Ứng dụng kĩ thuật HPLC

trong kiểm nghiệm dược phẩm

TS. Nguyễn Lâm Hồng

BM Hoá Phân tích-Độc chất

Mục tiêu học tập:

1: Phân biệt sắc kí phân bố pha thuận và pha đảo:
Các pha, lựa chọn các pha, thứ tự rửa giải …
2. Lựa chọn ĐKSK: lựa chọn các pha, thứ tự rửa
giải …
3. Trình bày các ứng dụng của HPLC trong phân
tích định tính, thử tạp chất và định lượng.
4. Áp dụng kĩ thuật HPLC để xây dựng phương
pháp định tính, định lượng và thử tạp chất.

1
 Ứng dụng phân tích bằng HPLC
• Dạng BC có 2-3 APIs

• Hoạt chất chính có

hàm lượng thấp.

• Dạng bào chế 1 API:

Chiết chất phân tích còn
lẫn: tá dược hoặc tạp
chất

2. Lựa chọn điều kiện sắc kí

Tính chất hóa lí hoạt chất Active Pharma Ingr (API):
chính: (A, B…) a.Dung môi pha mẫu
2.1. Độ tan:
Dễ tan trong nước, aceton
hay n-hexan, octanol… b.Điều Kiện Sắc Kí:
2.2. pKa=2,6 - Chọn pha tĩnh:
2.3. Độ phân cực: + Bản chất SP: C8, C18…
éM ù + Chiều dài cột, 2R trong...
ë oû
lgP= lg
éM ù
ë Nû

2
 2. Lựa chọn Điều Kiện Sắc Kí
Hoạt chất chính: - Chọn Pha động:
• Thành phần pha động:
+ Methanol, Acetonitril
+ Nước, đệm phosphat pH?
2.2. pKa=2,6 • pH pha động:
• Tỉ lệ pha động:
+ Giảm tR
+ Tăng tỉ lệ dung môi HC
• Tốc độ dòng pha động:

2. Lựa chọn Điều Kiện Sắc Kí

Hoạt chất chính: (A,B)
2.4. max - Chọn bước sóng: Quét phổ
chọn max

-Tra cứu TL và khảo - Chọn khoảng nồng độ PT

sát trên HT SK - Khảo sát và
- Thay đổi thể tích tiêm
mẫu:10-50L

3
 Xây dựng phương pháp định lượng
PARACETAMOL và IBUPROFEN
bằng kĩ thuật HPLC
ĐỘ TAN PARACETAMOL IBUPROFEN
Tan tốt trong dm methanol, ethanol, dim Hầu hết các dm
ethylformamid, ethylen HC
dichlorid, aceton, ethyl
acetat
Kém tan trong Ete dầu
dm hoả, pentan, benzen

pKa=9,5 pKa=4,4
lgP=0,34 lgP=3,7
7

Lựa chọn thành phần pha động

ACN: ĐỆM PP pH=2,35 ACN: ĐỆM PP pH=6,8

ACN: Đệm PP pH=2,35 (20:58)

ACN: Đệm PP pH=2,35 (50:50)

4
 Lựa chọn thành phần pha động

pKa=9,5 pKa=4,4
lgP=0,34 lgP=3,7

(HA) pH≤ pKaPAR -2=7,5; pH≥ pKaPAR +2=11,5 (A-)

(HA) pH≤ pKaIBU -2=2,4; pH≥ pKaIBU+2=6,4 (A-)

ĐK1: pH≤pKaIBU -2=2,4 PAR (HA), lgP = 0,34

ACN: Đệm PP pH=2,35 IBU (HA), lgP = 3,7

ĐK2: pKaIBU +2=6,4 ≤ pH ≤ pKaPAR-2=7,5 PAR (HA)

ACN: Đệm PP=6,8 IBU (A-)
9

Lựa chọn bước sóng phát hiện

10

5
 3. Ứng dụng HPLC

Pharmaceutical

11

3. Ứng dụng

(2)
(1)
Định lượng
Định tính

tR S (h)
12

6
 3.1. ĐỊNH TÍNH

MẪU THỬ

Chuẩn đơn PARACETAMOL

Chuẩn đơn IBUPROFEN

13

3.1. Định tính

Chồng phổ Paracetamol Chồng phổ Ibuprofen

So sánh phổ UV-VIS của chất phân tích trong

Mẫu chuẩn và thủ (hệ số match ≥ 0,999)

