Báo-cáo-Berberin-1-1 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ
LIÊN BỘ MÔN
HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT
LỚP DƯỢC 43
LỚP DƯỢC K43

BÁO CÁO THỰC TẬP
THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN CÓ
TRONG BỘT NGUYÊN LIỆU BERBERIN VÀ ỨNG DỤNG
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS.TS.ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ
CẦN THƠ, NGÀY 24 THÁNG 10 NĂM 2021

MỤC LỤC
MỤC LỤC...................................................................................................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.....................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH.....................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG.....................................................................................................v
CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................3
1. TỔNG QUAN VỀ BERBERIN...........................................................................3
1.1. Lịch sử và nguồn gốc : [29]..........................................................................3
1.2. Công thức hóa học và tính chất lý hóa..........................................................4
1.3. Chiết xuất.........................................................................................................6
1.4. Công dụng và ứng dụng trong y tế................................................................7
2. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN...........8
2.1. Theo Dược điển.............................................................................................8
2.2. Các nghiên cứu công bố..............................................................................10
3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH.........................13
3.1. Tổng quan về thẩm định quy trình định lượng............................................13
3.2. Điều kiện sắc ký tối ưu và tiến hành thẩm định phương pháp định lượng bột
nguyên liệu berberin trên một số yêu cầu..............................................................16
CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................18
3.1. Đối tượng, hoá chất, trang thiết bị..................................................................18
Hoá chất:...................................................................................................................... 18
3.2. Phương pháp thẩm định quy trình định lượng berberin có trong bột nguyên liệu
berberin........................................................................................................................ 18
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................................23
4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp......................................................................23
4.2. Chứng minh tính đặc hiệu.....................................................................................33
4.3. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính...........................................................42
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN...........................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................53
i
STT Chữ viết tắt Chữ nguyên Ý nghĩa
1 USE Ultrasound Safe Use Sóng siêu âm
2 MAE Microwave-assisted extraction Hỗ trợ vi sóng
3 PLE Pressure Liquid Extraction Chiết xuất chất lỏng có áp

suất
4 SPE Solid Phase Extraction Chiết xuất chất lỏng siêu

tới hạn
5 LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein cholesterol tỷ

Cholesterol trọng thấp
6 LOD Limit Of Detection Giới hạn phát hiện
7 LOQ Limit Of Quantitation Giới hạn định lượng
8 LLOQ Lower Limit Of Quatification Giới hạn định lượng dưới
9 GC Gas Chromatography Sắc ký khí
10 LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng

11 MS Mass spectrometry Khối phổ
12 TLC Thin layer Chromatoprophy Sắc ký lớp mỏng
13 CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

