Софийски университет “Св.

Климент
Охридски” Биологическифакултет
Катедра „Физиология на растенията”

Дипломна работа

Тема:

Ex situ съхранение и определяне на антиоксидантния

потенциал на метанолови екстракти от българския
ендемитен вид Achillea thracica Velen.

Дипломант: Научен ръководител:

Радина Димитрова Гл. ас. Женя Йорданова
Младенова ф. № 606
Магистърска програма
“Медицинска химия”
София, 2014
Използвани съкращения:

CR - критично застрашен
МS – (хранителна среда на) MurashigeSkoog
GSH - глутатион
SOD - супероксид дисмутазата
MPO – миелопероксидазата
HNE - неутрофилна еластаза
MMP-2 и -9- матричните металопротеинази
DPPH - 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил
LPS-активирани микроглиялни клетки
TNFα - тумур некрозен фактор
αCOX-2 - циклооксигеназа-2
Съдържание

Увод 4
Литературен обзор 5
Характеристики на Achillea tracica Velen. 5
Фитохимични характеристики на Achillea tracica Velen. 8
Фармакологична активност на Achillea tracica Velen. 14
Цел и задачи 19
Материал и методи 20
Резултати и обсъждане 25
Изводи и заключение 42
Приложения 43
Използвана литература 46
 I. Увод
Броят на застрашените от изчезване растителни видове в света прогресивно
нараства след 2000 година. Много от тях са с установени ценни
фармакологични свойства и с широко приложение в народната и съвременната
медицина.
В тези растения, наред с първичните метаболити, които пряко участват в
обмяната на веществата, се синтезират и много други органични съединения,
разглеждани най-често като вторични метаболити. Някои от тези вещества имат ясно
изразена биологична активност и се използват за лечението на различни заболявания.
В лечебните растения се съдържат най-често сложни комплекси от вторични
метаболити с различна химична природа, които проявяват широк спектър от
действия. Те са наричани най-общо биологично активни вещества (БАВ). Това са
различни етерични масла, феноли, флавоноиди, производни на захарите и други,
синтезиращи се в растенията като средство за защита срещу вредители и срещу
неблагоприятните условия на средата (климатични промени).
Родът Achille L. (сем. Asteraceae-Anthemideae) включва над 130 вида
многогодишни тревисти лечебни растения с център на разпространение Северното
полукълбо и по-точно Югоизточна Европа и Югозападна Азия, но е изкуствено
внесен и в други части на света с помощта на човека. В България родът е представен
от 19 вида. Achillea thracica Velen. е български ендемит включен в Червената книга
на България (2011), Бернската конвенция (приложение 1), Червеният списък на IUCN
(1998) като „рядък” и е под закрилата на Закона за биологичното разнообразие
(приложение № 3 към чл.37).
В настоящата дипломна работа е представено въвеждането на вида Achillea
thracica Velen. в in vitro култура и успешното адаптиране в ex vitro условия както и
сравнително определяне на съдържанието на фенолните киселини и антиоксидантния
потенциал на метанолови екстракти от in situ, in vitro и ex vitro култивирани растения.
Тези моделни системи ще позволят по нататъшното провеждането на изследвания
върху цялостния метаболитен профил на Achillea thracica и изследване на
антитуморния и потенциал на биологично активните вещества, продуцирани от този
ценен балкански ендемит.
1
 II. Литературен обзор

Лечебните растения намират широко приложение в медицината и козметиката

поради фармакологичните свойства, които притежават. Целебните ефекти на техните
екстракти се дължът на съдържащите се в тях разообразни биолгично активни
вещества: флавоноиди, фенолни киселини, антоцианини, витамини и др. Тези
извлеци могат да се прилагат самостоятелно или в комбинация с други лекарствени
продукти за лечение и профилактика на редица заболявания. Най-голяма част заемат
фитопрепаратите, в състава на които влизат флавоноиди, алкалоиди, гликозиди,
етерични масла, дитерпеноиди, сапонини, кумарини и др. Потенциалните ползи за
здравето от някои вещества като флавоноидите, са от особен интерес за
потребителите и производителите на храни (Keller, 2009).

1.1. Характеристика на Achillea thracica Velen.

Род Achille L. (сем. Asteraceae-Anthemideae) включва над 130 вида

многогодишни растения от хамефити до хемикриптофити (Saukel et al. 2004),
разпределени в 5 секции- Achillea sect. Otanthus (Hoffmanns. & Link), Achillea sect.
Babounya (DC.), Achillea sect. Ptarmica (Mill.), Achillea sect. Anthemoideae (DC.),
Achillea sect. Achillea s. lat. (Ehrendorfer and Guo,2005). Разпространени са
повсеместно - от полупустинни до влажни местности и от морското равнище до
глациалните райони на високопланинските системи. Срещат се предимно в
Североизточна Европа и Северозападна Азия.
Achillea thracica Velen. (тракийски равнец) е един от 19-те представители на
родът в България, разпределени в 2 секции-Anthemoideae и Achillea (Saukel et al.
2004). Той спада към групата на жълто-, бяло- и розовоцветните видове, секц.
Achillea (част от бившата секц. А. Filipendulinae (Ehrendorfer, F. & Guo, Y.-P.,2006).
Тракийският равнец е многогодишно тревисто растение, достигащо височина
до 30-50 см. Листата му са прости, перести с линейноланцетовидни до
линейнотриъгълни делчета, късовлакнести, с гъсто разположени прилегнали жилки.
2
Цветовете - златистожълти дребни кошнички, събрани в съцветие щит. Равнецът се
размножава полово чрез ентомофилно опрашване на семената и безполово,
вегетативно, чрез коренови издънки. Семената се разпространяват, посредством
аменохория и антропохория. Расте в ксеротермния дъбов пояс по сухите тревисти
местности покрай пътища, из храсталаци и по горските поляни (Stefanov, 2011). В
сравнение с някои други видове равнец (A. clypeolata, A. coarctata и A. chrysocoma),
тракийският има ниска ксероморфност по отношение на морфологични белези,
заради по-слабата си овласиненост, нормално развити епидермални клетки и
големите си устица (Kuzmanov, B., Ninova, D. & Ivanceva, S., 1997).
Популациите на Achillea thracica са разкъсани, малочислени, представени от по
няколко до десетина представители. По-компактна и многочислена субпопулация се
среща сред остатъчна дъбова гора от Quercus pubescens и Carpinus orientalis в
землището, намиращо се севрозападно от с. Маноле, Пловдивско, като заеманата
площ на находището е около 600-700 м2. На много места растението се появява като
поименен елемент, бързо се настанява на новосъздадени от човека местообитания.
Разпространението му е само в България-Тракийската низина (в района на селата
Маноле и Белозем и град Садово, Пловдивско), Тунджанска хълмиста равнина
(между селата Манолово и Скобелево, Казанлъшко). Има данни, че се сраща и в
Тополовградско на 150-300 м. н. в (Stefanov, S., 2011) (Фиг. 1 и 2).

3
 Фигура 1. Карта на разпространение на Achillea thracica в България
Разположението на находищата в близост до населени места, пътища,
обработваеми площи и силната им повлияност от човека е причина за намаляване
броя на популациите на Achillea thracica.

Класификация

Царство Plantae
Отдел Magnoliophyta
Клас Magnoliopsida
Разред Asterales
Семейство Asteraceae
Род Achillea
Секция Achillea
Вид Achillea thracica

Фигура 2. Находище на Achillea thracica край село Маноле, Пловдивско.

Achillea thracica Velen. e български ендемит под закрилата на Закона за

Биологичното Разнообразие (приложение № 3 към чл.37 на ЗБР) и в Червената книга
на България (2011), с национална природозащитна категория: критично застрашен
4
(CR). Видът е включен в Конвенцията за опазване на дивата европейска флора и
фауна и природните местообитания (Bern Convention, 1979) и в Червения списък на
IUCN на застрашените растения (IUCN Red list, 1998) с категория "рядък" (R).
1.2. Вторични метаболити, установени при представители от род Achillea
Представителите на род Achillea секция Achilleа, въпреки голямата си
морфологична разнородност и многобройния си видов състав се характеризират със
сравнително еднороден флавоноиден състав, като за тях най-характерни са
флавоните и флавонолите (Molina-Hernandez et al., 2004). Химически флавоноидите
имат петнайсет въглероден скелет ( C6 -С3 - С6 ), който се състои от двата фенилови
пръстена, свързани с мост, изграден от три въглеродни атома (Kumar et al., 2002).
Първите анти-спазматични флавоноиди- цинарозид и космосин са изолирани
от A. millefolium (Saeidnia et. al., 2011).
В растенията флаваноидите се намират главно под формата на гликозиди (с
един или повече захарни остатъци, свързани чрез ОН група (О-гликозиди) или чрез
въглерод-въглеродни връзки(C-гликозиди). Някои флавоноиди присъстват като
агликони (без захарна част) (Huang et. al., 2010). В секция Achillea, най-често
срещаните агликони са лутеолин, кемферол, кверцетин, апигенин, скутелареин
(цирсимаритин), скутелареин 6,7,4-триметилов етер (салвигенин), 6-
хидроксилутеолин-6,7,4-триметилов етер (еупаторин) и 6-хидроксилутеолин. От
моногликозидите при A. ligustica, A. millefolium са установени предимно О -
гликозиди, C - глюкозиди и О- глюкурониди. Диглиозидите са представени от 6 - C -
глюкозил - 8- C- арабинозил, 6- C -арабинозил - 8 - C - глюкозил, лутеолин - 6 - С -
фуранозил - (1 → 2)-глюкозид, рутин и др. (Tuberoso et al., 2009).

