 0,05
6 Elicitor nấm 10 43,83±2,27 7,34±0,16 p3-6< 0,05
7 Acid salicylic 10 44,78±1,53 7,62±0,17 p3-7< 0,05

Kết quả bảng 3.21 cho thấy: khi sử dụng các elicitor trong nuôi cấy tế
bào thông đỏ, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối tế bào đã cải thiện đáng kể
so với nhóm không dùng elicitor. Trong đó, MJ có hiệu quả nhất khi hàm
lượng paclitaxel tăng lên 9,39 mg/l so với nhóm không dùng elicitor là 6,48
mg/l (p<0,05). Tuy nhiên, việc sử dụng elicitor dẫn đến làm giảm sự phát
triển của tế bào so với nhóm không dùng.

- Khảo sát lựa chọn nồng độ methyl jasmonat

Sau khi đã lựa chọn được MJ sử dụng là chất kích thích tăng hoạt chất.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MJ từ 50 – 350 µM. Sau 48 giờ cho tiếp xúc
với tế bào, thu hoạch tế bào, xác định khối lượng khô, hàm lượng paclitaxel.
Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.22.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm
lượng paclitaxel trong tế bào
Nồng độ MJ số mẫu Khối lượng tế
Paclitaxel (mg/l)
STT (µM) cấy bào khô (g)
1 0 10 48,43±1,87 6,50±0,31 p3-1< 0,05
2 50 10 43,15±1,22 8,97±0,36 p3-2< 0,05
3 100 10 41,45±2,04 10,39±0,37 *
4 150 10 38,98±1,98 9,42±0,39 p3-4< 0,05
5 200 10 36,34±1,54 9,38±0,21 p3-5< 0,05
6 250 10 35,17±1,14 8,73±0,15 p3-6< 0,05
7 300 10 33,22±1,68 6,22±0,12 p3-7< 0,05
8 350 10 29,82±1,75 4,89±0,14 p3-8< 0,05
 61

Kết quả bảng 3.22 cho thấy: trong số các khoảng nồng độ MJ sử dụng
thì ở nồng độ 100 µM, hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào đạt cao
nhất đạt 10,39 mg/l (p<0,05), khối lượng tế bào giảm ít nhất (41,45 g/l).
Trong khi ở các nhóm khác hàm lượng paclitaxel tăng không nhiều mà khối
lượng tế bào lại giảm. Như vậy, nồng độ MJ thích hợp cho nuôi cấy tế bào
thông đỏ là 100 µM.

* Khảo sát điều kiện sử dụng elicitor

- Khảo sát lựa chọn thời gian tiếp xúc của elicitor

Để khảo sát lựa chọn thời gian tiếp xúc giữa tế bào và elicitor cho phù
hợp. Tiến hành nuôi cấy mẫu tế bào thông đỏ trong môi trường SH như trên. Sau
12 ngày nuôi cấy, bổ sung MJ (100 µM) vào môi trường. Tiếp tục duy trì nuôi
cấy trong thời gian từ 1 ngày đến 6 ngày. Sau đó thu hoạch, xác định khối lượng
tế bào khô, hàm lượng paclitaxel. Kết quả được trình bày trong bảng 3.23.

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào
Thời gian tiếp Số
Khối lượng tế
xúc với elicitor mẫu Paclitaxel (mg/l)
STT bào khô (g)
(ngày) cấy
1 mẫu chứng 10 48,31±2,34 6,49±0,31 p6-1< 0,05
2 1 10 44,37±2,12 7,21±0,26 p6-2< 0,05
3 2 10 44,23±1,97 8,75±0,21 p6-3< 0,05
4 3 10 41,45±2,04 10,39±0,37 p6-4< 0,05
5 4 10 42,98±2,02 11,06±0,28 p6-5< 0,05
6 5 10 42,37±2,17 12,32±0,12 *
7 6 10 39,65±1,98 9,93±0,27 p6-7< 0,05

Kết quả bảng 3.23 cho thấy: thời gian tiếp xúc giữa elicitor và tế bào
càng lâu thì hàm lượng hoạt chất càng tăng. Trong đó, tiếp thời gian tiếp xúc
5 ngày thì hàm lượng paclitaxel tăng cao nhất đạt 12,32 mg/l (với p<0,05).
 62

Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian tiếp xúc 6 ngày thì cả khối lượng tế bào và
hàm lượng paclitaxel thu được đều giảm. Như vậy thời gian tiếp xúc phù hợp
của elicitor với tế bào là 5 ngày.

- Khảo sát lựa chọn thời điểm tiếp xúc của elicitor

Tiến hành nuôi cấy mẫu tế bào thông đỏ trong môi trường SH bổ sung
NAA (3,0 mg/l); BAP (2,0 mg/l); saccharose (30g/l); pH = 5,6. Theo dõi tế
bào nuôi cấy và thêm MJ (100µM) vào các thời điểm 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16
ngày của chu kì nuôi cấy. Sau 5 ngày cho tiếp xúc với elicitor, thu hoạch tế
bào, tiến hành xác định khối lượng tế bào khô, hàm lượng paclitaxel. Kết quả
trình bày trong bảng 3.24.

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào

Số
Thời điểm tiếp Khối lượng tế
STT mẫu Paclitaxel (mg/l)
xúc (ngày thứ) bào khô (g)
cấy
1 4 10 17,43±2,21 4,72±0,09 P5-1< 0,05
2 6 10 17,42±1,38 5,61±0,11 P5-2< 0,05
3 8 10 24,84±2,05 6,06±0,17 P5-3< 0,05
4 10 10 32,55±1,29 9,83±0,22 P5-4< 0,05
5 12 10 42,28±1,57 12,45±0,19 *
6 14 10 42,83±1,43 10,52±0,24 P5-6< 0,05
7 16 10 46,35±2,37 9,92±0,15 P5-7< 0,05

Kết quả bảng 3.24 cho thấy: Khi cho elicitor tiếp xúc với tế bào ở ngày
thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy, hàm lượng paclitaxel cao nhất đạt 12,45 mg/l (với
p<0,05) tăng 1,9 lần so với môi trường đối chứng không sử dụng elicitor.
Trong khi khối lượng tế bào thu được giảm không nhiều so với nhóm chứng.
Như vậy, elicitor tiếp xúc với tế bào thông đỏ ở ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi
cấy, hàm lượng paclitaxel được cải thiện tốt nhất.
 63

3.1.3.9. Khảo sát phối hợp giữa sử dụng elicitor và bổ sung saccharose

* Kết quả khảo sát thời điểm bổ sung saccharose

Nuôi cấy mẫu tế bào thông đỏ trong môi trường SH bổ sung NAA (3,0
mg/l); BAP (2,0 mg/l); saccharose (30g/l); pH = 5,6. Sau các ngày thứ 2, 6, 10
và 14 của chu kì nuôi cấy, bổ sung thêm saccharose (20 g/l) vào môi trường
nuôi cấy ở các ngày thứ. Đồng thời bổ sung MJ (100 µM) vào ngày thứ 12.
Sau 17 ngày nuôi cấy tiến hành thu hoạch tế bào sinh khối. Kết quả xác định
khối lượng tế bào khô và hàm lượng paclitaxel được thể hiện trong bảng 3.25.

Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose

Thời điểm bổ sung Số
Khối lượng tế Paclitaxel p
STT saccharose mẫu
bào khô (g) (mg/l)
(ngày thứ) cấy
1 Mẫu chứng 10 48,23±2,11 6,51±0,09 p5-1<0,05
Không bổ sung 10 p5-2<0,05
2 42,28±1,57 12,45±0,19
đường
3 2 10 38,25±2,09 9,72±0,29 p5-3<0,05
4 6 10 42,41±1,89 11,26±0,36 p5-4<0,05
5 10 10 42,57±1,54 15,10±0,42 *
6 14 10 44,06±2,08 12,47±0,33 p5-6<0,05

Kết quả bảng 3.25 cho thấy: khi bổ sung saccharose vào môi trường
nuôi cấy vào ngày thứ 10 (gần pha ổn định), hàm lượng paclitaxel cao nhất
đạt 15,1 mg/l (p<0,05). Trong khi khối lượng tế bào giảm không nhiều so với
nhóm không bổ sung saccharose. Như vậy, thêm saccharose vào ngày thứ 10
thì hàm lượng hoạt chất trong sinh khối tế bào cải thiện tốt nhất so với việc
thêm vào các ngày khác của chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ.

* Kết quả khảo sát nồng độ saccharose bổ sung

Sau khi đã lựa chọn được thời điểm thêm đường, tiến hành khảo sát ảnh
hưởng nồng độ saccharose bổ sung khác nhau: 10, 15, 20 và 25 g/l ở ngày thứ
10 (gần pha ổn định). Đến ngày thứ 12 thêm MJ (100 µM). Tiếp tục nuôi cấy
 64

đến ngày thứ 14. Lọc lấy tế bào, sấy khô. Xác định khối lượng tế bào và và
định lượng xác định hàm lượng paclitaxel. Kết quả được trình bày trong bảng
3.26.

Bảng 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường

Nồng độ số
Khối lượng tế
đường mẫu Paclitaxel (mg/l)
STT bào khô (g/l)
(g/l) cấy
1 5 10 41,43 ± 1,07 12,35 ± 0,75 p4-1<0,05
2 10 10 40,59 ±1,21 13,17 ± 0,45 p4-2<0,05
3 15 10 42,21 ± 1,26 14,35 ± 0,41 p4-3<0,05
4 20 10 42,57 ± 1,54 15,12 ± 0,42 *
5 25 10 32,39 ± 1,64 11,51 ± 0,89 P4-5<0,05

Kết quả bảng 3.26 cho thấy: khi bổ sung saccharose (20 g/l) vào ngày
thứ 10 của chu kỳ nuôi cấy, hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào thông
đỏ cao nhất đạt 15,12 mg/l (p<0,05), khối lượng tế bào đạt 42,57 g/l. Trong
khi, bổ sung nồng độ 25 g/l thì hàm lượng hoạt chất và khối lượng tế bào đều
giảm. Như vậy, việc bổ sung saccharose với nồng độ 2% vào ngày thứ 10 của
chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ là phù hợp hơn cả với nuôi cấy tế bào thông
đỏ.

3.1.4. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít

Chọn điều kiện và thành phần môi trường nuôi cấy như đã khảo sát ở
trên gồm: sử dụng 4 lít môi trường SH bổ sung saccharose (30 g/l), NAA (3
mg/l), BAP (2 mg/l), điều chỉnh pH = 5,6, nuôi cấy ở 240C, tốc độ cánh khuấy
60 vòng/phút, nồng độ oxy hòa tan 30% nuôi cấy đến ngày thứ 10 bổ sung
thêm saccharose (20 g/l), tiếp tục nuôi cấy đến ngày thứ 12, thêm methyl
jasmonat (100 µM) và nuôi cấy tiếp đến ngày thứ 17. Lọc lấy tế bào, sấy ở
600C tới khô. Xác định tỷ lệ tăng trưởng so với ban đầu và hàm lượng
paclitaxel trong tế bào và ngoài môi trường. Kết quả trình bày ở bảng 3.27.
 65

Bảng 3.27. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít
Hàm lượng Hàm lượng
Tỷ lệ sinh
paclitaxel paclitaxel
Mẻ nuôi cấy trưởng
trong tế bào ngoài môi
(lần)
(mg/l) trường (mg/l)
1 3,37 12,16 1,28
2 3,55 12,89 1,46
3 3,73 13,56 1,13
4 3,41 13,99 1,16
5 3,67 13,96 1,25
6 3,91 13,87 1,37
7 3,61 10,04 1,12
8 3,53 12,88 1,09
TB 3,60 12,92 1,23
SD 0,16 1,33 0,13

Kết quả ở bảng 3.27 cho thấy: với các điều kiện đã khảo sát trong giai
đoạn nuôi cấy trên bình lắc khi chuyển sang nuôi cấy trong hệ thống
bioreactor 5 lít, sau 17 ngày nuôi cấy tốc độ phát triển đạt 3,60 lần, hàm lượng
paclitaxel đạt 12,92 mg/l. Hàm lượng paclitaxel ly giải ra ngoài môi trường là
1,23 mg/l. Như vậy, so với nuôi cấy trong bình lắc thì tốc độ phát triển của tế
bào giảm hơn. Hàm lượng hoạt chất trong tế bào cũng thấp hơn.

3.1.5. Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ

Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ được mô tả trong
hình 3.8.
Mô tả quy trình:
- Rút hỗn dịch sinh khối tế bào thông đỏ ra khỏi bình nuôi cấy và để
lắng tự nhiên 1 giờ.
- Hỗn dịch nuôi cấy được lọc bằng máy hút chân không để thu lấy khối
tế bào.
- Khối tế bào được hoà vào trong nước cất theo tỷ lệ 5 phần nước: 1
phần sinh khối tế bào, sau đó lọc loại bỏ phần nước rửa. Phần tế bào tiếp tục
 66

được rửa thêm 2 lần nữa, thu được sinh khối thông đỏ là dạng bột màu nâu
đậm và xốp.
- Bột sinh khối thông đỏ được sấy khô trong tủ sấy có quạt gió ở nhiệt
độ 600C cho tới khối lượng không đổi.
- Kiểm nghiệm sản phẩm, đóng túi PE 02 lần, bảo quản nơi khô mát.

Hỗn dịch nuôi cấy

Môi trường thừa Lọc qua giấy lọc

Khối tế bào thô

Nước rửa Rửa 3 lần bằng nước cất

Khối tế bào sạch

Sấy 600C /10 giờ

Khối tế bào khô

Kiểm nghiệm

Sản phẩm

Hình 3.8. Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong
Bioreactor
* Kết quả thu hoạch 8 mẻ nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bình
nuôi cấy 5 lít và xác định dư lượng NAA, BAP trong sinh khối, cũng như hàm
lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được trình bày trong bảng 3.28.
* Định lượng NAA trong sinh khối tế bào: Cân chính xác khoảng 1 g bột
SKTB thông đỏ khô, thêm 20 ml nước và 4 ml NaOH 50%. Đun hồi lưu trong 3
giờ. Ly tâm, lấy phần dịch trong. Thêm 10 ml DCM, lắc trong 1 phút. Chờ phân
lớp, lấy phần dịch nổi ở trên. Acid hoá bằng khoảng 3 – 4 ml HCl đặc tới pH <2.
Để nguội, chiết bằng 20 ml DCM x 2 lần. Dịch chiết DCM được làm khan bằng
natri sulfat khan. Gộp dịch chiết DCM và đuổi dung môi bằng dòng nitơ nhẹ ở
nhiệt độ 350C tới cắn. Thêm chính xác 10 ml DCM, lắc kỹ trong 1 phút. Lọc qua
 67

2 g natri sulfat khan. Bỏ khoảng 2 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc
chuyển vào cột chiết pha rắn (silica gel 2g) để loại tạp. Rửa giải với 5 ml hỗn
hợp 99%DCM 1% acid acetic x 3 lần. Lấy toàn bộ dịch rửa giải để đuổi dung
môi hữu cơ bằng dòng khí nitơ tới cắn. Thêm chính xác 10 ml ACN 50% trong
nước, lắc kỹ, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký với điều kiện: cột
SAX; 400C; pha động: MeCN: 0,025M KH2PO4 pH 5 (30:70, tt/tt); tốc độ dòng:
0,8 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 µl; nhiệt độ buồng bơm mẫu 40C; detector
huỳnh quang bước sóng 220 và 340 nm [4], [129].
* Định lượng BAP: Cân chính xác khoảng 1 g SKTB thông đỏ khô
chiết hồi lưu bằng Soxhlet với 100 ml EtOH 95% trong 3 giờ. Dịch chiết
EtOH được bốc hơi trong chân không tới cắn. Hòa tan cắn trong 8 ml đệm
amoni formiat (0,01M, pH =3,7), sau đó loại tạp bằng cách chiết với ether
ethylic 3 lần. Dung dịch đệm sau khi loại tạp được điều chỉnh về pH=5,6 với
dung dịch NH4OH 5%. Loại tạp bằng cột chiết pha rắn rửa lần lượt với nước
khử ion, dung dịch HCl 0,5N, dung dịch NaOH 0,5N. Rửa giải bằng 50 ml
MeOH. Dịch rửa giải được đuổi dung môi hữu cơ bằng dòng khí nitơ tới cắn.
Hòa tan cắn trong 1ml MeOH để phân tích bằng HPLC. Tiến hành sắc ký với
điều kiện: Cột C8; pha động: Nước : methanol (30 : 70 tt/tt), tốc độ dòng: 1,0
ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 6 µl. Detector PDA 255 nm [88].
Bảng 3.28. Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel
trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ
NAA BAP Hàm lượng paclitaxel
Mẻ cấy
(ppm) (ppm) %(kl/kl)
Mẻ 1 1,22 0,51 0,0361
Mẻ 2 1,91 0,64 0,0354
Mẻ 3 1,20 0,57 0,0362
Mẻ 4 1,92 0,66 0,0368
Mẻ 5 1,89 0,71 0,0352
Mẻ 6 1,78 0,59 0,0384
Mẻ 7 1,94 0,67 0,0321
Mẻ 8 1,98 0,53 0,0386
x 1,73 0,61 0,0361
SD 0,13 0,07 0,0020
 68

Sau 8 mẻ nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít thì hàm lượng
paclitaxel trong tế bào đạt 0,0361%. Dư lượng các chất kích thích sinh trưởng
sử dụng trong quá trình nuôi cấy gồm NAA và BAP lần lượt là 1,73 và 0,61
ppm (khối lượng tế bào khô).
Mẫu sinh khối tế bào thông đỏ thu được đã kiểm nghiệm tại Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương và đạt yêu cầu các chỉ tiêu chất lượng theo TCCS
trong đó hàm lượng paclitaxel và baccatin III lần lượt là 0,038% và 0,0061%
(số phiếu 42/TCH 01 ngày 01 tháng 12 năm 2011 – Xem phần phụ lục).

3.1.6. Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ

Từ các kết quả khảo sát thu được, đưa ra quy trình tạo sinh khối tế bào
thông đỏ quy mô phòng thí nghiệm như sau (hình 3.9):
- Mẫu thân non thông đỏ tự nhiên được tiệt khuẩn bằng dung dịch
HgCl2 0,07% + tween 80 (0,01%) trong thời gian 17 phút. Mẫu được cắt
thành cách lát nhỏ. Cấy mẫu vào trong môi trường B5 có bổ sung NAA (2,0
mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l), pH=5,6, nhiệt độ 240C. Nuôi
cấy không có ánh sáng trong 35 ngày để thu callus.
- Cấy chuyển callus 4 lần trong môi trường thạch SH có bổ sung NAA
(2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l), pH=5,6, nhiệt độ 22-240C,
thời gian 35 ngày để duy trì callus
- Cấy chuyển tế bào (tỷ lệ 20%) sang môi trường lỏng SH có bổ sung
NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l), saccharose (30 g/l), pH = 5,6; điều kiện
nuôi cấy: nhiệt độ 240C, tốc độ máy lắc 130 vòng/phút, thời gian 14 ngày.
- Cấy chuyển tế bào sang hệ thống bioreactor 5 lít trong môi trường SH
có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l), saccharose (30 g/l), pH = 5,6;
điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 240C, đến ngày thứ 10 thêm saccharose (20 g/l),
ngày thứ 12 bổ sung methyl jasmonat (100 µM), tiếp tục nuôi đến ngày thứ17
ngày, trong điều kiện không có ánh sáng. Lọc lấy tế bào, rửa sạch bằng nước
cất 3 lần, sấy khô ở 600C trong 10 giờ được sản phẩm sinh khối tế bào thông
đỏ.
 69

Th«ng ®á tù nhiªn

- TiÖt khuÈn mÉu c©y b»ng HgCl + Tween 80

- CÊy vµo MT B5 + NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/l),
T¹o callus saccharose (20g/l), pH=5,6.
- §iÒu kiÖn nu«i cÊy: 35 ngµy, nhiÖt ®é240C,
kh«ng cã ¸nh s¸ng

Callus

- M«i tr−êng SH +NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/),

saccharose (20g/l), pH=5,6.
Duy tr× nu«i cÊy trong - Nu«i trong ®iÒu kiÖn: t0= 22-240C; thêi 35
m«i tr−êng th¹ch ngµy; kh«ng cã ¸nh s¸ng. CÊy chuyÓn 4 lÇn

Callus/MT th¹ch

- M«i tr−êng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l),

saccharose (30g/l).
Nu«i cÊy - §iÒu kiÖn nu«i cÊy: tû lÖ mÉu cÊy 20%; t0=240C;
trªn m«i tr−êng láng pH=5,6; tèc ®é c¸nh khuÊy 130 v/phót, thêi gian:14
ngµy

SKTB/MT láng

- M«i tr−êng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l),

Nu«i cÊy trong hÖ
thèng bioreactor 5 lÝt
saccharose (30g/l+20g/l ë ngµy thø 10), thªm MJ
(100µM) ngµy thø 12
- §iÒu kiÖn nu«i cÊy: tû lÖ mÉu cÊy 20%; t0=240C;
pH=5,6; tèc ®é c¸nh khuÊy 60 v/phót, nång ®é oxy
hoµ tan 30%; thêi gian:17 ngµy

Sinh khèi/ Bioreactor

- Läc lÊy tÕ bµo

Thu sinh khèi - Röa 3 lÇn víi n−íc cÊt
- SÊy kh« 40 -600C/10giê

SKTB kh« KNSP

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ

 70

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT
XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH
KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ

3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong sinh khối tế bào thông đỏ

3.2.1.1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng các hoạt chất
trong sinh khối tế bào thông đỏ bằng HPLC

* Kết quả xây dựng phương pháp xử lý mẫu

- Chiết lỏng - lỏng với hỗn hợp dung môi methanol - dicloromethan
(3:1, tt/tt), chiết nhiều lần, rồi phân tích ngay bằng HPLC.
- Chiết lỏng - rắn với dung môi chiết methanol, chiết nhiều lần, sau đó
tinh chế bằng cột chiết pha rắn trước khi chạy HPLC.
Kết quả sắc ký đồ của 2 phương pháp xử lý mẫu thể hiện ở hình 3.10 a
và 3.10 b cho thấy: mặc dù phương pháp chiết lỏng – lỏng còn nhiều tạp hơn
so với phương pháp chiết pha rắn nhưng sắc ký đồ vẫn tách ra được pic quan
trọng paclitaxel và baccatin III. Phương pháp chiết pha rắn loại tạp tốt hơn
nhưng phương pháp này có hạn chế là tốn nhiều thời gian và giá thành cao,
trong khi có rất nhiều mẫu sinh khối phải phân tích. Vì vậy, phương pháp xử
lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo.
0.030 0.030

0.025 0.025

0.020
a 0.020
Paclitaxel
b
0.015 0.015 Baccatin III
AU
AU

Baccatin III Paclitaxel

0.010 0.010

0.005 0.005

0.000 0.000

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Minutes
Minutes

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết lỏng -lỏng
(a) và lỏng - rắn (b)
Cân chính xác khoảng 0,5g chế phẩm đã nghiền mịn vào ống ly tâm 50
ml, thêm 10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ khoảng 1000 vòng/phút trong 5
 71

phút, ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy dịch ly tâm, cắn
trong ống ly tâm được chiết như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml methanol. Gộp
các dịch ly tâm, chuyển vào bình gạn đã có sẵn 25 ml dung dịch natri clorid 5%,
lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2 lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết n-hexan.
Lớp nước được lắc kỹ với dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các dịch
chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat khan, sau khi lọc xong rửa lớp natri
sulfat bằng vài ml dicloromethan. Gộp các dịch lọc và dịch rửa dicloromethan,
bốc hơi dung môi ở 350C dưới dòng khí nitơ tới cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml
methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, được dung dịch tiêm sắc ký.
* Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký:
Kết quả sắc ký đồ khi tiến hành khảo sát trên cột Fortis phenyl
(150×4,6 mm; 5 µm) với 3 hệ pha động: sắc ký đồ mẫu chuẩn có xuất hiện
píc, tuy nhiên khi chạy mẫu thử các píc không tách khỏi nhau hoàn toàn,
không phân tích được paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông
đỏ.
Kết quả sắc ký đồ khi tiến hành khảo sát trên cột Luna L43 (250×4,6
mm; 5 µm) với ba hệ pha động: Các píc sắc nét, tách khỏi nhau hoàn toàn, píc
đối xứng.
- Pha động: tiến hành khảo sát khả năng tách paclitaxel và baccatin III
trong sinh khối tế bào thông đỏ với 3 hệ pha động (bảng 3.29).
Bảng 3.29: Khảo sát điều kiện pha động
ACN H2O MeOH
Hệ t (phút) Rửa giải
(%) (%) (%)
0 - 35 35 65 0 Đẳng dòng
35 - 60 35 - 80 65 – 20 0 Gradient
I
60 - 70 80 - 35 20 – 65 0 Gradient
70 - 80 35 65 0 Đẳng dòng
II 0 - 60 35 45 20 Đẳng dòng
0 - 45 25 - 63 75 – 37 0 Gradient
III 45 - 55 63 - 25 37 – 75 0 Gradient
55 - 60 25 75 0 Đẳng dòng
 72

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ III với chương trình chạy
gradient cho kết quả phân tách paclitaxel và baccatin III tốt nhất, các píc tách
rời nhau, sắc nét, chân píc gọn và thời gian phân tích phù hợp (hình 3.11).
0 .0 3 0

0 .0 2 5
P a c lita xe l
0 .0 2 0
B a c c a tin III
AU 0 .0 1 5

0 .0 1 0

0 .0 0 5

0 .0 0 0

1 0.0 0 15 .00 2 0 .0 0 2 5.0 0 30 .00 3 5 .0 0 4 0 .0 0

M in u tes

Hình 3.11. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha
động III sử dụng cột Luna L43
- Bước sóng: Pha chất chuẩn paclitaxel và baccatin III trong MeOH.
Tiến hành quét phổ UV trong khoảng 190 – 400 nm. Kết quả cho thấy
paclitaxel có cực đại hấp thụ tại 228 nm (hình 3.12a) và baccatin III có cực
đại hấp thụ tại 232 nm (hình 3.12b). Vì độ hấp thụ của baccatin III ở bước
sóng 228 nm và 232 nm khác nhau không nhiều nên để tiện lợi nghiên cứu
này sử dụng một bước sóng 228 nm áp dụng cho định lượng cả 2 chất này.
18.620 Peak 1
31.137 Peak 1
0.022 228.0 231.5
0.016

0.020
b
a
0.014
0.018

0.016 0.012

0.014
0.010

0.012
AU
AU

0.008
0.010

0.008 0.006

0.006
0.004

0.004

0.002
0.002 274.0

0.000 0.000

220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00
nm nm

Hình 3.12. Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b)
 73

- Lưu lượng dòng: qua khảo sát lưu lượng dòng từ 0,5 - 2 ml/phút cho
thấy lưu lượng dòng 1,0 ml/phút là tối ưu vì tách riêng được paclitaxel,
Baccatin III với các píc tạp khác trong dịch sinh khối tế bào thời gian xuất
hiện đáp ứng píc sớm.