14 ICH International Conference on Hội nghị quốc tế về hài
Harmonization hòa hóa các thủ tục đăng
ký dược phẩm
15 HPLC High-performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chromatography
16 ACN Acetonitril
17 Rt Retention Time Thời gian lưu
18 S Area Diện tích đỉnh
ii
19 N Theoretical plates Số đĩa lý thuyết
20 K’ Capacity factor Hệ số dung lượng
21 As Asymmetry Hệ số bất đối
iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh công thức hóa học của berberin.................................................5
Hình 1.2. Hình ảnh 3D công thức hóa học của berberin..........................................5
Hình 4.1. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với cột phenyl-hexyl, cột C8, cột C18.................23
Hình 4.2. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với hệ dung môi ACN‒H2O (80:20)..................25
Hình 4.3. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với hệ dung môi MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20).26
Hình 4.4. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20)....26
Hình 4.7. Sắc kí đồ của berberin ở pH 2,5.................................................................32
Hình 4.8. Sắc kí đồ của berberin ở pH 3,5.................................................................32
Hình 4.9. Overlay sắc ký đồ mẫu dung môi pha động (a), dung môi pha mẫu (b),
mẫu thử thêm chuẩn (c), mẫu thử (d) và mẫu chuẩn (e)..........................................35
Hình 4.10. Sắc ký đồ ở chế độ mixed-view của mẫu chuẩn berberin.......................35
Hình 4.11. Sắc ký đồ ở chế độ mixed-view của mẫu thử berberin............................36
Hình 4.12. Phổ UV của mẫu thử và sự tương đồng giữa phổ UV của mẫu thử và
mẫu chuẩn.................................................................................................................. 36
Hình 4.13. Pic purity của mẫu thử.............................................................................37
Hình 4.14. Mẫu chuẩn gây sốc bằng UV (đỏ) và mẫu chuẩn berberin (xanh lá)....38
Hình 4.15. Mẫu chuẩn gây sốc bằng nhiệt độ (hồng) và mẫu chuẩn berberin (xanh
lá)................................................................................................................................ 38
Hình 4.16. Mẫu chuẩn gây sốc bằng chất oxy hóa mạnh H2O2 (xanh dương) và
mẫu chuẩn berberin (xanh lá)...................................................................................39
Hình 4.17. Mẫu chuẩn gây sốc bằng chất có tính acid mạnh HCl (xanh dương) và
mẫu chuẩn berberin (xanh lá)...................................................................................40
Hình 4.18. Mẫu chuẩn gây sốc bởi chất có tính base mạnh NaOH (tím) và mẫu
chuẩn berberin (xanh lá)...........................................................................................41
Hình 4.19. (a, b). Sắc ký đồ của 6 mẫu thử ở nồng độ 10, 20, 40, 50, 60, 80 ppm....43
Hình 4.20. Đường tuyến tính biểu diễn diện tích đỉnh theo nồng độ chất chuẩn....44
Hình 4.21. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 5 ppm để xác định S/N.........................................47
iv
Hình 4.22. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 1 ppm để xác định S/N.........................................47
Hình 4.23. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 10 ppm để xác định S/N.......................................48
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. So sánh một số phương pháp định lượng Bererin....................................13
Bảng 4.1. Các thông số sắc ký....................................................................................24
Bảng 4.2. Kết quả phân tích tính tuyến tính..............................................................42
Bảng 4.3. Phân tích tính tuyến tính...........................................................................44
Bảng 4.4. LOD và LOQ xác định bằng phương pháp 1 và phương pháp 2.............48
Bảng 4.5. So sánh kết quả thực nghiệm với một số nghiên cứu khác......................49
vi
CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Berberin là một loại alkaloid thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều loại
cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu trong thân và rễ vàng đắng với tỉ lệ cao. Berberin được cho là
được sử dụng ở Trung Quốc như một loại thuốc dân gian bởi Thần Nông vào
khoảng năm 3000 trước Công nguyên. Ghi nhận đầu tiên về việc sử dụng
berberin được mô tả trong sách y học cổ đại Trung Quốc Thần Nông bản thảo
kinh[35]. Muối hydrocloride của berberin, được liệt kê là chất kháng khuẩn
đường uống trong Dược điển Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa, là một loại thuốc
không kê đơn phổ biến trong điều trị nhiễm trùng đường tiêu hóa [32]. Hiện
nay, berberin được dùng nhiều để điều trị các bệnh đường ruột như viêm đại
tràng, lỵ, viêm gan vàng da, đau mắt do viêm kết mạc, một số bệnh ngoài da
như nước ăn chân, ngứa do nấm…Berberin còn được biết đến với tác dụng nổi
bật là kìm khuẩn tả và Ecoli. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và
khá an toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích
ở ruột.
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm của berberin, đa dạng về bào
chế và cách sử dụng như: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao… Với sự cạnh
tranh về nhiều mặt như vậy thì chất lượng của các sản phẩm cũng như nguyên
liệu rất quan trọng đối với các nhà sản xuất, cơ quan quản lý, nhà nghiên cứu và
người tiêu dùng. Do đó có thể dễ dàng nhận thấy rằng, ngoài việc kiểm nghiệm
chất lượng của dược phẩm nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho
người sử dụng, thì kiểm nghiệm hàm lượng dược chất có trong nguyên liệu làm
thuốc cũng là một vấn đề đáng quan tâm. Các nghiên cứu để chiết xuất, định
lượng berberin trong bột vàng đắng được tiến hành để phục vụ cho việc nghiên
cứu, phát triển các chế phẩm mới từ nguyên liệu là berberin. Bắt đầu từ những
phương pháp cổ điển như phương pháp chuẩn độ thể tích đến nay khi có sự tiến
bộ của thiết bị, máy móc và con người, berberin có thể được chiết xuất và định
lượng bằng các phương pháp tiên tiến như sắc kí lỏng siêu hiệu năng như “Xác
1
định định lượng Alkaloids từ rễ cây Hydrastis canadensis L. và các chất bổ
sung chế độ ăn uống bằng cách sử dụng sắc ký lỏng siêu hiệu năng với đầu dò
UV” [9],[11]. Với mong muốn góp phần tìm kiếm quy trình phù hợp để kiểm
nghiệm nguyên liệu dược phẩm thì việc thẩm định quy trình phân tích để chứng
minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng hay không là rất cần thiết.
Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH
LƯỢNG BERBERIN CÓ TRONG BỘT NGUYÊN LIỆU BERBERIN VÀ
ỨNG DỤNG”. Đề tài nhằm giải quyết các vấn đề như sau:
1. Thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp
định lượng Berberin trong bột nguyên liệu (khảo sát điều kiện sắc ký tối
ưu).
2. Ứng dụng các thông số đã khảo sát, thực hiện thẩm định quy trình đề ra
để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích (độ đặc hiệu).
3. Chứng minh được tính thích hợp và ý nghĩa của các thông số trong
phương trình hồi qui, xác định LOD, LOQ.
2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TỔNG QUAN VỀ BERBERIN
1.1. Lịch sử và nguồn gốc : [29]
Berberin là một alkaloid benzylisoquinolin bậc 4 và được biết đến như một
alkaloid tự nhiên rất quan trọng để tổng hợp một số dẫn xuất có hoạt tính sinh
học bằng cách ngưng tụ, biến đổi và thay thế các nhóm chức ở các vị trí chiến
lược để thiết kế các loại thuốc mới.
Trong họ Berberidaceae, chi Berberis bao gồm khoảng 450 – 500 loài, đại diện
chính cho nguồn berberin tự nhiên. Các cây thuộc chi này được sử dụng để
kháng viêm, điều trị bệnh truyền nhiễm, đái tháo đường, táo bón và các bệnh lý
khác.
Bằng chứng lâu đời nhất về việc sử dụng quả thanh việt quất (Berberis vulgaris)
làm chất thanh lọc máu đã được viết trên các viên đất sét trong thư viện của
hoàng đế Assyria Asurbanipal trong năm 650 TCN. Ở Châu Á, việc sử dụng
rộng rãi thân, vỏ thân, rễ và vỏ rễ của các loại cây giàu berberin, đặc biệt là loài
Berberis, đã có từ hơn 3000 năm lịch sử. Ở Ayurveda, các loài Berberis theo
truyền thống đã được sử dụng để điều trị một loạt các bệnh nhiễm trùng tai, mắt
và miệng, chữa lành vết thương nhanh chóng, chữa bệnh trĩ, khó tiêu và kiết lỵ,
hoặc điều trị rối loạn tử cung và âm đạo. Chiết xuất và nước sắc berberin theo
truyền thống được sử dụng để chống lại nhiều loại vi sinh vật bao gồm vi
khuẩn, virus, nấm, động vật nguyên sinh, giun sán, trong các loại thuốc dân
gian Ayurvedic, Trung Quốc và Trung Đông.
Trong y học Yunani, Berberis asiatica có nhiều công dụng, chẳng hạn như để
điều trị bệnh hen suyễn, đau mắt, vàng da, sắc tố da và đau răng, cũng như giúp
loại bỏ viêm, sưng và làm khô vết loét. Nước sắc của rễ và vỏ thân có nguồn
gốc từ Berberis aristata, B. chitria , và B. lycium (loài Berberis Ấn Độ), đã
được sử dụng làm thuốc điều trị đối với bệnh viêm kết mạc hoặc các bệnh nhãn
khoa khác, gan và lá lách to, xuất huyết, vàng da, và bệnh ngoài da như loét.
Ngoài ra, đã có báo cáo về việc sử dụng nước sắc của cây nam việt quất Ấn Độ
3
và Emblic myrobalan trộn với mật ong để chữa các chứng rối loạn tiểu tiện như
tiểu buốt.
Ngày nay, một số lượng đáng kể các chất bổ sung chế độ ăn uống dựa trên thực
vật có chứa berberin được sử dụng để giảm sốt, cảm lạnh thông thường, nhiễm
trùng đường hô hấp và cúm.
Berberin đã được phát hiện, phân lập và định lượng từ các họ và chi thực vật
khác nhau bao gồm Annonaceae (Annickia, Coelocline, Rollinia và Xylopia),
Berberidaceae (Berberis, Caulophyllum, Jeffersonia, Mahonia,
Nandina và Sinopodophyllum), Menispermaceae (Tinoveraceae), Papaveraceae
(Argemone, Bocconia, Chelidonium, Corydalis, Eschscholzia, Glaucium,
Hunnemannia, Macleaya, Papaver và Sanguinaria), Ranunculaceae (Coptis,
Hydrastis và Xanthorhiza), và Rutaceae (Evodia, Phellodendronum
và Zanthoxyll). Chi Berberis được biết đến là nguồn berberin tự nhiên được
phân bố rộng rãi nhất. Vỏ của B. vulgaris chứa hơn 8% alkaloid, berberin là
alkaloid chính (khoảng 5%).
Berberin cũng hiện diện rộng rãi trong vỏ, lá, cành cây, thân rễ, rễ và thân của
một số loài cây thuốc, bao gồm Argemone mexicana, Berberis aristata, B.
aquifolium, B. heterophylla, B. beaniana, Coscinium fenestratum, C. chinensis,
C. japonica, C. rhizome, Hydratis canadensis, Phellodendron amurense, P.
chinense, Tinospora cordifolia, Xanthorhiza simplicissima. Một số nghiên cứu
cho thấy berberin phân bố rộng rãi trong vỏ, rễ và thân cây, tuy nhiên, vỏ và rễ
lại giàu berberin hơn so với các bộ phận khác của cây. Trong họ
Papaveraceae, Chelidonium majus là một nguồn thảo dược quan trọng khác của
berberin. Một số loài thực vật quan trọng để sử dụng làm thuốc, chẳng hạn
như Coptidis rhizoma và barberry, là những nguồn tự nhiên có nồng độ berberin
cao nhất. Quả việt quất, chẳng hạn như Berberis aristata, B. aquifolium, B.
asiatica, B. croatica, B. thunbergii và B. vulgaris , là cây bụi được trồng chủ
yếu ở châu Á và châu Âu, và vỏ, quả, lá và rễ của chúng thường được sử dụng
làm thuốc dân gian.
4
1.2. Công thức hóa học và tính chất lý hóa
Cấu trúc hóa học
Hình 1.1. Hình ảnh công thức hóa học của berberin
Hình 1.2. Hình ảnh 3D công thức hóa học của berberin
Công thức phân tử: C20H18NO4+
Danh pháp IUPAC: (5,6-dihydro-9,10-dimethoxybenzo[g]-1,3-
benzodioxolo[5,6a] quinolizinium)
Tính chất lý hóa
Tính chất vật lý
Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy khi ở
dạng base là 145oC. Độ tan dạng base ít tan trong nước, hơi tan trong ethanol,
khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan trong nước ở tỷ lệ 1/400, dễ tan trong
nước nóng, tan trong ethanol, thực tế không tan trong chloroform và ether.
Dạng muối sulfat dễ tan trong nước ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol. Berberin
không có C bất đối nên không có đồng phân quang học.
5
Tính chất hóa học
Hóa tính của N: Berberin có tính chất như một base yếu, tạo muối bằng cách
thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống như các alkaloid khác
mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân tử
nước.
Hóa tính của oxy: Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, N không
vững bền, trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd
gọi là berberinal.
Hóa tính của mạch kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho các
hydro alkaloid không màu[42].
1.3. Chiết xuất
Dựa trên nguyên tắc: Phản ứng chuyển đổi giữa muối protoberberin và bazơ
- Muối hòa tan trong nước, ổn định trong môi trường axit và trung tính
- Bazơ hòa tan trong dung môi hữu cơ.
Phương pháp chiết xuất:
Các kỹ thuật chiết xuất cổ điển như ngâm rượu, ngâm kiệt, Soxhlet, chiết xuất
liên tục lạnh hoặc nóng.
Chiết xuất dung môi hỗ trợ bằng sóng siêu âm (USE), chiết xuất dung môi hỗ
trợ vi sóng (MAE), chiết xuất áp suất siêu cao (UPE) và chiết xuất chất lỏng