5
 Флавоноид 3-метоксикверцетин 6-метоксилутеолин

Камферол

Фигура 3. Структурна формула на някои флавоноиди, установени в A.

millefolium

От флавоноидите най-обширно са проучвани епикутикуларните флавоноидни

агликони и жълтите флавоноиди (Achillea ochroleuca). Последните са отговорни за
ярката окраска на цветовете на членовете на бившата секция Filipendulinae (Thornton-
Wood 1993). Жълтите флавоноиди защитават растенията от навлизането на микроби
и от атаки на насекоми (Keller 2009). Епикутикуларните флавоноидни агликони се
предполага, че изпълняват ролята на UV-протектори (Ivanceva 1996). Те са
представени главно от деривати на кверцетин, кемферол и лутеолин, както и
центауреидин и аксиларин (Valant-Vetschera 1985; Valant-Veschera 1996; Ivancheva
and Nedelcheva 1995). Има данни (Ivancheva and Nedelcheva, 1996) и за наличие на
3,6,4’-метилови етери. Те биват флавоноиди и флавоноли, метокси-заместени на C-3
и С-6, както също и на други позиции по веригата. От тях в големи концентрации са
представени 3,6-диметоксикверцетагетин, 3,7–диметоксикверцетин, 3-
метоксикверцитин, 7-метоксикверцитин, 3,7-диметоксикемферол (куматакетин) и в
известно количество се среща 6-метоксилутеолин (Фиг. 3). Те предпазват растенията
от ултравиолетовите лъчи и корелират с ксерофитното им естество от биохимична
гледна точка (Valant-Vetschera Wollenweber 1985; Ivanceva 1996).
Лигнаните са една от групите химични съединения, открити в растенията от
секция Achilleа. Смята се, че лигнаните се образуват при димеризация на две
молекули цис-о-хидроксиканелена киселина с последващо допълнително
модифициране на новата молекула. Биосинтетичните реакции за получаване на
6
лигнани са ензимо-каталитични, тъй като по-голяма част от природните лигнани са в
оптичeски активна форма (Trifunovic et al., 2002). Te присъстват в растенията главно
в свободна форма. Лигнаните са представени основно от лигнанолиди,
циклолигнанолиди, бис-епоксилигнани, неолигнани и др. (Huang et al., 2009).
Изследвания на алкохолни ексртакти от надземните части на представители от
секция Achilleа (Achillea lingulata, А. Gypsicola, A. holesericea, A. ptarmica) (Trifunovic
et al., 2002) доказват наличието на бис-епоксилигнаните-епидесмин, пиноресинол и
кубосин. В коренови екстракти са открити и фаргесин и сесарамин.Тези молекули са
ефективни инхибитори на сАМР фосфодиестераза и са установени в голяма част от
представителите от род Achilleа. Най-често срещани в род Achillea са лигнаните
асхантин, епиасхантин, епиеудесмин (Si-Tang et al., 2006).

7
Фигура 4. Структурна формула на някои лигнани, установени в Achillea lingulata.
Сравнителни фитохимични изследвания на A. millefolium, A. nana, A. ligustica и
A. mucrophylla показват, че ацетиленови съединения с амидна групировка са
характерни за тези представители (Greger et. al., 1981). Тези метаболити са
установени както в корените, така и в надземните чати на растенията. Подземните
части на растенията са богати на олефинови и ацетиленови алкамиди. Сравнителни
HPLC- анализи на различни представители от род Achilleа показват, че натрупването
на пиперидинова киселина представлява типична биогенетична характеристика за
род Achilleа (Greger et al.,1988). Характерни амиди за представители от род Achilleа
са изобутил амид и фенетил, изопентил амид, декадиен амид, p-хидрокси
фенилетиламин и др. Различия в молекулата на амидите се наблюдава при дължина
на въглеводородната верига, стереохимия, както и разлка в нивата на насищане в
киселинните остатъци (Greger et al.,1987).

Фигура 5. Структурна формула на някои амиди, съдържащи се в A. millefolium

Алкалоидте са важни вторични метаболити, притежаващи разнообразни

8
биологични и фармакологични ефекти. Още през 1846 Zanon изолира алкалоида-
ахилеин от A. millefolium, а по-късно Miller и Chow (1954) успяват да го
характеризират. От тогава са изолирани безброй бази на различни алкалоиди
детектирани в секция Achilleа.(Chandler et al., 1982). От тях най-често срещани в род
Achillea са алкалоидите бетоницин и стахидрин (пиролидини), тригонелин (пиридин),
бетаин и холин (производни на аминокиселини). Открити са и много
неохарактеризирани алкалоиди като ахилеин(Pires et al., 2009), москатин и др.

Фигура 6. Структурна формула на някои алкалоиди, установени в Achillea

wilhelmsii .

От голям интерес както за медицината, така и за систематиката на род Achillea

се оказва съставът на етеричните масла. Изследванията от последните десетилетия
показват, че химическият състав на представителите от секция Achillea е сложен и
чувствителен към промяна, но биологично активни компоненти са предимно
етерични масла и сескитерпенови лактони (Tang-Si et al., 2006). Сескитерпеновите
лактони са клас химични съединения, изградени от три изопренови единици и
съдържат лактонов пръстен, откъдето идва и името им. Те действат като отблъскват

9
насекомни вредители, както и подтискат развитието на гъбички и бактерии.

Фигура 7. Структурна формула на някои моно- и сесквитерпени: А) Ациклични

монотерпени, Б) Моноциклични монотерпени, В) Полициклични монотерпени, Г)
Полициклични сесквитерпени

Терпените биват ациклични монотерпени, моноциклични монотерпени,

полициклични монотерпени и полициклични сесквитерпени. От монотерпените най-
широко застъпени в секция Achillea са борнеол, борниланетат, лимонен, β –

10
кариофилен, изоаскаридол (Toncer et al., 2010), пинен сабинен, терпинен- 4 -ол,
терпинеол, туйон, виридифлорол (Maggi et al. 2009), мирцен, хамазуленен (Gudaityte
and Venskutonis 2007; da Silva 2004), камфор, 1,8 - цинеол (евкалиптол)
Монотерпените евкалиптол (1,8-цинеол) и камфор са добре известни с изразения си
антимикробен потенциал (Tang Si X. et al., 2006). Редица изследвания на масла от
различни представители на род Аchillea показват, че в тях преобладават предимно
монотерпени. Доминиращи компоненти в маслото на A. talagonica, A. vermicularis и
А. albicaulis са 1,8-цинеол (27.0%, 20.0% и 10.1%) и камфор (29.0%, 32.0 и 9.2%).
Маслото от A. aucheri съдържаща 1,8-цинеол (40.7%) и α-терпинеол (11,3%) ,а
основни компоненти на маслото от A. Kellalensis са камфор (34.0%) и борнеол
(12.6%)( Esmaeili et. al. 2004).Сред сескитепените най-силно застъпени в секция
Аchillea са кариофилен, β –бисаболол (Bakkali et. al 2007), ахилицин, пиперитон,
оксонеролидол(A. aleppica ),лонгипин(A. Millefolium)( Xiao-Tang Si et al., 2006),
виридифлорол (Achillea ligustica)( Tuberoso et. al., 2005).
При различни представители от род Achillea са установени също и алкани
(Kordali et al. 2009), мастни киселини (Chandler et al., 2006), сапонини (Ali et al.,
2011), кумарини и лигнани (Trifunovic et al., 2006), аминокиселини (Si-Tang et al.,
2006).

1.3. Биологична активност на вторични метаболити, изолирани от

представители от род Achillea.

Вторичните метаболити, изолирани от представители на род Achillea

притежават широк спектър от терапевтични активности сред които:
 Кръвоспиращо действие (Akkol et al., 2011; Kojuharov and Anchev, 2012)
положителен ефект върху сърдечно-съдовата система (Dall’Acqua et al. 2011)
 Противовъзпалителна (Benedek et al., 2007; Burk et al. 2009; Krishnaraju et al.,
2005)
 Антимикотична (Baris et al., 2006; Stojanovic et al., 2005)
 Антибактериална (Maggi et al., 2009; Keller, 2009; Kordali et al., 2009; Candan et
al., 2003; Baris et al., 2006; Stojanovic et al., 2005)

11
 Антивирусна (Keller, 2009)
 Антихелминтна (Ali et al., 2011)
 Естрогенно действие (Innocenti et al., 2006; Innocenti et al., 2006; Dall’Acqua et
al., 2011)
 Нервноуспокоително (Baretta et al., 2012; Molina-Hernandez et al., 2004; Paladini
et al., 2010)
 Забавят някои нерводегенеративни болести (Keller 2009; Elmann et al., 2011;
Jonsdottir et al., 2011)
 Спазмолитично (Benedek and Kopp 2007; Kopp and Milzig 2007)
 Успокояващо и протективно действие върху храносмилателната система (Maggi
et al., 2009; Cavalcanti et al., 2006; Potrich et al., 2009; Niazmand et al., 2010;
Tuberoso et al., 2009)
 Антиканцерогенно действие (Maggi et al., 2009; Keller 2009);

1.3.1 Естрогенно действие

Установено е, че екстракти от надземните части на A. millefoliumе показват
естрогенна активност при in vitro тестове с рекомбинантни MCF-7 клетки (Chandler
RF et. al., 1982; Schulz V. et. al., 2001). Оценка на изолираните и идентифицирани
съединения от това растение показват, че лутеолин V и апигенин VI са най-важните
естрогенни съединения измежду тестваните . Апигенин и лутеолина са изследвани за
тяхната способност да активират α и β естрогенни рецептори (ERα, ERβ) като се
използват временно трансфектирани клетки (Dall’Acqua et. al., 2007). Резултатите
показват, че апигенина може да стимулира ERs-зависимите биологични пътища, но
по-слабо от ендогенните хормони. Лутеолин има много слаб ефект върху β
рецепторите и не изглежда да активира α рецепторите.

