SEMINAR MÔN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

Tên đề tài: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT
BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC ĐIỀU TRỊ
BỆNH ĐAU TUỶ XƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

1. Lý do chọn đề tài
- Tìm hiểu cách xác định hàm lượng của bortezomib bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dò UV – Vis
- Khảo sát tính thích hợp, tính tuyến tính, độ đúng, khoảng xác định, giới hạn
phát hiện, giới hạn định lượng và độ chính xác của phương pháp.
2. Tính chất vật lý

- Tên IUPAC: (R)-3-methyl-1-((S)-3-phenyl-2-(pyrazine-2-carboxamido)

propanamido) butylboronic acid
- Công thức phân tử: C19H25BN4O4
- Khối lượng phân tử: 238.237g.mol-1
- Bortezomib là một loại thuốc chống ung thư và là chất ức chế proteaome điều trị
đầu tiên được sử dụng ở người. Proteasomes là phức hợp tế bào phá vỡ protein.
Trong một số bệnh ung thư, các protein thường tiêu diệt tế bào ung thư bị phá vỡ
quá nhanh. Bortezomib làm gián đoạn quá trình này và cho phép các protein đó
tiêu diệt các tế bào ung thư. Nó được chấp thuận ở Mỹ và Châu Âu để điều trị tái
phát nhiều u nguyên bào tủy và tế bào lympho. Trong đa u tủy, các đáp ứng lâm
sàng hoàn toàn đã đạt được ở những bệnh nhân mắc bệnh khó chữa hoặc tiến triển
nhanh.
 3. Sơ lược thiết bị dùng trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-
performance liquid chromatography) để phân tích định lượng Bortezomib
3.1. Tổng quan phương pháp:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao: (High-performance liquid chromatography; viết tắt:
HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng
thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng
dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký
được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối
khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác
nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khi mà chúng chảy ra khỏi cột. Thành phần
và nhiệt độ của pha động (dung môi) đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng
cách tác động lên những tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất
hấp phụ ở cột.

Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ đến
200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân tích sắc ký, các
chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt
độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi phân
tích sắc ký. HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu,
pháp lý và y dược.
 3.2. Điều kiện sắc ký:
- Pha tĩnh cột sắc ký RP-C18 (kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích thước hạt 3mm)
- Pha động: Methanol:H2O:Acid formic tỉ lệ 63:37:0,1 thể tích tiêm mẫu 20 μl,
tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian sắc ký 10 phút, nhiệt độ cột được duy trì ở
350C bước sóng 270nm.
- Định lượng theo phương pháp dựng đường chuẩn

3.3. Lý do chọn đầu dò:

- Bortezomib hấp thu ánh sáng trong vùng ánh sáng khả kiến (270 nm)  Đầu dò
UV-Vis

4. Thực nghiệm:

4.1. Chuẩn bị mẫu và chuẩn đo:

Định mức 50ml Rút 5ml dung dịch và

Cân mẫu với Acetonitril định mức 50ml với
100% Acetonitril 100%
(25 mg
Bortezomib mẫu) Lọc qua màng lọc
0,45µm

Định mức 50ml Rút thể tích dung

với Acetonitril dịch tương ứng và
Cân chuẩn
100% định mức 50ml với
(25 mg Acetonitril 100%
Bortezomib chuẩn)
Lọc qua màng lọc
0,45µm

4.2. Tính thích hợp của hệ thống:

Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký tiêm lặp lại 6 lần dung
dịch chuẩn. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic Bortezomib giữa các lần tiêm
lặp lại ≤ 2,0 %. Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.
 Kết quả:
Kết quả hiển thị trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện các pic có thời gian
lưu tương ứng với thời gian của pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn.
 Trên sắc ký đồ dung dịch thử cho pic thời gian lưu tương ứng với thời gian
lưu của pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn (khoảng 7,7%)
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống

Thời gian lưu

Stt Diện tích pic
(phút)
1 7,763 1194,2
2 7,771 1198,7
3 7,776 1193,5
4 7,768 1199,8
5 7,766 1184,0
6 7,754 1191,5
TB 7,766 1193,6
RSD (%) 0,10 0,48