siêu tới hạn (SFE), chiết xuất chất lỏng có áp suất (PLE) đã được sử dụng thành
công như các kỹ thuật chiết xuất thay thế với tốt hơn kết quả khi so sánh với các
phương pháp chiết xuất cổ điển. Khai thác bằng sóng siêu âm và có sự hỗ trợ
của vi sóng được coi là các kỹ thuật xanh, đơn giản, hiệu quả và rẻ tiền.
Dung môi chiết xuất thường được sử dụng
- Metanol, etanol, cloroform, hỗn hợp nước và / hoặc axit hóa,…
- Dung môi axit hóa (thường có thêm 0,5% axit vô cơ hoặc hữu cơ) được
sử dụng để kết hợp với các ancaloit hữu cơ gốc tự do và biến đổi chúng thành
các muối ancaloit có độ hòa tan cao hơn Khó khăn: Berberin nhạy cảm, bị phân
6
hủy bởi ánh sáng và nhiệt. Nhiệt độ đại diện cho một yếu tố quan trọng trong cả
quá trình chiết xuất và làm khô trước khi chiết xuất[28].
1.4. Công dụng và ứng dụng trong y tế
Những ứng dụng của berberin đã được biết đến từ lâu, có rất nhiều báo cáo
chứng minh các hoạt tính sinh học của berberin như:
Tác dụng đối với hệ tiêu hóa: Berberin giúp giảm nhẹ các tổn thương ở đường
ruột, berberin có khả năng ức chế bài tiết và nhu động ruột. Berberin là hoạt
chất chống tiêu chảy hiệu quả, Rabbani và công sự đã chứng minh hoạt tính
kháng tiết của berberin trong bệnh tiêu chảy cấp do E. coli và V. cholerae gây
độc ruột. Thử nghiệm này cũng cho thấy BBR là một loại thuốc kháng tiết hiệu
quả và an toàn mà không có tác dụng phụ được ghi nhận [33].
Berberin có khả năng ức chế một số vi khuẩn và ký sinh trùng đường ruột như
Entamoeba histolytica, Clostridium difficile, berberin tăng cường tác dụng
kháng khuẩn của azithromycin chống lại Pseudomonas aeruginosa. Ngoài ra,
các dẫn xuất của berberin có tác dụng diệt khuẩn chống lại tụ cầu vàng kháng
methicillin và khuẩn E.coli. Bae và các cộng sự đã cho thấy trong thí nghiệm
của mình berberin có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của H.pylori.[8], [37],
[25], [26].
Tác dụng chống ung thư: đã có nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư của
berberin , Kuo đã chứng minh rằng berberin có khả năng chống khối u có thể
thúc đẩy quá trình apoptosis ở các tế bào HL-60 bạch cầu của con người.
Berberin ức chế sự gia tăng của các tế bào ung thư miệng thông qua con đường
chống viêm.[28] [16] [15].
Tác dụng đối với tim mạch: berberin thể hiện sự cải thiện huyết động ở bệnh
nhân suy tim sung huyết. Berberin có tác dụng giảm sức cản ngoại vi và thể tích
co bóp. Berberin có thể điều trị các bệnh lý khác về tim mạch như chứng loạn
nhịp tim, xơ vữa động mạch, thiếu máu cơ tim... [12], [38].
Tác dụng hạ đường huyết: Berberin có liên quan đến việc bảo vệ các tế bào
beta (tế bào chịu trách nhiệm tiết insulin) và góp phần tái tạo chúng [13]; bảo vệ
7
tế bào gan khỏi stress ER, làm giảm glucose trong tế bào gan [39]; điều chỉnh
sự tiết insulin từ các tế bào b như một chất chủ vận của thụ thể axit béo GPR40
[34].
Tác dụng hạ lipid máu: Berberin điều chỉnh thụ thể LDL trong gan [21] , làm
tăng sự hình thành và tiết mật [30], tương tác với mixen ảnh hưởng đến sự hấp
thụ cholesterol.
Tác dụng chống viêm: Berberin đã được sử dụng trên toàn thế giới điều trị một
số bệnh như bệnh thấp khớp, đau thắt lưng… Cơ chế chính xác vẫn chưa được
biết tuy nhiên, có thể liên quan đến khả năng ức chế sinh tổng hợp
prostaglandin thông qua sự ức chế của các protein điều hòa hoạt động COX2
[22].
Tác dụng chống trầm cảm và bảo vệ thần kinh: Berberin điều chỉnh chất dẫn
truyền thần kinh và hệ thống thụ thể của chúng trong não. Hơn nữa, một số
công trình chỉ ra tác dụng có lợi của berberin trong điều trị các rối loạn liên
quan hệ thần kinh trung ương bao gồm bệnh Alzheimer, thiếu máu cục bộ não,
tâm thần phân liệt, lo lắng và suy nhược tinh thần [23], [31],[40],[41].
2. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN
2.1. Theo Dược điển
Định lượng berberin bằng quang phổ hấp thu UV-Vis
Theo DĐVN III [1]
Dung dịch thử: Cân 0,200 g chế phẩm và hoà tan trong 200 ml nước bằng cách
đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy 10 ml dung dịch
này pha loãng với nước đến 100 ml (C = 20 µg/ml).
Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin
clorid.
Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện tại
bước sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc do dày 1 cm.
Cách tính kết quả: Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính
theo công thức:
8
At x mt
C%=
Ac x m c
Trong đó:
C%: Hàm lượng % berberin clorid trong mẫu thử
C: Hàm lượng % berberin clorid có trong mẫu chuẩn
At: Độ hấp thu của dung dịch thử
Ac: Độ hấp thu của dung dịch chuẩn
mt: Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột nguyên liệu đã cân
để pha dung dịch thử.
mc: Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột nguyên liệu đã cân
để pha dung dịch chuẩn.
Định lượng berberin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Dược điển Việt Nam V [2]
Theo Dược điển Việt Nam V, berberin được định lượng bằng việc áp dụng
phương pháp sắc ký lỏng với quy trình sau:
Pha động: Hòa tan 3,4 g kali dihydrophosphat (TT) và 1,7 g natri laurylsulfat
(TT) trong hỗn hợp nước – acetonitril (1:1) và pha loãng thành 1000 ml với
cùng dung môi.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,010 g chế phẩm, hòa tan trong pha
động và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoáng 0,010 g berberin clorid chuẩn, hòa tan
trong pha động và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.
Dung dịch phân giải: Hòa tan 1 mg berberin clorid chuẩn và 1 mg palmatin
clorid chuẩn trong 10 ml pha động.
Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (25 cm X 4 nm) được nhồi pha tĩnh c (5 µm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ờ bước sóng 345 nm.
Nhiệt độ cột: 40 °C.
9
Tốc độ dòng: Điều chinh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của berberin khoảng
10 min.
Thể tích tiêm: 10 µl.
Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung
dịch phân giải, thứ tự rửa giải lần lượt là pic palmatin và pic berberin, độ phân
giải giữa hai pic không nhỏ hơn 1,5. Tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, độ
lệch chuẩn tương đối của diện tích pic berberin không lớn hơn 1,5 %. Tiến hành
sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Tính hàm lượng berberin clorid,
C20H18NO4Cl, trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung
dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C 20H18NO4Cl trong berberin clorid
chuẩn.
Bên cạnh đó, việc định lượng berberin trong các chế phẩm có nguồn gốc dược
liệu bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cũng được quy định rõ ràng trong Dược điển Anh
2018 [10]
Dung dịch thử: Hòa tan 0,100 g dược liệu dạng bột trong 100,0 mL hỗn hợp axit
clohydric (TT) và methanol (TT) (1: 100). Đánh siêu âm trong 20 phút. Lọc 1,5
mL dung dịch qua màng lọc (kích thước 0,45 µm).
Dung dịch đối chiếu (a): Hòa tan 10,0 mg berberin clorid CRS trong hỗn hợp
axit clohydric (TT) và metanol (1: 100) và pha loãng thành 100,0 mL với cùng
hỗn hợp.
Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan 1 mg palmatine (TT) trong dung dịch đối
chiếu (a) và pha loãng thành 10,0 mL bằng dung dịch đối chiếu (a).
Điều kiện sắc ký:
Cột: kích thước: l = 0,25 m, Ø = 4 mm.
Pha tĩnh: silica gel octadecylsilyl giới hạn cuối dùng cho sắc ký R (5 µm).
Pha động: A: 0,5% dung dịch axit photphoric R; B: 0,5% dung dịch axit
photphoric R trong axetonitril (TT).
Tốc độ dòng 0,7 mL / phút.
Máy quang phổ phát hiện ở bước sóng 344 nm.
10
Thể tích tiêm 10 µL.
Thời gian lưu berberin khoảng 28 phút.
2.2. Các nghiên cứu công bố
Định lượng berberin bằng quang phổ hấp thu UV-Vis
Nguyên vật liệu: Máy quang phổ UV hai chùm tia (UV-1800, Shimadzu), đo độ
hấp thu dùng cuvet thạch anh 1cm, cân phân tích, máy siêu âm.
Trong nước λmax= 418,4 nm, methanol λmax= 424,8 nm, acetonitril λmax= 424,8
nm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn cho vào bình
định mức 10 ml. Bổ sung nước vừa đủ (dd nồng độ 1000 µg/ml). Lấy chính xác
1 ml chuẩn gốc pha loãng thành nồng độ 100 µg/ml, tiếp tục pha loãng thành
dung dịch có nồng độ 10 µg/ml. Tiếp tục pha loãng thành 1 µg/ml.
Chuẩn bị dung dịch thử: Từ dung dịch gốc trên, rút 10 ml, quét bằng máy quang
phổ UV-VIS trong phạm vi 400-800 nm, sử dụng mẫu trắng tương ứng. Tìm
được độ hấp thu cực đại (λmax).
Quy trình cho đường chuẩn: Lấy 1-5 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức
10 ml, điền đủ. Quét phổ, các mẫu được phân tích độ hấp thu ở λ max tương ứng.
Vẽ phương trình đường chuẩn.
Trong nghiên cứu đã xác định bằng các thông số khác nhau như độ tuyến tính,
độ chính xác, độ đúng, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Định lượng berberin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Theo nghiên cứu của Phan Thị Trang và công sự về định lượng berberin trong
một số mẫu dược liệu bằng phương pháp HPLC đã đưa ra điều kiện phân tích
được thực hiện trên cột pha đảo Luna C 18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), hệ dung môi
pha động acetonitril- dung dịch đệm phosphat, pH 2,5, rửa giải gradient, bước
sóng phát hiện: 346 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút. Khoảng tuyến tính của phương
pháp phân tích berberin là 43 - 860 µg/ml (r 2 = 0,9997). Phương pháp cho độ
đúng và độ lặp lại cao. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
11
lần lượt là 0,387 µg/ml và 1,289 µg/ml. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng
berberin khác nhau rõ rệt trong các loài dược liệu khảo sát [5].
Nghiên cứu định lượng BERBERIN CLORID trong “viên nén đại tràng 105”
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao của Hồ Cảnh Hậu và cộng sự đã
tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC với cột: RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm),
bước sóng 345 nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha động là
hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3). Kết quả:
phương pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính,
độ đúng và độ lặp lại. Giới hạn phát hiện của berberin chlorid trong “Viên nén
đại tràng 105” là 0,02 µg/ml[4].
Bài báo của Anubhuti Pasrija, Rahul Singh và Chandra Kant Katiyar đã sử dụng
phương pháp HPLC-UV để xác định berberin trong thảo mộc thô
Daruharidra (Berberis aristata DC), chiết xuất của nó và ở dạng bào chế
Ayurvedic và xác định được Pha tĩnh là cột sil C 18 trơ. Pha động bao gồm
axetonitril (Cấp HPLC) và đệm kali dihydrogen photphat (pH 2,5) theo
dòng gradient được sử dụng. Cột được cân bằng với pha động (tốc độ dòng 1,0
ml / phút); rửa giải được theo dõi ở bước sóng 346 nm. Dữ liệu phân tích hồi
quy tuyến tính cho các ô hiệu chuẩn cho thấy mối quan hệ tuyến tính tốt, với r
2
= 0,9942 trong khoảng nồng độ 16380–30420 μg / ml đối với diện tích pic [7].
Ngoài ra, còn có một số phương pháp khác như phương pháp thể tích, phương
pháp cân (áp dụng để định lượng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo
tủa của berberin với acid picric) [43], một số phương pháp khác cũng được sử
dụng phổ biến [18]
Nghiên cứu xác định đồng thời berberin, palmatine, coptisine, epiberberin và
jatrorrhizine trong huyết tương chuột bằng LC-MS / MS và dược động học so
sánh sau khi uống Rhizoma coptidis và chiết xuất Jiao-Tai-Wan với : Sắc ký sự
phân tách đạt được ở 30o C trên cột BDS Hypersil C18 (50 x 2.1 mm i.d., 2.4
µm, Thermo Scientic) với Cột bảo vệ Phenomenex C18 (4 x 2 mm i.d.) theo cơ
chế gradient,rửa giải với 0–2,5 phút, pha động là đệm pH 5 và acetonitrile (7:3),
12
thể tích tiêm là 5 ml.Khối phổ được vận hành ở chế độ ion hóa ESI+, sử dụng
kiểu đo mảnh MRM.Các đường chuẩn tuyến tính thu được trong khoảng nồng
độ 0.20–20.0 ng/ml đối với berberin và 0.20–100.0 ng/ml đối với palmatine,
coptisine, epiberberin và jatrorrhizine. Độ chính xác, độ chụm và độ thu hồi
chiết của năm chất phân tích đều đạt yêu cầu[27].
Nghiên cứu xác định đồng thời Berberin và Palmatine trong huyết tương thỏ
bằng phương pháp LC-MS–MS và ứng dụng của nó trong nghiên cuuws dược
động học sau khi uống Coptidis và Coptidis - Gardeniae.Sau khi trộn berberin
với nội chuẩn, mẫu huyết tương được xử lý trước với 1,5 mL acetonitril. Tách
sắc ký trên cột C18 bằng cách sử dụng hỗn hợp nước (chứa 10 mmol/L amoni
axetat, pH 3.5) và axetonitril (50:50, v/v) làm pha động. Khối phổ : chế độ ion
hóa là chế độ ESI + với kiểu đo mảnh SIM.Phương pháp này tuyến tính trong
khoảng nồng độ 2,0–200,0 ng mL-1 đối với berberin và 1,0–100,0 ng mL-1 đối
với palmatine. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là 2,0 ng mL-1 đối với
berberin và 1,0 ng mL-1 đối với palmatine. Các giá trị độ đúng trong và giữa
các ngày nhỏ hơn 14,3% và sai lệch trong khoảng ± 11,0%[24].
Bảng 2.1. So sánh một số phương pháp định lượng Bererin
Phương
Ưu điểm Nhược điểm
pháp
Độ chính xác và ổn định tốt, dễ vận Độ nhạy thấp và sự phân tách của
TLC hành, dễ sử dụng, dễ hiển thị màu, phân tử sinh học là không lý
tỷ lệ mở rộng cao. tưởng.
Hiệu quả tách cao, độ nhạy cao,