1.3.2 Антидиабетно действие

Изследвания на ефекта на водно-алкохолен екстракт от A. santolina върху
нивото на кръвната глюкоза, концентрацията на NO (азотен оксид) в серум от
панкреатична тъкан на плъх, води до намаляване нивото на кръвната захар,
серумният NO, а също и на MDA (малондиалдехид) (маркер за оксидативен стрес). В
12
допълнение, съдържанието на GSH (редуциран глутатион) се възстановява до
нормалното ниво на контролната група плъхове (Yazdanparast R et. al. 2009).

1.3.3 Противоязвено действие

A. millefolium е широко разпространено лечебно растение, което се използва в
народната медицина за лечение на възпаления и стомашно-чревни разстройства.
Установеное е, че воден екстракт ефективно защитава стомашната лигавица срещу
остри стомашни поражения, индуцирани от индометацин и етанол и за лечение на
хронични стомашни поражения, индуцирани от оцетна киселина (ED50= 32 mg/kg
орално). Проучвания показват, че антиязвения потенциал на A. millefolium не е
придружен от никакви признаци на токсичност, дори при продължителна употреба.
Предполага се, че най-вероятно противоязвената активност на екстракти от A.
millefolium се делжи на инхибиране на стомашната секреция или до увеличаване на
някои защитни фактори (като кръвен поток) в стомашната лигавица (Cavalcanti. et.
al., 2006; Potrich et. al., 2010).

1.3.4 Имуносупресивна активност

Имунологичните свойства на A. millefolium се свързва с наличието на
гликозилирани производни на кафеената киселина, изолирани и идентифицирани в
активни фракции на метанолов екстракт. Някои известни съединения, включително,
лутеолин-7 О-глюкозид и апигенин XXIV 7-О-глюкозид XXV също са докладвани в
този вид (Yassa et al., 2007). Етерични масла от A. talagonica и A. millefolium са
изследвани за стимулиране на хуморалния имуннен отговор в BALB / C мишки.
Маслото, изолирано от A. millefolium съдържа висок процент сескитерпени (55,4%), в
което бизаболол XXVI е основен компонент. Етеричното масло от A. millefolium
намалял титъра на анти-SRBC антитела, но маслото на A. talagonica не притежава
същия ефект (Saeidnia S. et. al., 2004).

1.3.5 Спазмолитично действие

Използването на билкови чайове от различни видове Аchillea срещу стомашно-
чревни разстройства, по-специално като спазмолитични и противовъзпалителни

13
средства е често срещано явление в народната медицина. Спазмолитичния ефект на
род Achillea може да се дължи на флавоноидния състав на растението. Галангин
XXXIV, кверцетин XXI и еупатилин XXXV, които се намират обикновено в Achillea,
предизвикват силена релаксация на илеума (Hammad et. al., 1997; Abu-Niaaj et. al.,
1996). Изследван е ефектът на хидро-алкохолен екстракт от A. millefolium за
контрактилни отговори на изолиран илеум на морско свинче при пет концентрации,
вариращи от 0.05 до 5 mg/ml. Активност притежава екстракт в доза ЕС50 = 1.5
mg/ml) (Babaei M et. al., 2007).

1.3.6 Антибактериална активност

Изследвана е антибактериална активност на екстракти (хексан: етер: метанол =
1:1:1) от надземните части на A. clavennae, A. holosericea, A. lingulata и A. Millefolium
срещу пет бактерии (S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и Salmonella
enteritidis) и две гъби (A. niger и C. albicans). Установено е, че екстракти от всичките
четири вида притежават висока антимикробна активност срещу тестваните щамове
(Stojanovic еt. al., 2005).
Съобщено е, че етеричното масло от A. biebersteinii Afan. проявява
антимикробна активност срещу 8 бактерии, 14 гъби и дрожди (Ozlem B et.al., 2006), а
маслото от A. ligusticaе е eфективно срещу Streptococcus mutans (Maggi et. al., 2009).

1.3.7 Антиоксидантна активност

Свободните радикали често са генерирани от продукти от биологични реакции
или от екзогенни фактори, увреждащи клетъчните мембрани и молекулите на ДНК.
Фенолните съединения, като флавоноиди и флавони представляват една от най-
важните фармакологично активни групи, установени при представители от род
Achillea. Предполага се, че противовъзпалителните (Blumenthal et. al., 2000),
антимикробиалните (Aljancic et. al.,1999) и цитотоксичните (Trifunovic. et al., 2006) "
свойства на растенията от род Achillea се дължат именно на тях.
Чрез HPLC-DPPH - анализ на екстракти от A. millefolium е установено, че
растеието притежава значителна антиоксидантна активност, която се дължи на
присъствието на радикалулавящи компоненти в комплекс с фенолни съединения. В

14
допълнение, флуориметрични измервания показват, че екстракти от A. millefolium
намаляват производството на H2O2 в изолирани митохондрии. Тези резултати, взети
заедно с фитохимичните данни, показващи наличие на значителни количества
феноли, демонстрират висок антиоксидантен потенциал на A. millefolium
(Trumbeckaite еt. al., 2011).
Съобщено е, че хидроалкохолен екстракт на A. santolina инхибира образуването
на тиобарбитурова киселинаи и липидната пероксидация в чернодробна тъкан на
плъх (Ardestani et. al. 2007).
Tuberosoa et al. (2009) изследват етанолови екстракти от осем проби от дива A.
ligustica и една проба от култивирана A. millefolium за радикал улавяща активност
посредством определяне на способността на екстрактите да инхибират неензимно
липидната пероксидация, като се използва in vitro система на окисляване на
линоловата киселина. Пет от девет екстракта имат силен антиоксидантен потенциал с
IC50 = 5μg. Изследвана е и антиоксидантната активност на екстрактите от A.
millefolium при Сасо-2 чревните с TBH-индуцирана токсичност. Установено е, че два
от екстрактите тествани в тази клетъчна система имат защитна способност срещу
индуцирания оксидативен стрес (Tuberosoa еt.al., 2009).

15
III. Цел и задачи

Цел на настоящата дипломна работа е in vitro култивиране на Achillea thracica Velen.

и последващо адаптиране в ex vitro условия, сравнително определяне на
съдържанието на фенолните киселини и антиоксидантния потенциал на метанолови
екстракти от in situ, in vitro и ex vitro култивирани растения.

За изпълнението на целта бяха разработени следните задачи:

1. Събиране на растителен материал (семена) от естественото находище (с.

Маноле, Пловдивско) на Achillea thracica.

2. Стерилизация на семената и въвеждане в in vitro условия.

3. Микроразмножаване и поддържане на колекция от in vitro регенерирали

линии на вида.

4. Определяне на количеството на общите феноли и флавоноиди в метанолови

екстракти от in situ, in vitro и ex vitro култивирани растения.

5. Определяне на общата антиоксидантна и DPPH-радикал улавяща активност

на метанолови екстракти от in situ, in vitro и ex vitro растения Achillea
thracica.

6. Сравнителен анализ на фенолните киселини в метанолови екстракти от in

situ, in vitro и ex vitro култивирани растения Achillea thracica, посредством
газ хроматограф мас-детектор (GC-MS).

16
III. Материал и методи
Експерименталната работа е изработена в Катедра Физиология на растенията,
Биологически факултет, СУ “Св. Климент Охридски”.

1. Растителен материал

Растителният материал (семена) е събран от популация на Achillea thracica

Velen., намираща се край с. Маноле (Пловдивско) с разрешението на МОСВ –
Република България. Събирането е осъществено в периода на пълна зрялост на
семената, в съответствие с целите на изследването. Образец от вида е депозиран в
хербариума към катедра „Ботаника” при Биологически факултет на СУ „Св. Климент
Охридски” под номер SO 107385, 23.06.2011 г. (Фиг. 5).

Фигура 8. Образец № SO 107385 депозиран в хербариума към катедра

„Ботаника” при Биологически факултет на СУ „Св. Климент Охридски”.
17
2. Стерилизация на семена от Achillea thracica и въвеждане в in vitro култура

In vitro стъблени култури са индуцирани от зрели сухи семена, събрани от in

situ диворастящи растения и стерилизирани със 70% етанол за 5 min. В асептична
среда 25 стерилизирани семена са инокулирани на базална MS (Murashige and Skoog,
1962) хранителна среда, съдържаща ½ концентрация на макро- и микро-соли (1/2
MS) и 25 семена на воден агар (WA). Семената са култивирани на тъмно при 25 °C.
След прорастване, регенериралите растенията са прехвърлени върху MS хранителна
среда, съдържаща 3% захароза, 0.8% агар и са култивирани при контролирани
условия на средата: фотопериод 16/8 ч., температура 25 °C, относителна влажност на
въздуха 60-70 %. Регенериралите растения in vitro се поддържат чрез прехвърляне на
експланти (част от стъбло с аксиларна пъпка) на всеки 30 дни върху свежа MS
хранителна среда и са култивирани при гореспоменатите условия.

3. Ex vitro адаптация на регенериралите in vitro растения A. thracica.

За ex vitro адаптация са подбират растения с добре развита коренова система.

Регенериралите растения in vitro се изваждат от хранителна среда и се промиват с
дистилирана вода до пълното отстраняване на агара. Следва засаждане в
индивидуални дезинфекцирани съдове върху стерилен почвен субстрат (градинска
торф:кокосови влакна:пясък = 2:1:1). Растенията се инкубират в адаптационна камера
(POL-EKO APARATURA SP.J.A. Polok – Kowalska KK 350 STD 1400 W) за 28 дни
при контролирани условия на средата, променящи се на всеки 4-5 дни (Таблица 2).
След един месец, растенията се преместват в оранжерия и след още един месец се
прехвърлят на градинска почва на експериментално опитно поле.