- Thể tích tiêm mẫu: tiến hành khảo sát thể tích tiêm mẫu từ 10-100 µl.
Kết quả cho thấy, khi tiến hành tiêm mẫu với thể tích 20 µl cho chân píc gọn
và các chất tách hoàn toàn khỏi nhau.

Từ kết quả trên, điều kiện HPLC được lựa chọn để định lượng
paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ là:

+ Pha tĩnh: cột Luna L43 (250 × 4,6 mm ; 5 µm).

+ Pha động: ACN-H2O chạy theo chương trình gradient với hệ pha
động III (Bảng 3.30).

Bảng 3.30. Chương trình chạy sắc ký

Thời gian (phút) ACN (%) H2O (%)

0 - 45 25 – 63 75 - 37
45 - 55 63 – 25 37 - 75
55 - 65 25 75

+ Bước sóng: 228 nm

+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

* Kết quả thẩm định quy trình định lượng

- Tính đặc hiệu và tương thích của hệ thống sắc ký

Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu hỗn hợp 2 chuẩn paclitaxel và
baccatin III có nồng độ 10 µg/ml và mẫu thử sinh khối thông đỏ. Kết quả ở
hình 3.13 và bảng 3.31 cho thấy trong mẫu trắng không có píc tại các thời
điểm xuất hiện các píc của paclitaxel và baccatin III; các píc cân đối, tách
 74

nhau rõ ràng; thời gian lưu (tR) và diện tích píc (μV*giây) của paclitaxel và
baccatin III chuẩn có độ lặp lại cao (độ lệch chuẩn RSD < 1%).
0.030 0.08

0.025
Paclitaxel
a b
0.06
0.020
Baccatin III Paclitaxel
Baccatin III
0.015

31.032
0.04

AU
AU

18.565
0.010

0.02
0.005

0.000
0.00
10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
-0.005
10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Minutes
Minutes

Hình 3.13. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b).

Bảng 3.31. Độ lặp lại của hệ thống

Paclitaxel Baccatin III
STT
TR (phút) S (μV*giây) TR (phút) S (μV*giây)
1 31,22 201879 18,55 129541
2 31,04 203589 18,69 126198
3 31,14 203598 18,59 128087
4 31,03 202387 18,66 128098
5 31,13 202780 18,64 128102
TB 31,11 202941 18,63 128015
RSD (%) 0,25 0,37 0,31 0,92

- Khoảng tuyến tính của paclitaxel và baccatin III

Pha các hỗn hợp chuẩn có nồng độ 5; 10; 20; 50; 80 và 100 µg/ml trong
methanol. Tiến hành chạy sắc ký các mẫu để xác định diện tích pic của
paclitaxel và baccatin III ở các nồng độ khác nhau. Kết quả ở bảng 3.31 và
hình 3.14 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích píc và nồng độ
paclitaxel và baccatin III có sự tương quan tuyến tính với R2 ~ 1.
 75

Bảng 3.32. Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III

Diện tích píc (µV*s)

Paclitaxel Baccatin III
Nồng độ (µg/ml)
5 93395 59921
10 203336 128307
20 403131 264345
50 1020613 645826
80 1618654 1027586
100 2068974 1337309
Y = aX + b Y = 20610X - 8919,2 Y = 13229X - 7051,4
R2 0,9998 0,9991

2500000
Diện tích pic (μV*s)

2000000

1500000

Paclitaxel
1000000
Baccatin III
500000

0
0 50 100 150

Nồng độ (μg/ml)

Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ
paclitaxel và baccatin III
- Giới hạn phát hiện

Tiến hành phân tích mẫu trắng, xác định diện tích píc trong khoảng thời
gian xuất hiện pic paclitaxel và baccatin III trong mẫu chuẩn. Kết quả cho
thấy diện tích pic mẫu trắng của cả 2 chất này khoảng 1.500 µV*s. Từ đó, tiến
hành pha loãng dung dịch chuẩn mỗi chất tới nồng độ thích hợp để có diện
tích píc gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền (mẫu trắng), cụ thể như sau:
0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 và 1,4 µg/ml. Kết quả cho thấy, giới hạn phát hiện là
0,6 µg/ml đối với paclitaxel và 0,8 µg/ml đối với baccatin III.

- Giới hạn định lượng dưới

 76

Từ giới hạn phát hiện của paclitaxel và baccatin III, tiến hành pha loãng
chuẩn gốc mỗi chất tới nồng độ: 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 µg/ml. Tiêm lặp lại 6
lần ở giới hạn định lượng dưới. Kết quả đáp ứng píc của các chất cần phân
tích được trình bày ở bảng 3.33 và bảng 3.34.
Bảng 3.33. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel

Mẫu trắng Paclitaxel Nồng độ ngoại Độ

STT
(µV*s) (µV*s) suy (µg/ml) đúng(%)
1 1297 32311 2,00 100
2 1490 31565 1,96 98,2
3 1567 32648 2,02 100,8
4 1387 31985 1,98 99,2
5 1498 32056 1,99 99,4
6 1620 30831 1,93 96,4
X 1477 31899 1,98 99,00
SD 118 635 0,03 1,50
RSD 7,99 1,99 1,56 1,52

Kết quả bảng 3.33 cho thấy: ở nồng độ 2 µg/ml paclitaxel đáp ứng píc
của chuẩn đều gấp trên 10 lần đáp ứng píc của mẫu trắng và giá trị RSD <2%,
độ đúng đều nằm trong khoảng ~ 100%. Vậy giới hạn định lượng dưới của
paclitaxel là 2 µg/ml.
Bảng 3.34. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III
Mẫu trắng Baccatin III Nồng độ ngoại Độ
TT
(µV*s) (µV*s) suy (µg/ml) đúng(%)
1 1597 32059 2,96 98,5
2 1490 31591 2,92 97,4
3 1534 31987 2,95 98,4
4 1398 32005 2,95 98,4
5 1791 32541 2,99 99,8
6 1720 33131 3,04 101,2
x 1588 32219 2,97 98,95
SD 147 540 0,0408 1,30
RSD 9,22 1,67 1,3744 1,31
 77

Ở nồng độ 3 µg/ml baccatin III đáp ứng píc của mẫu chuẩn đều gấp
trên 10 lần đáp ứng píc mẫu trắng và giá trị RSD <2%, độ đúng đều nằm
trong khoảng ~ 100%. Như vậy, nồng độ 3 µg/ml đáp ứng yêu cầu về giới hạn
định lượng dưới của baccatin III.
- Độ chính xác
Để đánh giá độ chính xác của phương pháp bằng cách khảo sát độ lặp
lại của đáp ứng píc với các lần tiêm mẫu khác nhau. Pha các mẫu LQC (5
µg/ml), MQC (50 µg/ml) và HQC (80 µg/ml). Mỗi loại mẫu QC gồm ít nhất 5
mẫu độc lập có cùng nồng độ. Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo các điều
kiện đã lựa chọn. Kết quả, độ chính xác trong ngày trình bày ở bảng 3.35.
Bảng 3.35. Kết quả xác định độ chính xác
Diện tích píc ở các nồng độ (μV*s)
STT Paclitaxel (µg/ml) Baccatin III (µg/ml)
5 50 80 5 50 80
1 92478 1023486 1610454 59365 648296 1026586
2 94037 1015628 1610836 58739 647938 1028087
3 94784 1027658 1609869 59028 650029 1026478
4 93779 1021293 1610264 57947 644658 1021990
5 92070 1029762 1620892 59879 642357 1027758
6 93972 1021973 1619764 58176 650184 1030984
x 93520 1023300 1613680 58856 647244 1026981
RSD(%) 1,10 0,49 0,32 1,23 0,48 0,29

Từ kết quả trong bảng 3.35 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối đều dưới
2% chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt, đáp ứng yêu cầu phân tích.
- Độ đúng
Tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn. Mẫu thử sinh khối thông đỏ
(0,5 g) được thêm chính xác một lượng chuẩn paclitaxel (khoảng 100 µg) và
baccatin III (khoảng 80 µg) rồi xử lý mẫu theo quy trình đã xác định. Mẫu đối
chứng (0,5 g) không thêm paclitaxel và baccatin III. Tiến hành định lượng
 78

paclitaxel và baccatin III trong 2 mẫu này. Từ tỷ lệ tìm thấy paclitaxel và

baccatin III chuẩn thêm vào. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.36
Bảng 3.36. Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III

Paclitaxel Baccatin III

Lượng
STT Lượng Lượng tìm Lượng
Tỷ lệ thu thêm Tỷ lệ thu
thêm vào thấy tìm thấy
hồi (%) vào hồi (%)
(µg) (µg) (µg)
(µg)
1 98 90,70 92,55 81 77,78 96,02
2 98 94,42 96,35 81 75,81 93,59
3 98 92,97 94,87 81 75,31 92,97
4 98 92,98 94,88 81 74,06 91,43
5 98 90,25 92,09 81 75,40 93,09
x 94,55 93,37
RSD(%) 1,78 1,67

Độ đúng của phương pháp thể hiện qua tỷ lệ thu hồi. Tỷ lệ thu hồi của
phương pháp đạt trên 90%. Như vậy, quá trình xử lý mẫu đã làm hỏng, mất
lượng mẫu không nhiều. Bản thân 2 chất này cũng dễ bị hỏng dưới tác động
của môi trường xung quanh, đặc biệt là nhiệt độ.

- Độ ổn định: tiến hành chiết một mẫu sinh khối thông đỏ theo quy
trình xử lý mẫu đã xác định. Song song chuẩn bị một mẫu chuẩn hỗn hợp của
paclitaxel và baccatin III. Tiến hành sắc ký ngay và sau 2, 4 và 6 giờ. Kết quả
được trình bày trong bảng 3.37.

Bảng 3.37. Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử
Chuẩn Thử
Thời
gian Paclitaxel Baccatin III Paclitaxel Baccatin III
(giờ) C % còn C % còn C % còn C % còn
µg/ml lại µg/ml lại µg/ml lại µg/ml lại
0 10,16 100,00 10,07 100,00 13,32 100,00 7,73 100,00
2 10,13 99,67 10,00 99,56 13,27 99,67 7,69 99,43
4 10,11 99,53 9,99 99,45 13,28 99,78 7,67 99,14
6 10,07 99,14 9,98 99,35 13,19 99,02 7,65 98,94
 79

Kết quả thực nghiệm cho thấy trong 6 giờ phân tích, lượng paclitaxel
và baccatin III trong mẫu thử giảm không đáng kể (≈100%). Vậy hoạt chất
trong mẫu chuẩn và thử đều ổn định trong thời gian phân tích.

Từ các kết quả khảo sát cho thấy phương pháp định lượng có độ đặc
hiệu, độ tuyến tính, độ đúng cao, có thể định lượng paclitaxel và baccatin III ở
nồng độ 5 μg/ml.

3.2.1.2. Xác định sơ bộ các nhóm hợp chất trong SKTB thông đỏ

Cân 10 g sinh khối tế bào thông đỏ chiết xuất theo phương pháp mô tả
trong mục 2.2.2.1.a. Các dịch chiết được làm các phản ứng hoá học với các
thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất. Kết quả được trình bày trong
bảng 3.38.

Bảng 3.38. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ
Nhóm hợp Dịch chiết Kết luận
Phản ứng định tính
chất Ether Cồn Nước sơ bộ
Alcaloid TT alcaloid - + - Có
Anthranoid Với dd KOH 10% - + Có
Flavonoid Cyanidin - - Không có
Chất béo Vết dầu béo trên giấy - Không có
Carotene H2SO4 đậm đặc - Không có
Tinh dầu Cặn có mùi thơm - Không có
Sterol Phản ứng Liebermann ++ + Có
Tanin FeCl3 + Na acetat ++ + Có
Đường khử TT Fehling A + B - - Không có
Anthocyanidin Với HCl đđ, NaOH - Không có
Acid hữu cơ Với Na2CO3 + Có

Kết quả bảng 3.38 cho thấy trong sinh khối tế bào thông đỏ có chứa các
nhóm hợp chất alcaloid, tanin, anthranoid, sterol, acid hữu cơ.

3.2.1.3. Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Định tính paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ
được tiến hành song song với mẫu lá thông đỏ tự nhiên. Kết quả trình bày
trong hình 3.15.
 80

0.025

baccatin III paclitaxel

18.626
0.020

31.144
a
0.015

AU
0.010

0.005

0.000

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Minutes

0.025

0.020
b
0.015

0.010 18.629
AU

31.149
0.005

0.000

-0.005
10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Minutes

0.025

0.020
c
0.015 31.131
AU

0.010
18.650

0.005

0.000

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Minutes

Hình 3.15. Sắc ký đồ các mẫu phân tích

a. Mẫu chuẩn paclitaxel, baccatin III; b. Mẫu thông đỏ tự nhiên; c. Mẫu
sinh khối thông đỏ

Trên sắc ký đồ ở hình 3.15 cho thấy đa số các píc xuất hiện trên mẫu
thông đỏ tự nhiên đều xuất hiện trên píc của mẫu thông đỏ sinh khối. Tại thời
điểm 18,6 phút và 31,1 phút ở sắc kí đồ mẫu sinh khối xuất hiện píc giống
như đáp ứng của mẫu chuẩn baccatin III và paclitaxel. Như vậy, trong sinh
khối thông đỏ có baccatin III và paclitaxel.
 81

3.2.1.4. Định lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ

Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối thông đỏ
bằng HPLC được trình bày trong bảng 3.39.
Bảng 3.39. Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá
thông đỏ tự nhiên bằng HPLC

Hàm lượng paclitaxel (%) Hàm lượng baccatin III(%)

Mẫu tự Mẫu tự
STT Sinh khối Sinh khối
nhiên nhiên
1 0,0363 0,0117 0,0065 0,0087
2 0,0369 0,0116 0,0057 0,0086
3 0,0355 0,0091 0,0062 0,0080
4 0,0361 0,0117 0,0063 0,0081
5 0,0357 0,0091 0,0058 0,0079
6 0,0354 0,0090 0,0061 0,0082

x 0,0360 0,0104 0,0061 0,0082

SD 0,0006 0,0017 0,0003 0,0003

Kết quả bảng 3.39 cho thấy: hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong
sinh khối thông đỏ lần lượt là 0,0360% và 0,0061%. So với cành và lá non
thông đỏ tự nhiên thu hái được, hàm lượng paclitaxel cao hơn khoảng 3,5 lần.
Tuy nhiên, hàm lượng baccatin III lại thấp hơn (p<0,05).

3.2.2. Chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh
khối tế bào thông đỏ

3.2.2.1. Chiết xuất, phân lập

Sinh khối thông đỏ khô (300 g) được chiết siêu âm với methanol
(3x1000 ml). Dịch chiết methanol được lọc, gom lại và cất loại dung môi ở
nhiệt độ không quá 60 oC dưới áp suất giảm thu được 78 g cắn dịch methanol.
 82

Cắn này được hòa vào 1000 ml nước và chiết phân đoạn lần lượt với các dung
môi n-hexan, ethyl acetat và n-butanol theo tỷ lệ 1/1 (3x1000 ml). Dịch chiết
của các phân đoạn được cất thu hồi dung môi thu được các cắn tương ứng là
n-hexan (11 g), ethyl acetat (20 g), n-butanol (13 g) và nước (16 g).
- Cắn n-hexan được tiến hành phân tách thô bằng sắc ký cột silica gel
sử dụng các thang nồng độ hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetat từ 100/1
đến 75/1, 50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 1/1 thu được 7 phân đoạn tương ứng. Phân
đoạn được rửa giải bằng n-hexan/ethyl acetat 25/1 (750 mg) được tiến hành
tinh chế với sắc ký cột (chất hấp phụ: silica gel pha thường, hệ dung môi rửa
giải: n-hexan/ethyl acetat 20/1) thu được hợp chất 1 (125 mg) và hợp chất 4
(75 mg). Phân đoạn được rửa giải bằng n-hexan/ethyl acetat 50/1 (900 mg)
được tiến hành tinh chế với sắc ký cột (chất hấp phụ: silica gel pha thường, hệ
dung môi rửa giải: n-hexan/ethyl acetat 40/1) thu được hợp chất 2 (15 mg) và
hợp chất 3 (25 mg). Phân đoạn được rửa giải bằng n-hexan/ethyl acetat 75/1
(500 mg) được tiến hành tinh chế với sắc ký cột (chất hấp phụ: silica gel pha
thường, hệ dung môi rửa giải: n-hexan/ethyl acetat 40/1) thu được hợp chất 9
(20 mg).
- Cắn ethyl acetat được tiến hành phân tách thô bằng sắc ký cột pha
thường sử dụng các thang nồng độ hệ dung môi rửa giải cloroform/methanol
từ 100/1 đến 75/1, 50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 3/1, 1/1 thu được 8 phân đoạn tương
ứng. Phân đoạn được rửa giải bằng cloroform/methanol 50/1 (850 mg) được
tiến hành tinh chế với sắc ký cột (chất hấp phụ: YMC RP-18, hệ dung môi rửa
giải: nước/methanol 2/1) thu được hợp chất 5 (10 mg) và hợp chất 6 (16 mg).
Phân đoạn được rửa giải bằng cloroform/methanol 10/1 (1,5 g) được tiến hành
tinh chế với sắc ký cột (chất hấp phụ: YMC RP-18, hệ dung môi rửa giải:
nước/methanol 1/1) thu được hợp chất 7 (75 mg) và hợp chất 8 (24 mg).

Xác định sơ bộ độ tinh khiết của 9 chất phân lập bằng SKLM. Kết quả
trên sắc ký đồ của các chất chỉ thấy xuất hiện 1 vết với hệ số di chuyển Rf như
sau: Các chất 1, 4: Rf x 100 = 62 (1), 77 (4) (bản mỏng: YMC RP-C18, hệ
 83

dung môi khai triển: aceton : nước [7 : 1]); Các chất 2, 3: Rf x 100 = 29 (2),
23 (3) (bản mỏng: YMC RP-C18, hệ dung môi khai triển: aceton : nước [10 :
1]); Chất 5: Rf x 100 = 38 (bản mỏng: YMC RP-C18, hệ dung môi khai triển:
MeOH : nước [2 : 1]); Chất 6: Rf x 100 = 34 (bản mỏng: YMC RP-C18, hệ
dung môi khai triển: MeOHl : nước [3 : 1]); Chất 7, 8: Rf x 100 = 65 (7), 72
(8) (bản mỏng: YMC RP-C18, hệ dung môi khai triển: MeOH : nước [1 : 1]);
Chất 9: Rf x 100 = 28 (Bản mỏng: Silica gel GF254, hệ dung môi khai triển: n-
hexan : EtAc [4 : 1]).

3.2.2.2. Xác định phổ các chất phân lập

Các chất phân lập được xác định nhiệt độ nóng chảy, ghi phổ tử ngoại
(UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR). Kết quả cho thấy:
Chất 1: Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 168−170 oC;
phổ khối lượng ESI-MS: m/z 445 [M - OAc]+ (C28H40O8, M = 504).
Chất 2: Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 193−194 oC;
phổ khối lượng ESI-MS: m/z 459 [M - OAc]+ (C29H42O8, M = 518,6).
Chất 3: Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 103−106 oC;
phổ khối lượng ESI-MS: m/z 487 [M - OAc]+, 445 [M -
OCOCH(CH3)CH2CH3]+ (C31H46O8, M = 546); phổ tử ngoại UV (CHCl3,
0,64) λmax (nm) = 212,4; 225,7 và 238,0; phổ hồng ngoại IR (KBr) ν (cm-1) :
2948,17 (C-H); 1739,4; 1644,1 (C=O); 1373,05 (C=C); và 1230,09; 1015,64;
938,02 (C-O).
Chất 4: Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 160−161 oC;
phổ khối lượng ESI-MS: m/z 503 [M - OAc]+ (C31H46O9, M = 562).
Chất 5: Bột có màu trắng, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 593 [M + Na]+
(C31H38O10, M = 570).
Chất 6: Bột có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 211−215 oC; phổ khối
lượng ESI-MS: m/z 876 [M + Na]+ (C47H51NO14, M = 853); phổ tử ngoại UV
(MeOH, 0,005) λmax (nm) = 204,3; 223,9 và 239,3; phổ hồng ngoại IR (KBr) ν
 84

(cm-1): 3475,7 (OH); 3029,3; 2937,2 (C-H); 1733,09; 1703,31; 1640,76

(C=O); 1530,56 (C=C); 1369,72 (CH3); 1250,59; 1074,86; 985,50 (C-O).
Số liệu phổ 1H-NMR và 13
C-NMR của các chất 1 – 6 được trình bày
trong bảng 3.40 và 3.41.

Chất 7: Bột có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 173–175 °C; năng suất
–
quay cực [α] 20
D +21,5° (MeOH, c 0,4); ESIMS m/z 289 [M – H] (C15H14O6, M

= 290).

Chất 8: Bột có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 230–232 °C; năng suất
quay cực [α] 20
D –21,0° (MeOH, c 0,6); UV (MeOH) λmax: 240 và 280 nm; IR

(KBr) νmax 3325 (OH), 1607, 1519, 1449 (C=C), 1359, 1283, 1141 cm-1;
EIMS m/z 290 [M] (C15H14O6, M = 290).

Chất 9: Tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 136–137 °C;
UV (CHCl3) λmax: 244 nm; IR (KBr) νmax 3400 (OH), 2938 (olefinic -
CH=CH-), 1460, 1380, 1060 cm-1; EIMS m/z 414 [M] (C29H50O, M = 414).

Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của các chất 7 – 9 được trình bày ở Phụ
lục 5.
 85

Bảng 3.40. Số liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) của các các chất 1 – 6

Carbon 1 (δCx) 2 (δCx) 3 (δCx) 4 (δCx) 5 (δCy) 6 (δCy)

C-1 59,1 59,2 59,2 59,3 80,8 79,0
C-2 70,7 70,5 70,1 70,6 75,1 74,9
C-3 42,3 42,3 42,1 42,3 48,2 47,9
C-4 142,5 142,4 142,2 142,4 82,6 82,3
C-5 78,4 78,4 78,1 78,4 85,8 85,9
C-6 29,1 29,0 28,9 29,0 37,8 36,6
C-7 33,9 33,9 33,8 33,9 72,5 72,2
C-8 37,5 37,5 37,2 37,4 59,7 59,3
C-9 44,1 44,1 43,8 44,0 205,9 205,1
C-10 70,7 70,7 70,1 70,9 77,7 76,3
C-11 135,4 135,5 135,3 135,5 133,5 135,6
C-12 134,9 134,9 134,8 134,8 143,5 142,1
C-13 39,6 39,7 39,6 39,6 31,2 72,3
C-14 70,3 70,3 70,5 70,2 27,0 37,5
C-15 39,8 39,8 39,6 39,8 43,5 44,6
C-16 25,6 25,6 25,4 25,5 20,2 22,3
C-17 31,9 31,9 31,7 31,8 27,0 26,9
C-18 21,6 21,6 20,9 21,6 20,7 14,7
C-19 22,6 22,6 22,4 22,6 10,0 10,4
C-20 117,1 117,1 116,8 117,1 77,4 77,5
C-1′ 170,4 173,5 175,6 174,9 - 174,4
C-2′ 22,0 28,1 41,0 47,1 - 76,8
C-3′ - 9,4 26,7 69,6 - 57,7
C-4′ - - 11,6 20,9 - -
C-5′ - - 16,5 14,1 - -
2-OAc C=O 170,1 170,2 169,9 170,1 - -
Me 21,1 21,1 21,3 21,1 - -
4-OAc C=O - - - - 171,6 171,8
Me - - - - 22,1 23,2
5-OAc C=O 169,9 169,9 169,8 169,9 - -
Me 21,7 22,0 21,9 22,0 - -
10-OAc C=O 170,2 170,4 170,2 170,4 171,4 171,3
Me 21,6 21,6 21,4 21,5 20,9 20,8
x: Đo trong dung môi CDCl3, y: Đo trong dung môi CD3OD.
 86

Bảng 3.41. Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) của các chất 1 - 6
1 2 3 4 5 6
x x x y
Carbon δH mult. δH mult. δH mult. δH mult. δHy mult.
δHx mult. (J=Hz)
(J=Hz) (J=Hz) (J=Hz) (J=Hz) (J=Hz)
C-1 1,89 d (1,5) 1,87 d (1,0) 1,88 d (2,5) 1,89 d (1,5) - -
5,34 dd (1,5; 5,34 dd (1,5; 5,36 dd (2,2; 5,34 dd (1,5;
C-2 5,58 d (5,7) 4,76 d (4,5)
3,5) 3,5) 6,7) 3,5)
C-3 2,92 d (3,5) 2,92 d (3,5) 2,94 d (6,5) 2,92 d (3,5) 3,81 d (5,7) 3,84 d (7,5)
5,01 dd (1,7;
C-5 5,29 t (1,5) 5,28 t (1,5) 5,30 t (2,7) 5,28 t (1,5) 5,01 d (6,3)
9,2)
2,47 m/1,77 2,48 m/1,83
C-6 1,80 m 1,79 m 1,81 m 1,80 m
m m
1,95 dd (6,5;
1,96 d (5)
1,96 d (3,5) 13,0) 1,95 m 4,34 dd (5,8; 4,34 dd (7,0;
C-7 1,24 ddd (1,3;
1,23 m 1,24 dt (2,2; 1,22 m 9,2) 11,0)
2,8; 7,5)
3,2)
2,42 d (2,0;
2,40 m 2,40 m
10,5) 2,41 d (7,5)
C-9 1,62 dd (3,0; 1,63 dd (3,0; - -
1,62 dd (3,0; 1,64 d (6,5)
8,5) 8,0)
8,5)
6,06 dd (3,3; 6,05 dd (3,3; 6,06 dd (5,5; 6,05 dd (3,0;
C-10 6,49 s 5,67 s
6,8) 6,8) 12,0) 7,0)
2,81 dd (5,0;
2,83 dd (5,0; 2,86 dd (9,0; 2,84 dd (5,0;
10,5) 6,18 dd (8,5;
C-13 10,5) 19,0) 10,5) nd
2,37 dd (6,7; 9,0)
2,36 m 2,37 m 2,38 m
8,3)
 87

2,26 dd (9,0;
4,99 dd (2,5; 4,99 dd (2,5; 4,99 dd (4,5; 5,01 dd (2,5; 15,4)
C-14 nd
5,0) 5,0) 9,0) 5,0) 2,01 dd (9,0;
14,5)
C-16 1,66 s 1,65 s 1,67 s 1,65 s 1,11 s 1,17 s
C-17 1,12 s 1,11 s 1,11 s 1,11 s 1,06 s 1,17 s
C-18 2,05 s 2,05 s 2,09 s 2,08 s 1,98 s 1,93 d (1,0)
C-19 0,84 s 0,84 s 0,85 s 0,83 s 1,62 s 1,68 s
4,16 dd (7,2;
C-20 5,26 s/4,85 s 5,26 s/4,84 s 5,27 s/4,81 s 5,26 s/4,81 s 4,21 s (tù)
20,4)
2,27 ddd (0,5;
C-2′ 2,04 s 2,32 m 2,37 m - 6,47 s (tù)
4,5; 8,5)
C-3′ - 1,10 m 1,60 m/1,45 m 3,85 m - 5,66 s (tù)
C-4′ - - 0,89 t (7,5) 1,14 d (4,0) - -
C-5′ - - 1,12 d (1,5) 1,19 d (3,5) - -
2-OAc Me 2,01 s 2,04 s 2,02 s 2,01 s - -
4-OAc Me - - - - 2,29 s 2,38 s
5-OAc Me 2,17 s 2,17 s 2,19 s 2,17 s - -
10-OAc
2,09 s 2,08 s 2,06 s 2,05 s 2,15 s 2,19 s
Me
x: Đo trong dung môi CDCl3, y: Đo trong dung môi CD3OD, nd: không xác định.
 88

3.2.2.3. Nhận dạng các chất phân lập

Dựa trên phân tích dữ liệu các phổ IR, UV, MS, 1H-NMR, 13C-NMR và
các phổ 2 chiều thu được kết hợp với các tài liệu công bố [34], [93], [138],
[140] cho thấy cấu trúc hoá học của 9 chất phân lập là Taxuyunnanine C (1);
2α,5α,10β- triacetoxy - 14β - propionyloxy-4(20),11-taxadiene (2);
2α,5α,10β-triacetoxy - 14β- (2-methyl) - butyryloxy-4(20),11- taxadiene (3);
2α,5α,10β-triacetoxy-14β-(3-hydroxy-2-methyl)-butyryloxy-4(20),11-
taxadiene (4) và β-sitosterol (9) và 04 chất từ phân đoạn ethyl acetat gồm 13-
dehydroxy baccatin III (5), paclitaxel (6), (+)-catechin (7) và (-)-epicatechin
(8) (Kết quả biện giải chi tiết các phổ xem phần phụ lục 4). Cấu trúc hóa học
các chất trình được bày trong hình 3.16.

1 2 3

4 5 6
 89

7 8 9

Hình 3.16. Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9

3.2.3. Chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ

3.2.3.1. Chiết xuất paclitaxel trong sinh khối thông đỏ

* Khảo sát lựa chọn dung môi chiết

Cân 100 g tế bào (hàm lượng 0,036%), chiết với các dung môi
methanol, aceton, chloroform, diethyl ether bằng phương pháp lắc siêu âm
trong 1 giờ (4 x 400 ml). Sau mỗi lần chiết, lọc chân không thu dịch chiết.
Gộp các dịch chiết đem cô dưới áp suất giảm ở 400C đến cắn. Xác định khối
lượng cắn, hàm lượng paclitaxel và hiệu suất chiết. Kết quả được trình bày
trong bảng 3.42.

Bảng 3.42. Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau
Dung môi Sản phẩm thô Hàm lượng
STT Hiệu suất (%)
chiết (g) paclitaxel (%)
1 Methanol 23,34 ± 0,95 0,50 ± 0,02 97,30 ± 0,56
2 Aceton 26,41 ± 1,13 0,35 ± 0,01 74,71 ± 2,01
3 Chloroform 18,99 ± 1,25 0,34 ± 0,02 53,58 ± 2,52
4 Diethylether 20,92 ± 1,42 0,40 ± 0,02 67,28 ± 3,89
p p1-2, 1-3, 1-4 <0,05 p1-2, 1-3, 1-4 <0,05

Trong 4 loại dung môi sử dụng để chiết xuất paclitaxel từ sinh khối tế
bào thông đỏ thì MeOH sau 4 lần chiết cho hiệu suất cao nhất đạt 97,30% và
hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm đạt 0,5% cao hơn so với các nhóm sử
dụng các dung môi khác (p<0,05). Như vậy sử dụng MeOH là dung môi thích
hợp trong chiết xuất paclitaxel từ sinh khối tế bào thông đỏ.
 90

* Chiết xuất giai đoạn 2 (chiết lỏng – lỏng)

Lấy khoảng 20 g cắn MeOH (hàm lượng 0,5%) thu được ở trên hòa tan
lại trong 300 ml MeOH, thêm dd NaCl 5% với tỷ lệ 1:1. Chiết 4 lần mỗi lần
với 200ml dichloromethan (DCM). Gộp dịch chiết DCM cô dưới áp suất giảm
ở nhiệt độ phòng đến cắn. Xác định khối lượng cắn và hàm lượng paclitaxel
trong cắn cũng như hiệu suất quá trình chiết. Kết quả được trình bày trong
bảng 3.43.

Bảng 3.43. Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM (n=6)
Khối lượng Hàm lượng Khối lượng
Hiệu suất
Mẫu sản phẩm thô paclitaxel paclitaxel
(%)
(g) (%) trong sp(mg)
1 1,53 5,81 88,7 90,54
2 1,47 5,92 89,1 91,81
3 1,58 5,61 88,6 91,25
4 1,68 6,36 89,8 92,59
5 1,49 5,98 88,6 90,32
6 1,52 5,89 89,5 94,18
x ± SD 1,55±0,08 5,93 ±0,25 89,0±0,05 91,94± 1,45

Khi chiết xuất lỏng–lỏng bằng dung môi DCM, hiệu suất chiết của quá
trình đạt 91,94%, đồng thời hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm chiết đã
tăng lên đáng kể từ 0,5% lên 5,93%.

3.2.3.2. Tinh chế paclitaxel

* Kết quả loại tạp chất bằng than hoạt

Cân khoảng 1,5 g cắn (hàm lượng 5,93%) DCM thu được ở trên được
hòa tan lại trong 100 ml DCM, tẩy màu dịch chiết bằng than hoạt tính với tỷ
lệ khác nhau 1:1; 2:1; 3:1 và 4:1(kl/kl) so với khối lượng chất đem tẩy màu.
Dịch lọc tẩy màu thu được cô đến cắn dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng.
Kết quả xác định khối lượng cắn, hàm lượng paclitaxel trong cắn và hiệu suất
chiết được trình bày trong bảng 3.44.
 91

Bảng 3.44. Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế
paclitaxel (n=6)
Khối lượng Hàm lượng Khối lượng
Tỷ lệ than
sản phẩm paclitaxel paclitaxel Hiệu suất (%)
STT hoạt (kl/kl)
thô (g) (%) trong sp(mg)
1 1:1 1,16±0,12 6,14±0,25 77,2±6,3 92,07±2,34
2 2:1 1,09±0,09 7,01±0,16 76,4±5,9 90,90±1,46
3 3:1 1,01±0,08 7,81±0,18 78,9±6,1 88,68±2,58
4 4:1 0,91±0,08 7,84±0,22 71,3±5,7 80,21±3,02
p3-1, 3-2, 3-4<0,05 p3-4<0,05
Kết quả bảng 3.44 cho thấy: sử dụng than hoạt ở tỷ lệ 3:1 là tốt nhất với
hàm lượng paclitaxel đạt 7,81% và hiệu suất đạt 88,68%. Như vậy, tỷ lệ than
hoạt phù hợp để loại tạp chất trong dịch chiết paclitaxel từ sinh khối tế bào
thông đỏ là 3:1.
* Kết quả tinh chế bằng thay đổi dung môi
Sau khi xử lý hấp phụ bằng than hoạt, cân 1,0 g cắn thu được ở trên
(hàm lượng paclitaxel 7,81%), hoà tan hoàn toàn lại trong 25 ml DCM, nhỏ từ
từ n-hexan với các tỷ lệ 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1, 12:1 (so với dung môi DCM).
Khuấy đều, để yên cho paclitaxel kết tủa. Lọc, sấy tủa tới khối lượng không
đổi, xác định khối lượng tủa thô, hàm lượng paclitaxel và hiệu suất của quá
trình tinh chế. Kết quả được trình bày trong bảng 3.45.
Bảng 3.45. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh chế
paclitaxel(n=6)
Tỷ lệ n- Khối lượng Hàm lượng KL Hiệu suất
STT hexan: sản phẩm (g) paclitaxel paclitaxel (%)
DCM (%) (mg)
1 4:1 0,16 ± 0,02 27,10 ± 1,76 40,7±2,4 55,97 ± 4,19
2 6:1 0,19 ± 0,01 26,51 ± 0,93 49,9±3,8 63,89 ± 2,43
3 8:1 0,22 ± 0,02 25,88 ± 0,99 57,12±2,6 73,14± 1,66
4 10 : 1 0,25 ± 0,01 25,37 ± 1,12 64,37±3,2 82,43 ± 2,76
5 12 : 1 0,31 ± 0,02 20,53 ± 0,84 63,36±2,3 81,61 ± 1,02
p p4-5<0,05 p4-1, 4-2, 4-3 <0,05

Kết quả bảng 3.45 cho thấy khi tăng tỷ lệ n-hexan vào dịch chiết DCM
thì hàm lượng paclitaxel giảm đi, đồng thời hiệu suất của quá trình tăng lên.
 92

Với tỷ lệ n-hexan thêm vào dịch chiết DCM là 10:1 là tốt nhất với hàm lượng
paclitaxel 25,37%, hiệu suất đạt 82,43%.

* Kết quả tinh chế paclitaxel bằng kết tinh phân đoạn

Cân 0,50 g tủa thô paclitaxel (hàm lượng khoảng 25%) thu được ở trên,
hòa tan lại trong 100 ml MeOH với tỷ lệ 0,5% (kl/tt). Sau đó nhỏ từ từ nước
cất (đã điều chỉnh pH = 8) với tỷ lệ (H2O : MeOH) thay đổi: 2:8, 3:7, 4:6, 5:5,
6:4, để ở 00C trong 3 ngày cho paclitaxel kết tủa. Lọc lấy tủa, sấy khô và đánh
giá hàm lượng tủa cũng như hiệu suất của quá trình tinh chế. Kết quả được
trình bày ở bảng 3.46.
Bảng 3.46. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và
hiệu suất tinh chế paclitaxel(n=6)
Khối
Tỷ lệ Khối lượng Hàm lượng Hiệu suất
lượng
H2O : sản phẩm paclitaxel
STT MeOH paclitaxel (%)
(mg) (%)
(mg)
1 2:8 89,4 ± 8,2 62,20 ±1,22 55,8±3,1 44,60 ±2,00
2 3:7 109,1 ± 6,9 60,03 ± 1,98 65,5±3,9 52,43 ±1,91
3 4:6 147,7 ± 9,4 60,46 ± 1,05 89,3±4,2 71,41 ± 1,45
4 5:5 179,2 ± 10,7 50,78 ± 2,97 91,2±3,5 73,07± 1,25
5 6:4 231,7 ± 14,3 40,05 ± 2,05 92,8±2,9 74,22 ± 1,65
p p3-4<0,05 p3-1, 3-2,3-4<0,05

Kết quả bảng 3.46 cho thấy: khi tăng tỷ lệ nước cất thêm vào dung
dịch paclitaxel thô thì hiệu suất quá trình tăng lên. Tuy nhiên, hàm lượng
paclitaxel trong sản phẩm thu được giảm đi. Ở tỷ lệ nước thêm vào dung dịch
paclitaxel trong MeOH 4 : 6 thì hiệu quả quá trình tinh chế tốt nhất với hiệu
suất đạt 71,41% và hàm lượng trong sản phẩm đạt 60,46%.
* Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột
Cân khoảng 500 mg tủa paclitaxel (hàm lượng khoảng 60,46%) thu
được ở giai đoạn kết tinh trong hỗn hợp MeOH : H2O, hòa tan trong 50 ml
 93

hỗn hợp dung môi MeOH : H2O = 2 : 1 (dung môi chạy cột), tiến hành triển
khai sắc ký cột theo sơ đồ hình 3.17.

Paclitaxel thô

Chất nhồi cột: YMC Rp-18 resin

Hệ dung môi MeOH : H2O = 2:1

PĐ1 PĐ2 PĐ3 PĐ4 PĐ5

Kết tinh lại trong MeOH

Paclitaxel

Hình 3.17. Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột

Sau khi triển khai sắc ký cột, kiểm tra bằng SKLM, thấy có 5 phân đoạn
khác nhau (từ phân đoạn PĐ1 ~ PĐ5). Phân đoạn PĐ3 thấy vết paclitaxel hiện rõ
và tách biệt (có nhiều hoạt chất nhất), cất loại dung môi, kết tinh lại trong
methanol thu được tinh thể paclitaxel. Lọc thu tinh thể, sấy chân không, xác định
hàm lượng paclitaxel và hiệu suất của quy trình. Kết quả trình bày trong bảng
3.47.
Bảng 3.47. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1
Khối lượng tinh Hàm lượng Hiệu suất (%)
Mẫu thể thu được (mg) Paclitaxel (%)
1 293,1 92,39 89,59
2 300,8 91,24 90,78
3 303,6 94,82 95,23
4 297,8 95,65 94,24
5 287,4 92,75 88,19
6 305,3 91,81 92,76
x ± SD 297,1 ± 6,8 93,11 ± 1,74 91,97 ± 2,61
 94

Sau khi tinh chế bằng sắc ký cột hàm lượng paclitxel trong sản phẩm
thu được đã tăng từ 60,46% (sản phẩm trước tinh chế) lên 93,11% và hiệu
suất của quá trình tinh chế bằng sắc ký cột đạt 91,97%.
So với tiêu chuẩn USP 30 thì hàm lượng paclitaxel chiết xuất được từ
sinh khối tế bào thông đỏ còn chưa đạt yêu cầu (>97%). Vì vậy, tiến hành tinh
chế bằng sắc ký cột thêm 1 lần nữa. Kết quả được trình bày trong bảng 3.48.

Bảng 3.48. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2

Khối lượng tinh Hàm lượng Hiệu suất (%)

Mẫu
thể thu được (mg) Paclitaxel (%)
1 429,4 98,39 90,74
2 451,2 99,04 95,98
3 452,6 96,82 94,12
4 443,3 98,65 93,93
5 416,8 97,71 87,47
6 448,1 97,81 94,18

x ± SD 440,2 ± 14,25 98,07 ± 0,79 92,74 ± 3,09

Sau khi tinh chế bằng sắc ký cột lần thứ 2 hàm lượng paclitxel trong
sản phẩm phẩm thu được đã tăng từ 93,11% (sản phẩm trước tinh chế) lên
98,07 % và hiệu suất đạt 92,74%. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm thu
được bằng HPLC. Kết quả sắc ký đồ được trình bày trong hình 3.18 a và
3.18b.

Như vậy, quá trình chiết xuất và tinh chế paclitaxel phải trải qua nhiều
giai đoạn khác nhau, sau mỗi giai đoạn hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm
thu được đã tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình cũng giảm
đi. Kết quả tổng hợp các giai đoạn chiết xuất và tinh chế paclitaxel được trình
bày trong bảng 3.49.
 95

Bảng 3.49. Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các
giai đoạn chiết xuất, tinh chế
Hàm lượng paclitaxel Hiệu suất từng giai
Giai đoạn chiết xuất tinh chế (%) đoạn (%)
Chiết xuất MeOH 0,50 ± 0,02 97,30 ± 0,56
Chiết xuất DCM 5,93 ± 0,25 91,94 ± 1,45
Loại tạp bằng than hoạt 7,81 ± 0,18 88,68 ± 2,58
Kết tủa trong n-hexan 25,37 ± 1,12 82,43 ± 1,76
Kết tủa trong MeOH: H2O 60,46 ± 1,05 71,41 ± 1,45
Tinh chế bằng sắc ký cột lần 1 93,11 ± 1,74 91,97 ± 2,61
Tinh chế bằng sắc ký cột lần 2 98,07 ± 0,97 92,74 ± 3,09
Cả quá trình 98,07 39,83
Kết quả bảng 3.49 cho thấy: hiệu suất của cả quá trình chiết xuất và tinh
chế đạt 39,83%, trong khi hàm lượng sản phẩm cuối cùng đạt 98,07%.

Hình 3.18. Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel

a. paclitaxel chuẩn b: paclitaxel chiết từ sinh khối (98,07%)

Trên sắc ký đồ của paclitaxel chuẩn và thử không xuất hiện các píc lạ,
thời gian lưu của paclitaxel của mẫu thử trùng với thời gian lưu của chuẩn.
Từ các kết qủa nghiên cứu, xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế
paclitaxel từ sinh khối tế bào thông đỏ được trình bày trong sơ đồ hình 3.19.
 96

Sinh khối

Dung môi MeOH, tỷ lệ 1:4(kl/tt)

Chiết siêu âm, 4 lần x 1h
Lọc, cô dưới áp suất giảm

Bã DL Dich chiết MeOH

NaCl 5%, tỷ lệ 1:1

DCM, tỷ lệ 1:4(kl/tt)
chiết lỏng lỏng, cô dưới áp suất giảm, t0

Dịch chiết Dịch chiết

MeOH DCM

Than hoạt, tỷ lệ 3:1

Khuấy trong 30p
Lọc, rửa, cô dưới áp suất giảm, t0 phòng

Than hoạt + tạp Dịch chiết DCM đã

xử lý hấp phụ

n-hexan, tỷ lệ 10:1
Khuấy
Lọc thu tủa, sấy chân không

Dịch lọc Tủa thô

MeOH, tỷ lệ 0,5%(kl/tt)
Nhỏ giọt nước cất pH 8,
Khuấy
Lọc thu tủa, sấy chân không

Dịch lọc Tinh thể

Sắc ký cột 2l

Paclitaxel tinh khiết

Hình 3.19. Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ

 97

3.2.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu sinh
khối tế bào thông đỏ và hoạt chất

3.2.4.1. Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của nguyên liệu

Qua khảo sát phân tích các chỉ tiêu của sinh khối thông đỏ thu được các
kết quả như sau:

* Hình thức cảm quan: Khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm
mốc, không có mùi lạ.

* Độ ẩm: Cân chính xác khoảng 1,000 g sinh khối tế bào thông đỏ.
Tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục 9.6-DĐVN IV. Kết quả xác
định độ ẩm trong các mẫu sinh khối tế bào thông đỏ được trình bày trong
bảng 3.50

Bảng 3.50. Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ
Khối lượng dược Khối lượng dược liệu
Mẫu Độ ẩm (%)
liệu ban đầu (g) sau khi sấy khô (g)
1 1,1124 1,0568 5,00
2 1,1920 1,1429 4,12
3 1,1154 1,0612 4,86
4 1,0256 0,9784 4,60
5 1,0325 0,9827 4,82
X ± SD 4,68 ± 0,34

Kết quả bảng 3.50 cho thấy độ ẩm trong sinh khối tế bào thông đỏ là
4,68 ± 0,34%.

* Tro toàn phần: Cân chính xác khoảng 1,500 g sinh khối, tiến hành
xác định tro toàn phần theo phương phương pháp mô tả trong phụ lục 9.8 –
DĐVN IV. Kết quả xác định tro toàn phần có trong sinh khối tế bào thông đỏ
được trình bày trong bảng 3.51.
 98

Bảng 3.51. Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ

Khối lượng dược Tro toàn phần

Mẫu Khối lượng tro (g)
liệu ban đầu (g) (%)
1 1,5235 0,0943 7,19
2 1,5795 0,0979 6,20
3 1,5987 0,1092 6,83
4 1,5654 0,1001 6,39
5 1,5901 0,0976 6,14
X ± SD 6,35 ± 0,28

Kết quả bảng 3.51 cho thấy khối lượng tro toàn phần trong sinh khối tế
bào thông đỏ là 6,35 ± 0,28 %.

* Tro không tan trong acid: Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở
4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục thêm 25 ml dung dịch HCl 2M
(TT), tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục 9.7 – DĐVN IV
(phương pháp 1). Kết quả xác định tro không tan trong acid trong sinh khối tế
bào thông đỏ được trình bày trong bảng 3.52.
Bảng 3.52. Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ

Khối dược liệu Khối lượng tro Tro không tan

Mẫu
(g) (mg) trong acid (%)
1 1,5235 2,7 0,13
2 1,5795 2,6 0,12
3 1,5987 3,3 0,15
4 1,5654 1,8 0,09
5 1,5901 2,5 0,09
X ± SD 0,11 ± 0,02

Kết quả bảng 3.52 cho thấy: khối lượng tro không tan trong acid trong
dược liệu sinh khối thông đỏ là 0,11 ± 0,02 %.