LC phạm vi ứng dụng rộng, phân tích Giới hạn phát hiện không đủ thấp.
nhanh và phạm vi lựa chọn rộng.
13
Ứng dụng rộng rãi, khả năng phân
Hiệu ứng ma trận trong LC-MS có
tách mạnh, giới hạn phát hiện thấp,
LC-MS thể thay đổi độ ổn định và khả
độ nhạy cao, độ chính xác phân
năng tái lập.
tích cao và độ đặc hiệu mạnh.
Độ nhạy cao, độ tin cậy định tính
cao, phân tách hiệu quả, phân tích Nhạy cảm hơn đối với các hợp
GC-MS
định lượng hiệu quả và phân tích chất dễ bay hơi.
cấu trúc chính xác.
Tách hiệu quả cao, nhanh hơn

CE Khả năng tái tạo kém.
HPLC.
3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH

3.1. Tổng quan về thẩm định quy trình định lượng
Thẩm định quy trình định lượng Berberin có trong bột nguyên liệu Berberin
theo hướng dẫn của ICH
Theo hướng dẫn của ICH năm 2005 thì quy trình phân tích cần phải được thẩm
định dựa vào các chỉ tiêu sau: tính đặc hiệu – tính chọn lọc, đường chuẩn và
khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác.
Xác định tính tương thích hệ thống
Sau khi đã khảo sát được các điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ để phân tích
Berberin, tính tương thích của hệ thống được đánh giá để đảm bảo các thiết bị
có khả năng cho kết quả chính xác và đáng tin cậy tại thời điểm sử dụng.
Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn theo quy trình, sau đó tiêm mẫu
chuẩn và mẫu thử với ít nhất 6 lần tiêm mẫu liên tiếp.
Tiêu chí chấp nhận: Thời gian lưu và diện tích đỉnh của các chất phải có
RSD≤2%
Xác định tính đặc hiệu – tính chọn lọc
14
Tiến hành: Sắc ký với lần lượt 7 mũi tiêm cho các loại mẫu sau đây theo quy
trình phân tích
Mẫu trắng dung môi pha động
Mẫu trắng dung môi hoà tan mẫu
Mẫu giả dược (Placebo – Mẫu nền)
Mẫu chuẩn: Chứa chất chuẩn chất cần phân tích pha trong dung môi pha động.
Mẫu thử: Chứa dược chất cần phân tích, có nồng độ chất cần phân tích tương
đương với mẫu chuẩn.
Mẫu thử thêm chuẩn của chất phân tích
Mẫu gây “sốc” để tạo sản phẩm phân huỷ.
Tiêu chí chấp nhận:
Thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu tự tạo phải tương đương với
thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu đối chiếu, đồng thời mẫu trắng
và mẫu placebo không có píc trùng với píc chất cần phân tích. Pic của các tạp
phải tách hoàn toàn khỏi Pic cần phân tích.
Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích đỉnh của chất phân tích
phải tăng lên so với trước khi thêm chất chuẩn.
Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử phải tinh khiết (Purity
level xấp xỉ 100%). Hệ số chồng phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích thu
được trong sắc ký đồ và phổ UV của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn
xấp xỉ 1,0.
Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được
tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử.
Khoảng xác định thường được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ
thuộc vào việc ứng dụng dự định của quy trình. Khoảng xác định được thiết lập
bởi việc khẳng định quy trình phân tích đã xây dựng có tính tuyến tính, độ đúng
và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng để định lượng mẫu thử chứa chất
15
phân tích với hàm lượng nằm trong khoảng hoặc ở 2 cực (cực đại và cực tiểu)
của khoảng xác định của quy trình phân tích.
Tiến hành:
Tuyến tính có thể thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bằng cách pha loãng dung
dịch chuẩn gốc) và/hoặc cân riêng biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần
dược chất dựa trên quy trình đã đặt ra. Cách sau có thể được dùng để nghiên
cứu khoảng phân tích.
Để định lượng nguyên liệu hoặc thành phẩm thuốc: Thường từ 80 -120% của
nồng độ thử. Để xác định tính tuyến tính cần tiến hành ít nhất 5 nồng độ.
Hệ số tương quan tuyến tính: 0,9950 ≤ R2 ≤ 1,0000.
Thẩm định độ đúng
Tiến hành:
Thêm chính xác lượng chất chuẩn của hoạt chất hoặc tập chất (ở dạng rắn hoặc
dung dịch pha loãng) ứng với 80, 100, 120% hàm lượng công bố trên nhãn vào
công thức Placebo hoặc công thức mẫu thử (với thử tinh khiết định lượng).
Mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 3 lần và phải nằm trong khoảng phát hiện
của chất phân tích.
Tiến hành định lượng 09 mẫu chuẩn bị theo quy trình phân tích dự kiến.
Tính tỷ lệ phục hồi (R).
Phân tích thường quy các thuốc tân dược: R ≈ 98-102%.
RSD tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ: ≤2,0%.
Thẩm định độ chính xác
Tiến hành: Độ lặp lại (Repeatability)
Tối thiểu 9 lần định lượng trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy
trình (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần).
Hoặc tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100%.
Tiêu chí chấp nhận: Phân tích thường quy các thuốc tân dược: RSD ≈ 2%.
16
3.2. Điều kiện sắc ký tối ưu và tiến hành thẩm định phương pháp định
lượng bột nguyên liệu berberin trên một số yêu cầu
Với mục tiêu đưa ra được quy trình phân bằng sắc ký lỏng pha đảo (RPHPLC)
đơn giản, thiết bị phù hợp với đa số các phòng thử nghiệm trong hệ thống kiểm
nghiệm, dung môi phân tích thông dụng, dễ tìm, ít độc hại, cách xử lý mẫu đơn
giản dễ tiến hành. Do đó cần tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu và tiến
hành thẩm định phương pháp trên một số chỉ tiêu.
Lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu
Nguyên tắc để tìm ra điều kiện sắc ký tối ưu là lựa chọn được loại pha tĩnh, loại
pha động, tỉ lệ pha động, pH pha động, tốc độ dòng để các chất tách nhau ra rõ
rệt, pic gọn, cân đối.
Loại pha tĩnh: sử dụng các cột với kích thước hạt khác nhau và các hãng sản
xuất khác nhau.
Loại pha động: dựa trên một số dược điển và tài liệu tham khảo để xác định
thành phần pha động, tỷ lệ, pH tối ưu, tốc độ dòng phù hợp.
Thẩm định phương pháp phân tích [3], [6], [17].
Tính tương thích hệ thống: chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn, mỗi mẫu tiêm 6
lần. Xác định các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh, độ phân giải, hệ số bất
đối, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết.
Độ đặc hiệu của phương pháp: tiến hành sắc ký trên các mẫu ở bước sóng
348nm.
Mẫu thử.
Mẫu chuẩn.
Mẫu thử thêm chuẩn.
Dung môi pha mẫu.
Dung môi pha động.
Mẫu gây sốc (Chất oxi hóa, axit mạnh, ánh sáng, nhiệt độ).
Sau đó đó so sánh các sắc ký đồ thu được để đánh giá độ đặc hiệu của phương
pháp:
17
Sắc kí đồ của các mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của chất
chuẩn trong sắc kí đồ của các mẫu chuẩn. Nếu trên sắc kí đồ xuất hiện thêm các
pic khác (pic tạp) không phải pic của Berberin thì pic của Berberin phải tách
hoàn toàn khỏi các pic tạp và đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp sắc kí
lỏng được quy định trong dược điển.
Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích đỉnh của berberin phải
tăng lên rõ rệt so với trước khi thêm chuẩn.
Hệ số chồng phổ của pic Berberin cần phân tích thu được trong sắc ký đồ và
phổ UV của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn xấp xỉ 1,0.
Pic của Berberin trong sắc ký đồ mẫu thử phải tinh khiết (purity level xấp xỉ
100%).
18
CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng, hoá chất, trang thiết bị
Đối tượng nghiên cứu: Bột nguyên liệu Berberin
Hoá chất:
Phát triển điều kiện sắc ký tối ưu:
MeOH; ACN; Acid formic; Triethylamin; Đệm pH 3.5; pH 2; pH 5; Acid
phosphoric 50%; Mẫu bột nguyên liệu 50 ppm pha trong MeOH trung quốc.
Chứng minh tính đặc hiệu của quy trình:
Dung dịch H2O2 30%; Acid HCl 1N; NaOH 1N.
Khảo sát quy trình chiết thích hợp:
MeOH 500mL Trung Quốc; Dung dịch berberin chuẩn ban đầu 500ppm pha
trong MeOH.
Trang thiết bị
Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối đầu dò dãy diod quang và khối phổ 3
lần tứ cực (Water ULPC – PDA/Xevo TQD).
Phát triển điều kiện sắc ký tối ưu: Cột thermo C18; Cột lunar C8; Cột synergi
4µm; Bình định mức 25ml: 02 bình; Vial: 02 lọ; Đầu lọc 0,45µm: 01; Quyển
DĐVN 5 tập 1.
Chứng minh tính đặc hiệu của quy trình:
Lọ có nắp nhựa đậy/lọ cân sấy dược liệu bằng thuỷ tinh chứa khoảng 5-8mL dd
chuẩn: 05 lọ; Vial: 06 lọ; Đầu lọc 0,45µm: 04 đầu lọc; Ống tiêm nhựa 3mL;
Becher 50mL sạch: 02 becher.
Khảo sát quy trình chiết thích hợp:
Bình định mức 20mL: 06 bình; Micropipet 1000mL: 01; Đầu lọc 0,45mm: 03 đầu
lọc.
3.2. Phương pháp thẩm định quy trình định lượng berberin có trong bột
nguyên liệu berberin
Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp
19
Phát triển điều kiện sắc ký: Các yếu tố ảnh hưởng ma trận để phát triển mẫu bao
gồm loại pha tĩnh, loại pha động, tỉ lệ pha động, pH đệm, nhiệt độ cột.
Lựa chọn loại pha tĩnh
Tiến hành trên 3 cột: C8, C18, Cột phenylhexyl với pha động là ACN - Đệm pH
3,5 (80:20)
Dựa trên kết quả đã chạy xác định các thông số Rs, As, tR, S, k, N
Từ các thông số tính được xác định được cột tối ưu.
Lựa chọn loại pha động
Tiến hành trên cột đã chọn.Các loại pha động được tiến hành khảo sát:
ACN - H2O pH 3,5 (80:20 và 70:30)
MeOH - Đệm pH 3,5 (80:20 và 70:30)
ACN - Đệm pH 3,5 (80:20)
Dựa trên kết quả đã chọn xác định các thông số Rs, As, tR, S, k, N
Từ các thông số tính được xác định được pha động tối ưu.
Tìm tỉ lệ dung môi pha động
Tiến hành trên pha động ACN - Đệm pH 3,5 đã khảo sát phía trên chạy thử 2 tỉ lệ
pha động là ACN - Đệm pH 3,5 (60:40 và 80:20)
Từ các thông số tính được xác định được tỉ lệ dung môi pha động tối ưu.
Tìm đệm pH được tiến hành khảo sát:
Tìm đệm pH được tiến hành như sau: với điều kiện pha tĩnh, loại và tỉ lệ dung
môi pha động đã được tối ưu, thực hiện cố định các điều kiện đó và tiếp tục thử
nghiệm tối ưu với đối tượng pH ở các pH = 2 và pH = 3,5.
Từ các thông số tính được xác định được đệm pH tối ưu.
Thiết lập chương trình chạy
Cho chạy lần lượt theo chương trình đẳng dòng trên cột với tỷ lệ pha động đã
chọn để xác định chương trình chạy thích hợp.
Chứng minh tính đặc hiệu
20
Điều kiện sắc ký xác định độ đặc hiệu của phương pháp:
- Pha tĩnh: cột synergi 4μm.
- Pha động: ACN – Buffer 3,5 (35:65).
- Nhiệt độ cột: 25oC.
- Tốc độ dòng: 1mL/phút.
- Thể tích tiêm: 20μL.
- Dung môi pha mẫu: MeOH
- Đầu dò: PDA.
Tiến hành thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết trên máy HPLC/PDA về
tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác trong
ngày và khác ngày.
Tiến hành sắc ký các loại mũi tiêm sau đây:
Mẫu 1 - Dung môi pha mẫu: MeOH lọc qua màng lọc milipore 0,45𝜇𝑚 vào vial.
Mẫu 2 - Dung môi pha động: ACN - Buffer 3,5 (35:65). Với buffer 3,5: dung
dịch triethylamin 0,8% được điều chỉnh đến pH 3,5 bằng acid phosphoric 85%.
Lọc qua màng lọc milipore 0,45𝜇𝑚 vào vial.
Mẫu 3 - Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 5mg berberin chuẩn cho vào bình
định mức 100ml. Thêm vào bình 50ml dung môi pha mẫu (MeOH), lắc đều.
Đánh siêu âm trong 15 phút để hòa tan. Bổ sung vừa đủ bằng MeOH, lắc đều.
Dung dịch chuẩn thu được có nồng độ berberin 50ppm. Lọc qua màng lọc
milipore 0,45𝜇𝑚 vào vial.
Mẫu 4 - Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 5mg berberin bột nguyên liệu cho vào
bình định mức 100ml. Thêm vào bình 50ml dung môi pha mẫu (MeOH), lắc
đều. Đánh siêu âm trong 15 phút để hòa tan. Bổ sung vừa đủ bằng MeOH, lắc
đều. Lọc qua màng lọc milipore 0,45𝜇𝑚 vào vial.
Mẫu 5 - Mẫu thử thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 1mg berberin chuẩn cho
bình định mức 25ml. Thêm vào dung dịch mẫu thử (Mẫu 3), lắc đều. Đánh siêu
âm trong 15 phút để hòa tan. Bổ sung dung dịch mẫu thử. Lọc qua màng lọc
milipore 0,45𝜇𝑚 vào vial.
21
Mẫu 6 - Mẫu gây sốc: Mẫu chuẩn được gây sốc bằng các tác nhân như nhiệt độ,
ánh sáng mặt trời, chất oxy hóa (H2O2), acid mạnh (HCl), base mạnh (NaOH).
Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính
Pha 6 mẫu chuẩn trong nồng đồ từ 10 đến 80 ppm là 10ppm, 20ppm, 40ppm,
50ppm, 60ppm, 80ppm. Từ 6 nồng độ này chuyển lên máy để đo diện tích đỉnh
(S).
Có 2 cách thực hiện:
Cách 1: Xác định LOD và LOQ từ đường tuyến tính
- Từ kết quả của các diện tích đỉnh (S) máy đo được, tiến hành xây dựng đường
tuyến tính bằng phần mềm Microsoft Excel.
- Tính các hệ số hồi quy a, b từ phương trình hồi quy y = ax + b và và hệ số
tương quan R (nếu 0,9950 < R ≤ 1,0000: có tương quan tuyến tính rõ rệt)
- LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn
của tín hiệu đo.
3,3 x SD
LOD =
a
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu
a: Độ dốc của đường chuẩn
Giá trị a có thể dễ dàng tính được từ đường chuẩn, giá trị SD có thể được tính
theo nhiều cách khác nhau, bao gồm:
Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng; phân tích mẫu trắng lặp lại 10 lần và tính
SD tương ứng.
Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặp lại 10
lần và tính SD.
Dựa trên hệ số chặn của đường chuẩn, làm nhiều lần để tính SD của giá trị b
(intercept).
Cách 2: Xác định LOD dựa vào quan sát thực nghiệm
Yêu cầu: tiến hành pha giảm nồng độ.
Thực hiện:
22
Tiến hành phân tích các mẫu giả dược có thêm chất chuẩn chất cần phân tích với
nồng độ giảm dần (mẫu thử). Trên sắc ký đồ, xác định đáp ứng pic tương ứng
với mỗi mức nồng độ.
Xác định mức nồng độ mà trên sắc ký đồ mẫu thử không xác định được pic của
hoạt chất cần phân tích. Khi đó, giá trị LOD của phương pháp tương ứng với
mức nồng độ thực nghiệm ngay trên mức nồng độ mẫu thử không cho pic trên
sắc ký đồ.
 Tỷ lệ đáp ứng S/N nằm giữa 3:1 hoặc 2:1 thường được chấp nhận để thiết lập
LOD và 10:1 với LOQ.
23
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp
Khảo sát pha tĩnh tối ưu
Quy trình thực hiện:
Dựa vào độ phân cực của berberin, các cột được đề xuất làm pha tĩnh bao
gồm:
Cột C18 (màu đỏ): C18 có các chuỗi Octadecyl là các hợp chất không
phân cực nên có khả năng lưu giữ các chất kỵ nước.
Cột C8 (màu xanh lá): Cột C8 có chuỗi Octyl có khả năng lưu giữ các chất
không phân cực, khả năng lưu giữ các hợp chất kém hơn so với cột C18.
Cột phenyl-hexyl (màu xanh dương): bao gồm các nhóm phenyl được liên
kết với bề mặt silica bằng chuỗi 6 cacbon để có thể lưu giữ các chất thơm và kỵ
nước.
Chọn 1 hệ dung môi pha động với tỉ lệ bất kì (ACN–Buffer pH 3,5
(80:20)) chạy với 3 cột nêu trên. Sau khi chạy xong 3 cột, ta có kết quả được thể
hiện trong sắc kí đồ hình 4.1.
1800 1800
DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm
141021_CHUAN 50PPM_80A20BUFER 3.5_F12_N1DK43.dat 141021_CHUAN50PPM_80A20BUFER35_COTSYRNEGIC8_F12_N1DK43.dat 141021_CHUAN50PPM_80A20BUFER35_COTC18_F12_N1DK43.dat
Name Name Name
Retention Time
0.91229
Retention Time Retention Time