14

7
 3.2. ĐỊNH LƯỢNG

Phương Phương Phương

pháp pháp pháp
chuẩn chuẩn thêm
Ngoại nội chuẩn

15

3.2.1. Phương pháp chuẩn ngoại

a. Chuẩn ngoại 1 điểm (so sánh)

Mẫu thử Mẫu chuẩn

Xử lí mẫu

DD thử DD chuẩn
Cx Cc
16

8
 a . Phương pháp chuẩn ngoại 1 điểm (so sánh)
Mẫu thử Mẫu chuẩn

Cân 1 lượng bột 0,325 g Cân 1 lượng chuẩn Cân 1 lượng chuẩn
PARA 32,5 mg PARA 20 mg IBU

DD chuẩn gốc
DT=10,000 CPARA= 0,325 mg/mL
CIBU= 0,20 mg/mL

DD chuẩn
DD thử
CPARA= 0,0325 mg/mL
CPARA= 0,0325 mg/mL
CIBU= 0,020 mg/mL
CIBU= 0,020 mg/mL

17

Dung dịch thử Dung dịch chuẩn

Cân cx 1 lượng bột viên Cân cx 1 lượng 32,5 mg Cân cx 1 lượng 20,0 mg
 0,325 g Paracetamol Chất chuẩn Paracetamol Chất chuẩn Ibuprofen

Hoà tan = 70 ml MP và Hoà tan = 70 ml MP

đm vừa đủ = MP đm vừa đủ = MP

Bình định mức 100 ml Bình định mức 100 ml Bình định mức 100 ml

Hút cx 10,0 ml Hút cx 10,0 ml

Bình định mức 100,0 ml

Bình định mức 100,0 ml

Hút cx 10,0 ml

Bình định mức 100,0 ml

18

9
 ĐỊNH LƯỢNG PARA 325 mg + IBU 200 mg
• Pha động: Acetonitril – dung dịch đệm phosphat pH=6,8 (60 : 40).
• Dung dịch chuẩn gốc paracetamol: Cân chính xác khoảng 32,5 mg
paracetamol chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 80 ml pha
động, lắc siêu âm 15 min, thêm pha động vđủ đến vạch, lắc đều.
• Dung dịch chuẩn gốc ibuprofen: Cân chính xác một lượng khoảng 20
mg ibuprofen chuẩn cho vào bình định mức 100 ml thêm khoảng 80 ml
pha động, lắc siêu âm 15 min, thêm pha động đến vạch, lắc đều.
• Dung dịch chuẩn hỗn hợp PARA + IBU: Hút chính xác 10,00 mL dung
dịch chuẩn gốc PARA và 10,00 mL dung dịch chuẩn gốc IBU vào một
bình định mức 100 mL, pha loãng đến vạch bằng pha động, lắc đều.
• Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền
thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 325
mg paracetamol cho vào bình đm 100 ml, thêm khoảng 80 ml pha động,
lắc siêu âm 15 min, thêm pha động vđ đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng
10,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml bằng pha động. Hút chính xác 10,00 mL
dung dịch này vào một bình định mức 100 mL, pha loãng đến vạch bằng
pha động, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
19

3.2.1. Phương pháp chuẩn ngoại

Mẫu chuẩn Mẫu thử

Thời gian lưu Diện tích píc Thời gian lưu Diện tích píc
1. 2,118 979,282 1. 2,111 831,249
2. 3,260 611,197 2. 3,268 614,852

A x Cx Ax
= → Cx = . Cc
A c Cc Ac

20

10
 a. Chuẩn hóa 1điểm (So sánh)
❖ Hµm lượng (%) hoạt chất chính trong chế phẩm, so
với lượng ghi trên nhãn:

ST mC .P(%) DT MV
HL(%) = x x x x 100%
SC mT DC HLGTN

mc : Lượng cân chất chuẩn P% H.lượng chất chuẩn

mT : Lượng cân bột viên
DT : Độ pha loãng dd thử Dc : Độ PL dd chuẩn
Mv : Khối lượng TB 1 viên HLGTN :HL ghi trên nhãn