* Định tính: Cân khoảng 500 mg sinh khối tế bào thông đỏ. Tiến hành
định tính paclitaxel và baccatin III theo phương pháp HPLC đã xây dựng ở
phần 3.2.1.1. Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.20:
 99

0.025

18.626
0.020

31.144
0.015

AU
0.010

0.005

0.000

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Minutes

0.025

0.020
b

31.131
0.015
AU

0.010
18.650

0.005

0.000

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Minutes

Hình 3.20. Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b)
Trên hình ảnh của sắc ký đồ của mẫu thử cho các píc thời gian lưu trùng
với thời gian lưu của paclitaxel và baccatin III trong mẫu chuẩn.
* Định lượng:
- Cân chính xác khoảng 0,5 g bột mịn sinh khối thông đỏ, chiết bằng
dung môi methanol (10 ml x 3 lần). Tiếp tục làm theo phương pháp đã mô tả
trong phần 3.2.1.1. Kết quả được trình bày trong bảng 3.53.
Bảng 3.53. Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế
bào thông đỏ
Mẫu Khối lượng mẫu Độ ẩm mẫu Paclitaxel Baccatin III (%)
cân (mg) (%) (%)
1 524,5 4,98 0,0363 0,0065
2 498,6 5,04 0,0369 0,0057
3 516,7 4,97 0,0355 0,0062
4 505,2 4,45 0,0361 0,0063
5 501,9 4,69 0,0357 0,0058
6 517,4 4,87 0,0354 0,0061
X ± SD 0,0360±0,0006 0,0061 ±0,0003
 100

Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ lần
lượt là 0,0360 và 0,0061%.
Từ kết quả trên, đưa ra TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ như sau:
* Nguồn gốc: Là khối tế bào thông đỏ được tạo ra bằng công nghệ sinh
khối tế bào thực vật từ nguồn thân non thông đỏ tự nhiên (Taxus wallichiana
Zucc.). Sinh khối tế bào thông đỏ thu hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa,
sấy khô.

YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG

* Hình thức: Khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc, không
có mùi lạ.
* Độ ẩm: không quá 12 %.
* Tro toàn phần: không quá 8%.
* Tro không tan trong acid: không quá 2%.
* Định tính: Phải thể hiện phép thử định tính của paclitaxel và baccatin
III.
* Định lượng:
+ Hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ không ít hơn
0,03%.
+ Hàm lượng baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ không ít hơn
0,005%.
PHƯƠNG PHÁP THỬ
- Hình thức: Kiểm tra bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã
nêu.
- Độ ẩm: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 (1g, 850C trong 5 giờ).
- Tro toàn phần: Lấy 1,5 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 1, phụ
lục 9.8, DĐVN IV (nung ở 5000C).
- Tro không tan trong acid: theo phương pháp 1, phụ lục 9.7, DĐVN IV.
- Định tính baccatin III và paclitaxel:
 101

Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các pic
cùng thời gian lưu với các pic baccatin III và paclitaxel trong sắc ký đồ của
các dung dịch baccatin III và paclitaxel chuẩn.
- Định lượng: Phương pháp HPLC (Phụ lục 5.3, DĐVN IV)
™ Hoá chất và thuốc thử:
- Acetonitril: loại dùng cho HPLC.
- Methanol, n-hexan, diclorometan (TT).
- Dung dịch natri clorid 5% (TT).
- Natri sulfat khan (TT).
™ Điều kiện sắc ký:
- Cột Phenomenex, Luna 5μm PFP 100 A0 (25cm x 4mm) hoặc cột
tương đương
- Pha động: Hỗn hợp Acetonitril - nước với chương trình dung môi:
Thời gian (phút) Dung môi A Dung môi B
0 - 45 25 - 62 75 - 38
45 - 55 62 - 25 38 - 75
55 - 65 25 75

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

- Detector UV ở bước sóng 228 nm.
- Thể tích tiêm: 20 μl.
™ Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:
- Dung dịch thử:
Cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm đã nghiền mịn vào ống ly tâm 50
ml, , thêm 10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ khoảng 1000 vòng/phút trong
5 phút, ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy dịch ly tâm,
cắn trong ống ly tâm được chiết như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml
methanol. Gộp các dịch ly tâm, chuyển vào bình gạn đã có sẵn 25 ml dung
dịch natri clorid 5%, lắc đều. Rửa loại tạp bằng n-hexan 2 lần, mỗi lần 10 ml,
gạn bỏ dịch chiết n-hexan. Lớp nước được lắc kỹ với dichlorometan 4 lần,
 102

mỗi lần 15 ml. Gộp các dịch chiết dichlorometan, lọc qua natri sulfat khan,
sau khi lọc xong rửa lớp natri sulfat bằng vài ml dichloromethan. Gộp các
dịch lọc và dịch rửa dichloromethan, bốc hơi dung môi ở 350Cdưới dòng khí
nitơ tới cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,45μm
được dung dịch tiêm sắc ký.
- Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn baccatin III trong methanol có nồng độ khoảng 5 μg
trong 1 ml.
Dung dịch chuẩn paclitaxel trong methanol có nồng độ khoảng 30 μg
trong 1 ml.
Tiến hành:
Tiêm riêng biệt 20 μl các dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ
thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả, ghi nhận sắc ký đồ,
thời gian lưu và diện tích của các pic baccatin III và paclitaxel.
Hàm lượng (%) (KL/KL) baccatin III (hoặc paclitaxel) tính theo chế
phẩm khô kiệt được tính theo công thức:
At 5 100 100
X(%) = x Cc x x
Ac 1000 mt 100-b

Trong đó:
At và Ac: Diện tích pic baccatin III (hoặc paclitaxel) trong dung dịch
thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch baccatin III (hoặc paclitaxel) chuẩn (μg/ml).
mt: Khối lượng của mẫu thử (mg).
b : Độ ẩm của bột (%).

ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN

- Đóng gói trong túi PE 2 lớp, dãn nhãn nguyên liệu

- Bảo quản nơi khô mát.
Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng trong nghiên cứu này đã được Viện Kiểm
nghiệm Trung ương thẩm định ngày 01 tháng 12 năm 2011 (Xem phụ lục 2).
 103

3.2.4.2. Kết quả kiểm nghiệm paclitaxel theo USP 30

Sản phẩm paclitaxel đã được kiểm nghiệm chỉ tiêu định lượng theo
USP 30 tại Trung tâm kiểm nghiệm Dược Hà Nội. Kết quả hàm lượng
paclitaxel đạt 98,1% (Đạt yêu cầu của USP 30 - Phiếu kiểm nghiệm số
1290/11 ngày 16 tháng 11 năm 2011 – (xem phụ lục). Như vậy, sản phẩm
paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế bào thông đỏ đạt yêu cầu về chỉ tiêu định
lượng theo USP 30.
 104

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1. QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ

4.1.1. Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ

Trong sinh khối tế bào thực vật, giai đoạn tạo callus đóng vai trò quyết
định tới thành công của cả quy trình. Nếu tạo được dòng callus phát triển tốt,
không bị biệt hóa, khả năng sinh hoạt chất cao sẽ góp phần quan trọng tới
năng suất và hiệu quả của quy trình sinh khối. Vì vậy, cần phải nghiên cứu
các điều kiện để tạo ra callus tốt sử dụng cho các bước tiếp theo của quy trình
sinh khối tế bào thực vât. Để tạo được callus có thể sử dụng nhiều loại mô ở
các bộ phận khác nhau. Thông thường hay sử dụng các mô non như đỉnh sinh
trưởng, rẽ non, lá non, cành non [87], điều này góp phần cho callus tạo ra phát
triển nhanh hơn so với các mô lấy tại các bộ phận tế bào già. Đối với tế bào
thông đỏ, các nghiên cứu trên thế giới thường sử dụng cành non, lá non và
hạt, tuy nhiên cành non là bộ phận hay được sử dụng hơn cả [48]. Trong luận
án này, sử dụng bộ phận đưa vào nuôi cấy là cành non thông đỏ.

4.1.1.1. Về lựa chọn chất sát khuẩn và thời gian tiệt khuẩn mẫu cấy

Nghiên cứu tạo callus là quá trình tách và cấy chuyển các mô, tế bào từ
cây tự nhiên vào nuôi cấy trong điều kiện vô khuẩn. Vì vậy, việc vô khuẩn mẫu
cấy quyết định tới sự thành bại của công nghệ. Để đảm bảo độ vô khuẩn cho
mẫu nuôi cấy, ngoài việc kiểm soát độ vô khuẩn của môi trường, dụng cụ và
thiết bị nuôi cấy thì việc lựa chọn chất tiệt khuẩn và thời gian tiệt khuẩn thích
hợp là rất quan trọng, nhằm làm giảm thiểu tối đa mẫu cấy bị nhiễm vi khuẩn
và vi nấm, đồng thời cũng giảm cả tỷ lệ mẫu bị chết do nhiễm độc các chất sát
khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng chất sát khuẩn HgCl2 nồng độ
0,07% kết hợp với chất hoạt động bề mặt tween 80 cho hiệu quả tiệt khuẩn tốt
nhất với tỷ lệ tạo thành callus không bị nhiễm khuẩn là 38% (bảng 3.1). Kết
quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Fornalè và cs khi tiệt khuẩn mẫu cấy
thông đỏ Châu Âu cũng sử dụng HgCl2 kết hợp với tween 20 [52].
 105

Về thời gian tiệt khuẩn mẫu cấy thông đỏ, khi tiệt khuẩn quá lâu mẫu
cấy sẽ hạn chế bị nhiễm khuẩn hơn, tuy nhiên tỷ lệ không tạo thành callus
cũng tăng lên. Điều này được giải thích là do thời gian tiếp xúc dài với chất
sát khuẩn sẽ làm mẫu bị ngộ độc chất sát khuẩn gây thâm đen và chết sau 5-
10 ngày nuôi cấy. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn cho
thấy mẫu thông đỏ khi tiệt khuẩn 17 phút thì tỷ lệ tạo thành callus trong môi
trường thạch là cao nhất đạt 45% (Bảng 3.2). Kết quả này cũng phù hợp với
các kết quả nghiên cứu của các tác giả về việc sử dụng HgCl2 để tiệt khuẩn
mẫu cấy thực vật như nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh, tế bào dừa cạn [7].

4.1.1.2. Về lựa chọn môi trường tạo callus thông đỏ

Mỗi loại thực vật đều cần một môi trường thích hợp để nuôi cấy sinh
khối tế bào nói chung và tạo callus nói riêng. Các loại sâm thường sử dụng
môi trường MS để nuôi cấy, trong khi nuôi cấy callus dừa cạn hay sử dụng
môi trường SH hoặc B5 [7]. Trong nghiên cứu này, 4 loại môi trường thông
dụng đã được khảo sát để tạo sinh khối tế bào thực vật và đánh giá kết quả
tạo thành callus thông đỏ. Kết quả khảo sát cho thấy môi trường Gamborg
(B5) cho tỷ lệ tạo callus cao nhất 73%, môi trường Murashige - Skoog (MS)
cho tỷ lệ thấp nhất 12% (Bảng 3.4). Tốc độ phát triển của tế bào trên môi
trường B5 cũng cao hơn trên các môi trường khác (Bảng 3.5). Hình thái
callus thông đỏ trên các môi trường khác nhau cũng không giống nhau.
Callus mọc trong môi trường B5 và SH, tế bào màu vàng nhạt, tươi và sáng
không bị nhiễm khuẩn. Callus mọc trên môi trường MS và White màu nâu
sẫm và tế bào phát triển chậm (Hình 3.2). Kết quả này cũng phù hợp với
nghiên cứu về lựa chọn môi trường B5 cho tạo callus thông đỏ Thái Bình
Dương (T. brevifolia) với tỷ lệ khoảng 75%, thông đỏ Châu Âu (T. baccata)
tỷ lệ 30%, thông đỏ Nhật Bản (T. cuspidata) tỷ lệ trên 50% của
Wickremesinhe và Arteca [48], nuôi cấy tạo callus thông đỏ Trung Quốc (T.
chinensis) của Luo và cs [91]. Từ kết quả khảo sát lựa chọn môi trường B5
cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ.
 106

4.1.1.3. Về thời gian chu kỳ nuôi cấy callus thông đỏ

Trong kỹ thuật sinh khối tế bào thực vật, xác định thời gian của một
chu kỳ nuôi cấy callus thực sẽ góp phần tránh được lãng phí môi trường mà tế
bào thu được vẫn đảm bảo phát triển tốt. Nếu thu hoạch nhanh thì lãng phí vì
callus còn có thể tiếp tục sinh trưởng, trong khi môi trường vẫn còn chất dinh
dưỡng. Nếu thu hoạch muộn thì không tiết kiệm được thời gian, thậm chí
callus có thể bị chết hoặc đổi màu do chất dinh dưỡng trong môi trường đã
cạn kiệt [18], [47].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: từ ngày thứ 25 đến ngày thứ 35 khối
lượng của callus tăng nhanh. Sau ngày thứ 35, tốc độ tăng của callus chậm lại
và gần như không phát triển cho đến ngày thứ 40. Đến ngày thứ 40 - 45, khối
lượng callus lại giảm. Như vậy, ngày thứ 35 là thời điểm thích hợp nhất để
thu hoạch hoặc tiếp tục cấy chuyển callus thông đỏ (Hình 3.3). Kết quả này
phù hợp với kết quả nghiên cứu của Enaksha và cs về thời điểm cấy chuyển
callus của loài T. media (35 - 42 ngày) [48], thông đỏ Châu Âu (T. baccata)
từ 28-42 ngày [21]. So với loài thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis) thì thời
gian tạo callus nhanh hơn, theo nghiên cứu của Parc [110] thấy rằng chu kỳ
nuôi cấy của callus của loài T. baccata trong môi trường B5 là 42-56 ngày.

4.1.1.4. Về ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng đến callus thông đỏ

Chất kích thích sinh trưởng đóng vai trò quan trọng đối với sự phát
triển của tế bào, đặt biệt các tế bào mới bị tách ra khỏi cơ thể, giúp duy trì quá
trình phân chia tế bào, đồng thời góp phần tăng sinh mô sẹo, hàn gắn các tổn
thương khi bị tác động từ bên ngoài [18], [64], [121].

Thông thường trong giai đoạn nghiên cứu tạo callus thì các chất kích
thích sinh trưởng hay được dùng là 2,4-D, NAA, IBA [96]. Với các loài thông
đỏ thì NAA được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy tạo callus cũng như
nuôi cấy trong môi trường lỏng [125], [127]. Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi
sử dụng chất kích thích sinh trưởng khác nhau thì tế bào phát triển cũng khác
 107

nhau. Ở môi trường sử dụng NAA và kinetin, tốc độ phát triển của callus thông
đỏ tốt hơn môi trường sử dụng 2,4-D hoặc NAA kết hợp với BAP với p < 0,05
(Bảng 3.6). Vì vậy, NAA và kinetin được lựa chọn là những chất kích thích
sinh trưởng cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ.

4.1.1.5. Về ảnh hưởng của nồng độ NAA

Trong quá trình nuôi cấy tạo callus cũng như duy trì nuôi cấy khối tế
bào thông đỏ, nhất thiết phải sử dụng các chất kích thích sinh trưởng đặc biệt
là các chất thuộc nhóm auxin (2,4-D, NAA, IBA, IAA). Đó là những chất
giúp cho quá trình phân chia tế bào nhanh hơn, đồng thời có thể làm hạn chế
quá trình biệt hóa của tế bào. Vì vậy, cần phải chọn được chất nào phù hợp
nhất và nồng độ tối ưu nhất [32], [64], [126].

Qua khảo sát, đã lựa chọn được NAA là chất kích thích sinh trưởng phù
hợp với sự phát triển của callus thông đỏ. Tuy nhiên, khi sử dụng NAA ở các
nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l thì tốc độ phát triển của callus cũng thay đổi.
Khối lượng callus của nhóm dùng NAA với nồng độ 2,0 mg/l là cao hơn so với
nhóm NAA ở nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l và 1,5 mg/l sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê (p < 0,05). Tuy nhiên, ở các nhóm dùng NAA, nồng độ 2,5 mg/l so
với nhóm dùng nồng độ 2,0 mg/l, khối lượng của callus không khác biệt (p >
0,05, bảng 3.7). Như vậy, nồng độ NAA thích hợp dùng cho duy trì nuôi cấy
callus thông đỏ là 2,0 mg/l. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của một số
nghiên cứu khác trong nuôi cấy các loài thông đỏ Thái Bình Dương, thông đỏ
Châu Âu, thông đỏ Canada, thông đỏ Nhật Bản [40], [48], [119].

4.1.1.6. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin

Việc sử dụng phối hợp các nhóm chất kích thích sinh trưởng trong nuôi
cấy tế bào thực vật là rất quan trọng vì chúng có tác dụng hiệp đồng với nhau.
Nhóm auxin giúp tăng nhanh quá trình phân bào, làm cho tế bào phát triển tốt
hơn, trong khi nhóm cytokinin (kinetin, BAP) có tác dụng chống lại sự già
 108

hóa của tế bào. Do vậy, đa phần các nghiên cứu nuôi cấy tế bào đều sử dụng
kết hợp 2 nhóm hợp chất này với nhau.

Kết quả khảo sát đã lựa chọn được kinetin phối hợp với NAA là phù hợp
trong nuôi cấy tạo callus thông đỏ. Khi nồng độ kinetin sử dụng từ 0,1 mg/l đến
0,2 mg/l thì tốc độ phát triển của tế bào tăng nhanh sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê (p<0,05, bảng 3.8). Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ kinetin lên từ 0,3
mg/l đến 0,5 mg/l thì khối lượng callus thu được thay đổi không có sự khác biệt
(p>0,05). Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với các nghiên cứu nuôi cấy tạo
callus thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia) của Enaksha khi sử dụng
NAA kết hợp với 0,2 mg/l kinetin [48]. Tuy nhiên, so với nuôi cấy tạo callus
thông đỏ Châu Âu (T. baccata) thì hàm lượng kinetin ít hơn. Fornale và cs [52]
dùng kinetin tới 0,8 mg/l. Brunakova và cs [30] dùng 0,5 mg/l cho nuôi cấy tạo
callus. Thông thường hàm lượng kinetin hay sử dụng trong nuôi cấy tạo callus
trong khoảng 0,1 -10 mg/l [87]. Kết quả cho thấy nồng độ kinetin thích hợp cho
nuôi cấy tạo callus thông đỏ là 0,2 mg/l.

4.1.2. Về duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch

Sau khi tạo được callus thông đỏ, để có thể nuôi cấy được trong môi
trường lỏng cần có giai đoạn nuôi cấy duy trì trong môi trường thạch nhằm
mục đích cho tế bào phát triển tốt hơn, khả năng sinh trưởng cao hơn và đặc
biệt tế bào ít có khả năng biệt hóa thành các mô, cơ quan khác. Sau một số lần
cấy chuyển trong môi trường thạch thích hợp, sẽ chuyển sang môi trường lỏng.

4.1.2.1. Về sự thích nghi của callus thông đỏ trong môi trường thạch

Callus thông đỏ sau khi đã được tạo ra trong môi trường thạch mềm, các
tế bào còn cứng và tiếp tục biệt hóa thành thành các cơ quan tổ chức khác như
rễ, chồi thân. Vì vậy, cần phải có giai đoạn duy trì nuôi cấy trong môi trường
thạch trong một thời gian nhất định để đảm bảo tế bào không còn biệt hóa.
Ngoài ra, tế bào phải có hình thái mềm, xốp thích hợp cho việc nuôi cấy trong
môi trường lỏng. Từ callus chúng có thể bị biệt hóa trở lại tạo ra các mô, cơ
 109

quan khác nhau và có thể hình thành những cây mới tùy theo tác động của điều
kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [18], [87], [121].

Với tế bào thông đỏ được tạo ra và cấy chuyển nhiều lần trong môi
trường B5 cho thấy tế bào phát triển chậm, sau 4-5 lần cấy chuyển tế bào vẫn
cứng và có hiện tượng biệt hóa thành chồi (hình 3.4). Trong khi cấy chuyển tế
bào sang môi trường thạch SH thì tế bào phát triển tốt hơn, hình thái tế bào qua
4 lần cấy chuyển đã mềm, xốp (Hình 3.5). Như vậy, môi trường SH là phù hợp
cho duy trì nuôi cấy tế bào thông đỏ. Kết quả nghiên cứu cho thấy có khác biệt
so với các nghiên cứu về môi trường duy trì nuôi cấy callus các loài thông đỏ
khác của Cusidó và Luo sử dụng môi trường B5 cho nuôi cấy tế bào thông đỏ
Châu Âu và thông đỏ Trung Quốc [42], [91].

Tốc độ sinh trưởng của callus thông đỏ qua các lần cấy chuyển cũng
thay đổi. Ở những lần cấy chuyển đầu tiên, tế bào phát triển chậm với tỷ lệ
tăng trưởng khoảng 1,87 lần. Tuy nhiên, các lần cấy chuyển tiếp theo tốc độ
phát triển cao hơn với tỷ lệ tăng trưởng của lần thứ 2 là 2,25 lần, lần cấy thứ 3
là 2,78 lần, lần thứ 4 là 3,51 lần và lần thứ 5 là 3,72 lần. Điều này cho thấy
sau khi cấy chuyển nhiều lần các tế bào mới dần thích nghi với thành phần
môi trường mới. Với tế bào thông đỏ sau lần cấy chuyển thứ 4-5 thì tốc độ
phát triển ổn định (bảng 3.9). Kết quả này phù hợp với các tác giả nước ngoài
nghiên cứu về nuôi cấy callus các loài thông đỏ khác khác với chu kỳ cấy
chuyển 5-7 lần [52], [110].

4.1.2.2. Về ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự phát triển của callus
thông đỏ

Nguồn hydratcarbon đóng vai trò quan trọng cung cấp chất dinh dưỡng
cho tế bào phát triển, đặc biệt khi tế bào đã bị tách ra khỏi cây. Thông thường
trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào các loài thông đỏ thường sử dụng các loại
đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, có thể sử dụng
riêng lẻ hay kết hợp. Các kết quả nghiên cứu cho thấy: khi nồng độ saccharose
sử dụng từ 10 đến 15 g/l thì tốc độ phát triển tế bào đạt 2,48 lần và 2,65 lần
 110

thấp hơn so với sử dụng ở nồng độ 20 g/l đạt 3,72 lần (sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê với p < 0,05). Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ saccharose sử dụng lên
trên 20 g/l thì tốc độ phát triển của tế bào lại giảm (bảng 3.10). Điều này có thể
do bản thân saccharose cũng gây ra stress áp lực thẩm thấu tác động vào tế bào
làm ức chế sự phát triển [102]. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với các
nghiên cứu về sử dụng nồng độ saccharose khi nuôi cấy tế bào thông đỏ Thái
Bình Dương, thông đỏ Nhật Bản, và loài thông đỏ lai T.x media [110] đều sử
dụng nồng độ saccharose là 20 g/l. Tuy nhiên, trong nuôi cấy của loài thông đỏ
Châu Âu và thông đỏ Trung Quốc nhiều tác giả sử dụng môi trường B5 với
hàm lượng saccharose là 30 g/l [42], [90]. Như vậy có thể thấy mỗi loài thông
đỏ thích nghi với mỗi loại môi trường và hàm lượng saccharose khác nhau.

4.1.2.3. Về ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của callus
thông đỏ trong môi trường thạch mềm

Nhiệt độ nuôi cấy có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến các quá trình
sinh lý và sinh hóa của tế bào. Nếu nhiệt độ nuôi cấy quá thấp các quá trình
này sẽ chậm lại dẫn đến các tế bào chậm phát triển. Tuy nhiên, nếu tăng nhiệt
độ nuôi cấy quá cao, tế bào thực vật có thể chết do các enzym bị mất hoạt tính
[57], [69], [85]. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy khối lượng callus thông đỏ
trong các mẻ nuôi cấy ở khoảng nhiệt độ từ 22 – 240C cao hơn các nhóm khác
đạt 3,72 lần, sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05). Trong khi nuôi cấy ở nhiệt độ
18 – 200C chỉ đạt 2,46 lần, khi tăng nhiệt độ từ 26 - 280C thì tỷ lệ tăng trưởng
tế bào đạt 2,61 lần, các tế bào chuyển sẫm màu và phát triển chậm hơn nhiều
so với các khoảng nhiệt độ khác (bảng 3.11). Kết quả nghiên cứu thu được
phù hợp với nghiên cứu của Huyng và cs [38] khi tạo callus thông đỏ Trung
Quốc ở nhiệt độ 240C, thông đỏ Châu Âu là 250C [106].