1600 1600
Area Area
Area Theoretical plates (USP)
Theoretical plates (USP)
Theoretical plates (USP) Capacity factor
Capacity factor
Capacity factor
2.57333
Asymmetry
1.17075
1400 Asymmetry 1400

Asymmetry
0.85195
1534
1200 1200
7.23333
967 1.62667
9272698
1000 1000
3205
3.573
10274684
mAU
mAU
16059202
800 800
Berberin
2.627
600 600
8.233
Berberin
400 400
Berberin
200 200
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Hình 4.1. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với cột phenyl-hexyl, cột C8, cột C18
24
* Tên sắc ký đồ (Name); Thời gian lưu (Retention time); Diện tích pic (Area), Số
đĩa lý thuyết (Theoretical plates (USP)); Hệ số dung lượng (Capacity factor); Hệ
số bất đối (Asymmetry).
Từ sắc ký đồ, ta chọn được cột phenyl-hexyl là pha tĩnh tối ưu nhất do:
- Diện tích đỉnh lớn hơn có hệ số bất đối tốt 1,17075 (0,8As1,2).
- Cho pic đẹp.
- Số đĩa lý thuyết:
+ Cột phenyl-hexyl: có số đĩa lý thuyết lớn làm tăng hiệu suất tách của cột.
+ Cột C8 và C18: có số đĩa lý thuyết không đạt yêu cầu (N<2000).
Bảng 4.1. Các thông số sắc ký
Thông số sắc ký Cột C18 Cột C8 Cột phenyl-hexyl
Nhận xét hình dạng Hình dạng tương Hình dạng không Hình dạng tương
pic đối đối xứng đối xứng đối đối xứng
Thời gian lưu (tR)
3,573 2,627 8,233
(phút)
Diện tích pic (S)
9272698 10274684 16059202
(mAU.phút)
Hệ số bất đối (As) 0,91229 0,85195 1,17075
Số đĩa lý thuyết (N) 1534 967 3205
Hệ số dung lượng 2,57333 1,62667 7,23333
Khảo sát dung môi pha động tối ưu

Quy trình thực hiện:
- Dựa vào các tính chất lý hóa về độ tan và pKa của berberin, các dung môi
đươc đề xuất làm dung môi pha động bao gồm:
+ MeOH: dung môi phổ biến trong sắc ký, độ phân cực mạnh.
+ ACN: độ phân cực trung bình.
+ H2O: độ phân cực mạnh.
25
+ Dung dịch đệm pH 3,5 (Buffer pH 3,5): dựa trên dạng bererin được sử dụng ở
dạng muối (pKa=2,5).
- Từ các dung môi được đề xuất ở trên, chúng tôi tiến hành tiêm 3 mẫu vào cột
pha tĩnh phenyl-hexyl (đã được chứng minh ở phần khảo sát cột pha tĩnh tối ưu)
với 3 hệ dung môi khác nhau, được cố định tỉ lệ dung môi là A‒B (80:20) như
sau:
+ Hệ gồm: ACN–H2O (80:20).
+ Hệ gồm: MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20).
+ Hệ gồm: ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20).
- Đánh giá kết quả dựa vào các thông số sắc ký đặc trưng cho HPLC, sự tách và
hình dạng các pic.
- Kết quả thực nghiệm: Sau khi chạy hết 3 mẫu, kết quả được thể hiện trong các
sắc ký đồ dưới đây:
+ Hệ dung môi ACN‒H2O (80:20): (Hình 4.2)
1200 1200
DAD-CH1 345 nm
141021_CHUAN50PPM_80A20C_F12_N1DK43.dat
Name
Retention Time
Area
Berberin 9.040 16215613 2943 8.04000 1.55750
1000
Theoretical plates (USP) 1000
Capacity factor
Asymmetry
800 800
600 600
mAU
mAU
400 400
200 200
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Minutes
Hình 4.2. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với hệ dung môi ACN‒H2O (80:20)
* Tên sắc ký đồ (Name): Berberin; Thời gian lưu (Retention time): 9,040 phút;
Diện tích pic (Area): 16215613; Số đĩa lý thuyết (Theoretical plates (USP)):
2943; Hệ số dung lượng (Capacity factor): 8,04000; Hệ số bất đối
(Asymmetry): 1,55750.
26
+ Hệ dung môi MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20): (Hình 4.3)
1800 1800
DAD-CH1 345 nm
141021_CHUAN50PPM_80B20BUFER35_F12_N1DK43
Name
Berberin 3.133 15868817 2659 2.13333 1.20583