18
Таблица 1 Условия във фитотронната камера, при които се извършва адаптацията
на Achillea thracica Velen. Всеки етап от адаптацията е с продължителност 4-5
дни и се извършва при определени условия на средата в камерата, повтарящи се
ежедневно (циклично) до края на съответният етап. Контролираните фактори се
изменят в рамките на деня по начин, имитиращ промените настъпващи във
външните условия в рамките на едно денонощие.
Дата Бележки Въздушна Температу- Осветеност Продъл- Венти-
влажност ра жително лиране
ст на
деня в
часове
01.01.13 Начало на Смрачаване- Смрачаване-20; Смрачаване- Смрачаван 45%
опита за 85%; Нощ-18; 40%; е-3;
адаптация в Нощ-90%; Съмване-20; Нощ-0%; Нощ-8;
камера Съмване-85%; Ден-23 Съмване-40%; Съмване-
Ден-80% Ден-60% 3;
Ден-10.
07.01.13 Смрачаване- Смрачаване-20; Смрачаване- Смрачаван 45%
80%; Нощ-18; 40%; е-3;
Нощ-85%; Съмване-20; Нощ-0%; Нощ-8;
Съмване-80%; Ден-23 Съмване-40%; Съмване-
Ден-75 % Ден-60% 3;
Ден-10.
13.01.13 Смрачаване- Смрачаване-20; Смрачаване- Смрачаван 45%
75%; Нощ-18; 40%; е-3;
Нощ-80%; Съмване-20; Нощ-0%; Нощ-8;
Съмване-75%; Ден-23 Съмване-40%; Съмване-
Ден-70% Ден-60% 3;
Ден-10.
19.01.13 Смрачаване- Смрачаване-20; Смрачаване- Смрачаван 45%
70%; Нощ-18; 40%; е-3;
Нощ-75%; Съмване-20; Нощ-0%; Нощ-8;
Съмване-70%; Ден-23 Съмване-40%; Съмване-
Ден-65% Ден-60% 3;
Ден-10.
23.01.13 Смрачаване- Смрачаване-20; Смрачаване- Смрачаван 45%
65%; Нощ-18; 40%; е-3;
Нощ-75%; Съмване-20; Нощ-0%; Нощ-8;
Съмване-65%; Ден-23 Съмване-40%; Съмване-
Ден-60% Ден-60% 3;
Ден-10.
26.01.13 Смрачаване- Смрачаване-20; Смрачаване- Смрачаван 45%
60%; Нощ-18; 40%; е-3;
Нощ-75%; Съмване-20; Нощ-0%; Нощ-8;
Съмване-60%; Ден-23 Съмване-40%; Съмване-
Ден-55% Ден-60% 3;
Ден-10.
29.01.13 Край на Влажността 22 ± 2 ºС Според Според
опита- варира между дневнията условията
култивиране 30 и 60 % цикъл на слън- в адапта-
на цето ционната
растенията камера
във
фитостатно
помещение
19
 4. Определяне количеството на тотални феноли

Фенолите реагират с фосфомолибденовата киселина в реактива на Фолин в

алкална среда и образуват син комплекс. Съдържанието на тотални феноли се
определя по метода на Singleton et al., (1999) с модификации. Инкубационната среда
съдържа: 0,1 ml от екстракта, в концентрация 1 mg/ml, 1,5 ml реагент на Фолин (1:10
разреждане с dН2О) и 1,4 ml Na2CO3. Пробите се инкубират на стайна температура за
30 мин. на тъмно. Измерва се екстинкцията при 765 nm на спектрофотометър
Shimadzu UV 1800. Количеството на тоталните феноли се изразява в mg галова
киселина на грам растителен екстракт.

5. Определяне количеството на тоталните флавоноиди

Количеството на тоталните флавоноиди се определя по метода на Chang et al.,

(2002) с модификации. Инкубационната среда съдържа 0,5 ml екстракт с
концентрация 1 mg/ml, 1,4 ml метанол, 0,1 ml 10% AlCI3, 0,1 ml 1М калиев ацетат и
2,8 ml dН2О. Пробите се инкубират на стайна температура за 30 мин. Измерва се
екстинкцията при 415 nm на спектрофотометър Shimadzu UV 1800. Количеството на
тоталните флавоноиди се изразява в mg кверцетин на грам растителен екстракт.

6. Тотална антиоксидантна активност

Тоталната антиоксидантна активност е определена по методът на Prieto, Pineda

and Aguilar (1999) с модификации. Антиоксидантната активност се измерва
спектрофотометрично като се използва фосфомолибденовия метод. Той се основава
на редукцията на Mo(VI) до Mo(V) в екстракта и формирането на зелен
фосфомолибденов комплекс. Инкубационната среда съдържа 0,25 ml екстракт (1
mg/ml), 2.5 ml реагент (0.6 M сярна киселина, 28 mM калиев дихидроген фосфат и 4
mM амониев молибдат). Пробите се инкубират на водна баня за 90 мин при 90 ˚С.
Реакцията се прекратява, след поставяне на пробите на лед, темперират се на стайна
температура и се измерва абсорбцията при 695 nm на спектрофотометър Shimadzu

20
UV 1800. Паралелно се залага и контрола, която съдържа 0,25 ml метанол и 2.5 ml
реагент и се инкубира при същите условия. Тоталната антиоксидантна активност се
изразява в mM.g-1 растителен екстракт.

7. DPPH-радикал улавяща активност.

Способността за свързване на свободни радикали е определена чрез използване

на стабилен DPPH (2,2-дифенил-2-пикризилхидразил хидрат), следвайки
модифициран метод на Blois (1958). DPPH е азот-съдържащ радикал с максимум на
абсорбция при 517 nm, и се превръща в 1,1,дифенил-2-пикрил хидразин при
взаимодействие с активни водородни форми. Степента на промяна на цвета на
радикала е пропорционална на концентрацията и потенциалната активност на
антиоксидантите. Антиоксидантната активност се измерва чрез намаляването на
абсорбцията при 517 nm. Способността за свързване на свободни радикали е
определена чрез използване на стабилен DPPH радикал, следвайки модифициран
метод на Blois (1958)
Тествани са 8 различни концентрации на избраните екстракти - 10, 20, 40, 60,
80, 100 120, 150 μg/ml и е добавен метанол до краен обем 1,5 ml. След това е добавян
радикалът 0,5 ml DPPH (1:3). Като бланк е използван метанол, а като позитивна
контрола - смес от метанол (1.5 ml) с DPPH (0,5 ml). Пробите са инкубирани за 30
мин. на тъмно и е измервана абсорбцията при 517 nm. Процентът на инхибиране е
изчислен по формулата:
Inhibition % = [(AB – AA)/AB] × 100,
където AB е абсорбцията на позитивната контрола, а AA е абсорбцията на
пробата. Построена е крива, от която е намерена концентрацията, при която има 50 %
инхибиране на радикала.

8. Приготвяне на метанолови екстракти от in situ, in vitro и ex

vitro адаптирани растения

Три грама фино смлян сух растителен материал (in situ, in vitro и ex

21
vitro адаптирани растения) се поставя в целулозен патрон (Whatman© cellulose
extraction thumbles, 18mm X 55mm, Ext. Dia. 20mm X 55mm Ext. Length) и се
екстрахира на Soxhlet апарат с 30 ml метанол за 8 до 12 часа до пълно обезцветяване
при температура 65˚С. Екстрактът се филтрува и се концентрира на ротационен
вакуум изпарител. Полученият концентрат се накапва в предварително претеглени
епендорфки и се изпарява до сухо. Изсушените екстракти се съхраняват в хладилник
(4˚C).

9. Анализ на съдържанието на фенолни киселини в in situ, in vitro и ex vitro

растения от A. thracica чрез GC-MS.

Газ-хроматографският анализ е осъществен на 7890 A газ хроматограф, снабден

с 5975 C мас селективен детектор (7890 A GC System, 5974 C inert XL EI/CI/MSD with
Triple-Axis Detector, Agilent Technologies, China). Разделянето е постигнато чрез HP-5
MS колона (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm). Скоростта на потока на носещия газ (хелий) е
поддържана 1.0 ml/min. Температурата на инжектора и на трансферната линия е
поддържана на 250˚C. Температурната програма на камерата е използвана както
следва: 80˚C за 2 min, след това 5˚C/min до 200˚C за 2 min, след това 10˚C/min до
300˚C за 10 min, за общо работно време 48 min. Инжекциите са правени на
разделителен принцип в съотношение 10:1. 1 μL на инжектирания разтвор.
Идентификацията на съединенията е постигната чрез сравняване времената на
задържане и относителните индекси по Ковач с тези на стандартни вещества и
масспектрални данни от библиотеката на WILEY, The Golm Metabolome Database
(http:/csbdb.mpimpgolm.mpg.de/csb-db/gmd/gmd.html) and National Institute of Standards
and Technology (NIST 08) и Adams libraries.

10. Статистическа обработка на резултатите

Представените резултати от експериментите са средна стойност поне от 3

проведени независими експерименти. Резултатите са сравнени по стандартната
грешка на средните стойности (S.E.M. n-1).