4.1.2.4. Về ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của callus
thông đỏ trong môi trường thạch mềm

Trong nuôi cấy tế bào thực vật, mỗi loại tế bào phát triển ở khoảng pH
thích hợp, nếu pH môi trường quá cao hoặc quá thấp thì hiệu suất nuôi cấy
 111

không cao, tế bào sinh trưởng chậm hoặc bị chết. Tuy nhiên, so với tế bào vi
khuẩn, nấm thì tế bào thực vật thường có khoảng pH thích nghi rộng hơn [47],
[57], [111].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: tốc độ phát triển của callus thông đỏ ở
môi trường có pH 5,6 là cao nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,81 lần, trong khi
ở pH = 5,0 và 5,3 tỷ lệ tăng trưởng lần lượt là 2,14 và 2,98 lần. Đặc biệt khi
nuôi cấy ở khoảng pH = 6,5 callus không phát triển được, một số bị chuyển
mầu nâu đen và có hiện tượng tế bào bị chết (Bảng 3.12). Kết quả nghiên cứu
phù hợp với nghiên cứu của các tác giả trên thế giới trong duy trì nuôi cấy
callus các loài thông đỏ (Taxus sp.) thường sử dụng khoảng pH nuôi cấy từ
5,6 đến 5,8 [42], [48], [138].

4.1.3. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng

Giai đoạn nuôi cấy trong môi trường lỏng có vai trò quan trọng. Vì
trong giai đoạn này phải xác định được môi trường nuôi cấy tốt nhất thông
qua việc đánh giá một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng
và phát triển của tế bào thực vật nói chung và tế bào thông đỏ nói riêng.
Ngoài ra, cần nghiên cứu các biện pháp kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt
chất nhằm mục đích cuối cùng là tế bào phát triển tốt nhất và hàm lượng hoạt
chất (paclitaxel) cao nhất.

4.1.3.1. Về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế
bào thông đỏ

* Về khả năng thích nghi của tế bào trong môi trường lỏng

Khi cấy chuyển tế bào từ môi trường thạch sang môi trường lỏng, thông
thường tế bào phải trải qua giai đoạn thích nghi với môi trường và điều kiện
nuôi cấy mới. Vì vậy, phải khảo sát khả năng thích nghi của tế bào bằng cách
cấy chuyển nhiều lần trong môi trường lỏng, để đánh giá tế bào có phát triển
hay không, có khả năng biệt hóa trở lại thành các bộ phận hay không. Kết quả
khảo sát số lần cấy chuyển tế bào thông đỏ cho thấy ở các lần cấy chuyển thứ
 112

nhất và thứ 2 tế bào vẫn còn cứng, vẫn liên kết với nhau. Tuy nhiên, đến lần
cấy chuyển thứ 3, thứ 4 thì tế bào đã mềm mại, tách rời nhau hoàn toàn, ít có
khả năng biệt hóa, màu sắc tế bào cũng sáng hơn so với các lần cấy chuyển
trước (hình 3.6).

Về tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển cũng
thay đổi, ở lần cấy chuyển đầu tiên tốc độ phát triển đạt 1,51 lần (bảng 3.13).
Tuy nhiên, đến lần thứ 2, thứ 3 tăng lần lượt đạt 2,20 và 2,83 lần (p<0,05).
Các lần cấy chuyển thứ 4 và thứ 5 tốc độ phát triển tế bào đạt 2,89 lần và 2,92
lần so với lần cấy chuyển thứ 3 thì không có sự khác biệt (p>0,05). Như vậy,
sau 3 - 4 lần cấy chuyển, tế bào thông đỏ đã thích nghi với môi trường nuôi
cấy mới. Kết quả nghiên cứu này cũng tương đối phù hợp với kết qủa nghiên
cứu của Yan và cs [138] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ Trung Quốc từ 4-5 lần
thì tế bào mới đồng nhất và không còn biệt hóa.

* Về ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy thông đỏ trong môi trường lỏng

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới lượng tế bào thu được cũng như
quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất. Quá trình sinh trưởng và phát triển của
tế bào thực vật được chia thành các pha khác nhau gồm: pha thích nghi, pha
phát triển, pha ổn định và pha suy tàn [37], [111], [112].

Tại pha thích nghi các tế bào thực vật gần như không phát triển, nó chỉ
phải thích nghi với điều kiện và môi trường nuôi cấy mới. Tại pha phát triển
các tế bào đã trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo
hàm lũy thừa. Tại pha dừng các tế bào gần như không phát triển và không
nhân lên, tốc độ phát triển của tế bào trong môi trường tiến dần tới ổn định.
Giai đoạn này quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp gia tăng.
Cuối cùng là pha suy tàn, tại pha này các tế bào thực vật bắt đầu giảm dần, do
trong môi trường hết chất dinh dưỡng, biểu hiện bên ngoài là thay đổi màu sắc
tế bào và pH môi trường tăng lên. Mỗi một loại tế bào thực vật có quá trình
phát triển khác nhau. Kết quả nghiên cứu với tế bào thông đỏ cho thấy: từ
ngày nuôi cấy thứ 1 đến ngày nuôi cấy thứ 4 các tế bào phát triển chậm tương
 113

ứng với pha thích nghi, từ ngày thứ 4 đến ngày 12 tế bào phát triển nhanh và
đạt tối đa ở ngày thứ 14 ứng với pha phát triển, từ ngày thứ 14 đến 16, tốc độ
phát triển của tế bào khá ổn định và có xu hướng chậm dần lại ứng với pha
dừng. Sau ngày thứ 16 thì khối lượng tế bào thông đỏ gần như không tăng,
thậm chí còn giảm, tế bào có hiện tượng sẫm màu. Giai đoạn này tương ứng
với pha ly giải hay pha suy tàn (hình 3.7).

Như vậy, thời gian cho 1 chu kì nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi
trường lỏng đã rút ngắn xuống chỉ còn 14 ngày so với nuôi cấy trong môi
trường thạch là 35 ngày. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với các nghiên cứu
về thời gian nuôi cấy loài T. chinensis của tác giả Choi và cs [38] là 14 ngày,
loài T. chinensis var. mairei là 15 ngày [138].

* Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy trong môi trường

Lượng mẫu cấy ban đầu quyết định đến thời gian của một chu kỳ nuôi
cấy, thông thường nếu lượng mẫu cấy ban đầu cho vào nhiều thì thời gian 1
chu kỳ nuôi cấy ngắn và ngược lại. Ngoài ra, tỷ lệ mẫu quyết định mật độ tế
bào, mật độ tế bào càng cao thì khả năng tiếp xúc tế bào - tế bào càng cao, điều
này giúp cho tế bào phát triển nhanh hơn [85].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi sử dụng tỷ lệ mẫu cấy từ 10% thì tốc độ
phát triển đạt 1,53 (bảng 3.14). Nếu tăng tỷ lệ sử dụng mẫu cấy 15% và 20% thì
tốc độ phát triển tế bào tăng nhanh đạt 2,46 và 2,83 lần (p<0,05). Tuy nhiên nếu
tiếp tục tăng tỷ lệ mẫu cấy tới 25% thì tốc độ phát triển của tế bào tăng không
nhiều đạt 2,99 lần, thậm chí tốc độ phát triển tế bào còn giảm xuống 2,60 lần sau
14 ngày nuôi cấy. Điều này có thể là do khi mật độ tế bào nuôi cấy quá cao sẽ
làm tế bào phát triển nhanh hơn song cũng sớm đạt ổn định hơn do dinh dưỡng
môi trường đã hết. Như vậy, với nuôi cấy tế bào thông đỏ, để tăng tốc độ sinh
trưởng trong môi trường lỏng thì tỷ lệ mẫu cấy ban đầu khoảng 20%. So với các
kết quả nghiên cứu đối với các loài thông đỏ khác thì tốc độ phát triển của tế bào
thông đỏ đã cao hơn. Luo và cs [91] khi nuôi cấy tế bào T. chinensis đã sử dụng
tỷ lệ mẫu cấy ban đầu so với môi trường nuôi cấy là 5%, sau 14 ngày nuôi cấy tỷ
 114

lệ tăng trưởng của tế bào chỉ đạt 1,82 lần. Trong khi nuôi cấy tế bào loài T.
baccata tốc độ tăng trưởng của tế bào đạt 1,88 lần khi sử dụng tỷ lệ mẫu cấy ban
đầu là 10% [41]. Osorio và cs [107] khi nuôi cấy tế bào (T. wallichiana) sử dụng
tỷ lệ mẫu cấy khoảng 10% thì sau 28 ngày nuôi cấy tốc độ phát triển tế bào mới
tăng 3,05 lần, như vậy so với kết quả nghiên cứu của luận án thì thời gian nuôi
cấy đã phải kéo dài hơn 14 ngày. Đối với tế bào thông đỏ, trong quá trình nuôi
cấy hoạt chất paclitaxel có thể tiết ra môi trường nuôi cấy và chính nó ức chế
ngược lại sự phát triển của tế bào. Vì vậy, nếu sử dụng tỷ lệ mẫu cấy thấp có thể
làm cho tế bào chậm phát triển [147].

* Về ảnh hưởng của pH của môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và quá trình tổng hợp
hoạt chất vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Tuy nhiên, sự thay đổi của pH
môi trường nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của mô thực vật [33],
[55].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: với nuôi cấy tế bào thông đỏ, khi pH môi
trường nuôi cấy tăng từ 5,2 đến 5,6 thì tốc độ phát triển của tế bào cũng tăng và
đạt cao nhất ở pH=5,6 với tỷ lệ tăng trưởng đạt 2,83 lần. Tuy nhiên, nếu pH
môi trường nuôi cấy tiếp tục tăng từ 5,8 đến 6,2 thì tốc độ phát triển của tế bào
giảm (p < 0,05) (bảng 3.15). Như vậy, ở pH = 5,6 thì tốc độ phát triển tế bào
tốt nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt khoảng 2,83 lần. Kết quả nghiên cứu này
phù hợp với các kết quả nghiên cứu sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis) [6], tế bào dừa cạn, tế bào thuốc lá [56] và các loài thông đỏ
khác [72], [140].

* Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tế bào thông đỏ trong
môi trường lỏng

Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào
thực vật và sự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp. Mỗi loại tế bào thực
vật có một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định [69], [85]. Kết quả nghiên
 115

cứu cho thấy: khi nuôi cấy ở nhiệt độ thấp, tốc độ phát triển của tế bào chậm
(ở 180C tỷ lệ tăng trưởng đạt 1,93 lần). Khi nhiệt độ tăng dần, tốc độ phát
triển tế bào tốt hơn. Ở nhiệt độ từ 240C, tỷ lệ tăng trưởng tốt nhất đạt 2,83 lần
(bảng 3.16). Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ nuôi cấy trên 280C, thì các tế
bào thông đỏ phát triển chậm lại. Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy
sinh khối tế bào thông đỏ là 240C. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với
kết quả nghiên cứu của các tác giả về nuôi cấy tế bào các loài thông đỏ khác
nhau [38], [41].

4.1.3.2. Về ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy tới tốc độ phát
triển tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng

Trong sinh khối tế bào thực vật, nuôi cấy trong môi trường lỏng là giai
đoạn quan trọng, quyết định đến hiệu suất, hàm lượng hoạt chất. Trong các
yếu tố ảnh hưởng, thì thành phần môi trường đóng vai trò quyết định. Các
chất kích thích sinh trưởng, hàm lượng đường liên quan đến tốc độ phát triển
của tế bào cũng như sự hình thành các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp [32],
[57], [59].

* Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng

Trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ thường sử dụng 2 nhóm chất
kích thích sinh trưởng chính là auxin (NAA; 2,4-D; 2,4,5-T, picloram) và
cytokinin (kinetin, BAP). Kết quả của các nghiên cứu trước đây cho thấy: việc
phối hợp chất kích thích sinh trưởng cho hiệu quả cao hơn dùng riêng lẻ từng
chất. Điều này được giải thích là do sự tác động đồng thời nhiều cơ chế khác
nhau làm thúc đẩy nhanh sự phân chia tế bào cũng như các con đường chuyển
hóa tạo ra sản phẩm thứ cấp [87].

Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào thông đỏ cho thấy: khi sử dụng các
chất kích thích sinh trưởng riêng lẻ sẽ làm tế bào phát triển chậm hơn so với
khi dùng phối hợp 2 nhóm với nhau (p < 0,05). Trong các phối hợp, thì sử
dụng cặp NAA phối hợp BAP cho kết quả tốt nhất với p < 0,05 (bảng 3.17).
 116

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Moon và cs [97], Fornalè và
cs [52] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ Châu Âu đã sử dụng môi trường SH có
bổ sung NAA kết hợp với BAP thì tốc độ phát triển tế bào đạt cao nhất.

* Ảnh hưởng của nồng độ BAP

Các chất kích thích sinh trưởng nhóm cytokinin có vài trò tăng sinh
tế bào, hạn chế quá trình già hóa của tế bào, giúp làm giảm sự biến đổi của
bộ gen góp phần ổn định tế bào [85]. Các chất hay được sử dụng trong nuôi
cấy tế bào thực vật gồm BAP, kinetin với nồng độ từ 0,1-10 mg/l.

Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi tăng nồng độ BAP từ 0,5; 1,0; 1,5
đến 2,0 mg/l thì tốc độ sinh trưởng của tế bào tăng nhanh với tỷ lệ tăng
trưởng lần lượt đạt 2,06; 2,82; 3,02 và 3,27 lần (bảng 3.18), sự khác biệt có
ý nghĩa thống kê với p<0,05. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ BAP tới
2,5; 3,0 và 3,5 thì tốc độ sinh trưởng tế bào tăng không đáng kể (p>0,05) và
lần lượt đạt 2,28; 3,30 và 3,34 lần. Như vậy, nếu dùng quá nhiều BAP thì tế
bào không phát triển thêm nhiều mà lại gây lãng phí hóa chất, ngoài ra có
thể tồn dư trong sản phẩm sẽ ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất và tinh chế
sản phẩm. Vì vậy, với nồng độ BAP sử dụng là 2,0 mg/l là thích hợp cho
nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng, với khối lượng tế bào khô
thu được đạt 33,56 g/l. So với các nghiên cứu về nuôi cấy các loài thông đỏ
khác trên thế giới thì nồng độ BAP sử dụng cao hơn [41], [107]. Điều này
một phần là do tỷ lệ mẫu cấy trong nuôi cấy tế bào thông đỏ cao hơn so với
các loài thông đỏ khác.

* Ảnh hưởng của nồng độ NAA

Chất kích thích sinh trưởng liên quan tới quá trình phân chia tế bào,
giúp cho tế bào phát triển nhanh. Đồng thời, nó cũng liên quan đến các quá
trình sinh hóa như kích hoạt các enzym tham gia vào các qúa trình chuyển
hóa tạo các sản phẩm thứ cấp, như lipase và NADPH oxidase giúp tăng tích
 117

lũy hoạt chất trong tế bào [96]. Cũng như các chất kích thích sinh trưởng
nhóm cytokinin, mỗi loại tế bào phù hợp với khoảng nồng độ nhất định [87].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi sử dụng NAA từ nồng độ 1,0 mg/l đến
3,0 mg/l thì tốc độ phát triển của tế bào đã tăng nhanh từ 2,53 lần đến 4,01 lần
(p<0,05). Nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 4,0; 5,0 hoặc 6,0 mg/l thì tốc độ
phát triển tế bào tăng không đáng kể (với p>0,05) và lần lượt đạt 4,05; 4,07;
4,09 lần (bảng 3.19). Như vậy, nồng độ NAA phù hợp cho nuôi cấy tế bào
thông đỏ trong môi trường lỏng là 3,0 mg/l. Nếu sử dụng nồng độ cao quá tế
bào không phát triển nhiều hơn sẽ gây lãng phí hóa chất, đồng thời có thể gây
tồn dư chất kích thích sinh trưởng trong sản phẩm sau thu hoạch làm phức tạp
thêm cho chiết xuất tinh chế sản phẩm. Khosroushahi và cs [72] khi nuôi cấy
thông đỏ Châu Âu đã sử dụng NAA 2,0 mg/l kết hợp với 2,4-D 0,2 mg/l, sau
28 ngày nuôi cấy đạt tốc độ phát triển tế bào cao nhất. Bonfill [27] sử dụng
nồng độ NAA 2,0 mg/l kết hợp 0,1 mg/l BAP ở giai đoạn tăng sinh tế bào.
Nuôi cấy tế bào thông đỏ Trung Quốc, Kim [77] cũng sử dụng NAA với nồng
độ 2,0 mg/l. Như vậy, so với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác về nuôi
cấy tế bào các loài thông đỏ thì hàm lượng NAA sử dụng cao hơn. Tuy nhiên,
điều này có thể giải thích là do tỷ lệ mẫu cấy của tế bào thông đỏ (20%) cao
hơn so với các nghiên cứu trên (chỉ dùng 10%) nên hàm lượng chất kích dùng
nhiều hơn.

* Ảnh hưởng của nồng độ đường tới tốc độ phát triển của tế bào
thông đỏ trong môi trường lỏng

Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát
triển khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách ly hoàn toàn ra khỏi
cây. Các chất hay sử dụng là đường glucose, saccharose, maltose, fructose…
Các loại đường này có thể sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong quá trình nuôi
cấy.

Kết quả nghiên cứu về sử dụng nồng độ saccharose trong nuôi cấy tế
bào thông đỏ cho thấy khi nồng độ đường sử dụng ở nồng độ 15, 20, 25 và 30
 118

g/l thì tốc độ phát triển tế bào thông đỏ tăng nhanh (p<0,05) và lần lượt là
3,02; 4,01; 4,41 và 5,14 lần (bảng 3.20). Nếu tiếp tục tăng nồng độ đường sử
dụng tới 35 g/l thì tốc độ phát triển tế bào giảm (đạt 4,65 lần). Điều này có thể
giải thích là khi nồng độ đường quá cao sẽ tạo ra stress áp lực thẩm thấu quá
lớn tác động vào tế bào gây ức chế tế bào phát triển [102]. Như vậy nồng độ
đường thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng là 30 g/l.
Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với kết của nghiên cứu của Luo [91] về
nuôi cấy tế bào thông đỏ Trung Quốc sử dụng 30 g/l saccharose. Tương tự
như vậy Moyano [98], hoặc Bonfill [26], [27] cũng sử dụng saccharose 30 g/l
cho nuôi cấy tế bào thông đỏ Châu Âu.

4.1.3.3. Về sử dụng chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất trong
sinh khối tế bào thông đỏ

Chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) là những chất có bản
chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác dụng kích thích tạo các sản
phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các mầm bệnh xâm nhập vào tế bào
thực vật, trong đó có việc kích thích làm tăng tổng hợp các sản phẩm thứ cấp
[11]. Trong nuôi cấy tế bào các loài thông đỏ việc sử dụng các elicitor đã thu
được nhiều thành tựu khả quan, góp phần cải thiện và nâng cao hàm lượng
paclitaxel trong tế bào [102], [119], [125]. Tuy nhiên, cũng giống như nuôi
cấy các tế bào thực vật khác việc lựa chọn được loại elicitor cũng như điều
kiện sử dụng chúng là rất cần thiết.

* Về ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất

Hiện có rất nhiều loại elicitor khác nhau, thông thường các elicitor được chia
thành 2 loại (theo phân loại nguồn gốc), mỗi loại có cơ chế kích thích khác nhau.
Mỗi elicitor có khả năng kích thích sinh hoạt chất cũng khác nhau với từng loại tế
bào và với từng hoạt chất khác nhau trong cùng một loại tế bào [22], [102], [119].
Trong nghiên cứu này sử dụng cả 2 loại elicitor gồm: dịch chiết cao nấm men
100 µg/g tế bào tươi (elicitor hữu sinh), JA, MJ, FA,CA, SA nồng độ 150 µM
(elicitor vô sinh). Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng elicitor, hàm lượng
 119

paclitaxel đều tăng hơn so với nhóm chứng. Trong các chất kích thích đã được
sử dụng, methyl jasmonat cho hiệu suất tốt nhất (đạt 9,39 mg/l) so với các chất
còn lại (bảng 3.21). Tuy nhiên, khi sử dụng các elicitor, khối lượng tế bào thu
được giảm so với nhóm không dùng (p<0,05). Điều này được giải thích là do
bản thân các elicitor cũng là những yếu tố bất lợi đối với tế bào, các yếu tố
này khi tiếp xúc với tế bào sẽ ức chế sự phát triển [101], [103]. Như vậy, đối
với nuôi cấy tế bào thông đỏ, khi sử dụng methyl jasmonat đã làm tăng hàm
lượng paclitaxel trong tế bào khoảng 1,5 lần so với nhóm chứng và tăng cao
nhất so với các loại elicitor khác.

Acid jasmonic (JA) và các dẫn chất từ lâu đã được sử dụng để làm chất
kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (con đường jasmonat) [51]. Các dẫn chất
tương tự JA bao gồm methyl jasmonat, ethyl jasmonat cũng có tác dụng
tương tự. Hiện nay người ta đã chứng minh được cơ chế tác động của acid
jasmonic và đây được coi là chất trung gian để hoạt hóa các phân tử oxylipins
từ đó biểu hiện gen kích thích sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp
trong thực vật [58], [99], [128].

Yukimune và cs [144] đã thêm methyl jasmonat (MJ) 100µM vào ngày

thứ 14 của chu kỳ nuôi cấy tế bào T. baccata. Kết quả hàm lượng paclitaxel
đã tăng từ 0,4 mg/l lên 48,3 mg/l so với nhóm chứng. Wang [135] khi nghiên
cứu kích thích tăng hoạt chất của loài T. chinensis đã thêm 100 µM MJ ở
ngày thứ 7, sau 14 ngày nuôi cấy tất cả các hoạt chất đều tăng hơn so với
nhóm không dùng MJ, trong đó paclitaxel tăng từ 412 µg/g lên 3153 µg/g;
baccatin III từ 7µg/g lên 69µg/g; 10 deacetyl baccatin III từ 203µg/g lên
456µg/g. Một nghiên cứu khác của Ketchum và cs [70] khi thêm MJ ở ngày
thứ 8 trong nuôi cấy tê bào thông đỏ Canada (T. canadensis) sau 10 ngày tiếp
xúc thì hàm lượng paclitaxel đạt 14,4 mg/l. Như vậy, kết quả nghiên cứu thu
được cũng phù hợp với các nghiên cứu khác khi sử dụng methyl jasmonat làm
chất kích thích sinh tổng hợp paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ (T.
wallichiana). Tuy nhiên mức độ tăng còn thấp hơn so với các loài khác. Điều
 120

này có thể do bản chất loài khác nhau. Ngoài ra, còn chưa tối ưu được các
điều kiện về sử dụng elicitor như nồng độ, thời gian tiếp xúc, thời điểm tiếp
xúc của elicitor với tế bào.

Trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ, ngoài sử dụng MJ và các dẫn
chất, các nhà khoa học còn sử dụng rất nhiều các elicitor khác như: dịch chiết
các loại nấm [133], [143]; các muối vô cơ AgNO3, VSO4, VOSO4, La+3 [25],
[42], [137]. Các chất này có thể sử dụng riêng rẽ, kết hợp với nhau, hoặc kết
hợp sử dụng với các tiền chất [54], thêm đường vào giữa chu kỳ nuôi cấy
[89], [97].

* Về khảo sát nồng độ chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất phù hợp
với sinh khối thông đỏ trong môi trường lỏng

Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình kích thích
sinh hoạt chất. Nếu sử dụng nồng độ thấp có thể hiệu quả đáp ứng chưa đạt yêu
cầu, còn nếu sử dụng nồng độ cao có thể là cho tế bào thực vật bị chết dẫn tới
làm giảm hiệu suất của sản phẩm [102], [103]. Kết quả khảo sát nồng độ
methyl jasmonat cho thấy: ở nồng độ MJ 100 µM thì hàm lượng paclitaxel đạt
cao nhất đạt 10,39 mg/l, trong khi đó nếu nồng độ MJ nhỏ hơn 100 µM hoặc
lớn hơn 100 µM thì hàm lượng paclitaxel đều giảm, ngoài ra khi dùng nồng độ
MJ càng cao thì khối lượng tế bào thông đỏ càng giảm nhiều (bảng 3.22). Kết
quả này cũng phù hợp với nghiên cứu các tác giả khác trên thế giới vế sử dụng
nồng độ MJ trong nuôi cấy các loài thông đỏ [50], [70], [135]. Như vậy, có thể
thấy rằng nồng độ MJ thích hợp cho nuôi cấy tế bào các loài thông đỏ nói
chung và thông đỏ nói riêng để kích thích tăng sinh hoạt chất là 100 µM.