1600 Retention Time 1600
Area
1400
Capacity factor 1400
Asymmetry
1200 1200
1000 1000
mAU
mAU
800 800
600 600
400 400
200 200
0 0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
Minutes
Hình 4.3. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với hệ dung môi MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20)
*Tên sắc ký đồ (Name): Berberin; Thời gian lưu (Retention time): 3,133 phút;
+ Hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20): (Hình 4.4)
1800 1800
DAD-CH1 345 nm
141021_CHUAN 50PPM_80A20BUFER_F12_N1DK43.dat
Name
B erb erin8.233 16 05920232 05 7.233331.17075
1600
Retention Time 1600
Area
1400
Asymmetry
1200 1200
1000 1000
m AU
m AU
800 800
600 600
400 400
200 200
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Hình 4.4. Sắc ký đồ khi chạy mẫu với hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20)
27
* Tên sắc ký đồ (Name): Berberin; Thời gian lưu (Retention time): 8,233 phút;
Bàn luận:
- Từ hình sắc ký đồ sử dụng hệ dung môi pha động ACN‒H2O (80:20), có thể
loại hệ dung môi ACN‒H2O (80:20) ngay ban đầu do:
+ Hệ số bất đối nằm ngoài ngưỡng cho phép (lý thuyết từ 0,8 đến 1,5), điều này
dễ làm kéo đuôi pic dài làm cho pic không đạt độ đối xứng và không đẹp.
+ Hệ số dung lượng cao (8,04000) nằm ngoài ngưỡng lý thuyết (từ 1 đến 8).
Khi hệ số dung lượng nhỏ hơn 1, pic xuất hiện sớm, dễ nhầm lẫn hoạt chất
chính cần phân tích với dung môi, tạp hay một chất khác không phải hoạt chất
cần tìm. Và hệ số dung lượng lớn hơn 8, pic xuất hiện trễ làm cho thời gian
phân tích kéo dài, tốn kém dung môi. Do đó, để đảm bảo pic xuất hiện đúng và
đẹp cần hệ số dung lượng nằm từ 1 đến 8 và hệ số bất đối nằm từ 0,8 đến 1,5.
+ So sánh sắc ký đồ hệ dung môi ACN‒H2O (80:20) với hai sắc ký đồ hệ dung
môi còn lại (MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20) và ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20)) thì
hai sắc ký đồ hệ dung môi còn lại này đảm bảo các thông số sắc ký tốt, tối ưu
hơn về hệ số bất đối và hệ số dung lượng so với sắc ký đồ hệ dung môi ACN‒
H2O (80:20). Vì vậy, có thể bỏ qua hệ dung môi ACN‒H2O (80:20).
+ Từ hai hình sắc ký đồ Hình 4.3 và Hình 4.4 cho thấy, khi sử dụng hệ dung
môi pha động MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20) có tính tối ưu hơn hệ dung môi
ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20) về các thông số sắc ký thời gian lưu và hệ số dung
lượng (thời gian lưu ngắn hơn trong khi hệ số dung lượng nằm trong khoảng
cho phép). Mặt khác, khi xét về hệ số bất đối, cường độ tín hiệu, cũng như diện
tích pic, sự khác biệt giữa các thông số sắc ký của hai pic không có ý nghĩa
thống kê. Điều này chỉ hợp lý khi mẫu đã được tinh chế rất tốt (trong bài thực
tập, đã sử dụng dung dịch chuẩn berberin độ tinh khiết trên 90%, kết quả thể
hiện ở cả hai hệ chỉ cho một pic của berberin và nhiễu nền dường như không có
28
ý nghĩa). Nhưng giả sử khi áp dụng tương tự với một nền mẫu phức tạp hơn thì
với thời gian lưu là 3,133 phút và hệ số dung lượng tương đối nhỏ là 2,133 của
hệ MeOH‒Buffer pH 3,5 (80:20) dẫn đến nguy cơ không đáp ứng được việc
tách pic berberin khỏi các pic của những thành phần khác, nói cách khác, có thể
có nguy cơ rất cao hoặc rất có thể không đạt được độ phân giải tối ưu. Vì thế,
nếu lựa chọn giữa 2 hệ pha động này, hệ ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20) sẽ là lựa
chọn tối ưu hơn vì với thời gian lưu là 8,233 và hệ số dung lượng là 7,233, đồng
thời với số đĩa lý thuyết là 3205 cao hơn so với 2659 của hệ MeOH‒Buffer pH
3,5 (80:20) thì khả năng tách của hệ này tốt hơn đáng kể.
- Kết luận: Từ kết quả và bàn luận ở trên cho thấy, pha động có thành phần gồm
ACN‒Buffer pH 3,5 cho pic của berberin đáp ứng tốt nhất các thông số của
HPLC. Tóm lại, thành phần dung môi pha động tối ưu được lựa chọn là ACN‒
Buffer pH 3,5.
Khảo sát tỉ lệ dung môi pha động tối ưu
- Từ pha động ACN‒Buffer pH 3,5 đã khảo sát phía trên, tiến hành chạy thử 2 tỉ
lệ pha động là :
+ ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ 60:40.
+ ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ 80:20.
- Đánh giá kết quả dựa vào các thông số sắc ký đặc trưng cho HPLC, sự tách và
hình dạng các pic.
- Kết quả thực nghiệm:
+ Hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 (60:40): (Hình 4.5)
1800 1800
DAD-CH1 345 nm
141021_CH UAN50PPM_60A40BUFER 35_F12_N1DK43 _LAN2.dat
Name
Berberin 8.333 158295833358 7.33333 1.14938
1600
Retention Time 1600
Area
1400
Asymmetry
1200 1200
1000 1000
m AU
m AU
800 800
600 600
400 400
200 200
29
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
* Tên sắc ký đồ (Name): Berberin; Thời gian lưu (Retention time): 8,333 phút;Diện
tích pic (Area): 15829583; Số đĩa lý thuyết (Theoretical plates (USP)): 3358; Hệ số
dung lượng (Capacity factor): 7,3333; Hệ số bất đối (Asymmetry): 1,14938.
+ Hệ dung môi A ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20): (Hình 4.6)
1800 1800
DAD-CH1 345 nm
Name
B erb erin8.233 16 05920 232 05 7.233331.17075

Area
1400
Asymmetry
1200 1200
1000 1000
m AU
m AU
800 800
600 600
400 400
200 200
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
*Tên sắc ký đồ (Name): Berberin; Thời gian lưu (Retention time): 8,233 phút; Diện
tích pic (Area): 16059202; Số đĩa lý thuyết (Theoretical plates (USP)): 3205; Hệ số
dung lượng (Capacity factor): 7,23333; Hệ số bất đối (Asymmetry): 1,17075.
Bàn luận:
- Về số đĩa lý thuyết:
+ So cột phenyl-hexyl của ACN‒Buffer pH 3,5 (60:40) có N=3358 cao hơn N
của ACN‒Buffer pH 3,5 (80:20) là 3205.
+ Theo lý thuyết N càng lớn khả năng tách càng tốt, các pic càng hẹp và nhọn.
+ Nhưng ở đây sự khác biệt giữa 2 thông số là không đáng kể để có thể có
những sự ảnh hưởng nhất định đến pic cũng như ảnh hưởng đến quyết định lựa
chọn của 2 tỉ lệ dung môi.(*)
- Về hệ số bất đối:
+ Hệ số bất đối (As) là đại lượng đặc trưng cho tính đối xứng của pic sắc ký.
Thông thường 0,8<As<1,2. Hệ số bất đối càng lớn thì hiện tượng kéo đuôi càng
30
rõ, pic sắc ký rộng. Hệ số bất đối của đỉnh càng tăng thì tính tương thích và độ
chính xác kém hơn.
+ So cột phenyl-hexyl của ACN‒Buffer pH 3,5:
- Hệ dung môi tỉ lệ 60:40 hệ số bất đối là 1,14938.
- Hệ dung môi tỉ lệ 80:20 hệ số bất đối là 1,17075.
Cả 2 tỉ lệ dung môi đều có hệ số bất đối nằm trong khoảng cho phép, chưa có
cơ sở để kết luận.(**)
- Về thời gian lưu:
+ Cột phenyl-hexyl của ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ 60:40 có thời gian lưu dài hơn
là 8,333 sẽ làm mất thời gian hơn.
+ Cột phenyl-hexyl của ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ 80:20 là 8,233.
Cả 2 tỉ lệ dung môi đều có thông số thời gian lưu nằm trong khoảng cho phép.
Nhưng chúng ta sẽ ưu tiên sử dụng hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ 80:20
hơn.(***)
- Về hệ số dung lượng:
+ Còn được gọi là hệ số lưu giữ được định nghĩa là tỷ số giữa thời gian lưu hiệu
chỉnh và thời gian không lưu giữ thể hiện khả năng lưu giữ của cột đối với cấu
tử. Hệ số dung lượng càng lớn thì thời gian phân tích càng lâu, thông thường hệ
số dung lượng nằm trong khoảng từ 1–8.
+ So cột phenyl-hexyl của ACN‒Buffer pH 3,5:
- Hệ dung môi tỉ lệ 60:40 hệ số dung lượng là 7,3333.
- Hệ dung môi tỉ lệ 80:20 hệ số dung lượng là 7,2333.
Cả 2 tỉ lệ dung môi đều có thông số hệ số dung lượng nằm trong khoảng cho
phép. Nhưng chúng ta sẽ ưu tiên sử dụng hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ
80:20 hơn.(****)
Từ (*), (**), (***), (****), ta kết luận, dung môi tối ưu có thể sử dụng trong
quy trình phân tích này là hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5 tỉ lệ 80:20.
Khảo sát giá trị đệm pH
31
- Giá trị pH của pha động là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong quá
trình phân tách các alkaloid trên HPLC pha đảo. Alkaloid nói chung là các hợp
chất cơ bản với nucleophin có một hoặc hai nguyên tử nitơ với cặp electron duy
nhất. Do đó, việc lưu giữ của các alkaloid ion hóa trên cột RP phụ thuộc nhiều
vào thành phần của hệ pha động cùng với tỷ lệ phần trăm dung môi hữu cơ.
Hơn nữa, khả năng lưu giữ của các alkcaloid có liên quan chặt chẽ với đặc tính
kỵ nước của chúng trên cột pha đảo. Khi các alkaloid bị ion hóa trong điều kiện
môi trường axit, chúng trở nên ít kỵ nước hơn. Nói cách khác, các alkaloid có
xu hướng dễ dàng thu được proton và trở nên ion hóa trong môi trường axit. Do
đó, thời gian lưu giữ của chúng trên cột pha đảo giảm đáng kể khi pH thấp hơn.
Tuy nhiên, berberin dạng bazơ là ion nên ở pH axit sẽ có dạng phân tử trung
hòa.
- Khi phân tích được thực hiện ở pH trung tính hoặc bazơ vừa phải, cả dạng
proton hóa và dạng bazơ tự do của alkaloid do alkaloid proton hóa một phần có
thể cùng tồn tại, dẫn đến hình dạng pic không đều. Trong môi trường kiềm, các
alkcaloid protoberberin bậc bốn có thể được chuyển thành bazơ tự do của chúng
(dạng ion hóa) [20]
- Do đó, việc sử dụng pha động có tính axit nói chung là thích hợp trong phân
tích HPLC của alkaloid cụ thể là berberin.
- Đối với berberin, ta có phương trình Henderson Hasselbalch như sau:
pH = pKa+log ( dạngdạng
không ion hóa )
ion hóa
Cụ thể, với nguyên liệu kiểm nghiệm ban đầu là berberin clorid (pKa=2,5) thì
việc chuyển về môi trường axit theo phương trình Henderson Hasselbalch sẽ
chuyển hóa hết về một dạng muối không tan, điều đó sẽ cho ra pic gọn đẹp hơn,
không bị kéo đuôi. Do đó nhóm thực hiện thử nghiệm ở pH 2,5 và 3,5 để tối ưu
hóa điều kiện sắc kí.
32
1800 1800
DAD-CH1 345 nm
131021_40A60 BUFFER 25_F1 (TEST MP)
Name
Area
1400
Asymmetry
1200 1200
1000 1000
mAU
mAU
800 800
600 600
400 400
200 200
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7
Minutes
8 9 10 11 12 13 14 15
Hình
4.7. Sắc kí đồ của berberin ở pH 2,5
* Tên sắc ký đồ (Name); Thời gian lưu (Retention time); Diện tích pic (Area), Số đĩa
lý thuyết (Theoretical plates (USP)); Hệ số dung lượng (Capacity factor); Hệ số bất
đối (Asymmetry).
33
Thực tế hình ảnh pic chạy ra:
1800 1800
DAD-CH1 345 nm
Name
Berberin 8.233 16059202 3205 7.23333 1.17075