21

b. Chuẩn hóa nhiều điểm

Mẫu thử Mẫu chuẩn

Xử lí mẫu

DD thử C1-50% C2-80% C3-100%

C4-120% C5-150%
22

11
 Cách pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp

Độ pha loãng DD gốc PAR DD gốc IBU Bình định mức

C1-50% 20 1,00 ml 1,00 ml 20 ml

C2-80% 12,5 2,00 ml 2,00 ml 25 ml
C3-100% 10 2,00 ml 2,00 ml 20 ml
C4-120% 8,33 3,00 ml 3,00 ml 25 ml
C5-150% 6,67 3,00 ml 3,00 ml 20 ml

23

b. Chuẩn hóa nhiều điểm

24

12
 1800
1600 y = 24936x + 4.8122
R² = 0.9998
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08

25

Chất chuẩn ngoại ?

- Chất chuẩn ngoại có BẢN CHẤT là CHẤT
CẦN PHÂN TÍCH.
- Đạt yêu cầu chất chuẩn là TINH KHIẾT.

26

13
 3.2.2. Phương pháp chuẩn nội
Thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một
lượng như nhau chất tinh khiết thứ 2.

27

Chất chuẩn nội?

- Có cấu trúc hoá học tương như chất thử.
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử
- Không phản ứng với bất kĩ thành phần nào của
mẫu thử
- Đạt yêu cầu về độ tinh khiết và dễ kiếm.

* Yêu cầu với chất chuẩn nội?

- Chất chuẩn nội tách hoàn toàn khỏi chất thử
(Rs>1,25)
- Chất chuẩn nội có tR gần với tR của chất thử.

28

14
 a. Chuẩn hoá 1 điểm (so sánh)

Mẫu thử Mẫu chuẩn

Thêm 1 lượng IS

Xử lí mẫu

Dung dịch thử Dung dịch chuẩn

CX + CIS Cc + CIS
29

a. Chuẩn hoá 1 điểm (so sánh)

Mẫu chuẩn Mẫu thử

SES SX
RS = RX =
SIS SIS

30

15
 ĐK SK Viên nén Prednisolon USP 40
(a) Use a stainless steel column (20 cm × 4.6
mm) packed with octadecylsilyl silicagel for
chromatography (5 µm) (Spherisorb ODS 1).
(b) Use isocratic elution and the mobile phase .
(c) Use a flow rate of 1 mL per minute.
(d) Use an ambient column temperature.
(e) Use a detection wavelength of 254 nm.
(f) Inject 20 µL of each solution.
MOBILE PHASE
42 volumes of water and 58 volumes of methanol .
31

ĐLượng Viên nén Prednisolon USP 40

Weigh and powder 20 tablets. Carry out the method
for liquid chromatography
(1) Add 58 mL of methanol to a quantity of the
powder containing 5 mg of Prednisolone, shake for
10 minutes, add sufficient water to produce 100 mL,
mix and filter.
(2) Prepare solution (2) in the same manner as
solution (1) but add 10 mL of a 0.075% w/v solution
of dexamethasone (internal standard) in methanol
and 48 mL of methanol in place of the 58 mL of
methanol (DE.
32

16
 ĐLượng Viên nén Prednisolon USP 40

Dung dịch chuẩn gốc: 0.05% w/v (0,5 mg/mL) of

prednisolone BPCRS and 0.075% w/v (0,75
mg/mL) w/v of dexamethasone (internal
standard) in a mixture of 58 volumes of methanol
and 42 volumes of water.
(3) 0.005% w/v of prednisolone BPCRS and 0.0075%
w/v of dexamethasone (internal standard) in a
mixture of 58 volumes of methanol and 42
volumes of water.