22
IV. Резултати и обсъждане

1. Стерилизация на семената и въвеждане в in vitro условия на Achillea thracica

Velen.
Ендемитните растителни видове са под силен антропогенен, абиотичен и
биотичен стрес в естествената си среда, което налага вземането на мерки за
поддържането и опазването на растителното разнообразие.
От последните десетилетия на 20 век до днес се наблюдава намаляване на
популациите на тракийски равнец поради силният антропогенен натиск, на който е
изложено растението. Въпреки взетите мерки за защита на растението от съответните
държавни институции и наскорошното включване на растението към Пилотната
мрежа от малки защитени територии през 2012 г. бързото намаляване на числеността
му изисква и до прибягването до някои други консервационни мерки с цел
запазването на вида. Един такъв метод е въвеждането на растението в in vitro условия
и микроразмножаването му. Методът е подходящ и за видове с намалена фертилност
както и за бързо размножаване на растителни видове, синтезиращи ценни вторични
метаболити или притежаващи други важни качества.
Видът A. thracica не е въвеждан в in vitro условия на култивиране. За успешно
въвеждане в култура in vitro е нужно установяване на ефективен протокол за
стерилизация на началния растителен материал.
Успешно въвеждане на A. thracica в in vitro култура се осъществи чрез
стерилизиране със 70 % етанол на 50 зрели семена, събрани от in situ растения. След
10-дневно култивиране на 25 семена върху ½ MS хранителна среда, 34% от тях
покълнаха, докато кълняемостта на семената (25 броя) върху WA e приблизително
два пъти по ниска – 18%. След установяване на покълване, семеначетата бяха
премествани във фитокултивационно помещение с контролирани условия
(осветяване и температура), за да не етиолират и да продължат нормалното си
развитие. След един месец, те бяха прехвърлени върху MS пълна хранителна среда
(Фиг.1). Няколко източника посочват хранителната среда MS, като най-подходяща за
получаване на добре развити регенеранти от различни видове Achillea (Wawrosch et
al., 1994; Evenor and Reuveni, 2004; Grigoriadou et al., 2011). Тя не съдържа растежни

23
регулатори, които могат да допринесат за генетично вариране на културите и да
намалят възможността за по-нататъшна реинтродукция на in vitro регенерантите в
техния оригинален хабитат (Sarasan et al., 2006).

Фигура 9. Схематично представяне на процедура по въвеждане на Achillea

thracica в in vitro условия от семена.

In vitro културите могат да подпомогнат съществено проучването на

метаболитите и на потенциалните лечебни свойства на този вид, тъй като
отглеждането му в полеви условия може да бъде компрометирано от сезонно и
соматично вариране, бактериални и гъбни зарази, както и от замърсяване на околната
среда, което може да промени съдържанието на биологично-активни вещества (Geng
et al. 2001). Мащабното събиране с търговска цел на лечебни растения от техните
естествени местообитания причинява изчерпване на растителните ресурси. Затова
съхраняването на генетичен материал от A. thracica е наложително и размножаването
чрез тъканни и органни култури, поддържаши гентичната стабилност на вида е от
голямо значение (Murch et al. 2000).
24
3. Адаптация на Achillea thracica Velen. от in vitro в ex vitro условия

Беше проведен опит за ex vitro адаптация на in vitro регенеранти A. thracica в растежна

камера. Режимът на контролирани условия в продължение на четири седмици е организиран,
така че да протича с намаляваща влажност, която се сменя всяка седмица - 90% > 80% > 70%
> 60%. От 20 заложени растения, всички бяха успешно адаптирани.

Фигура 10. Ex vitro адаптирани растения Achillea thracica

Ex vitro регенерантите на вида, адаптирани в условия на растежна камера бяха

адаптирани успешно и в оранжерийни условия и след това бяха засадени на опитно поле с.
Лозен. Всичките 20 растения (100%), които бяха оцелели след 4-сегментната ex vitro камерна
адаптация, се развиха с образуване на цветни кошнички и семена през първата половин
година след засаждането им на опитното поле (Фиг. 2).

25
 4. Определяне количеството на тотални феноли
Вторичните метаболити не са необходими за растежа на растенията, но в
резултат на дълга адаптивната еволюция, влияят цялостно върху способността и
благополучието на растения, особено по отношение на отговорите на околната среда
и привличане на опрашители (Kato-Noguchi et al. 2013). Фенолните съединения се
характеризират с антиоксидантна активност, която предотвратява натрупването на
АФК, получени в резултат на метаболитните процеси. Антиоксидантна им роля се
определя чрез способността им да улавят свободните радикали, проявяват се като
донори на протони и електрони и могат да изменят кинетиката на прекисното
окисление на мембранните липиди чрез промяна в пакетирането им и намаляване
флуидността на мембраните (Bonoli et al. 2004) Напоследък непрекъснато нараства
интересът към естествените антиоксиданти, главно феноли, които се установяват в
медицинските растения и могат да предпазят клетките от промени вследствие на
оксидативен стрес (Gardner et al., 2000; Halliwell et. al., 1999). През последното
десетилетилетие са направени редица изследвания за проучване на антиоксидантните
свойства на различни видове от род Achillea (A. biebersteinii (Özer et., al.2006), A.
tenuifolia, A. vermicularis и A. wilhelmsii (Nickavar et. al., 2006), A. santolina (Ardestani
et. al., 2007), A. ptarmica, A. nobilis (Koleckar et. al., 2008) A. millefolium (Eghdami et.
al., 2010; Vitalini et. al., 2011), A. ligusta (Tuberoso et. al., 2009).
Наблюдава се вискоко съдържание на фенолни съединения при in situ растения
A. thracica (16,5±0,33 mg/g екстракт), докато при in vitro култивираните регенеранти
се наблюдава двукратно намаляване на количеството на тези метаболити (6.66±0,05
mg/g екстракт). При ex situ култивираните растения се установи възстановяване на
количеството на фенолите (16,872±0,19 mg/g екстракт) до нива измерени при
диворастящите растения (Фиг.11). По този начин, растенията, развиващи се във
външни условия си осигуряват защита срещу оксидативния стрес, докато значението
на тази защита в контролираната среда, в която се отглеждат in vitro растенията, е по-
малко. По-ниското количество на фенолните киселини при in vitro размножените
растения вероятно се дължи на по-високата влажност, при която се отглеждат in vitro
растенията, поради което лигнификацията им е по-ниска (Piqueras et al. 2002; Saher et
al. 2004).

26
Фигура 11. Количество на общите феноли при растения отглеждани in situ ex vitro
и in vitro.

5. Определяне количеството на тоталните флавоноиди

Флавоноидите са полифенолни антиоксиданти, които се откриват естествено в
растенията. Тези метаболити са разпределени из различни частите на растението и
придават окраска на цветовете и плодовете, привличат насекомите опрашители,
отблъскват микроби и насекоми. Важно е, че консумацията на храни, съдържащи
флавоноиди е свързана с множество ползи за здравето. Антиоксидантната им
активност се дължи на бавното им усвояване от организма, което е индикация, че
биологично задействат производството на естествени ензими, които се борят с
болестите (Keller, 2009). Флавоноидите, като един от най-разнообразна и широко
разпространена група на природни съединения, са може би най-важните природни
феноли (Rendeiro, 2012).

27
 Фигура 12. Количество на общите флаваноиди при растения отглеждани in
situ ex vitro и in vitro.

По отношение на флавоноидите също се наблюдава тенденция към намаляване

съдържанието им по време на in vitro култивиране (0.009±0.0004 mg/g екстракт) и
възстановяване при ex vitro аклиматизация (0.015. ±0.001 mg/g екстракт) (Фиг. 12).

6. Анализ на съдържанието на фенолни киселини в in situ, in vitro и ex vitro

растения от A. thracica чрез GC-MS.
В получените метанолни екстракти на in situ, in vitro и ex vitro растения от A.
thracica след анализ чрез GC-MS са идентифицирани 15 фенолни киселини.(Таблица
2).
Процентното съдържание на детектираните фенолни киселини при in situ, in
vitro и ex vitro растенията варира в различна степен. Забелязва се частично
понижение на количествения състав при in vitro култивираните растения и
възстановяване при ex vitro адаптираните растения. С най високо процентно

28
отношение се открояват кафеената, генистовата, протокатехиновата и ваниловата
киселини (Таблица 2).

Таблица 2. Качествено и процентно съдържание на фенолни киселини в in situ, in

vitro и ex vitro метанолни екстракти от Achillea tracica, получени с помощта на GC-
MS анализ.

A. thracica in situ A. thracica in vitro A. thracica ex vitro

Phenolic acids RT [%] of total [%] of total [%] of total

Salicylic acid 7,7 0,52 0,18 0,52

3(m) Hydroxybenzoic acid 8,2 0,07 - 0,11

4(p) Hydroxybenzoic acid 8,87 0,94 0,44 0,21

Benzoic acid 10,36 0,49 0,48 0,58

Vanilic acid 10,58 2,03 0,25 0,85

Gentisic acid 10,79 3,16 1,36 1,11

Protocatechuic acid 11,38 2,73 0,4 1,72

Quinic acid 12,21 0,128 - 0,04

Syringic acid 12,5 0,488 0,194 1,23

p-Hydroxycinnamic acid 13,06 0,238 0,359 0,376

Hydrocaffeic acid 13,23 0,693 0,19 -

Gallic acid 13,5 0,4 - 0,03

Ferulic acid 15,2 0,293 0,093 0,78

Caffeic acid 16,25 15,47 8,09 42,78

Chlorogenic acid 30,79 0,11 - 0,08

29
 Най-голяма разлика в количествените стойности се наблюдава при кафеената
киселина. В A. thracica in situ количеството и е 15,47% , при in vitro регенерантите
количеството и пада до 8.09%, докато при ex vitro адаптираните растения
количеството и достига до 42,78%.
Голяма част от идентифицираните фенолни киселини са били докладвани в
други представители от род Achillea. Хлорогенова и кафеена киселина са установени
в A. millefolium (Innocenti et. al., 2007), а също и протокатехинова, ванилова (Oksus et.
al., 2004), ферулова и сирингова киселини (Kahkonen et. al., 1999).
Вторични метаболити, т.е. органични съединения, които не са пряко
ангажирани в нормалния растеж, развитие, или възпроизвеждане на организмите
(Fraenkel, 1959; Dixonе et. al., 2001) са широко разпространени в растенията. В
отговор на биотични и абиотични фактори, растенията могат да увеличат
производството на тези вещества. Изследвания сочат, че растения от род Achillea са
богати на хидроксиканелени киселини като хлорогенова киселина, 3,5-ди-О-
кафеоилхинова киселина и 4,5-ди-О-кафеоилхинова киселина (Giorgi et. al., 2009).
Тези съединения увеличават капацитета на растенията да реагират на стреса.
Някои от фенолните киселини в пробите са с доказани фармакологични
свойства и намират реално приложение в козметиката, фармацията и медицината, а
други са с потенциален ефект. Наличието им в пробите и високото съдържание на
някои от тях дават основание растението да се смята за лечебно и с реална
практическа полза.
Кафеена киселина е органично съединение, което е класифицирано като
хидроксиканелена киселина.Установенa е при много билкови растения, тъй като е
ключово междинно съединение в биосинтеза на лигнините. Кафеената киселина има
разнообразие от потенциални фармакологични ефекти. In vitro и in vivo изследвания
на кафеената киселина показват, че тя е мощен антиоксидант. Тя също притежава и
имуномодулаторно действие и противовъзпалителна активност (Cilliers et. al., 1990).
Протокатехинова киселина (PCA) е широко разпространенa фенолнa
киселина.Тя има структурно сходство с галовата, кафеената, ваниловата и сирингова
киселини, които са добре известни антиоксидантни съединения.