 Nhận xét: RSD thời gian lưu < 1,0 %; RSD diện tích pic < 2,0 % đáp ứng
đúng yêu cầu độ đặc hiệu cho thấy hệ thống phù hợp để định lượng Bortezomib
trong mẫu tổng hợp

4.3. Khoảng tuyến tính và miền giá trị:

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng dung môi pha mẫu để thu được các
dung dịch chuẩn có nồng độ Bortezomib biến thiên trong khoảng 0,025 – 0,075
mg/ml Bortezomib (tương ứng 50 – 150 % nồng độ định lượng). Tiêm các dung dịch
này vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Tiến hành phân tích các mẫu, xác định
phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác đinh
giá trị R2.
Khoảng xác định được suy ra từ kết quả độ đúng và độ tuyến tính (Từ giá trị
nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).
 Kết quả: Kết quả khảo sát sự tương quan giữa y (diện tích pic
Bortezomib) và x (nồng độ Bortezomib) bằng phương pháp bình phương tối thiểu,
kết quả cho thấy: hệ số R2 = 0,9997 (=> R = 0,9998 ≥ R = 0,998); chứng tỏ có sự
tương quan tuyến tính giữa nồng độ Bortezomib và diện tích pic tương ứng.
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib
Thể tích dung
Bìn
dịch chuẩn Nồng độ
% so với h Diện tích
Stt gốc Bortezomib
định định pic
Bortezomib (mg/ml)
lượng mức Bortezomib
(ml)
(ml)
1 50 1 20 0,0254 589,3
2 80 4 50 0,0406 951,6
3 100 5 50 0,0507 1193,6
4 120 3 25 0,0609 1441,6
5 150 3 20 0,0761 1779,3
Hệ số tương quan r 0,9998
Hệ số góc 23544,6069
Hệ số chắn (intercept) 3,7476
%Y 0,31 %

Tiến hành xây dựng đường chuẩn bortezomib bằng excel ta được phương
trình đường uẩn như đồ thị bên dưới:
 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib và diện tích pic

4.4. Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp:

Mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu thử cho kết quả trong bảng sau:

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib

Lượn
Lượng
g
Diện tích Bortezomi
Mẫu chuẩn % Thu hồi
pic b tìm lại
Bortezomi
Bortezomib (mg)
b thêm
vào (mg)
80% 21,03 984,0 21,13 100,5
TB: 99,9 %
80% 20,41 942,2 20,23 99,1
RSD: 0,7 %
80% 20,14 939,5 20,17 100,2
100% 25,46 1185,3 25,45 100,0
TB: 99,7 %
100% 25,41 1181,7 25,37 99,9
RSD: 0,3 %
100% 25,73 1190,2 25,56 99,3
120% 31,35 1475,3 31,68 101,0
TB: 100,0 %
120% 30,07 1395,0 29,95 99,6
120% 30,45 1410,4 30,29 99,5 RSD: 0,8 %

TB (%) 99,9
RSD (%) 0,61
 Nhận xét: % thu hồi trong khoảng 98,0 % – 102,0 % với RSD =0,61% < 2
% Khẳng định Phương pháp định lượng Bortezomib trong mẫu tổng hợp đạt yêu cầu
về độ đúng. Sự tương quan tuyến tính giữ nồng độ và diện tích pic trong khoảng
nồng độ Bortezomib từ 0,025 – 0,075 mg/ml) tương ứng nồng độ Bortezomib bằng
50% đến 150% so với nồng độ định lượng. Kết quả này cho thấy tại nồng độ
Bortezomib bằng 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng có độ đúng, độ lặp lại
tốt và nằm trong khoảng tuyến tính. Như vậy khoảng xác định của phương pháp là
trong giới hạn từ 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng

4.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng:

Giới hạn phát hiện được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn
Bortezomib đến khi tỷ lệ tín hiệu thu được gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền.
Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác
định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.
Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch thu được, ghi lại các sắc ký đồ và xác định
RSD của diện tích pic