33

Dung dịch chuẩn

Cân cx 1 lượng 10 mg Cân cx 1 lượng 15 mg

Chất chuẩn PRED Chất chuẩn DEX

Hoà tan = 10 ml MP
đm vừa đủ = MP

Bình định mức 20 ml Bình định mức 20 ml

0.075% w/v (0,75 mg/mL)

Hút cx 2,0 ml dexamethasone (IS)

0.05% w/v (0,5 mg/mL)

prednisolone
Bình định mức 20,0 ml

0.05% w/v (0,05 mg/mL) prednisolone

(0,75 mg/mL) dexamethasone (IS)

34

17
 a. Chuẩn hóa 1điểm (So sánh)
❖ Hàm lượng (%) Hoạt chất chính trong chế phẩm, so
với lượng ghi trên nhãn:

R T mC .P(%) DT MV
HL(%) = x x x x 100%
RC mT DC HLGTN

mc : Lượng cân chất chuẩn P% H.lượng chất chuẩn

mT : Lượng cân bột viên
DT : Độ pha loãng dd thử Dc : Độ PL dd chuẩn
Mv : Khối lượng TB 1 viên HLGTN :HL ghi trên nhãn

35

b. Chuẩn hóa nhiều điểm

Mẫu thử Mẫu chuẩn

Thêm 1 lượng IS
Xử lí mẫu

DD thử C1-50% C2-80% C3-100%

C4-120% C5-150%
36

18
 Cách pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp

Độ pha loãng DD gốc PRED DD gốc DEX (IS) Bình định mức

C1-50% 20 1,00 ml 2,00 ml 20 ml

C2-80% 12,5 2,00 ml 2,50 ml 25 ml
C3-100% 10 2,00 ml 2,00 ml 20 ml
C4-120% 8,33 3,00 ml 2,50 ml 25 ml
C5-150% 6,67 3,00 ml 2,00 ml 20 ml

37

b. Chuẩn hóa nhiều điểm

SES
RS =
SIS

CES
CIS

38

19
 Ưu điểm của PP chuẩn nội
Giảm sai số do quá trình xử lí mẫu,
phân tích mẫu.

2000 1900
R= =2 R= =2
1000 950
39

Nhược điểm của PP chuẩn nội

Chọn điều kiện sắc kí để tách sẽ khó hơn

40

20
 a.Phương pháp thêm chuẩn 1 điểm
- Chuẩn bị song song 2 mẫu thử (1 và 2).
- Thêm vào mẫu thử thứ 2 một lượng chính xác chất chuẩn.

ΔC
CX =SX
ΔS

41

b. Phương pháp thêm đường chuẩn

- Chuẩn bị một dãy dung dịch thử (n+1) mẫu
- Thêm vào các mẫu dung dịch thử trên các thể tích khác nhau
của dung dịch chuẩn gốc
- Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.

42

21
 b. Phương pháp thêm đường chuẩn

43

b. Phương pháp thêm đường chuẩn

AS

Dung dÞch thö thªm chuÈn

SAxx
Nång ®é
dd thö
Cx Nång ®é chuÈn thªm vµo
0
Giao điểm của đường chuân với trục hoành
là nồng độ của dung dịch thử
44

22
 3.3. THỬ ĐỘ HOÀ TAN
Môi trường hòa tan: 900 ml đệm phosphat chuẩn pH 7,2 (TT).
Tốc độ quay: 50 r/min. Thời gian: 45 min.
Cách tiến hành: Dung dịch thử: Lấy một phần môi trường sau khi hòa
tan, lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu.
Dung dịch chuẩn paracetamol: Cân chính xác khoảng 36 mg
paracetamol chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol
(TT), lắc kỹ, thêm môi trường hòa tan vđ đến vạch, lắc đều.
Dung dịch chuẩn ibuprofen: Cân chính xác khoảng 22 mg ibuprofen
chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol (TT), lắc kỹ,
thêm môi trường hòa tan vừa đủ đến vạch. Pha loãng (nếu cần) một thể
tích dung dịch thu được bằng môi trường hòa tan để thu được dung dịch
có nồng độ ibuprofen tương ứng với dung dịch thử.
Xác định hàm lượng paracetamol và ibuprofen hòa tan bằng phương pháp
sắc ký lỏng với các điều kiện sắc ký như mô tả trong mục Định lượng.
Yêu cầu: Không ít hơn 75 % (Q) lượng PARA, C8H9NO2, và 75 % (Q)
lượng IBU, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 45 min.