* Thời gian tiếp xúc của tế bào thông đỏ với chất kích thích sinh tổng
hợp hoạt chất

Bản thân elicitor cũng được coi là những yếu tố bất lợi đối với tế bào
[65]. Khi elicitor tiếp xúc với tế bào, bắt đầu ức chế sự phát triển tế bào, chính
vì vậy tế bào không những không phát triển mà còn chết do các yếu tố bất lợi
 121

đó. Trong thời gian tiếp xúc giữa elicitor và tế bào, chủ yếu xảy ra quá trình
sinh tổng hợp hoạt chất trong tế bào theo cơ chế bảo vệ của tế bào thực vật
chống lại tác động bất lợi của môi trường bằng việc sản xuất ra các hợp chất
thứ cấp. Thời gian tiếp xúc càng nhiều thì khối lượng tế bào càng giảm,
nhưng kéo dài quá trình sinh tổng hợp hoạt chất trong tế bào. Tuy nhiên, nếu
tiếp tục kéo dài thời gian tiếp xúc với elicitor khi đó quá ức chế tế bào của
elicitor càng tăng dẫn đến làm cho tế bào chết nhiều hơn.

Kết quả nghiên cứu với sinh khối tế bào thông đỏ cho thấy khi cho
methyl jasmonat tiếp xúc càng lâu thì hàm lượng paclitaxel càng tăng và đạt
cao nhất 12,32 mg/l sau 5 ngày nuôi cấy (bảng 3.23). Nếu kéo dài tới ngày thứ
7 thì khối lượng tế bào giảm dần, đồng thời hàm lượng paclitaxel cũng giảm đi
nhiều.

Các nghiên cứu về thời gian tiếp xúc của tế bào với elicitor trong nuôi
cấy các loài thông đỏ cho thấy thời gian tối ưu khoảng 7 – 16 ngày. Yan và cs
[138] khi sử dụng MJ nồng độ 100 µM trong thời gian 7 ngày thì hàm lượng
paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ đạt cao nhất. Trong khi Ketchum
[70] cho MJ tiếp xúc với dòng tế bào OC93P của loài thông đỏ Canada trong
12 ngày, còn khi dòng tế bào C93AD là 5 ngày. Một nghiên cứu khác đối với
loài thông đỏ Châu Âu [106] cho thấy khi sử dụng MJ bổ sung vào ngày thứ 8,
sau 16 ngày tiếp xúc với tế bào thì hàm lượng paclitaxel đạt cao nhất 18,2 mg/l.
Như vậy, so với nuôi cấy tế bào thông đỏ thì thời gian tiếp xúc với elicitor có
khác so với các loài thông đỏ khác. Điều này được giải thích do bản loài khác
nhau, không những với cùng một loài nhưng các dòng tế bào khác nhau cũng
có sự đáp ứng với elicitor khác nhau [35].

* Về khảo sát thời điểm tiếp xúc của tế bào thông đỏ với chất kích thích
sinh tổng hợp hoạt chất trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ

Trong nuôi cấy tế bào thực vật, sự phát triển của tế bào thường trải qua
4 pha khác nhau: pha thích nghi, pha phát triển, pha dừng và pha suy tàn.
Trong đó tại pha dừng là thời điểm quá trình sinh tổng hợp hoạt chất bắt đầu khởi
 122

động do vậy hàm lượng hoạt chất trong tế bào được tích lũy nhiều trong pha này. Vì
vậy, việc bổ sung elicitor vào pha ổn định sẽ kích thích tăng mạnh hơn quá trình
sinh tổng hợp hoạt chất và làm cho hàm lượng hoạt chất trong tế bào cao hơn mà
không ảnh hưởng nhiều đến tốc độ phát triển tế bào [102].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi bổ sung MJ vào ngày thứ 4 của chu
kỳ nuôi cấy (pha thích nghi), ngày thứ 6, 8, 10 (pha phát triển) hoặc ngày thứ
14, 16 (pha suy tàn) thì hàm lượng paclitaxel đều giảm hơn so với bổ sung ở
ngày thứ 12 (bắt đầu pha ổn định). Thậm chí nếu bổ sung MJ vào ngày thứ 4
của chu kỳ nuôi cấy thì hàm lượng paclitaxel giảm nhiều chỉ đạt 4,72 mg/l
(bảng 3.24). Trong khi nếu bổ sung MJ vào ngày thứ 12 thì hàm lượng
paclitaxel đạt cao nhất 12,45 mg/l. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các
nghiên cứu về sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [8].
Onrubia và cs [106] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ Châu Âu, đã bổ sung MJ ở ngày
thứ 8 (bắt đầu chuyển sang pha ổn định) thì hàm lượng paclitaxel đạt cao nhất sau
16 ngày tiếp xúc. Như vậy, thời điểm bổ sung elicitor thích hợp là ngày thứ 12 (pha
ổn định) trong quá trình nuôi cấy tế bào thông đỏ.

4.1.3.4. Về việc sử dụng kết hợp giữa bổ sung saccharose và elicitor trong nuôi
cấy tế bào thông đỏ

* Ảnh hưởng việc sử dụng kết hợp bổ sung saccharose và elicitor

Đường đóng vai trò vô cùng quan trọng cung cấp dinh dưỡng cho tế
bào phát triển. Nếu trong môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng này tế bào sẽ
không phát triển được. Do vậy, hiện nay các nhà khoa học đã sử dụng chiến
lược thêm đường vào giữa chu kỳ nuôi cấy nhằm mục đích duy trì và kéo dài
thời gian sinh trưởng của tế bào [59]. Ngoài ra, đường khi thêm vào cũng tạo
ra stress áp lực thẩm thấu, khi áp suất thẩm thấu tăng tác động vào tế bào sẽ
kích thích sản xuất các sản phẩm thứ cấp [77].
Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi thêm đường vào các giai đoạn khác
nhau của chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ thì hàm lượng paclitaxel thu được
sau 17 ngày cũng thay đổi (bảng 3.25), trong đó nếu bổ sung 20 g/l đường
 123

vào ngày thứ 2 (pha thích nghi) ngày thứ 6 (pha phát triển), ngày thứ 14 (pha
suy tàn) thì hàm lượng paclitaxel lần lượt đạt 9,72; 11,26 và 12,47 mg/l đều
thấp hơn so với bổ sung vào ngày thứ 10 (gần pha ổn định) đạt 15,1 mg/l
(tăng khoảng 2,5 lần so với nhóm chứng) và tăng hơn so với nhóm không bổ
sung đường ở giữa chu kỳ nuôi cấy. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên
cứu của Wang và cs [134] trong nuôi cấy tế bào T. chinensis, khi sử dụng
đường với nồng độ cao 40-50 g/l ngay từ đầu (bổ sung 20 g/l vào ngày đầu
tiên) thì hàm lượng pacltaxel giảm. Tuy nhiên, khi bổ sung đường vào ngày
thứ 7 (gần pha ổn định) thì cả khối lượng tế bào và hàm lượng paclitaxel tăng
đáng kể. Một nghiên cứu khác cũng sử dụng chiến thuật này khi thêm
saccharose vào ngày thứ 16 (chu kỳ nuôi cấy 28 ngày) thì hàm lượng
paclitaxel tăng gấp 2 lần so với nhóm không bổ sung đường [89]. Như vậy,
việc bổ sung đường vào giữa chu kỳ nuôi cấy đã cải thiện hàm lượng
paclitaxel trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ.
* Ảnh hưởng nồng độ saccharose bổ sung vào giữa chu kỳ nuôi cấy
Chiến lược kết hợp bổ sung saccharose và elicitor vào giữa chu kỳ nuôi
cấy trong sản xuất paclitaxel và các dẫn chất bằng công nghệ sinh khối tế bào
thực vật các loài thông đỏ được căn cứ vào giai đoạn phát triển của tế bào.
Thông thường giai đoạn sinh tổng hợp hoạt chất xảy ra nhiều ở pha ổn định. Vì
vậy, việc bổ sung thêm đường sẽ kéo dài thời gian của pha này, khi đó cùng với
việc thêm các elicitor, tiền chất sẽ mang lại hiệu quả đáng kể trong tổng hợp
hoạt chất. Tuy nhiên, sử dụng nồng độ đường phải thích hợp vừa để cho tế bào
phát triển tốt, đồng thời kích thích được tăng sinh hoạt chất. Bởi bản thân
đường khi sử dụng nồng độ cao sẽ ức chế sự phát triển của tế bào [134].
Kết quả nghiên cứu với tế bào thông đỏ cho thấy, khi tăng lượng đường
thêm vào môi trường nuôi cấy ở ngày thứ 10 của chu kỳ từ 5 g/l đến 20 g/l thì
hàm lượng paclitaxel (15,12 mg/l) và khối lượng tế bào thu được đều tăng và
đạt cao nhất (42,57 g/l) ở nồng độ 20 g/l (bảng 3.26). Kết quả này cũng phù
hợp với kết quả Luo và Wang [89], [134] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ Trung
Quốc Khosroushahi và cs [72] trong nuôi cấy tế bào T. baccata sử dụng kỹ
 124

thuật nuôi cấy 2 giai đoạn, giai đoạn 1 nuôi cấy trong môi trường B5 không bổ
sung elicitor, sau 10 ngày nuôi cấy chuyển sang môi trường mới bổ sung đường
và các elicitor MJ; SA, dịch chiết nấm Rhyzopus stelonifera, tiền chất
(phenylalanin). Kết quả sau 25 ngày nuôi cấy hàm lượng paclitaxel đạt 39,5
mg/l tăng 16 lần so với môi trường không sử dụng các chất trên, tăng 3 lần so
với môi trường chỉ bổ sung elicitor (13,75 mg/l). Như vậy, với chiến lược kết
hợp các yếu tố giữa cung cấp thêm đường và các elicitor cũng như tiền chất
vào giữa chu kỳ nuôi cấy hàm lượng paclitaxel đã tăng đáng kể. Tuy nhiên,
mức độ cải thiện hàm lượng hoạt chất của mỗi loài là không giống nhau. Điều
này là do sự khác biệt về đáp ứng với elicitor của các loài khác nhau. Trong
nghiên cứu này hàm lượng paclitaxel tăng 2,5 lần so với nhóm không sử dụng.

4.1.4. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít

Để sản xuất được khối lượng lớn hoạt chất thì việc nuôi cấy trên hệ
thống các bình nuôi cấy dung tích lớn (Bioreactor) rất cần thiết. Thông
thường, quá trình nuôi cấy diễn ra theo thứ tự từ các bình nuôi cấy nhỏ sau đó
tăng dần dung tích lên các bình nuôi cấy lớn nhằm tạo ra các điều kiện nuối
cấy giống nhau ở các quy mô khác nhau.

Trong điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm, bước đầu thử
nghiệm nuôi cấy tế bào thông đỏ trong hệ thống Bioreactor 5 lít cánh khuấy
thông thường với các điều kiện về môi trường, elicitor như đã khảo sát ở nuôi
cấy trong bình lắc. Kết quả sau 8 mẻ nuôi cấy, tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,6 lần và
hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt 12,92 mg/l, ngoài môi trường 1,23 mg/l
(bảng 3.27). So với nuôi cấy trên bình lắc thì tốc độ phát triển của tế bào thấp
hơn. Điều này có thể là do ảnh hưởng của các yếu tố khi triển khai nuôi cấy
trên bioreactor gặp phải là: kiểu bioreactor, nồng độ oxy hòa tan, các khí phối
hợp vào như CO2; ethylen [109], [147].

Osorio và cs [107] nghiên cứu nuôi cấy tế bào 2 loài thông đỏ T. baccata
và T. wallichiana trong hệ thống bioreactor 20 lít kiểu cánh khuấy khí nâng.
 125

Sau 28 ngày nuôi cấy thì tốc độ phát triển của tế bào cũng như hàm lượng
paclitaxel của 2 loài không giống nhau. Với loài T. baccata tốc độ phát triển
của tế bào đạt 2,59 lần, hàm lượng paclitaxel (paclitaxel trong tế bào và ngoài
môi trường) đạt 12,04 mg/l, trong khi với loài T. wallichiana tốc độ phát triển
tế bào là 3,02 lần, hàm lượng paclitaxel đạt 21,04 mg/l. Tuy nhiên, hàm lượng
paclitaxel bị ly giải ra bên ngoài môi trường của loài T. wallichiana (52%) cao
hơn so với loài T. baccata (20%). Một nghiên cứu khác [146] nuôi cấy với loài
T. chinensis trên bioreactor 1,0 lít cho thấy, sau 14 ngày tế bào phát triển tốt
nhất nhưng tỷ lệ tăng trưởng chỉ đạt 1,63 lần và hàm lượng taxuynnanin C đạt
115,2 mg/l. Như vậy, so với các nghiên cứu đã công bố thì tốc độ phát triển của
tế bào thông đỏ trong Bioreactor 5 lít cao hơn so với các loài khác. Hàm lượng
paclitaxel trong tế bào thông đỏ (12,92 mg/l) cũng cao hơn (loài T. baccata -
9,63 mg/l, loài T. wallichiana -10,10 mg/l).

Ngoài ra, khi nuôi cấy trên bioreactor gặp phải một trở ngại đáng kể là
tác động bất lợi của lực khuấy đảo của cánh khuấy lên tế bào (shear stress).
Các tế bào thực vật rất nhạy cảm với yếu tố này nên có thể bị dập nát. Khi đó
hoạt chất có thể bị ly giải ra môi trường nhiều hơn, sẽ ức chế ngược làm tế
bào chậm phát triển [119]. Để hạn chế tác động của bất lợi của chuyển động do
cánh khuấy bioractor, người ta đã sử dụng kỹ thuật bất động tế bào và kỹ thuật
nuôi cấy hai pha bằng cách thêm các chất không đồng tan vào môi trường để
giảm chuyển động tế bào, đồng thời hấp phụ các chất chuyển hóa thứ cấp sinh
ra trong môi trường góp phần tránh tác động ức chế ngược đối với tế bào [23],
[78], [131].

Như vậy, bước đầu đã nghiên cứu thử nghiệm thành công nuôi cấy tế
bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 05 lít với hàm lượng paclitaxel trong tế
bào đạt 12,92 mg/l. Tuy nhiên, để có cơ sở cho việc nâng cấp quy mô nuôi cấy
lớn hơn thì cần phải nghiên cứu khảo sát các biện pháp cải thiện tốc độ phát
triển tế bào, hàm lượng hoạt chất trong tế bào, ngoài ra nghiên cứu các kỹ thuật
 126

nhằm làm giảm ly giải hoạt chất ra môi trường góp phần thu hoạch hoạt chất
được dễ dàng hơn trong giai đoạn sau.

4.1.5. Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ

Kết quả xây dựng quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trên
bioreactor cho thấy sử dụng phương pháp lọc thông thường để lấy tế bào, đồng
thời rửa bằng nước sạch 4-5 lần thì hàm lượng paclitaxel trong tế bào thu được
không thay đổi (bảng 3.28), trong khi hàm lượng các chất tồn dư BAP và NAA
đều thấp (nằm trong giới hạn quy định của Cục bảo vệ môi trường Mỹ về tồn
dư trong hoa quả, với BAP không quá 5 ppm, NAA không quá 10 ppm) [16],
[17]. Tuy nhiên, với sinh khối tế bào thông đỏ sử dụng để chiết xuất hoạt chất
tinh khiết mà không sử dụng trực tiếp sinh khối hoặc cao toàn phần nên không
ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng.

Với tế bào thông đỏ khi nuôi cấy trên bioreactor tỷ lệ hoạt chất ly giải ra
ngoài môi trường vào khoảng 10-15% so với các nghiên cứu khác là thấp nên
trong nghiên cứu này không sử dụng các biện pháp thu hồi hoạt chất từ môi
trường bởi hiệu quả kinh tế không cao.

4.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN
LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO
THÔNG ĐỎ

4.2.1. Về nghiên cứu thành phần hóa học

4.2.1.1. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng paclitaxel và
baccatin III bằng HPLC

Để khảo sát đánh giá tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm trong quá trình xây
dựng quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ cũng như xây dựng TCCS cho sản
phẩm cuối cùng. Tiến hành xây dựng phương pháp định lượng paclitaxel và
baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ bằng HPLC. Đây là những hoạt
chất chính có trong sản phẩm thu được. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng
 127

dung môi MeOH chiết, với điều kiện sắc ký: cột PFP Luna L43 (250x4,6 mm;
5 µm); hệ pha động ACN-H2O chạy theo theo chương trình gradient (Bảng
3.30); bước sóng: 228 nm ; tốc độ dòng: 1 ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20 µl.
Phương pháp định lượng xây dựng được đáp ứng được các yêu cầu về độ đúng,
độ chính xác, độ đặc hiệu, độ tuyến tính dùng cho phân tích, kiểm nghiệm. Kết
quả nghiên cứu cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả khác
về định lượng paclitaxel và các dẫn chất trong sinh khối cũng như cây thông đỏ
tự nhiên [21], [81], [83], [91]. Vì vậy, trong luận án đã sử dụng phương pháp
này để xây dựng TCCS của sản phẩm sinh khối, cũng như định lượng hoạt chất
để đánh giá chất lượng sản phẩm trong quá trình khảo sát xây dựng quy trình
tạo sinh khối tế bào thông đỏ.

4.2.1.2. Về định tính các thành phần hóa học

* Về định tính các nhóm hoạt chất trong sinh khối tế bào thông đỏ

Để làm cơ sở cho việc nghiên cứu thành phần hóa học của tế bào thông
đỏ, trước hết cần phải xác định trong sinh khối thông đỏ có chứa những nhóm
hợp chất nào. Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong sinh khối tế bào thông
đỏ (Bảng 3.38) cho thấy: trong sinh khối tế bào có các nhóm hợp chất alcaloid,
anthranoid, sterol, tanin và acid hữu cơ. So với thông đỏ tự nhiên thì trong sinh
khối hầu như chứa đầy đủ các nhóm như alcaloid, sterol, tanin, acid hữu cơ,
anthranoid, tuy nhiên không chứa nhóm flavonoid.

Nghiên cứu định tính bằng các phản ứng màu có giá trị định hướng cho
việc chiết xuất phân lập các nhóm hoạt chất chính trong dược liệu. Với thông
đỏ nhóm hoạt chất chủ yếu khung taxan được xếp vào nhóm alcaloid [124].
Tuy nhiên, hiện tại có rất nhiều chất chứa khung taxan song trong công thức lại
không chứa dị tố N vì vậy chúng được xếp vào nhóm diterpenoid [82].

* Về định tính các taxan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hợp chất khung taxan trong thông đỏ tự nhiên được coi là nhóm hoạt
chất tiêu biểu có giá trị như paclitaxel, baccatin III, 10-DAP, baccatin IV... Vì
 128

vậy, nghiên cứu định tính các nhóm hoạt chất này có nghĩa quan trọng, định
hướng cho việc xác định hàm lượng, chiết xuất, phân lập những chất thuộc
nhóm taxan. Kết quả nghiên cứu định tính bằng HPLC cho thấy, trong sinh
khối tế bào thông đỏ có rất nhiều píc có thời gian lưu trùng với píc của các mẫu
tế bào thông đỏ tự nhiên. So sánh với sắc ký đồ của chất chuẩn cho thấy trong
sinh khối tế bào thông đỏ có paclitaxel và baccatin III (hình 3.15). Như vậy, với
phương pháp định tính bằng HPLC so sánh với chất chuẩn có thể khẳng định
sinh khối tế bào thông đỏ có chứa paclitaxel và baccatin III.

* Về định lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ

Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào
thông đỏ cho hàm lượng paclitaxel đạt 0,0360% ; baccatin III đạt 0,0061%
(bảng 3.40). Ở thông đỏ tự nhiên hàm lượng paclitaxel thay đổi từ 0,004-
0,016% tùy theo bộ phận thu hái hoặc theo mùa thu hái. Theo Nguyễn Công
Hào và cs khi nghiên cứu định lượng một số hoạt chất trong thông đỏ cho thấy
hàm lượng paclitaxel trong vỏ thân là 0,012%, trong vỏ rễ là 0,016 %, trong lá
và thân là 0,0066% [5], [10]; Kết quả định lượng mẫu cành và lá cho thấy hàm
lượng paclitaxel đạt 0,0104%. Như vậy, so với mẫu tự nhiên (mẫu thu hái
được) thì hàm lượng paclitaxel trong sinh khối cao hơn khoảng 2,5 - 5,5 lần tùy
theo bộ phận thu hái. Trong khi đó hàm lượng baccatin III lại thấp hơn. Điều
này được giải thích là do khi nuôi cấy tế bào thông đỏ có sử dụng MJ làm chất
kích thích sinh tổng hợp hoạt chất. Chính MJ kích thích các enzym tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp paclitaxel như GGPP synthase (enzym quan trọng
tham ra tổng hợp nguyên liệu ban đầu geranylgeranyl diphosphat để tổng hợp
nhân taxan); taxadien synthase -TS (enzym tham gia xúc tác phản ứng đóng
vòng taxan). Ngoài ra MJ còn kích thích enzym baccatin III-13-O-phenyl
propanoyl transferase (BAPT) xúc tác cho phản ứng của baccatin III với
phenylalanoyl –CoA để tạo thành cấu trúc cơ bản của paclitaxel (hình 1.5). Vì
vậy, MJ thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp paclitaxel [41], [105], [106].
 129

Do đó hàm lượng các chất trung gian (như 10-DAB, baccatin III…) trong con
đường sinh tổng hợp paclitaxel có thể bị giảm đi.

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật so với gieo trồng tự nhiên có nhiều
ưu điểm vượt trội như thời gian tạo nguồn ngắn, không bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố khí hậu, thổ nhưỡng, có thể chủ động được nguồn nguyên liệu với khối
lượng lớn [9]. Đặc biệt, có thể điểu khiển quá trình sinh tổng hợp hoạt chất cao
hơn so với tự nhiên. Với nuôi cấy tế bào thông đỏ, sau 17 ngày nuôi cấy (1 chu
kỳ) thu được sinh khối với hàm lượng paclitaxel cao gấp khoảng 2,5 đến 5,5
lần so với mẫu tự nhiên thu hái được ( mẫu tự nhiên thường kéo dài từ 5 năm
trở lên mới thu hoạch được lá) [12]. Điều này có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu
sản xuất thuốc điều trị ung thư paclitaxel và các dẫn chất bằng công nghệ sinh
khối tế bào ở quy mô lớn, góp phần giảm giá thành, đáp ứng được nhu cầu
ngày càng tăng của người bệnh.

4.2.2. Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh
khối tế bào thông đỏ

Từ sinh khối tế bào thông đỏ, bằng phương pháp chiết phân đoạn với
dung môi và phương pháp sắc ký cột, đã phân lập được 09 chất. Kết quả đo và
phân tích các loại phổ có thể nhận dạng được cấu tạo của các hợp chất đó là: 5
chất ở phân đoạn ethyl acetat gồm: Taxuyunnanine C (1); 2α,5α,10β-
triacetoxy - 14β - propionyloxy-4(20),11-taxadiene (2); 2α,5α,10β-triacetoxy
- 14β- (2-methyl) - butyryloxy-4(20),11- taxadiene (3); 2α,5α,10β-triacetoxy-
14β-(3-hydroxy-2-methyl)-butyryloxy-4(20),11-taxadiene (4) và β-sitosterol
(9) và 04 chất từ phân đoạn ethyl acetat gồm: 13-dehydroxy baccatin III (5),
paclitaxel (6), (+)-catechin (7) và (-)-epícatechin (8). Trong 9 chất phân lập
này, các chất 7, 8 và 9 là những chất có phổ biến trong thực vật. 6 chất thuộc
dẫn chất taxan diterpenoid có bộ khung 6/8/6 trong đó các chất 1, 2, 3 và 4
thuộc nhóm có chứa nhóm thế exomethylen ở vị trí C4-C20, còn paclitaxel
(6) và 13-dehydroxy baccatin III (5) thuộc nhóm đóng vòng epoxid ở C5-C20.
Đây là những chất đặc trưng của chi Taxus. Các chất 5 và 6 đã được phân lập
 130

từ sinh khối tế bào của T. chinensis [24]. Chất 1, 2, 3 và 4 đã được phân lập từ
T. yunnanensis [36] và sinh khối tế bào Taxus chinensis var mairei [92]. So
với thông đỏ tự nhiên thì những chất này cũng đã được phân lập từ các bộ
phân khác nhau của chi Taxus nói chung và loài T. wallichiana nói riêng [6].
Tuy nhiên, đây là báo cáo đầu tiên về phân lập các hoạt chất này từ sinh khối
tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) (Phần biện giải phổ xác định cấu
trúc xem phụ lục 4).