30
 7. Антиоксидантна активност на метанолови екстракти от A. thracica

Метаноловите екстракти от in situ и ex vitro A. thracica съдържат най-високи

нива на феноли и флавоноиди (Фиг. 11 и 12), което корелира и с високата
антиоксидантна активност, установена чрез прилагане на два метода (TAA и DPPH
радикал улавяща активност, при която има 50 % инхибиране на радикала.),
50.92±2.08 и IC50= 17.7±0.28 за in situ и 53±2.95 и IC50=35.05±0.07 за ex vitro
адаптирните растения. При екстрактите от in vitro регенерантите се наблюдава
намаляване на общата антиоксидантна активност (36,92±0.80) и радикал улавящата
способност (IC50=93.45±0.35) (Фиг.13 и 14).

Фигура 13. Количество на общата антиоксидантнаактивност при растения

отглеждани in situ, ex vitro и in vitro.

31
 Фигура 14. Количество на DPPH-радикал улавяща активност при растения
отглеждани in situ, ex vitro и in vitro.

Най-вероятно високата антиоксидантна активност се дължи на високото

процентно съдържание на кафеената, генистовата, протокатехиновата и ваниловата
киселени, които се характеризират с висок антиоксидантен потенциал (Kakkar et. al.,
2014). Получените резултати разкриват възможността за използване на A. thracica
като естествен източник на антиоксиданти, които могат да бъдат полезни за здравето
и да намерят приложение в козметиката, фармацията и медицината.

32
 V. Изводи
Въз основа на проведените експерименти могат да се обобщят следните изводи:

1. Българският ендемитен вид A. thracica е въведен в in vitro условия и

регенериралите растения са успешно микроразмножавани и поддържани в
колекция от in vitro култури на MS-хранителна среда без добавени растежни
регулатори.

2. Постигната е 100% адаптация на регенериралите in vitro растения в ex vitro

условия.

3. Най-висока концентрация на общи феноли и флавоноиди се установи при

диворастящите и ex vitro адаптираните растения A. thracica, което е в пълна
корелация и с антиоксидантна активност на екстрактите, получени от тези
варианти.

4. Детектирани са 15 фенолни киселини, от които кафеената, генистовата,

протокатехиновата и ваниловата киселини преобладават в процентното
съдържание.

5. В отговор на различните условия на култивиране в микроразмножените

растения съдържанието на акумулираните фенолни съединения се понижава, но
възстановяване на биосинтетичнатан им активност настъпва при адаптирането
им в ex vitro среда.

6. Индуцираната in vitro моделна системи ще позволи по нататъшното

провеждането на изследвания върху цялостния метаболитен профил на A.
thracica, сравняване на профилите на in vitro култивирани, ex vitro адаптирани и
in situ растения, и оценка на биосинтетичния им потенциал с оглед създаване на
икономически обусловен процес и запазване на растителното биоразнообразие.

33
ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1: Състав на МS-хранителна среда

Концентрац
Съединения
ия в
Източници на средата
макроелементи
NH4NO3 1,65 g/l
KNO3 1,9 g/l
CaCl2.2H2O 0,44 g/l
MgSO4.7H2O 0,37 g/l
KH2PO4 0,17 g/l
Източници на
микроелементи
KI 0,83 mg/l
H3BO3 6,2 mg/l
MnSO4.4H2O 22,3 mg/l
ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l
Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l
CuSO4.5H2O 0,025 mg/l
CoCl2.6H2O 0,025 mg/l
Железен източник
FeSO4.7H2O 27,8 mg/l
Na2EДTA.2H2O 37,3 mg/l
Органични добавки
Миоинозитол 100 mg/l
Никотинова киселина 0,5 mg/l
Пиридоксин HCl 0,5 mg/l
Тиамин HCl 0,5 mg/l
Глицин 2 mg/l

Въглероден източник
Захароза 20 g/l
Втвърдител
Агар 8 g/l
pH на средата – 5,8

34
VI. Използвана литературa

1. Abu-Niaaj L, Abu-Zarga M, Abdalla SS. Isolation and inhibitory effects of eupatilin, a flavone
isolated from Artemisia monosperma Del., on rat isolated smooth muscle. Pharmaceutical Biol
1996: 34: 134-140.
2. Ardestani A, Yazdanparast R. Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea
santolina extractsFood Chemistry 2007; 104: 21-29.
3. Ardestani, A.; Yazdanparast, R. Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea
santolina extracts. Food Chem. 2007, 104, 21–29.
4. Babaei M, Abarghoei ME, Akhavan MM, Ansari R, Vafaei AA, Taherian AA, Mousavi S,
Toussy J.Antimotility effect of hydroalcoholic extract of yarrow (Achillea millefolium) on the
guinea-pig ileum. Pak J Biol Sci 2007; 10: 3673-3677.
5. Blois, M.S., (1958). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature,
181: 1199 - 1200. ISSN 0028-0836
6. Bozin B., Mimica-Dukic N., Bogavac M., Suvajdzic L., Simin N., Samojlik I. and Couladis
M. 2008. Chemical Composition, Antioxidant and Antibacterial Properties of Achillea collina
Becker ex Heimerl s.l. and A. pannonica Scheele Essential oils. - Molecules 2008, 13, 2058-
2068; DOI: 10.3390/molecules13092058.
7. Burk David R., Cichacz Zbigniew A. and Daskalova Sasha M. 2009. Aqueous extract of
Achillea millefolium L. (Asteraceae) inflorescences suppresses lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in RAW 264.7 murine macrophages. - Journal of Medicinal Plants
Research Vol. 4(3), pp. 225-234, 4 February, 2010 Available online at
http://www.academicjournals.org/JMPR ISSN 1996-0875© 2010 Academic Journals.
8. Byun, Sanguine; KW Lee, SK Jung, EJ Lee, MK Hwang,SH Lim, AM Bode, HJ Lee,Z Dong
(2010). Luteolin Inhibits Protein Kinase Cε and c-Src Activities and UVB-Induced Skin
Cancer. Cancer Research 70 2415–23. doi10.11580008-5472.
9. Calderón-Montaño JM, Burgos-Morón E, Pérez-Guerrero C, López-Lázaro M. "A review on
the dietary flavonoid kaempferol". Mini Rev Med Chem. 2011 Apr; 11(4):298-344.
10. Candan F., Unlu M., Tepe B., Daferera D., Polissiou M., Sökmen A., Akpulat H. A. 2003.
Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea
millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae). - Journal of Ethnopharmacology 87 (2003)
215–220.
11. Cavalcanti A. M., Baggio C. H., Freitas C. S., Rieck L., de Sousa R. S., Da Silva-Santos J. E.,
Mesia-Vela S., Marques M. C. A. 2006. Safety and antiulcer efficacy studies of Achillea
millefolium L. after chronic treatment in Wistar rats. - Journal of Ethnopharmacology 107
35
 (2006) 277–284.
12. Cavalcanti AM, Baggio CH, Freitas CS, Rieck L, de Sousa RS, Da Silva-Santos JE, Mesia-
Vela S, Marques MCA. Safety and antiulcer efficacy studies of Achillea millefolium L. after
chronic treatment in Wistar rats. J Ethnopharm 2006; 107: 277-284.
13. Chandler R. F., Hooper S. N., Safe L. M., Hooper D. L., Jamieson W. D., Flinn C. G. 1982.
Herbal remedies of the maritime Indians: Sterols and triterpenes ofAchillea millefolium L.
(Yarrow). - Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 71, Issue 6, pages 690–693, June
1982.
14. Chandler RF, Hooper SN, Hooper DL, Jamieson WD, Flinn CG, Safe LM. Herbal remedies
the maritime Indians: sterols and triterpenes of Achillea millefolium L. (yarrow). J Pharm Sci
1982; 71: 690-693.
15. Chang, C. C., Yang, M. H., Wen, H. M., & Chern, J. C. 2002. „Estimation of total flavonoid
content in propolis by two complementary colorimetric methods”. Journal of Food and Drug
Analysis, 10,178–182.
16. da Silva J. A. T. 2003. Anthemideae: advances in tissue culture, genetics and transgenic
biotechnology. - African Journal of Biotechnology Vol. 2 (12), pp. 547-556, December 2003.
Available online at http://www.academicjournals.org/AJB. 2003 Academic Journals.
17. da Silva J. A. T. 2004. Mining the essential oils of the Anthemideae. - African Journal of
Biotechnology Vol. 3 (12), pp. 706-720, December 2004. Available online at
http://www.academicjournals.org/AJB. ISSN 1684–5315 © 2004 Academic Journals.
18. Dall’Acqua S., Bolego C., Cignarella A., Gaion R. M., Innocenti G. 2011. Vasoprotective
activity of standardized Achillea millefolium extract. - Phytomedicine 18 (2011) 1031– 1036.
19. Danova K., Bertoli A., Pistelli L., Dimitrov D., Pistelli L. 2009. In vitro culture of Balkan
endemic and rare Pulsatilla species for conservational purposes and secondary metabolites
production. Botanica Serbica 33 (2), 157-162.
20. Darwish RM, Aburjai TA. Effect of ethnomedicinal plants used in folklore medicine in Jordan
as antibiotic resistant inhibitors on Escherichia coli. BMC Complement Altern Med 2010; 10:
9.
21. Davis J. M., Murphy E. A., Carmichael M. D., Davis B. (2009). Quercetin increases brain and
muscle mitochondrial biogenesis and exercise tolerance. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol. 296 (4) R1071–7.
22. Edwards R. L., Lyon T., Litwin S. E., Rabovsky A., Symons J. D., Jalili T. (1 November
2007). Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects. J. Nutr. 137 (11) 2405–11.
23. Egert S et al. (2009). "Quercetin reduces systolic blood pressure and plasma oxidised low-
density lipoprotein concentrations in overweight subjects with a high-cardiovascular disease