45

3.4. XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT HỮU CƠ

* Nguyên tắc:
𝐦 𝐭ạ𝐩 đơ𝐧
% tạp đơn = × 100%
𝐦 𝐭𝐡ử
𝐦 𝐭ổ𝐧𝐠 𝐭ạ𝐩 đơ𝐧
% tổng tạp chất hữu cơ = Σ% tạp đơn = × 100%
𝐦 𝐭𝐡ử

Mỗi tạp chất nhỏ hơn giới hạn cho phép

- Định lượng tạp chất: định lượng được chính xác hàm lượng tạp
chất và nhỏ hơn giới hạn tạp cho phép
- Thử giới hạn tạp chất: bán định lượng được hàm lượng tạp chất vì
nhỏ hơn giới hạn tạp cho phép

46

23
 3.4.1. Xác định tạp chất liên quan bằng
kĩ thuật chuẩn hoá diện tích
Hàm lượng phần trăm từng chất có trong hỗn hợp bằng:
Si .fi
% tap don= .100%
S1f1 + S2 f 2 +...+ Sn f n
Hệ số f được xác định bằng cách: Chạy sắc ký một dung dịch
chuẩn có nồng độ đã biết (CC) và đo diện tích của nó (SC)

CC
fi =
SC
• Yêu cầu: Tất cả các thành phần đều được rửa giải, phát hiện và có
hệ số đáp ứng trên detector như nhau.
• Ứng dụng trong HPLC: Để xác định tạp chất liên quan.

47

3.4.1. Xác định tạp chất liên quan bằng

kĩ thuật chuẩn hoá diện tích

𝐒𝐩𝐢𝐜 𝐭ạ𝐩𝟏 .𝐟𝟏

% tạp đơn = 𝐒. × 100%
𝐭ạ𝐩𝟏 𝐟 𝟏 + 𝐒 𝐭ạ𝐩 𝟐.𝐟𝟐+ 𝐒𝐡𝐜𝐜+𝐒 𝐭𝐚𝐩𝟑.𝐟𝟑…

Tổng 𝐒𝐩𝐢𝐜 𝐭ạ𝐩𝟏 .𝐟𝟏

% tổng tạp đơn = 𝐒. × 100%
𝐭ạ𝐩𝟏 𝐟𝟏+𝐒 𝐭ạ𝐩 𝟐.𝐟𝟐+ 𝐒𝐡𝐜𝐜+𝐒 𝐭𝐚𝐩𝟑.𝐟𝟑…

48

24
 Organic impurities (Levofloxacine)

49

3.4.1: Xác định tạp chất Liên Quan bằng

KT chuẩn hóa diện tích
%
Name RT Area
Area
Imp 1 3.46 1319 0.01
Imp 2 6.67 1163 0.01
Imp 3 8.21 2119 0.01
API 10.24 14505569 99.94

Imp 4 13.88 3243 0.02

unk 14.63 861 0.01

x100% % Tongtap=  tap x100%

Si S
%Tapdon=
SHCC +  Stap SHCC + Stap

50

25
 Ưu, nhược điểm của phương pháp:

❖ Ưu điểm: Phương pháp chuẩn hoá diện tích là cách đơn giản
nhất để định lượng tạp chất liên quan vì không cần chất
chuẩn tạp và thường áp dụng khi chưa xác định được chính
xác từng tạp chất.

51

Nhược điểm của phương pháp:

❖ Nhược điểm:
• Yêu cầu các thành phần tạp chất liên quan đều có hệ số đáp ứng
tương đối so với hoạt chất chính gần với 1. Nếu không, phải tính hệ số
đáp ứng.
• Phương pháp định lượng các tạp chất hữu cơ khác mà có hệ số đáp
ứng khác xa 1 (phải xác định được hệ số đáp ứng).
• Khoảng nồng độ tuyến tính rộng: từ nồng độ của các chất liên quan
(<1%) đến nồng độ của hoạt chất (>95%).
• Độ nhạy của phương pháp thấp: Mẫu thử ở nồng độ cao, hình dạng
pic của hoạt chất tù, đường chuẩn kém tuyến tính.
• Để duy trì tính tuyến tính ở nồng độ của hoạt chất, giảm nồng độ
mẫu thử nên khả năng phát hiện các tạp chất liên quan thấp có
thể không đầy đủ.