4.2.3. Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ

Paclitaxel là hoạt chất quan trọng nhất trong thông đỏ tự nhiên nói
chung và trong sinh khối tế bào thông đỏ nói riêng. Việc chiết xuất hoạt chất
này gặp nhiều khó khăn như: hàm lượng hoạt chất thấp, khó tinh chế do có
nhiều chất có cấu trúc hóa học tương tự, vì vậy quá trình chiết xuất tinh chế
thường trải qua nhiều giai đoạn. Tuy nhiên, cho đến nay để thu được
paclitaxel đạt tiêu chuẩn dược dụng (>97,0%) vẫn phải sử dụng sắc ký cột,
đặc biệt với chiết xuất từ tế bào thì tạp chất trong sản phẩm thường lớn hơn so
với chiết từ cây tự nhiên. Do vậy, để nâng cao hiệu suất tinh chế, giảm giá
thành thì việc nghiên cứu quy trình chiết xuất và tinh chế giai đoạn trước khi
cho vào cột là rất quan trọng.

4.2.3.1. Về chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ

Có nhiều phương pháp chiết xuất paclitaxel từ tự nhiên đã được sử dụng

như ngấm kiệt, hồi lưu, siêu âm, chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn, chiết
xuất bằng vi sóng. Tuy nhiên, phương pháp chiết siêu âm thường được sử dụng
vì hiệu suất chiết cao và thời gian chiết xuất ngắn [68]. Trong luận án này, sử
dụng phương pháp chiết siêu âm để chiết xuất paclitaxel từ sinh khối tế bào
thông đỏ. Tuy nhiên, khảo sát lựa chọn được dung môi thích hợp cho hiệu suất
cao là rất quan trọng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 4 loại dung môi sử
dụng thì MeOH có hiệu suất chiết cao hơn các dung môi còn lại đạt 97,30%
(p<0,05). Sau 4 lần chiết gần như kiệt hoạt chất (bảng 3.42). Như vậy, dung
 131

môi MeOH phù hợp cho chiết paclitaxel bằng phương pháp chiết siêu âm. Hàm
lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được đạt 0,50%. Kết quả này cũng phù
hợp với nghiên của Kim và cs [74], [75] về sử chiết xuất paclitaxel từ sinh khối
tế bào T. chinensis. Tuy nhiên, sản phẩm vẫn còn lẫn nhiều tạp chất cần tiếp tục
quá trình tinh chế tiếp theo.

Để loại bớt các tạp chất phân cực có trong dịch chiết MeOH, nhiều tác
giả đã sử dụng các dung môi ít phân cực hơn như DCM, diethyl ether,
cloroform, n-hexan [114]. Trong đó DCM là dung môi được sử dụng cho hiệu
suất chiết hoạt chất cao hơn cả. Vì vậy, trong nghiên cứu này sử dụng DCM để
chiết paclitaxel trong dịch chiết MeOH (chiết lỏng - lỏng). Kết quả nghiên cứu
cho thấy: hiệu suất chiết được sau 4 lần đạt 91,94%, hàm lượng paclitaxel trong
sản phẩm thu được đạt 5,93% (bảng 3.43). Như vậy, sau quá trình chiết bằng
DCM hàm lượng paclitaxel đã tăng từ 0,50% lên 5,93%. Kết quả này cũng phù
hợp với nghiên cứu của Pyo, Da [113], [43].

4.2.3.2. Về tinh chế paclitaxel

* Loại tạp chất

Giai đoạn tinh chế ban đầu rất quan trọng để thu được paclitaxel có độ
tinh khiết cao trước khi đưa qua sắc ký cột. Để loại các tạp chất trong sản phẩm
có thể sử dụng nhiều cách khác nhau như: hấp phụ bằng than hoạt, chiết lỏng
lỏng bằng dung môi có độ phân cực khác nhau, kết tinh phân đoạn.

- Loại tạp chất bằng hấp phụ

Các tạp chất màu, nhựa có thể loại bằng các chất hấp phụ bề mặt như
than hoạt tính, đất sét hoạt tính, silica gel có độ xốp cao [113]. Trong đó than
hoạt tính giá thành thấp phù hợp với sản xuất công nghiêp. Tuy nhiên, khả
năng loại tạp không bằng đất sét hoạt tính và silica gel [84]. Trong nghiên cứu
sử dụng than hoạt tính để loại tạp chất trong dịch chiết DCM. Kết quả khảo sát
tỷ lệ than hoạt sử dụng cho thấy: khi sử dụng than hoạt với tỷ lệ 3:1 thì hàm
lượng paclitaxel cao nhất đạt 7,81% (p<0,05). Tuy nhiên, nếu tăng lượng than
 132

hoạt sử dụng lên 4:1 thì hàm lượng paclitaxel tăng không đáng kể, trong khi
hiệu suất của cả qúa trình giảm đi rõ rệt (bảng 3.44). Điều này là do một phần
hoạt chất đã bị hấp phụ trong than hoạt. Kết quả này phù hợp với nghiên của
Kim [75].

- Loại tạp bằng thay đổi dung môi để kết tủa

Dịch chiết DCM thu được từ giai đoạn trước ngoài paclitaxel ra còn lẫn
nhiều các tạp chất như catechin, các chất không phân cực khác [75]. Vì vậy, để
loại một số tạp chất ít phân cực đã sử dụng biện pháp kết tủa bằng cách thêm
vào dịch chiết dung môi n-hexan với các tỷ lệ khác nhau. Kết quả nghiên cứu
cho thấy tinh chế bằng n-hexan thì hàm lượng paclitaxel tăng lên đáng kể so
với trước tinh chế (trước: 7,81%, sau: 25,37%). Khi tăng tỷ lệ n-hexan thêm
vào từ 4:1 đến 10:1, hiệu suất quá trình tăng nhanh từ 53,97% đến 82,43%
trong khi hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được giảm từ 27,10%
xuống còn 25,37% (bảng 4.45). Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ n-hexan thêm vào lên
12:1 thì hàm lượng paclitaxel giảm nhiều đạt 20,53% trong khi hiệu suất không
tăng so với sử dụng tỷ lệ 10:1. Như vậy, với tỷ lệ 10:1 n-hexan sử dụng cho kết
tủa paclitaxel là phù hợp. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Kim
và cs [75] khi tinh chế paclitaxel chiết xuất từ sinh khối thông đỏ T. chinensis.

* Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn

Sản phẩm thu được ở giai đoạn kết tủa bằng n-hexan hàm lượng paclitaxel
còn thấp. Vì vậy, nếu chuyển vào sắc ký cột hiệu quả sẽ không cao, khó tách để
thu được sản phẩm tinh khiết. Do đó, cần phải tinh chế tiếp để nâng cao hàm
lượng paclitaxel. Kết tinh phân đoạn là phương pháp đơn giản, có thể dễ dàng
triển khai quy mô lớn. Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi thay đổi nồng độ MeOH
bằng cách thêm H2O vào dịch chiết MeOH 4:6 thì hàm lượng paclitaxel trong sản
phẩm đạt 60,46%, trong khi hiệu suất của quá trình đạt 71,41% (bảng 3.46). Nếu
tỷ lệ nước thêm vào quá cao sẽ làm sản phẩm thu được lẫn nhiều tạp chất tan
trong nước. Như vậy, tỷ lệ H2O thêm vào dịch chiết MeOH là 4:6 thích hợp với
tinh chế paclitaxel chiết xuất từ sinh khối thông đỏ bằng. Kết quả này cũng phù
 133

hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác khi tinh chế paclitaxel từ sinh
khối tế bào thông đỏ [62], [63], [76].

* Tinh chế bằng sắc ký cột

Để thu được paclitaxel có độ tinh khiết cao thì phải tinh chế bằng sắc
ký cột. Thông thường các loại cột hay sử dụng là cột pha đảo vì cho hiệu suất
và độ tinh khiết của sản phẩm cao hơn cột pha thuận. Trong nghiên cứu này
sử dụng cột pha đảo YMC Rp-18 resin. Kết quả paclitaxel thu được trong sản
phẩm có hàm lượng đạt 93,11% ở lần tinh chế thứ nhất (bảng 3.47) và đạt
98,07% ở lần tinh chế thứ 2 (bảng 3.48). Kết quả này cũng phù hợp với công
bố của Pyo [114]. Sản phẩm thu được có lẫn rất ít các chất lạ (hình 3.18), hàm
lượng của sản phẩm đạt 98,07%. Sản phẩm tinh chế ra đã đạt tiêu chuẩn USP
30 về chỉ tiêu định lượng [130].

Như vậy, việc chiết xuất và tinh chế paclitaxel từ sinh khối tế bào thông
đỏ rất phức tạp, phải trải qua nhiều giai đoạn và kỹ thuật tinh chế khác nhau,
với nhiều yếu tố ảnh hưởng. Với việc nghiên cứu khảo sát các yếu tố này góp
phần tăng hàm lượng của sản phẩm qua các giai đoạn, đồng thời để nâng cao
hiệu suất tinh chế của cả quá trình. Kết quả đã xây dựng được quy trình chiết
xuất, tinh chế paclitaxel từ sinh khối thông đỏ với hàm lượng sản phẩm cuối
cùng đạt 98,07% và hiệu suất đạt 39,83% (bảng 3.49). Kết quả này có ý nghĩa
quan trọng trong việc tạo ra hoạt chất đủ tiêu chuẩn cho sản xuất thuốc điều
trị ung thư ở Việt Nam.

4.2.4. Về kết quả xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ

4.2.4.1. Về xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ
Để sản phẩm có chất lượng ổn định thì việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu
có ý nghĩa quan trọng. Sinh khối tế bào thông đỏ là nguyên liệu phục vụ cho
chiết xuất paclitaxel và một số dẫn chất khác dùng trong sản xuất thuốc điều
trị ung thư. Vì vậy, cần phải xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của nguyên
liệu. Hiện nay, chưa có các chuyên luận về sinh khối tế bào nói chung và sinh
 134

khối thông đỏ nói riêng, do đó căn cứ vào bộ tiêu chuẩn USP 30 và DĐVN IV
để xây dựng TCCS đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của sinh khối tế bào
thông đỏ.
Kết quả nghiên cứu cho thấy các chỉ tiêu về vật lý như, hình thức cảm
quan, độ ẩm, tạp chất tro, đều đạt yêu cầu chung của DĐVN IV (áp dụng với
dược liệu). Các chỉ tiêu định tính và định lượng được xây dựng theo phương
pháp HPLC là phương pháp phân tích hiện đại có độ chính xác cao. Trong đó
chỉ tiêu về hàm lượng paclitaxel và baccatin III (những chất quan trọng trong
sinh khối) là quan trọng quyết định chất lượng của sinh khối và hiệu quả của
sản phẩm. Đây là lần đầu tiên tại Việt Nam công bố TCCS của nguyên liệu
sinh khối tế bào thông đỏ.
4.2.4.2. Về kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu định lượng paclitaxel chiết xuất
được từ sinh khối tế bào thông đỏ
Kết quả định lượng paclitaxel chiết xuất được trong mẫu sinh khối tế bào
thông đỏ cho thấy mẫu đạt yêu cầu về chỉ tiêu định lượng theo USP 30. Tuy
nhiên, để nguyên liệu có thể dụng được trong sản xuất thuốc ung thư thì cần phải
kiểm nghiệm các chỉ tiêu khác như định tính, độ ẩm, vi sinh, kim loại nặng…
Trong đó, đặc biệt chú ý về chỉ tiêu giới hạn các tạp chất liên quan. Ở Việt Nam,
hiện nay chưa có đủ các chất chuẩn để xác định chỉ tiêu này trong sản phẩm. Do
vậy, trong đề tài này mới chỉ tiến hành xác định chỉ tiêu định lượng cho sản
phẩm chiết xuất được từ sinh khối tế bào thông đỏ mà chưa tiến hành đầy đủ các
chỉ tiêu khác.
 135

KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu thu được rút ra một số kết luận sau

1. Xây dựng quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ quy mô
phòng thí nghiệm

- Lựa chọn được môi trường B5 có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin
(0,2 mg/l), saccharose (20g/l) và thời gian 35 ngày cho nuôi cấy tạo callus từ
cành non thông đỏ tự nhiên. Tỷ lệ tạo callus thông đỏ đạt 73%.

- Xác định được môi trường SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin
(0,2 mg/l), saccharose (20g/l), pH = 5,6, nhiệt độ 22-240C, thời gian 35 ngày
cho duy trì nuôi cấy tế bào thông đỏ. Sau 4 lần cấy chuyển trong môi trường
thạch, hình thái tế bào mềm, xốp, khó biệt hóa. Tốc độ phát triển của tế bào
cao và ổn định với tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,79 lần.

- Lựa chọn được môi trường SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0
mg/l), saccharose (30g/l), pH = 5,6; điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 240C, tốc độ
máy lắc 130 vòng/phút, thời gian 14 ngày, không có ánh sáng cho nuôi cấy tế
bào thông đỏ trên môi trường lỏng. Với các điều kiện đã chọn thì tốc độ phát
triển của tế bào tăng nhanh với tỷ lệ tăng trưởng đạt 5,14 lần.

- Lựa chọn được methyl jasmonat (100 µM) sử dụng làm chất kích
thích tăng sinh hoạt chất, khảo sát các điều kiện sử dụng: bổ sung thêm
saccharose (20 g/l) vào ngày thứ 10, bổ sung MJ vào ngày thứ 12 của chu kỳ
nuôi cấy. Tiếp tục duy trì nuôi cấy đến ngày thứ 17. Khi sử dụng MJ ở điều
kiện này thì hàm lượng paclitaxel đạt 15,18 mg/l tăng 2,5 lần so với nhóm
không sử dụng.

- Nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít. Với các
điều kiện đã khảo sát, sau 17 ngày tế bào phát triển tốt, tỷ lệ tăng trưởng 3,6
lần, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt 0,0361% (kl/kl).
 136

- Xây dựng được qui trình thu hoạch khối tế bào thông đỏ, trong đó hàm
lượng tồn NAA, BAP tồn dư trong tế bào lần lượt là 1,73 ppm và 0,61 ppm,
nằm trong giới hạn cho phép của Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ.

2. Xác định thành phần hóa học, chiết xuất phân lập một số chất
chính, xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế
bào, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ

- Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng đồng thời
paclitaxel và baccatin III trong sinh khối dùng trong phân tích, kiểm nghiệm
nguyên liệu cũng như đánh giá chất lượng sản phẩm. Phương pháp có độ đúng,
độ chính xác và độ lặp lại tốt.

- Xác định được thành phần hóa học của sinh khối tế bào thông đỏ chứa
các nhóm chất: alcaloid, sterol, tannin, acid hữu cơ và anthranoid.

- Định tính và định lượng được paclitaxel và baccatin III, trong đó hàm
lượng paclitaxel và baccatin III lần lượt đạt 0,0360% và 0,0061%.

- Phân lập, nhận dạng được 09 chất chính trong sinh khối, trong đó có 06
chất có cấu trúc khung taxan vòng 6/8/6 điển hình của chi Taxus đại diện có
paclitaxel và 03 chất còn lại là catechin, epicatechin và β-sitosterol

- Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh chế paclitaxel trong sinh
khối tế bào thông đỏ. Sản phẩm paclitaxel thu được có hàm lượng đạt 98,07%
đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu định lượng theo USP 30.

- Xây dựng được TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ theo USP 30 và
DĐVN IV bao gồm các chỉ tiêu: hình thức, độ ẩm, tạp chất, định tính, định
lượng.
 137

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để nâng quy mô nuôi cấy trên
các bioreactor lớn hơn, nhằm tạo ra khối lượng sản phẩm sinh khối nhiều hơn

- Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học để làm cơ sở cho việc chiết
xuất các dẫn chất taxan khác có thể sử dụng được như baccatin III, 10-DAB.
Nghiên cứu phương pháp chiết xuất, tinh chế paclitaxel và một số hoạt chất
khác trong sinh khối quy mô lớn nhằm mục định tạo được nguyên liệu đủ tiêu
chuẩn bào chế thuốc tiêm
 138

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Nguyễn

Tùng Linh (2008), “Nghiên cứu quy trình tạo callus thông đỏ Việt
Nam (Taxus wallichiana)”, Tạp chí Dược học, 9, tr. 24-27.
2. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Nguyễn
Tùng Linh (2010), “Nghiên cứu duy trì nuôi cấy tế bào thông đỏ Việt
Nam trên môi trường thạch”, Tạp chí Y Dược học quân sự, 6, tr. 26-30.
3. Vũ Bình Dương, Nguyễn Tùng Linh, Nguyễn Văn Long, Đào Văn
Đôn, Phạm Thị Thanh Hà, Phan Đình Châu (2010), “Nghiên cứu
định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí khoa học và công nghệ,
48(6A), tr. 55-61.
4. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Phạm Văn Hiển, Chử Đức
Thành (2011), “Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ Việt
Nam trong môi trường lỏng”, Tạp chí Y Dược học quân sự, 8, tr. 7-14.
5. Vũ Bình Dương, Trịnh Nam Trung, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn
Lương (2011), “Phân lập paclitaxel và một dẫn chất của taxuyunnanine
C từ sinh khối thông đỏ Việt Nam (Taxus wallichiana Zucc)”, Tạp chí
Dược học, 11, tr. 52-55.
6. Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương (2011), “Sản xuất thuốc điều trị
ung thư paclitaxel từ các loài thông đỏ bằng công nghệ sinh khối tế bào
thực vật”, Tạp chí thông tin Y Dược học, 8 và 9, tr. 12-15 và 7-10.
 139

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, trang PL.
127-129 và tr. PL182-183.
2. Bộ Y tế (2010), Dược thư quốc gia, Nhà xuất bản Y học, tr.121-128 và
trang 245-258.
3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và cộng sự
(2009), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản
khoa học - kỹ thuật, 2, tr. 897-900.
4. Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn
Lương (2010), “Nghiên cứu định lượng acid 1 naphtalenacetic trong
sinh khối sâm ngọc linh bằng HPLC”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự, 7,
tr.7-11.
5. Nguyễn Công Hào, Nguyễn Thị Diệu Thuần, Hồng Thị Đức,
Nguyễn Đình Trung (2002), “Một số kết quả nghiên cứu về cây thông
đỏ (Taxus wallichiana Zucc,)”, Kỷ yếu hội thảo hóa học các hợp chất
thiên nhiên với YHCT.
6. Vương Chí Hùng (2010), Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết
hoạt chất sinh học từ lá cây thông đỏ và dừa cạn Việt Nam phục vụ sản
xuất thuốc chống ung thư và xuất khẩu, Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà
nước - Mã số KC.10.01/06.10.
7. Nguyễn Văn Long (2010), Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào
và đánh giá một số tác dụng sinh học của sâm Ngọc Linh sinh khối,
Luận án Tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Hà Nội.
8. Nguyễn Văn Long, Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn (2010), “Nghiên
cứu chất kích thích sinh tổng hợp ginsenosid trong nuôi cấy tế bào rễ
sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)”, Tạp chí y dược học quân sự,
35(5), tr. 18-23.
 140

9. Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Lê Bách Quang, Vũ Bình

Dương (2008), “Công nghệ sinh khối tế bào thực vật, hướng mới trong
sản xuất nguyên liệu làm thuốc”, Tạp chí thông tin Y dược học, 12, tr.6-
9.
10. Trần Công Luận, Ngô Thiện Tú Khanh, Phan Văn Đệ, Vương Chí
Hùng (2008), “Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của
lá thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng”, Tạp chí y
học Thành phố Hồ Chí Minh, 12, tr. 98 - 104.
11. Hoàng Văn Lương, Vũ Bình Dương (2009), “Các yếu tố ảnh hưởng
tới tốc độ phát triển và hàm lượng hoạt chất trong sinh khối tế bào thực
vật”, Tạp chí Y dược học Quân sự, 6, tr.5-11.
12. Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nguyễn Công Hào, Châu Văn Minh
(2007), “Sự biến động của hàm lượng 10 deacetyl baccatin III, 19
hydroxy baccatin III theo thời gian thu hái trong lá cây thông đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.) ở tỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Sinh học, 29(4), tr.49-
51.
13. Lê Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng, Trần Văn Minh
(2006), “Tìm hiểu sự tăng trưởng của dịch treo tế bào thông đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.)”, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, 9 (5), tr.
47-51.
14. Nguyễn Ngọc Song Trâm, Bùi Thế Vinh, Nguyễn Hoàng Quỳnh
Hương, Trần Công Luận (2008), “Xây dựng quy trình định lượng 10-
DAB và taxol trong lá thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)”, Tạp chí Y
học thành phố Hồ Chí Minh, 12(4), tr. 105-111.
15. Viện dược liệu – Bộ Y tế (2008), Phương pháp nghiên cứu cây thuốc,
Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 10-20.
Tiếng Anh
16. Agency Enviromnent Protection (2003), “Naphthaleneacetic Acid,
Salts, Ester and Acetamide”, HED Records Center Series 361 Science
Riviews, File R086913, pp.1-80.
 141

17. Agency United State Enviroment Protection (2011), Revised Non-

target Organism and Endangered Species Screening Risk Assessment
for the N-6-Benzyladenine, Registration Review Preliminary Work
Plan. WASHINGTON D.C., 20460.
18. Alan H.S. (1992), “Large-scale plant cell culture: methods,
applications and products” Current opinion in biotechnology, 3,
pp.105-109.
19. Angela S. (1991), “The manufacture of food ingredients using plant
cell and tissue cultures”, Trends in Food Science Technology, 2:116-
122.
20. Appendino G., Ozen H. C., Enriu R., Barboni L., Gabetta B., Zini
G. F. (1993), “Apocarotenoids from the Needles of Taxus
wallichiana”, Fitoterapia, 64, pp. 396-398.
21. Bala S., Chattopadhyay S.K., Tripathi V., Sashidhara K.V.,
Kulshrestha M., Sharma R.P., Jain S.P., Kukreja A.K., Kumar S.
(1999), “Analysis of taxol and major taxoids in Himalayan yew, Taxus
wallichiana”, Journal of Chromatography, 858, pp. 239-244.
22. Benhamou N. (1996), “Elicitor induce plant defense pathways”,
Trends in Plant Science, 1, pp. 233-240.
23. Bentebibel S., Palazon J., Cusido R. M., Bonfill M., Eibl R., Pinol
M. T. (2005), “Effect of immobilization by entrapment in alginate and
scale-up in paclitaxel and baccatin III production in cell suspension
cultures of Taxus baccata”, Biotechnol Bioeng, 89, pp. 647-655.
24. Birgitta M., Peter J., Hylands, Adelbert B., Nmeinhart H. Z.
(1998) “Taxoids from cell cultures of Taxus chinensis”, Phytochemistry
49(1) pp. 113-125.
25. Bonfill M., Cusido R. M., Joly S., Morales C., Pinol M. T. (2003),
“Influence of elicitors on taxane production and 3-hydroxy-3-
methylglutaril coenzyme A reductase activity in Taxus media cells”,
Plant Physiology Biochemistry, 41, pp. 91-96.
 142

26. Bonfill M., Bentebibel S., Moyano E., Palazon J., Cusidó R. M.,
Eibl R. (2007), “Paclitaxel and baccatin III production induced by
methyl jasmonate in free and immobilized cells of Taxus baccata”,
BiolPlantarum, 51, pp. 647-652.
27. Bonfill M., Exposito O., Moyano E., Cusido R. M., Palazon J.,
Pinol M. T. (2006), “Manipulation by culture mixing and elicitation of
paclitaxel and baccatin III production in Taxus baccata suspension
cultures”, In Vitro Cell Dev-Pl, 42, pp. 422-426.
28. British Pharmacopoiea (2010) Monographs: paclitaxel, pp 1324-
1327.
29. Brodelius P. (1982), “Immobilized plant cells”, Appl Biochem
Biotechnol, 7, pp. 31-44.
30. Brunakova K., Babincova Z., Takác M., Cellárová E. (2004),
“Selection of callus cultures of Taxus baccata L. as a potential source
of paclitaxel production”, Eng Life Sci, 4, pp.465-469.
31. Brunakova K., Cellarova E. (2005), “Production of taxanes in callus
and suspension cultures of Taxus baccata L.”, Springer, 5, pp.567-574.
32. Buitelaar R. M., Tramper J. (1992), “Strategies to improve the
production of secondary metabolites with plant cell cultures: a literature
review”’ Journal of Biotechnology, 2, pp.111-141.
33. Butenko R. G., Lipsky A. K., Chernyak N. D., Arya H. C. (1984),
“Changes in culture medium pH by cell suspension cultures of
Dioscorea deltoidea”, Plant Science Letters, 35(3), pp.207-212.
34. Cai Y. E., Roberts F. J., M. F., Phillipson J. D., Zenk M. H., Gleba
Y. Y. (1991), “Biological and chemical investigation of dragon's blood
from Croton species of South America. Part 1. Polyphenolic
compounds from Croton lechleri”, Phytochemistry, 30(6), pp. 2033-
2040.
35. Chawla H. S. (2003), Introduction Plant Biotechnology, Amazon
Press.
 143