Area
1400
Asymmetry
1200 1200
1000 1000
mAU
mAU
800 800
600 600
400 400
200 200
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
Hình 4.8. Sắc kí đồ của berberin ở pH 3,5

Bàn luận:
- Ở pH 2,5 không thu được pic của berberin có thể do những lý do sau:
+ Tiêm nhầm mẫu dung môi.
+ Hệ thống máy bị nghẹt.
Từ đó, nhóm đã rút kinh nghiệm như sau:
- Kỹ thuật viên nên kiểm tra máy trước khi chạy mẫu, đảm bảo đã rửa giải hết
và loại hết mẫu được chạy trước đó để tránh hệ thống máy nghẹt.
- Kiểm tra vị trí để vial trước khi tiến hành sắc ký.
- Ở pH 3,5 cho hình dạng pic mũi nhọn, cân đối, ít bị kéo đuôi với những thông
số As (1,17075), k’ (7,2333), N (3205) nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Vì
những lý do đó, pH ở 3,5 là pH tối ưu trong điều kiện thực tế của thử nghiệm
này.
4.2. Chứng minh tính đặc hiệu
Điều kiện sắc ký tối ưu để xác định tính đặc hiệu của phương pháp:
- Pha tĩnh: Cột Phenyl-hexyl (250x4.6mm, 4μm)
- Pha động: CAN - Buffer pH 3,5 (65:35)
34
- Nhiệt độ cột: 25℃
- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
- Thể tích tiêm: 20 μL
- Dung môi pha mẫu: MeOH
- Đầu dò: PDA
Tiến hành thẩm định quy trình trên máy HPLC/PDA về tính đặc hiệu với các
mẫu tiêm sau:
- Mẫu 1 (Dung môi pha mẫu): MeOH lọc qua màng lọc milipore 0,45 𝜇𝑚 vào
vial.
- Mẫu 2 (Dung môi pha động): ACN - Buffer pH 3.5 (65:35), lọc qua màng lọc
milipore 0,45 𝜇m vào vial.
- Mẫu 3 (Mẫu chuẩn): Cân chính xác khoảng 5 mg berberin chuẩn cho vào bình
định mức 100 ml. Thêm vào bình 50 ml dung môi pha mẫu (MeOH), lắc đều.
Đánh siêu âm trong 15 phút để hòa tan. Bổ sung vừa đủ bằng MeOH lắc đều.
Dung dịch chuẩn thu được có nồng độ berberin 50 ppm. Lọc qua màng lọc
milipore 0,45 𝜇𝑚 vào vial.
- Mẫu 4 (Mẫu thử): Cân chính xác khoảng 5 mg berberin bột nguyên liệu cho
vào bình định mức 100 ml. Thêm vào bình 50 ml dung môi pha mẫu (MeOH),
lắc đều. Đánh siêu âm trong 15 phút để hòa tan. Bổ sung vừa đủ bằng MeOH,
lắc đều. Dung dịch thử thu được có nồng độ berberin 50 ppm. Lọc qua màng lọc
milipore 0,45 𝜇𝑚 vào vial.
- Mẫu 5 (Mẫu thử thêm chuẩn): lấy 10 ml dung dịch thử (mẫu 4) và 10 ml dung
dịch chuẩn (mẫu 3) cho vào becher, sau đó đem cô cách thủy ở 70 oC đến khi thể
tích còn 10 ml, để nguội. Lọc qua màng lọc milipore 0,45 𝜇𝑚 vào vial.
-Mẫu 6 (Mẫu gây sốc): Mẫu chuẩn được gây sốc bằng các tác nhân như nhiệt
độ, ánh sáng, chất oxy hóa (H2O2), acid mạnh (HCl), base mạnh (NaOH).
a. Mẫu gây sốc bằng nhiệt độ: lấy khoảng 5-10ml dung dịch chuẩn (mẫu 3) cho
vào becher rồi để vào tủ sấy ở nhiệt độ 90-100 oC trong 120 phút. Sau đó cho
vào vial.
35
b. Mẫu gây sốc bằng ánh sáng (dùng tia UV): lấy khoảng 5-10ml dung dịch
chuẩn (mẫu 3) cho vào becher rồi đặt vào máy UV rồi chỉnh bước sóng 254 nm
trong 120 phút. Sau đó cho vào vial.
c. Mẫu gây sốc bằng chất oxy hóa mạnh: hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn
(mẫu 3) và 5ml dung dịch H2O2 30% cho vào becher, khuấy đều, để yên trong
khoảng 120 phút. Lọc qua màng lọc milipore 0,45 𝜇𝑚 vào vial.
d. Mẫu gây sốc bằng acid mạnh: hút chính xác 5 ml dung dịch chuẩn (mẫu 3) và
5 ml dung dịch HCl 1N cho vào becher, khuấy đều, để yên trong khoảng 120
phút. Lọc qua màng lọc milipore 0,45 𝜇𝑚 vào vial.
e. Mẫu gây sốc bằng base mạnh: hút chính xác 5 ml dung dịch chuẩn (mẫu 3) và
5 ml dung dịch NaOH 1N cho vào becher, khuấy đều, để yên trong khoảng 120
phút. Lọc qua màng lọc milipore 0,45 𝜇𝑚 vào vial.
Sau khi tiến hành tiến hành phân tích các mẫu trên, nhóm thu được các kết quả
như Hình 4.9; Hình 4.10; Hình 4.11; Hình 4.12.
Hình 4.9. Overlay sắc ký đồ mẫu dung môi pha động (a), dung môi pha mẫu (b),
mẫu thử thêm chuẩn (c), mẫu thử (d) và mẫu chuẩn (e)
36
Hình 4.10. Sắc ký đồ ở chế độ mixed-view của mẫu chuẩn berberin
Hình 4.11. Sắc ký đồ ở chế độ mixed-view của mẫu thử berberin
37
Hình 4.12. Phổ UV của mẫu thử và sự tương đồng giữa phổ UV của mẫu thử và
mẫu chuẩn
Nhận xét:
- Sắc ký đồ mẫu dung môi pha động và dung môi pha mẫu: không xuất hiện pic
ở khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu chuẩn: xuất hiện một pic cao, có hình dạng rõ ràng ở thời gian
lưu tR=6,620 phút  pic của berberin.
- Sắc ký đồ mẫu thử: xuất hiện một pic có hình dạng rõ ràng, tách hoàn toàn
khỏi pic tạp lạ, ở khoảng thời gian lưu tương ứng so với thời gian lưu mẫu
chuẩn (Mẫu thử: tR=6,640 phút, mẫu chuẩn: tR=6,620 phút)  dự đoán trong
mẫu thử có berberin.
- Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn: xuất hiện một pic có hình dạng rõ ràng ở thời
gian lưu tương ứng so với thời gian lưu mẫu chuẩn và mẫu thử (t R=6,527 phút).
Đồng thời, diện tích đỉnh của pic tăng lên rõ rệt so với trước khi thêm chất
chuẩn (Mẫu thử là S = 9696923 mAu.phút, mẫu thử thêm chuẩn là S =
29354433 mAu.phút)  trong mẫu thử có chứa berberin.
38
- Phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn có sự tương đồng là 1.0000 nên trong mẫu
thử có chứa berberin. (Hình 4.13)
Hình 4.13. Pic purity của mẫu thử