52

26
 3.4.2. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT HỮU CƠ
Bằng phương pháp pha loãng dung dịch thử
Nguyên tắc:
Dung dịch thử
• Mẫu thử được chuẩn bị ở cả nồng
độ cao và nồng độ thấp.
• Mẫu thử nồng độ cao (dung dịch
thử) để phát hiện tất cả các tạp
chất nên tăng độ nhạy của
phương pháp.
DT • Mẫu ở nồng độ thấp-dung dịch
Dd đối chiếu (a) đối chiếu (a) được pha loãng từ
dung dịch thử với độ pha loãng
(DT) dựa vào giới hạn tạp chất
đơn có trong mẫu.
53
NMT: not more than

n/độ rất cao

(
• Dung dịch thử: 4,0 mg/mL (Etoposid/DMPM).

• Dung dịch đối chiếu (a): Hoà tan 1,0 mL dd thử vào 100,0 mL DMPM. Pha
loãng 1,0 mL dd này thành 10,0 mL bằng DMPM. Độ pha loãng DT=1000

Tên tạp chất tR tương đối GHT NMT (%)

Tạp chất D 0,4 0,2
Tạp chất E 0,8 0,2
Tạp chất C 1,1 0,2
Tạp chất B 1,2 0,2
Tạp chất N 3,1 0,2
Tạp chất O 4,2 0,15
Tạp không xác định khác - 0,1
Tổng tạp - 1,0

Tạp chất B, C, D, E, N có diện tích píc của từng tạp trong ddịch thử không được
lớn hơn 2 diện tích píc của Etoposid trong ddịch đối chiếu (a) (NMT 0,2%)

Tổng tạp: NMT 10 lần diện tích píc của Etoposid trong ddịch đối chiếu (a) 1,0%

54

27
 Ưu, nhược điểm của phương pháp:

• Ưu điểm: khắc phục hạn chế của khoảng tuyến tính rộng
trong phương pháp chuẩn hóa diện tích và tăng độ nhạy
phát hiện tạp chất liên quan.
• Hạn chế của phương pháp là tổng thời gian phân tích tăng
lên gấp đôi và có thể mắc sai số do pha loãng.

55

3.4.3. ĐỊNH LƯỢNG TẠP CHẤT HỮU CƠ

Bằng chất chuẩn tạp
Dung dịch thử
A x Cx A
= → C x = x . Cc
A c Cc Ac

Pha dung dịch thử ở nồng độ để phát hiện

được tối đa tạp

Dung dịch chuẩn tạp Pha dung dịch chuẩn tạp ở nồng độ chất
chuẩn tạp ???

56

28
 THỬ TẠP CHẤT 4-aminophenol/NL Paracetamol

Dung dịch thử: Cân một lượng bột thuốc khoảng 1g PARA/bđm
100,0 mL đm vđ bằng MeOH (C% thử 1%, V dd thử 100 mL)

Dung dịch chuẩn tạp 4-aminophenol nồng độ ????????

GIỚI HẠN TẠP CHẤT ≤ 0,1%

Trong 1 g Paracetamol sẽ có lượng TẠP CHẤT ≤ 0,1% x 1g = 0,001 g
Dung dịch chuẩn tạp dự kiến pha: cân 1 mg/V dd thử 100 mL MeOH

Dung dịch chuẩn tạp gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn
tạp 4-aminophenol /bđm 100,0 mL đm vđ bằng MeOH.
Dung dịch chuẩn tạp: Hút 1,0 ml dung dịch này pha vào bđm 10,0
mL đm vđ bằng MeOH (0,001%),
57

Ưu, nhược điểm của phương pháp:

❖ Ưu điểm:
• Đính tính và Định lượng được chính xác từng tạp chất nhờ chất
chuẩn tạp.
• Đường chuẩn được pha từ chất chuẩn tạp và chỉ yêu cầu khoảng
tuyến tính hẹp.
• Tăng độ nhạy của phương pháp: phương pháp này chỉ tính riêng
các chất liên quan đơn so với chất chuẩn tạp. Tiêm nồng độ mẫu
cao để xác định tới đa tạp chất dù đáp ứng của hoạt chất ngoài
khoảng tuyến tính.

❖ Nhược điểm:
• Cần phải có một chất chuẩn tạp. Giá chất chuẩn tạp đắt.
• Cân chính xác một lượng nhỏ chuẩn tạp. Sai số khi cân có thể ảnh
hưởng đến độ chính xác và độ đúng của phương pháp .

58

29