36
 risk phenotype: A double-blinded, placebo-controlled cross-over study". Br J Nutr 102 (7):
1065–1074.
24. Eghdami, A.; Sadeghi, F. Determination of total phenolic and flavonoids contents in
methanolic and aqueous extract of Achillea millefolium. Org. Chem. J. 2010, 2, 81–84.
25. Ehrendorfer F. and Guo Yan-Ping. 2005. Changes in the circumscription of the genus Achillea
(Compositae-Anthemideae) and its subdivision. - Willdenowia 35 – 2005.
26. Ehrendorfer F. and Guo Yan-Ping. 2006. Multidisciplinary studies on Achillea sensu lato
(Compositae-Anthemideae): new data on systematics and phylogeography. - Willdenowia 36 –
2006.
27. Elmann Anat, Mordechay Sharon, Erlank Hilla, Telerman Alona, Rindner Miriam, and Ofir
Rivka. 2011. Anti-Neuroinflammatory effects of the extract of Achillea fragrantissima. - BMC
Complement Altern Med. 2011; 11: 98. Published online 2011 October 21.
28. Flavonoid characterization and antioxidant activity of hydroalcoholic extracts from Achillea
ligustica All. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 3, 440–448.
29. Geng S., Ma M., Ye H.C., Liu B.Y., Li G.F. and Cong K. (2001). Effect of ipt gene expression
on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. Plant Science, 160:
691-698.
30. Geng S., Ma M., Ye H.C., Liu B.Y., Li G.F. and Cong K. (2001). Effect of ipt gene expression
on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. Plant Science, 160:
691-698.
31. Grigoriadou K. Krigas N., Maloupa S. GIS in vitro propagation and ex situ conservation of
Achillea occulta. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 2011, Volume 107, Issue 3,
pp 531
32. Hammad HM, Abdalla SS. Pharmacological effects of selected flavonoids on rat isolated
ileum: Structure-activity relationship. General Pharmacol: The Vascular System 1997; 28:
767-771.
33. Huber-Morath A. Achillea L. 1997. In Davis PH. (Ed.), Flora of Turkey and the Aegean
Islands V. (Davis P. H., ed.) p. 224. Edinburgh University.
34. Innocenti G., Vegeto E., Dall’Acqua S., Ciana P., Giorgetti M., Agradi E., Sozzi A., Fico G.,
Tome` F. 2007. In vitro estrogenic activity of Achillea millefolium L. - Phytomedicine 14
(2007) 147–152. Epub 2006 Jul 24
35. International Programme on Chemical Safety-"Poisons Information Monograph: Camphor".
http://www.inchem.org/documents/pims/pharm/camphor.htm.
36. Ivanceva, S. & Kuzmanov, B. 1986: Flavonoids in genus Achillea - A. nobilis group. - Bull.
Liais. Groupe. Polyphénols 13: 576-579.

37
37. Ivanceva, S. & Kuzmanov, B. 1987: Flavonoiden sastav na Achillea coarctata Poir. - Pp. 50-
52 in:Kuzmanov, B. & al. (ed.), Trudovc na cctvartata nacionalna konferencija po botanika, 2.
- Sofija.
38. Ivanceva, S. & Kuzmanov, B. 1990: Epicuticular flavonoids in Achillea sect. Filipendulinae; a
comparative study. - Farmacija (Sofija) 40(11): 20-24.
39. Ivanceva, S. 1996. Chemotaxonomy in Bulgaria. - Chemotaxonomy in Bulgaria. - Bocconea 5:
55-62. 1996. - ISSN 1120-4060.
40. Ivancheva, S. and Nedelcheva, A. 1995. Flavonoids in genus Achillea - sect. Filipendulinae
(Asteraceae). - Polyphenols 94. 17. International Conference on Polyphenols, Palma de
Mallorca (Spain), May 23-27, 1994, Institut National de la Recherche Agronomique, Paris
(France).- Paris (France): INRA, 1995.- ISBN 2-7380-0602-7. p. 303-304.
41. Jonsdottir G., Omarsdottir S., Vikingsson A., Hardardottir I., Freysdottir J. 2011. Aqueous
extracts from Menyanthes trifoliate and Achillea millefolium affect maturation of human
dendritic cells and their activation of allogeneic CD4+ T cells in vitro. - Journal of
Ethnopharmacology 136 (2011) 88–93.
42. Keller B. R. 2009. Flavonoids: Biosynthesis, Biological Effects and Dietary Sources. -
Copyright © 2009 by Nova Science Publishers, Inc. - ISBN: 978-1-60741-622-7.
43. Klocke, J. A.; Darlington, M. V.; Balandrin, M. F. 1987. "8-Cineole (Eucalyptol), a Mosquito
Feeding and Ovipositional Repellent from Volatile Oil of Hemizonia
fitchii (Asteraceae)". Journal of Chemical Ecology 13 (12): 2131.
44. Kojuharov S. I. and Anchev M. E. 2012. Flora Bulgarica. Vol. 11, pp. 326-348.
45. Koleckar, V.; Opletal, L.; Brojerova, E.; Rehakova, Z.; Cervenka, F.; Kubikova, K.; Kuca,
K.;Jun, D.; Polasek, M.; Kunes, J.; et al. Evaluation of natural antioxidants of Leuzea
carthamoides as a result of a screening study of 88 plant extracts from the European
Asteraceae and Cichoriaceae. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2008, 2, 218–224.
46. Kordali S., Cakir A., Akcin T. A., Mete E., Akcin A., Aydin T., Kilic H. 2009. Antifungal and
herbicidal properties of essential oils and n-hexane extracts of Achillea gypsicola Hub-Mor.
and Achillea biebersteinii Afan. (Asteraceae). - industrial crops and products 29 (2009) 562–
570.
47. Krishnaraju Alluri V., Rao Tayi V. N., Sundararaju Dodda, Vanisree Mulabagal, Tsay Hsin-
Sheng, and Subbaraju Gottumukkala V. 2005. Assessment of Bioactivity of Indian Medicinal
Plants Using Brine Shrimp (Artemia salina) Lethality Assay. - International Journal of Applied
Science and Engineering 2005. 3, 2: 125-134.
48. Kuzmanov, B., Ninova, D. & Ivanceva, S.: Morphological and phytochemical adaptations in
some species of Achillea sect. Filipendulinae (Compositae) in Bulgaria. - Bocconea 5: 671-

38
 678.1997. - ISSN 1120-4060.Lääketietokeskus. Pharmaca Fennica 1996, p. 814.
49. Li, X; Wang, G; Zhao, J; Ding, H; Cunningham, C; Chen, F; Flynn, DC; Reed, E. 2005.
"Antiproliferative effect of beta-elemene in chemoresistant ovarian carcinoma cells is
mediated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase". Cellular and molecular life
sciences : CMLS 62 (7–8): 894–904.
50. Lourenco P.M.L., Figueiredo A.C., Barroso J.G., Pedro L.G., Oliveira M.M., Deans S.G.,
Scheffer J.J.C. 1999. Essential oils from hairy root cultures and from plant roots of Achillea
millefolium. - Phytochemistry 51 (1999) 637-642.
51. Maggi F, Bramucci M, Cecchini C, Coman MM, Cresci A, Cristalli G, Lupidi G, Papa F,
Quassinti L, Sagratini G, Vittori S. Composition and biological activity of essential oil of
Achillea ligustica All. (Asteraceae) naturalized in central Italy: Ideal candidate for anti-
cariogenic formulations. Fitoterapia 2009; 80: 313-319.
52. Maggi F., Bramucci M., Cecchini C., Coman M. M., Cresci A., Cristalli G., Lupidi G., Papa
F., Quassinti L., Sagratini G., Vittori S. 2009. Composition and biological activity of essential
oil of Achillea ligustica All. (Asteraceae) naturalized in central Italy: Ideal candidate for anti-
cariogenic formulations. - Fitoterapia 80 (2009) 313–319.
53. Micropropagation of Achillea filipendulina cv. ‘Parker’. Dalia Evenor & Moshe Reuveni∗,
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 79: 91–93, 2004.
54. Murch S.J., KrishnaRaj S. and Saxena P.K. (2000). Phytomaceuticals: Mass production,
standardization and conservation. Sci. Rev. Altern. Med., 4: 39-43.
55. Murch S.J., KrishnaRaj S. and Saxena P.K. (2000). Phytomaceuticals: Mass production,
standardization and conservation. Sci. Rev. Altern. Med., 4: 39-43
56. Nasrallah, N. 2007. Annals of the Caliphs' Kitchens: Ibn Sayyâr al-Warrâq's Tenth-century
Baghdadi Cookbook. Islamic History and Civilization, 70. Leiden, The Netherlands: Brill.
57. Nedelcheva, A. M. 1995. Comparative-morphological analysis of the complex of caracters,
determinating life forms of the species from genus Achillea L., sect. Filipendulinae (DC.)
Afan. - Proceedings of a jubilee symposium marking 100 years from the birthday of the
Academician Boris Stephanov (1894-1979), Sofia, Bulgaria, 2-3 June 1994-1995 pp. 125-127.
58. Neuhouser M. L. 2004. Dietary flavonoids and cancer risk evidence from human population
studies. Nutr Cancer 50 (1) 1–7.
59. Niazmand S., Khooshnood E. and Derakhshan M. 2010. Effects of Achillea wilhelmsii on
rat’s gastric acid output at basal, vagotomized, and vagal-stimulated conditions. -
Pharmacognosy Magazine 6(24):282 (2010) PMID 21120029.
60. Nickavar, B.; Kamalinejad, M.; Haj-Yahya, M.; Shafaghi, B. Comparison of the free radical
scavenging activity of six Iranian Achillea species. Pharm. Biol. 2006, 44, 208–212.