36. Chen W., Wu B., Zheng Q. (1991), “Studies on the chemical

constituents of Taxus yunnanensis”, Acta pharmaceutica Sinica, 26,
pp. 747.
37. Cheol S. J., Kee Y. P. (2006), “Effects of oxygen, carbon dioxide and
ethylene on growth and bioactive compound production in bioreactor
culture of ginseng adventitious roots” Biochemical Engineering
Journal, 27(3), pp.252-263.
38. Choi H. K., Kim S. I., Son J. S., Hong S. S., Lee H. S., Lee H. J.
(2000), “Enhancement of paclitaxel production by temperature shift in
suspension culture of Taxus chinensis”, Enzyme and Microbial
Technology, 27, pp. 593-598.
39. Chuang C. L., Chen K. J., Lin Y. S., Chen F. C. (1990),
“Constituents of the heartwood of Taiwan yew. Part IV. Isolation of 1,
4-p-methanediol and 1-dehydroxy baccatin IV”, Huaxue, 48, pp.275-
280.
40. Ciddi V., Srinivasan V., Shuler M. L. (1995), “Elicitation of Taxus
sp. cell cultures for production of paclitaxel”, Biotechnol Lett, 17,
pp.1343-1346.
41. Cusido R. M., Palazon J., Bonfill M., Exposito O., Moyano E.,
Pinol M. T. (2007), “Source of isopentenyl diphosphate for taxol and
baccatin III biosynthesis in cell cultures of Taxus baccata”,
Biochemical Engineering Journal, 33, pp.159-167.
42. Cusido R. M., Palazon J., Navia-Osorio A., Mallol A., Bonfill M.,
Morales C., Pinol M. T. (1999), “Production of taxol and baccatin III
by a selected Taxus baccata callus line and its derived cell suspension
culture”, Plant Science Letters, 146, pp.101-107.
43. Da H. L., Seul G. K., Sungyong M., Jin H. K. (2010), “Evaluation of
feeding and mixing conditions for fractional precipitation of paclitaxel
from plant cell cultures” Process Biochemistry, 45, pp.1134-1140.
 144

44. Daniela B. (1978), “Conditioning factor affecting growth in plant

cells in culture” Plant Science Letters, 51(1), pp.83-91.
45. David N. W., Benson N. (1992), “Carbon-13 NMR studies on
sitosterol biosynthesized from [13C] mevalonates”, Phytochemistry,
31(3), pp.805-811.
46. DiCosmo F., Misawa M. (1995), “Plant cell and tissue culture:
alternatives for metabolite production”, Biotechnology Advance, 13,
pp.425-453.
47. Dirk H. S. (1996), “The design of culture media based on the
elemental composition of biological material” Journal of
Biotechnology, 45(2), pp.97-102.
48. Enaksha R. M., Wickremesinhe, Arteca R. N. (1993), “Taxus callus
cultures: Initiation, growth optimization, characterization and taxol
production”, Plant cell, Tissue and Organ Culture, 35, pp.181-193.
49. Erdtman H., Tsuno K. (1969), “Taxus heartwood constituents”,
Phytochemistry, 8, pp.931-932.
50. Exposito O., Bonfill M., Onrubia M., Jane A., Moyano E., Cusido
R. M., Palazon J., Pinol M. T. (2009), “Effect of taxol feeding on
taxol and related taxane production in Taxus baccata suspension
culture” New Biotechnology, 25, pp.252-259.
51. Farmer E. E., Almeras E., Krishnamurthy V. (2003), “Jasmonates
and related oxylipins in plant responses to pathogensis and herbivory”,
Current Opinion in Plant Biology, 6, pp.372 - 378.
52. Fornale S., Esposti D. D., Navia-Osorio A., Cusido R. M., Palazon
J., Piñol M. T., Bagni N. (2002), “Taxol transport in Taxus baccata
cell suspension cultures”, Plant Physiol. Biochem, 40, pp. 81-88.
53. Frank D. (1995), “Plant cell and tissue culture: alternatives for
metabolite production”, Biotechnology Advance, 13(3), pp.425-453.
54. Furmanova M., Sykłowska-Baranek K., Josefowicz & J GS (2000),
“Increased taxane accumulation in callus cultures of Taxus cuspidata
 145

and Taxus x media by some elicitors and precursors”, Biotechnology

Letters, 22, pp.1449-1452.
55. Gabriella P., Fausto M., Silvia A. (2002), “Effects of the culture
medium pH and ion uptake in invitro vegetative organogenesis in thin
cell layers of tobacco” Plant Science, 162, pp.947-955.
56. Gulik W. M., Hoopen H. J. G. (2004), “Kinetics and stoichiometry of
growth of plant cell cultures of Catharanthus roseus and Nicotiana
tabacum in batch and continuous fermentors”, Biotechnol
Bioengineering, 40(8), pp.863-874.
57. Gulik W. M., Hoopen H. J. G., Heijnen J. J. (2001), “The
application of continuous culture for plant cell suspensions” Enzyme
and Microbial Technology, 28(9-10), pp.796-805.
58. Gundlach H., Muller M. J., Kutchan T. M., Zenk M. H. (1992),
“Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell
cultures” Proc Natl Acad Sci USA, 89, pp.2389-2393.
59. Heike D., Dietrich K. (1995), “Strategies for the improvement of
secondary metabolite production in plant cell cultures”, Enzyme and
Microbial Technology, 17(8), pp.674-684.
60. Hirasuna T. J., Srinivasan V., Shuler M. L, (1996) “Paclitaxel
production in suspension cultures of Taxus baccata”, Plant Cell, llssue
and Organ Culture, 44, pp.95-102.
61. Holton R., Kim H. B., Liang F., Biediger R. J., Boatman P. D,
(1994), “First total synthesis of paclitaxel 1. Functionalization of the B
ring”, J Am Chem Soc, 116, pp.1597-1598.
62. Jeon K. Y., Kim J. H (2009), “Improvement of fractional
precipitation process for pre-purification of paclitaxel”, Process
Biochemistry,44, pp.736-741.
63. Jeon S. I., Kim. J.H (2006), “Optimal temperature control in
fractional precipitation for paclitaxel pre-purification”, Process
Biochemistry, 41, pp.276-280.
 146

64. Jian J. Z. (2006), “Effects of plant growth regulators on cell growth

and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax
quinquefolium”, Journal of Biotechnology, 45, pp.227 - 234.
65. Jian Zhaoa T., Lawrence C., Davis B., Robert V. (2005), “Elicitor
signal transduction leading to production of plant secondary
metabolites”, Biotechnology Advances, 23, pp.283-333.
66. Jin H. K., Seul G. K., Sun I. J. (2008), “Effect of temperature and pH
on fractional precipitation for paclitaxel pre-purification” Journal of
Biotechnology, 136, pp.22-71.
67. John H., Dodd S., Lorin W., Robert S. (1995), Experiments in Plant
Tissue Culture, Cambridge University Press, England, pp.55-60.
68. Kawamura F., Ohira T., Yatagai M. (1999), “Accelerated solvent
extraction of paclitaxel and related compounds from the bark of Taxus
cuspidate”, Journal of Natural Products, 62(2), pp.244-247.
69. Kee W. Y., Hosakatte N. M., Eun J. H., Kee Y. P. (2005),
“Ginsenoside production by hairy root cultures of Panax ginseng:
influence of temperature and light quality” Biochemical Engineering
Journal, 23(1), pp. 53 - 56.
70. Ketchum R. E., Gibson D. M., Croteau R. B., Shuler M. L. (1999),
“The kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of
Taxus following elicitation with methyl jasmonat”. Biotechnology and
Bioengineering, 62, pp.97-105.
71. Keum Y. J., Jin H. K. (2009), “Improvement of fractional
precipitation process for pre-purification of paclitaxel”, Process
Biochemistry, 44, pp.736-741.
72. Khosroushahi A. Y., Valizadeh M., Ghasempour A.,
Khosrowshahli M., Naghdibadi H., Dadpour M.R., Omidi Y.
(2006), “Improved Taxol production by combination of inducing
factors in suspension cell culture of Taxus baccata”, Cell Biology
International, 30, pp.262-269.
 147

73. Kieran P. M. (1997), “Plant cell suspension cultures: some

engineering considerations”, Journal of Biotechnology, 59(1-2), pp.39
- 52.
74. Kim J. H. (2004), “Prepurification of paclitaxel by mixen and
precipication”, Process Biochemistry, 39, pp.1567-1571.
75. Kim J. H., Kang I. S., Choi H. K., Hong S. S., Lee H. S. (2002), “A
novel prepurification for paclitaxel from plant cell cultures”, Process
Biochemistry, 37, pp.679-682.
76. Kim S. G. (2009), “Effect of pH on fractional precipitation for pre-
purification of paclitaxel from plant cell culture”, Korean Journal
Chemistry Engineering, 26(2), pp.449-452.
77. Kim S. I., Choi H. K., Kim J. H., Lee H. S., Hong S. S. (2001)
“Effect of osmotic pressure on paclitaxel production in suspension cell
cultures of Taxus chinensis”, Enzyme and Microbial Technology, 28,
pp.202-209.
78. Kolewe M. E., Roberts S. C. (2008), “Pharmaceuticals active natural
products synthesis and supply via plant cell culture technology”
Molecular Pharmaceutics, 5, pp.243-256.
79. Kovacs P., Csaba G., Pallinger E., Czaker R. (2007), “Effects of
taxol treatment on the microtubular system and mitochondria of
Tetrahymena”, Cell Biology International, 31, pp.724-732.
80. Kwon I. C., Lee J. H., Hyun J. O, (1998) “Enhancement of paclitaxel
production by in situ recovery of product”, Process Biochemistry, 33,
pp.701-708.
81. Lauren D.R., Douglas J. A. (1995) “Analysis of taxol, 10-
deacetylbaccatin III and related compound in Taxus baccata”, J.
Chromatography. 712, pp.303-309.
82. Li C., Huo C., Zhang M., Shi Q. (2008) “Chemistry of chinensis
yew, Taxus chinensis var mairei”, Biochemical Systematics and
Ecology, 36, pp.266-282.
 148

83. Li S., Zu Y., Sun R., Wang Y., Zang L., Luo H., Gu C., Efferth T.
(2009) “Determination of paclitaxel and other six taxoids in Taxus
species by high-performance liquid chromatography- tandem mass
spectrometry”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
49, pp.81-89.
84. Li Y.; Liqun Z. (2009) “Process utilized oligo-[1]-cyclodextrin
substituted agarose gel medium for efficient purification of paclitaxel
from Taxus cuspidata”, Separation and Purification Technology, 68,
pp.119-124.
85. Lipsky A. K. (1992), “Problems of optimization of plant cell culture
processes”, Journal of Biotechnology, 26, pp.83-97.
86. Liu S. (1998), “Phosphate effect on production of ginseng saponin and
polysaccharide by cell suspension cultures of Panax ginseng and Panax
quinquefolium”, Process Biochemistry, 33(1), pp.69-74.
87. Lorraine M. (1999), Plant tissue culture techniques. Tested studies for
laboratory teaching, 11, pp.151-174.
88. Luca M., Luciano S. (1994), “HPLC Determination of Benzyladenine
Residues in Micropropagated Apple Explants”, J. Agric. Food Chem.,
42, pp.744-746.
89. Luo J. (2004), “Optimization of elicitors and precursors for paclitaxel
production in cell suspension culture of Taxus sp in the presence of
nutrient feeding”, Process Biochemistry, 39, pp.1073-1079.
90. Luo J., He G. Y. (2004), “Optimization of elicitors for paclitaxel
production in cell suspension culture of Taxus chinensis in the presence
of nutrient feeding”, Process Biochemistry, 39, pp.1073-1079.
91. Luo J., Liu L., Wu C. D. (2001), “Enhancement of paclitaxel
production by abscisic acid in cell suspension cultures of Taxus
chinensis”, Biotechnology Letters, 23, pp.1345-1348.
92. Ma W. W., Adams T. L., Park G. L., Evans W. A., Blumenthal S.
G., Gomez G. A., Nieder M. H., Hylands P. J. (1994), “Yunnanxane
 149

and its homologous esters from cell cultures of Taxus chinensis var.
mairei”, Journal of Natural Products 57 (9) , pp.1320−1324.
93. Ma W., Evans W. A., Blumenthal S. G., Gomez G. A. (1994),
“Taxol and its homologous esters from cell cultures of Taxus chinensis
var. mairei”, Journal of Natural Products, 58(5) , pp.1212-1215.
94. Margaret D. (1981), “Technologies and strategies in plant cell culture
- new approaches to old problems”, Enviromental and Experimetal
Botany, 21, pp.269 - 275.
95. Mclaughlin J.J., Powell R.G., Smith C.R. (1981), “19-
hydroxybaccatin III, 10-deacetylcephalomanine and 10 -deacetyltaxol:
New antitumor taxanes from Taxus wallichiana”, Journal of Natural
Products, 44(3) , pp.312-319.
96. Michael W. F. (1986), Process strategies for plant cell cultures,
Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 0166- 9430/86.
97. Moon W. J., Yoo B. S., Kim D. I., Byun S. Y. (1998), “Elicitation
kinetics of taxane production in suspension cultures of Taxus baccata”,
BiotechnolTech, 12, pp.79.
98. Moyano E., Gene A., Bonfill M., Cusido R. M., Palazon J., Pinol
M. T. (2004), “Improvement of paclitaxel and baccatin III production
in Taxus sp. cell cultures”, Biotechnol. Prog., 5, pp.239-253.
99. Mueller M. J., Brodschelm W., Spannagl E., Zenk M. H. (1993),
“Signaling in the elicitation process is mediatd through the
octadecanoid pathway leading to jasmonic acid”, Proc Natl Acad Sci
USA, 90, pp.7490-7494.
100. Mun S. Y. (2008), “Optimization of productivity in solvent gradient
simulated moving bed for paclitaxel purification”, Process
Biochemistry, 43, pp.1407-1418.
101. Namdeo A. G. (2004), Investigation on pilot scale bioreactor with
reference to the synthesis of bioactive compounds from cell suspension
 150

cultures of Catharanthus roseus, PhD Thesis: Devi Ahilya

Vishwavidyalya, Indore, M.P. India.
102. Namdeo A. G. (2007), “Plant cell elicitation for Production of
secondary metabolites”, Pharmacognosy Reviews 1, pp.69-79.
103. Namdeo A. G., Patil S., Fulzele D. P. (2002), “Influence of fungal
elicitors on production of ajmalicin by plantcell cultures of
Catharanthus roseus”, Biotechnol Prog., 18, pp.159-162.
104. Nhan Trung Nguyen, Arjun H. et al (2003), “Diterpenes and
sesquiterpenes from the bark of Taxus yunnnanensis”, Phytochemistry
64, pp.1141- 1147.
105. Nims E., Dubois C. P., Roberts S. C., Walker E. L. (2006),
“Expression profiling of genes involved in paclitaxel biosynthesis for
targeted metabolic engineering”, Metabolic Engineering, 8, pp.385-
394.
106. Onrubiab M., Moyanob E., Bonfilla M., Expositoa O., Palazóna J.,
Cusido R. M. (2010), “An approach to the molecular mechanism of
methyl jasmonate and vanadyl sulphate elicitation in Taxus baccata cell
cultures: The role of txs and bapt gene expression”, Biochemical
Engineering Journal, 53, pp.104-111.
107. Osorio A.N. GH, Cusidó R. M., Palazón J., Alfermann A.W., Pinol
M. T. (2002), “Taxol and baccatin III production in suspension cultures
of Taxus baccata and Taxus wallichiana in an airlift bioreactor”,
Journal of Plant Physiology, 159, pp.97-102.
108. Palazon J., Cusido RM., Bonfill M., Morales C., Pinol M. T. (2003),
“Inhibition of paclitaxel and baccatin III accumulation by mevinolin
and fosmidomycin in suspension cultures of Taxus baccata”, Journal of
Biotechnology, 101, pp.57-163.
109. Pan Z. W., Zhong J. J. (2000), “Scale-up study on suspension cultures
of Taxus chinensis cells for production of taxane diterpene”, Enzyme
and Microbial Technology, 27, pp.714-723.
 151

110. Parc G., Canaguier A., Landre P., Hocquemiller R., Chriqui D.,
Meyer M. (2002), “Production of taxoids with biological activity by
plants and callus culture from selected Taxus genotypes”,
Phytochemistry 59, pp.725-730.
111. Parr A. J. (1989), “The production of secondary metabolites by plant
cell cultures”, Journal of Biotechnology, 2(5) , pp.101-126.
112. Peter D. S. (1985), “Biotechnological applications of plant cells in
culture”, Biotechnology Advance, 3(1) , pp.29-38.
113. Pyo S. H., Song B K., Ju C. H., Han B. H., Choi H. J. (2005),
“Effects of adsorbent treatment on the purification of paclitaxel from
cell cultures of Taxus chinensis and yew tree”, Process Biochemistry,
40, pp.1113-1117.
114. Pyo S. H., Song B. K., Han B. H., Kim J. H (2004), “A large-scale
purification of paclitaxel from cell cultures of Taxus chinensis”,
Process Biochemistry, 39, pp.1985-1991.
115. Qiu L., Lian M., Ma Z., He G. (1989), “Biflavones of Taxus
wallichiana Zucc.”, Zhiwu Xuebao, 31, pp.54-56.
116. Rao S. R., Ravishankar G. A. (2002), “Plant cell cultures: chemical
factories of secondary metabolites”, Biotechnology Advance, 20,
pp.101-153.
117. Rehman H. U., Rahman A. U. (2004), “Chemical constituents of
Taxus wallichiana”, J.Chem. Soc., 26, pp.302-306.
118. Rheman H. U., Choudhary M. L. (2004), “Chemical constituents of
Taxus wallichiana”, J.chem. Soc. Pakistan 26, pp.302.
119. Sabater-Jara A. B., Lopez-Perez A. J. (2010), “In vitro culture of
Taxus sp.: strategies to increase cell growth and taxoid production”,
Phytochem Rev, 9, pp.343-356.
120. Sang H. P., Heung B. P., Bong K. S., Byung H. H., Jin H. K. (2004),
“A large-scale purification of paclitaxel from cell cultures of Taxus
chinensis”, Process Biochemistry, 39, pp.1985-1991.
 152

121. Sharon M. H. S., Pauline M. D. (2009), “Foreign protein production

using plant cell and organ cultures: Advantages and limitations”
Biotechnology Advance, 27(6) , pp.1036-1042.
122. Shen Y. C., Chen C. Y., Huang M. C. (2000), “Taxan diterpenoids
from seeds of Taxus mairei”, Chem. Pharm. Bull., 48, pp.1344-1346.
123. Shen Y. C., Lo K. L., Chen C. Y., Kuo Y. H., Huang M. C. (2000),
“New taxans with an opened oxetane ring from the roots of Taxus
mairei”, Journal of Natural Products, 63, pp.720-722.
124. Siegfried B., Daniel G. (1990), The taxus alkaloids, Academic Press,
Inc. Vol 39.
125. Sonia M., Rosa M., Cusido et al (2011), “Production of the anticancer
drug paclitaxel in Taxus baccata suspention culture”, Process
Biochemistry, 46(1), pp.23-34.
126. Susan C. R., Michael L. S. (1997), “Large-scale plant cell culture”,
Curr Opin Biotechnol, 8(2), pp.154-159.
127. Tabata H. (2004), “Paclitaxel Production by Plant-Cell-Culture
Technology”, Adv Biochem Engin/Biotechnol, 7, pp.1-23.
128. Tamogami S., Rakwal R., Kodama O. (1997), “Phytoalexin
production elicited by exogenously applied jasmonic acid in rice leaves
(Oryza sativa L.) is under the control of cytokinins and ascorbic acid”,
FEBS Lett. 412, pp.61-64.
129. Thomas E. A. (1983), “A Method for the Quantitative Determination
of 1-Naphthaleneacetic Acid, 1-Naphthalenylacetylaspartic Acid, and
P-D-Glucose 1-( 1-Naphtha1ene)acetate in Grapes”, J. Agric. Food
Chem, 31, pp.286-288.
130. United Stage Pharmacopoiea 30th (2007), NF 25:3461-3462.
131. Verpoorte R., Memelink J. (2002), “Engineering secondary
metabolite production in plants” Curr. Opin. Biotechnol, 13, pp.181-
187.
 153

132. Virendra B. A. P. (1991), “Large-scale plant cell culture: methods,

applications and products”, Curr Opin Biotechnol, 2, pp.370-374.
133. Wang C., Mei X. (2001), “Enhancement of taxol production and
excretion in Taxus chinensis cell cultures by fungal elicitation and
medium renewal”, Appl Microbiol Biotechnol, 55, pp.404-410.
134. Wang H. Q., Zhong J. J. (1999), “Significant improvement of taxane
production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose
feeding strategy”, Process Biochemistry 35, pp.479-483.
135. Wang Y. D., Ying J. Y., Jin C. W. (2004), “Induction studies of
methyl jasmonat and salicylic acid on taxan production in suspension
culture of Taxus chinensis var mairei” Biochemical Enginering
Journal, 19, pp.259-265.
136. Wani M. C., Taylor H. L., Wall M. E., Coggon P., Mcphail A. T.
(1971), “The Isolation and Structure of Taxol, A Novel Antileukemic
and Antitumor Agent from Taxus brevifolia”, Journal of the American
Chemical Society, 93, pp.2325-2327.
137. Wu J., Mei X. (2001), “Stimulation of taxol production and excretion
in Taxus cell cultures by rare earth chemical lanthanum”, Journal of
Biotechnology, 85, pp.67-73.
138. Yan D. W., Yuan J. Y., Jin. C. W. (2004), “Induction studies of
methyl jasmonate and salicylic acid on taxane production in suspention
culture of Taxus chinensis var. mairei”, Biochemical Engineering
Journal, 19, pp.259-265.
139. Yeung T. K., Germond C., Chen X., Wang Z. (1999), “The mode of
action of taxol: Apoptosis At low concentration and necrosis at high
concentration”, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 263, pp.398 - 404.
140. Ying J. Y., Zuo J. W., Zhi Q. M., Jin C. W. (2002), “Acting paths of
elicitors on Taxol biosynthesis pathway and their synergistic effect”
Biochemical Engineering Journal, 10, pp.77-83.
 154

141. Yong C. L., Wen Y. T., Cheng L. (2009), “Paclitaxel production

using co-culture of Taxus suspension cells and paclitaxel-producing
endophytic fungi in a co-bioreactor”, Applied Microbiol Biotechnol, 83,
pp.233-239.
142. Yoshizaki F., Fufuda M., Hisamichi S. (1998), “Constituents of the
arils of Japanese yew, Taxus cuspidata”, Annu. Rep. Tohoku Coll.
Pharm, 34, pp.111-114.
143. Yu L. J., Qin W. M., Xu H. B. (2001), “Effects of salicylic acid on
fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and taxol
production in cell suspension cultures of Taxus chinensis”, Process
Biochemistry, 37, pp.477-482.
144. Yukimune Y., Tabata H., Higashi Y., Hara Y. (1996), “Methyl
jasmonate induced over production of paclitaxel and baccatin III in
Taxus cell suspension cultures”, Nattural Biotechnology, 14, pp.1129-
1132.
145. Zhang J. Z., Fang Q. C., Liang X. T., He C. H., Kong M., He W. Y.,
Jin X. L. (1995), “Taxoids from the barks of Taxus wallichiana”,
Phytochemistry, 40, pp.881-884.
146. Zhen Y. W., Jian J. Z. (2002), “Combination of conditioned medium
and elicitation enhances taxoid production in bioreactor cultures of
Taxus chinensis cells” Biochemical Engineering Journal, 12, pp.93-97.
147. Zhong J.J., Fujiyama K., Seki T., Yoshida T. (1993), “Enhancement
of anthocyanin production by Perilla frutescens cells in a stirred
bioreactor with internal light irradiation” Journal of Fermentation
Bioengineering, 15, pp.299-303.
148. Zhong T. X. (1998), “Kinetin induced caffeic acid-O-
methyltransferases in cell suspension cultures of Vanilla planifolia
Andr. and isolation of caffeic acid O-methyltransferase cDNAs”, Plant
Physiology Biochemistry, 36(11), pp. 132-137.
 155

PHẦN PHỤ LỤC