 Kết quả: Giới hạn phát hiện được xác định tại dung dịch chuẩn có nồng
độ ≈ 1,25 µg/ml cho đáp ứng píc gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền. Tiến hành
sắc ký 6 lần dung dịch cho kết quả độ lặp lại của diện tích pic của dung dịch có nồng
độ ở mức giới hạn phát hiện được ghi trong bảng 4.
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD
Thời gian lưu
STT Diện tích pic S/N
(phút)
1 7,848 30,6 3,0
2 7,718 34,5 3,1
3 7,748 33,1 3,1
4 7,775 28,9 3,3
5 7,847 32,0 3,1
6 7,805 34,1 3,1
T.bình 7,790 32,2 3,1
RSD
0,680 6,69 (< 10%)
(%)
 LOD ≈ 1,25 µg/ml và LOQ = 1,25 x 3,3 ≈ 3,75 µg/ml.

4.6. Độ chính xác:

Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt với giá trị thực khi
lặp lại quy trình phân tích nhiều lần. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ đúng.
Độ lặp lại: Acetonitril được sử dụng làm dung dịch chuẩn.Pha dung dịch thử
bằng cách cân chính xác 25 mg mẫu bortezomib tổng hợp vào bình định mức 50 ml,
hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung
dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua
màng lọc 0,45 µm.
 Hàm lượng (%) của Bortezomib (C 19H25BN4O4) tính theo chế phẩm đã làm
khô được tính theo công thức:

Trong đó:
- ST: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch thử SC: Diện tích pic
Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn C: Nồng độ Bortezomib trong mẫu
chuẩn (mg/ml)
- mT: Lượng cân mẫu thử (mg)
- a: Hàm lượng nước trong chế phẩm (%)
Tiến hành định lượng phân tích 6 mẫu bortezomib dung dịch thử độc lập.Xác
định hàm lượng các hoạt chất có trong các mẫu thử theo trung bình diện tích pic
Bortezomib của dung dịch chuẩn. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn
tương đối RSD (%) giữa giá trị các lần định lượng
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib
STT Lượng cân chuẩn: 25 mg
Diện tích pic TB mẫu chuẩn: 1250,1
Lượng cân
Diện tích
mẫu thử % Hàm lượng
pic
(mg)
1 25,71 1253,9 98,6
2 25,03 1248,4 100,8
3 25,01 1214,7 98,2
4 25,04 1218,2 98,5
5 25,39 1229,6 97,9
6 25,11 1231,1 99,1
Kết quả định lượng trung bình (n = 6): 98,9 %
RSD (n=12): 1,07 %
 Nhận xét: RSD (n=6) ≤ 3,0 % => Phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại.
Qui trình phân đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác
định, độ đúng, độ lặp lại, thích hợp để định tính, định lượng nguyên liệu Bortezomib
trong mẫu tổng hợp

Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn

Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp

4.7. Phương pháp xử lý số liệu:

 Để xử lý số liệu kết quả của các giá trị đo được qua mỗi lần đo. Dùng toán
thống kê để xử lý số liệu các kết quả với phần mềm
Microsoft Excel 2010. Một số công thức tính toán trong
xử lý thống kê kết quả:
- Giá trị trung bình:

- Độ lệch chuẩn:

- Độ lệch chuẩn tương đối:

5. Các phương pháp khác

- Phương pháp sắc ký cột  phân tách các chất
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)  phân tích định tính, thử độ tinh khiết
- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR  phân tích định tính
- Phương pháp phổ khối lượng  phân tích định tính

6. Giải pháp
Đã thẩm định quy trình định lượng bortezomib bằng phương pháp HPLC với
đầu dò UV-Vis tại bước sóng 270nm. Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ
thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ đúng, khảo sát được tính tuyến tính, giới hạn phát
hiện và giới hạn định lượng của phương pháp  Mở rộng đối tượng nghiên cứu, có
thể xác định hàm lượng của các dược phẩm khác bằng phương pháp HPLC