39
61. Normanly J, Slovin JP, Cohen JD . 1995. Rethinking auxin biosynthesis and metabolism. Plant
Physiol 107: 1–7.
62. Nöthlings U et al. 2007. Flavonols and pancreatic cancer risk. American Journal of
Epidemiology 166 (8) 924–931. doi10.1093ajekwm172. PMID 17690219. Oliviera, L.M.,
Paiva, R., Santana, J.R., Alves, E., Nogueria, R.C. and Pereira, F.D. 2008. Effect of cytokinins
on in vitro development of autotrophism and acclimatization of Annona glabra L. In vitro Cell.
Dev. Biol. Plant. 44:128-135.
63. Özer, H.; Sökmen, M.; Bariş, Ö.; Şahin, F.; Özkan, H.; Güllüce, M.; Kiliç, H.; Özbek,
T.Biological activities of the essential oil and methanol extract of Achillea biebersteinii
Afan(Asteraceae). Turk. J. Biol. 2006, 30, 65–73.
64. Ozlem B, Gulluce M, Sahin F, Ozer H, Kilic H, Ozkan H, Sokmen M, Ozbek T. Biological
activities of the essential oil and methanol extract of Achillea biebersteinii Afan. (Asteraceae).
Turk J Biol 2006; 30:65-73.
65. Paladini A. C., Marder M., Viola H., Wolfman C., Wasowski C., Medina J. H. 1998.
Flavonoids and the Central Nervous System: from Forgotten Factors to Potent Anxiolytic
Compounds.-Article first published online: 18 FEB 2010.
66. Paliwal S; Sundaram, J; Mitragotri, S. 2005. Induction of cancer-specific cytotoxicity towards
human prostate and skin cells using quercetin and ultrasound. British Journal of Cancer 92 (3)
499–502.
67. Picard C., Bosco M. 2003. Soil antimony pollution and plant growth stage affect the
biodiversity of auxin-producing bacteria isolated from the rhizosphere of Achillea ageratum L.
- FEMS Microbiology Ecology 46 (2003) 73-80.
68. Potrich F. B., Allemand A., da Silva L. M., dos Santos A. C., Baggio C. H., Freitas C. S.,
Mendes D. A. G. B., Andre E., de Paula Werner M. F., Marques M. C. A. 2010.
Antiulcerogenic activity of hydroalcoholic extract of Achillea millefolium L.: Involvement of
the antioxidant system. - Journal of Ethnopharmacology 130 (2010) 85–92
69. Potrich FB, Allemand A, da Silva LM, dos Santos AC , Baggio CH, Freitas CS, Mendes
DAGB, Andre E, de Paula Werner MF, Marques MC. Antiulcerogenic activity of
hydroalcoholic extract of Achillea millefolium L. Involvement of the antioxidant system. J.
Etnopharm 2010;130:85-92.
70. Prieto P., M. Pineda, M. Aguilar. 1999. Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant
Capacity through the Formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific Application to
the Determination of Vitamin E1. Analytical Biochemistry 269, 337–341.
71. Reynolds G. 2009. Phys Ed Is Quercetin Really a Wonder Sports Supplement. New York
Times, October 7, 2009. Review of the research.

40
72. Rietjens I. M., Boersma M. G., van der Woude H., Jeurissen S. M., Schutte M. E., Alink G. M.
2005. Flavonoids and alkenylbenzenes mechanisms of mutagenic action and carcinogenic risk.
Mutat. Res. 574 (1–2) 124–38.
73. Saaby L., Rasmussen H. B., Jäger A. K. 2009. MAO-A inhibitory activity of quercetin from
Calluna vulgaris (L.) Hull. J Ethnopharmacol 121 (1) 178–180.
74. Saeidnia S, Yassa N, Rezaeipoor R. Comparative investigation of the essential oils of A
talagonica Boiss and A millefolium L, Chemical composition and immunological studies. J
Essent Oil Res 2004; 16: 262-264.
75. Saeidnia, S.; Gohari, A.; Mokhber-Dezfuli, N.; Kiuchi, F. A review on phytochemistry and
medicinal properties of the genus Achillea. Daru. 2011, 3, 173–186.
76. Sarasan V.; Cripps R.; Ramsay M. M.; Atherton C.; McMichen M.; Prendergast G.; Rowntree
J. K., (2006). Conservation in vitro of threatened plants—progress in the past decade. In Vitro
Cell Dev Biol—Plant, 42: 206–214.
77. Sarasan V.; Cripps R.; Ramsay M. M.; Atherton C.; McMichen M.; Prendergast G.; Rowntree
J. K., (2006). Conservation in vitro of threatened plants—progress in the past decade. In Vitro
Cell Dev Biol—Plant, 42: 206–214.
78. Schiestl, F. P.; Roubik, D. W. 2004. "Odor Compound Detection in Male Euglossine
Bees". Journal of Chemical Ecology 29 (1): 253–257.
79. Schulz V, Hansel R, Tyler VE. In: Rational Phytotherapy: A Physician’s guide to Herbal
Medicine. Berlin: Springer; 2001, p 294.
80. Sfara, V.; Zerba, E. N.; Alzogaray, R. A. (May 2009). "Fumigant Insecticidal Activity and
Repellent Effect of Five Essential Oils and Seven Monoterpenes on First-Instar Nymphs
of Rhodnius prolixus". Journal of Medical Entomology 46 (3): 511–515.
81. Shigeharu. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against
respiratory tract pathogens by gaseous contact. 2001. Oxford Journals Medicine Journal of
Antimicrobial Chemotherapy Volume 47, Issue 5 Pp. 565-573.
82. Singleton, V., R. Orthofer, R. M. Lamuela-Raventós. 1999. Analysis of Total Phenols and
Other Oxidation Substrates and Antioxidants by Means of Folin–Ciocalteu Reagent. Methods
in Enzymology, 299, (Oxidants and Antioxidants Part A), 152–178.
83. Stefanov S. 2011. Тракийски равнец :: Червена Книга на Република България. - http://e-
ecodb.bas.bg/rdb/bg/vol1/Achthrac.html
84. Stojanovic G, Radulovic N, Hashimoto T, Palic R. In vitro antimicrobial activity of extracts of
four Achillea species. The composition of Achillea clavennae L. (Asteraceae) extract. J
Ethnopharm 2005; 101 :185-190.
85. Trumbeckaite S. Benetis R., Bumblauskiene L., Burdulis D.,JanulisV a, Toleikis A, Vi škelis

41
 P.,” Achillea millefolium L. s.l. herb extract: Antioxidant activity and effect on the rat heart
mitochondrial functions” Food Chemistry 127 (2011) 1540–1548
86. Tuberoso, C.I.; Montoro, P.; Piacente, S.; Corona, G.; Deiana, M.; Dessì, M.A.; Pizza, C.;
Cabras, P.
87. Tuberosoa CIG, Montoro P, Piacente S, Corona G, Deiana M, Assunta Dessi M, Pizza C,
Cabras P. Flavonoid characterization and antioxidant activity of hydroalcoholic extracts from
Achillea ligustica All. J Pharmaceut and Biomed Anal 2009; 50: 440-448.
88. Vitalini, S.; Beretta, G.; Iriti, M.; Orsenigo, S.; Basilico, N.; Dall'Acqua, S.; Iorizzi, M.; Fico,
G.Phenolic compounds from Achillea millefolium L. and their bioactivity. Acta Biochim. Pol.
2011,2, 203–209.
89. Vitalini, S.; Grande, S.; Visioli, F.; Agradi, E.; Fico, G.; Tome, F. Antioxidant activity of
wildplants collected in Valsesia, an alpine region of Northern Italy. Phytother. Res. 2006, 7,
576–580.
90. Wawrosch C , Kopp B, Kubelka G.I vitro propagation of Achillea asplenifolia VENT. through
multiple shoot regeneration. Plant Cell Reports, 1994, Volume14, Issue 2-3, pp 161-164
91. Wawrosch C., Wolfgang Kubelka. In vitro propagation of Achillea asplenifolia VENT.
through multiple shoot regeneration. Plant Cell Reports, 1994, Volume 14, Issue 2-3, pp 161-
164
92. Wojdyło, A.; Oszmianski, J.; Czemerys, R. Antioxidant activity and phenolic compounds in
32 selected herbs. Food Chem. 2007, 105, 940–949.
93. Yassa N, Saeidnia S, Pirouzi R, Akbaripour M, Shafiee A. Three phenolic glycosides and
immunological properties of Achillea millefolium . Iran population of Golestan. Daru 2007;
15: 49-52.
94. Yazdanparast R, Ardestani A, Jamshidi S. Experimental diabetes treated with Achillea
santolina: Effect on pancreatic oxidative parameters. J Ethnopharm 2007; 112: 13-18.

42