Nhận xét:
- % tinh khiết pic Berberin được tính ở chế độ Max plot dựa trên phương pháp
quy về 100% diện tích pic, với kết quả:
S berberin
- % tinh khiết trung bình của berberin = X100% = 100%
S
Với: Sberberin là diện tích pic berberin ở chế độ Max plot.
S là tổng diện tích tất cả các pic ở chế độ Max plot trừ pic dung môi và các pic
dưới ngưỡng (≤0.05% tổng diện tích pic).
Vậy, kết quả kiểm tra độ tinh khiết trên HPLC/PDA đạt độ tinh khiết cao
(100%).
Mẫu gây sốc bằng UV (Hình 4.14)
39
Hình 4.14. Mẫu chuẩn gây sốc bằng UV (đỏ) và mẫu chuẩn berberin (xanh lá)
Nhận xét: So sánh 2 đường chuẩn ta nhận thấy không có sự xuất hiện của pic
mới đồng thời pic của berberin không khác nhau giữa 2 mẫu (thời gian lưu
tương đương nhau, tR mẫu gây sốc =6,507 phút, tR mẫu chuẩn =6,62 phút) chứng tỏ mẫu
gây sốc bởi UV không sinh ra tạp chất và berberin không bị tác động bởi UV.
Vậy, mẫu phân tích berberin bền và không bị phân hủy bởi UV.
Mẫu gây sốc bằng nhiệt độ (Hình 4.15)
Hình 4.15. Mẫu chuẩn gây sốc bằng nhiệt độ (hồng) và mẫu chuẩn berberin
(xanh lá)
40
Nhận xét: So sánh 2 đường chuẩn, ta nhận thấy không có sự xuất hiện của pic
mới đồng thời pic của berberin không khác nhau giữa 2 mẫu (thời gian lưu
tương đương nhau, tRmẫu gây sốc là 6,427 phút, tRmẫu chuẩn là 6,62 phút) chứng tỏ mẫu
gây sốc bởi nhiệt không sinh ra tạp chất và berberin không bị tác động bởi nhiệt
độ. Tuy nhiên ở mẫu gây sốc có sự tăng cao rõ ràng của diện tích đỉnh. Điều
này có thể lý giải rằng do đặt mẫu ở nhiệt độ cao làm lượng dung môi hòa tan
mẫu giảm đi đáng kể, dẫn đến sự tăng nồng độ của hoạt chất có trong mẫu và
diện tích pic tăng lên so với mẫu chuẩn.
Vậy, mẫu phân tích berberin bền và không bị phân hủy bởi nhiệt độ 90 oC trong
vòng 120 phút.
Mẫu gây sốc bằng chất có tính oxy hóa mạnh (dung dịch H2O2) (Hình 4.16)
Hình 4.16. Mẫu chuẩn gây sốc bằng chất oxy hóa mạnh H2O2 (xanh dương) và
mẫu chuẩn berberin (xanh lá)
Nhận xét: So sánh 2 đường chuẩn, ta nhận thấy không có sự xuất hiện của pic
mới đồng thời pic của Berberin không khác nhau (thời gian lưu tương đương
nhau, tRmẫu gây sốc = 6,513 phút, tRmẫu chuẩn =6,62 phút) giữa 2 mẫu chứng tỏ mẫu gây
sốc bởi H2O2 không sinh ra tạp chất và berberin không bị tác động bởi H 2O2.
Ngoài ra, ta nhận thấy diện tích pic của mẫu gây sốc giảm đi khoảng 1 nửa so
với pic của mẫu chuẩn, điều này có thể lí giải rằng do quá trình chuẩn bị mẫu
41
gây sốc bằng các lấy đồng lượng mẫu thử và dung dịch H 2O2 đã dẫn đến nồng
độ berberin bị pha loãng.
Vậy, mẫu phân tích berberin bền và không bị phân hủy bởi H2O2.
Mẫu gây sốc bằng chất có tính acid mạnh (dung dịch HCl 1N) (Hình 4.17)
Hình 4.17. Mẫu chuẩn gây sốc bằng chất có tính acid mạnh HCl (xanh dương) và
mẫu chuẩn berberin (xanh lá)
Nhận xét: So sánh 2 đường chuẩn ta nhận thấy không có sự xuất hiện của pic
mới đồng thời pic của Berberin không khác nhau giữa 2 mẫu (thời gian lưu
tương đương nhau: tRmẫu gây sốc là 6,54 phút, tRmẫu chuẩn là 6,62 phút) chứng tỏ mẫu
gây sốc bởi HCl không sinh ra tạp chất và berberin không bị tác động bởi acid.
Ngoài ra, ta nhận thấy diện tích pic của mẫu gây sốc giảm đi khoảng 1 nửa so
với pic của mẫu chuẩn, điều này có thể lí giải rằng do quá trình chuẩn bị mẫu
42
gây sốc bằng các lấy đồng lượng mẫu thử và dung dịch HCl đã dẫn đến nồng độ
berberin bị pha loãng đi.
Kết luận: mẫu phân tích berberin bền và không bị phân hủy bởi acid.
Mẫu gây sốc bằng dung dịch có tính base mạnh ( dung dịch NaOH 1N) (Hình
4.18)
Hình 4.18. Mẫu chuẩn gây sốc bởi chất có tính base mạnh NaOH (tím) và mẫu
chuẩn berberin (xanh lá)
Nhận xét: Sắc ký đồ của hai mẫu chuẩn và mẫu gây sốc cho thấy trong mẫu
gây sốc có pic xuất hiện tại thời gian lưu vào khoảng phút thứ 7,98. Trong khi
đó pic của berberin chuẩn có tR vào khoảng 6,62 phút. Từ đó, nhóm kết luận
rằng berberin trong mẫu chuẩn bị biến đổi bởi NaOH 1N tạo ra sản phẩm mới
có tín hiệu tách biệt tương đối so với pic berberin chuẩn.
Vậy, mẫu phân tích berberin bị biến đổi trong môi trường kiềm nhưng vẫn đảm
bảo độ đặc hiệu của quy trình.
KẾT LUẬN:
Theo các sắc ký đồ ghi nhận được từ các mũi tiêm là dung môi pha mẫu, dung
môi pha động, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu gây sốc (bởi
các tác nhân UV, nhiệt độ, acid, base, chất oxy hóa mạnh), có thể kết luận được
rằng pic của mẫu thử và chuẩn có thời gian lưu tương tự nhau và đó cũng là
43
đỉnh hấp thu của hoạt chất chính (berberin), pic của mẫu thử đạt độ tinh khiết
theo yêu cầu. Sắc kí đồ của các mẫu dung môi không xuất hiện pic ở thời gian
lưu lân cận với pic hoạt chất, đồng thời tạp chất hay hoạt chất phân hủy ra (nếu
có) do các tác nhân gây sốc có pic tách riêng rẽ ra khỏi pic của hoạt chất và kết
quả định lượng không bị ảnh hưởng. Vậy, quy trình định lượng bằng
HPLC/PDA có tính đặc hiệu với berberin trong bột nguyên liệu thử nghiệm.
4.3. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính
Tiến hành:
Pha dung dịch chuẩn gốc berberin 500 ppm (A): Cân chính xác khoảng 25 mg
bột nguyên liệu berberin cho vào bình định mức 50 mL, hòa tan vừa đủ với
methanol.
Pha dung dịch chuẩn thứ cấp berberin 100 ppm (B): Hút chính xác 20 mL dung
dịch (A) cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng vừa đủ bằng methanol.
Pha 6 mẫu thử (dung dịch chuẩn với các nồng độ 10, 20, 40, 50, 60, 80 ppm)
bằng cách pha loãng dung dịch (B) với methanol: Hút chính xác 10 mL dung
dịch (B) cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ với methanol. Dung
dịch thu được có nồng độ 10 ppm. Tiến hành pha loãng tương tự để để thu được
các dung dịch còn lại. Lọc các dung dịch có nồng độ 10 – 80 ppm qua màng lọc
millipore 0.45 μm vào các vial và tiến hành sắc ký 6 mẫu thử này. Kết quả được
trình bày trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả phân tích tính tuyến tính
Nồng độ Diện tích đỉnh
10 2407219
20 4263409
40 8203090
50 10952432
60 12735095
80 16822217
44
DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm
141021_CHUAN10PPM_N2DK43 141021_CHUAN20PPM_N2DK43 141021_CHUAN40PPM_N2DK43 141021_CHUAN50PPM_N2DK43 141021_CHUAN60PPM_N2DK43 141021_CHUAN80PPM_N2DK43
a 450 Name
Retention Time
450
Area
8.247 16822217
400 400
350 350
Berberin
300 300
250 250
mAU
mAU
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Minutes
DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm DAD-CH1 345 nm
b
141021_CHUAN10PPM_N2DK43 141021_CHUAN20PPM_N2DK43 141021_CHUAN40PPM_N2DK43 141021_CHUAN50PPM_N2DK43 141021_CHUAN60PPM_N2DK43 141021_CHUAN80PPM_N2DK43
Area Name Name Name Name Name
Name Retention Time Retention Time Retention Time Retention Time
Retention Time Area Area Area Area Area
Theoretical plates (USP) Theoretical plates (USP) Theoretical plates (USP) Theoretical plates (USP) Theoretical plates (USP) Theoretical plates (USP)
Capacity factor
Capacity factor Capacity factor Capacity factor Capacity factor Capacity factor
Resolution (USP)
Resolution (USP) Resolution (USP) Asymmetry Resolution (USP) Resolution (USP) Resolution (USP)
Asymmetry Asymmetry Asymmetry Asymmetry Asymmetry
1200 1200
0.00000 1.15479
1.15379
0.00000
1000 1000
1.12924
0.00000 1.14596
3072 7.24667
3050 7.24667
0.00000
1.12754
800 800
1.12489
8.247 16822217
3053 7.25333
mAU
mAU
3069 7.25333
0.00000
8.247 12735095
0.00000
600 600
2987 7.22000
8.253 10952432
8.240 2994 7.24000
Berberin
8.253 8203090
Berberin
8.220 4263409
400 400
Berberin
Berberin
Berberin
Berberin
200 200
2407219
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Minutes
Hình 4.19. (a, b). Sắc ký đồ của 6 mẫu thử ở nồng độ 10, 20, 40, 50, 60, 80 ppm
Từ kết quả phân tích, tiến hành xây dựng đường tuyến tính và đánh giá sự phù hợp
của đường tuyến tính bằng công cụ Microsoft Excel 2013.
45
Hình 4.20. Đường tuyến tính biểu diễn diện tích đỉnh theo nồng độ chất chuẩn
Kiểm tra sự phù hợp của phương trình hồi quy và các hệ số hồi quy
Phương trình hồi quy được kiểm tra sự phù hợp và ý nghĩa của các hệ số a, b
trong phương trình bằng phân tích Regression trong Microsoft Excel 2013, kết
quả được trình bày ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3. Phân tích tính tuyến tính
SD tín
250434.7922
hiệu
R2 0.9983 >0.995
FTN 2310.6 > F0,05(1,4) = 7.7086
ta 48.0687 > t0,05(4) = 2.2764
tb 0.912902 < t0,05(4) = 2.2764
Phương trình tuyến tính y=208506 x
Khoảng tuyến tính 10 – 80 ppm
KẾT LUẬN: Quy trình định lượng đạt tính tuyến tính và có phương trình là
y=208506 x trong khoảng nồng độ 10 – 80 ppm.
46
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định bằng 2
phương pháp:
- Phương pháp 1: Dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn.
- Phương pháp 2: Dựa vào tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N –signal to noise ratio).
a. Phương pháp dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn
LOD và LOQ có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch
chuẩn của tín hiệu đo, được tính theo công thức sau:
3.3 × SD
LOD=
a
10 × SD
LOQ=
a
Trong đó: SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu
a: độ dốc của đường chuẩn
Độ dốc đường chuẩn được xác định dựa vào phương trình hồi quy được xây
dựng ( y=208506 x ):
a=208506 .
Độ lệch chuẩn của tín hiệu đo được tính toán dựa vào kết quả ghi nhận được khi
sắc ký 6 mẫu thử là các dung dịch chuẩn nồng độ 10 – 80 ppm và được thể hiện
ở Bảng 4.4: SD=250434.7922.
Kết quả:
3,3 × 250434.7922
LOD= ≈ 3.96 ppm
208506
10 × 250434.7922
LOQ= ≈12.01 ppm
208506
Phương pháp tính này là một phương pháp ngoại suy, do đó để khẳng định các
giá trị tính toán trên là chính xác, chúng tôi dự định tiến hành sắc ký dung dịch
chuẩn ở các nồng độ LOD = 3.96 ppm, LOQ = 12.01 ppm và quan sát tỷ lệ tín
hiệu trên nhiễu S/N. Tuy nhiên vì một số điều kiện khách quan (hết dung môi
pha động), nhóm chỉ có thể phân tích thêm 2 mẫu chuẩn với nồng độ 1 ppm và
47
5 ppm để khẳng định lại giá trị LOD, và dùng sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
nồng độ 10 ppm để khẳng định lại giá trị LOQ. Kết quả LOD, LOQ xác định
bằng phương pháp dựa vào S/N này được trình bày ở phần b bên dưới đây.
b. Phương pháp dựa vào tỷ lệ đáp ứng S/N
LOD và LOQ được xác định dựa trên trên tỉ lệ tín hiệu chất phân tích chia cho
nhiễu nền (S/N).
- LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ đáp ứng S/N nằm giữa 3:1 hoặc 2:1.
- LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ đáp ứng S/N là khoảng 10:1.
Tiến hành pha thêm 2 dung dịch chuẩn nồng độ 1 ppm và 5 ppm: Dùng micro
pipet hút chính xác 1 mL dung dịch (B) cho vào bình định mức 100 mL, pha
loãng với methanol thu được dung dịch có nồng độ 1 ppm. Để pha dung dịch
nồng độ 5 ppm hút chính xác 5 mL dung dịch (B) bằng pipet chính xác và cho
vào bình định mức 100 mL, điền vừa đủ bằng methanol. Lọc qua màng lọc
millipore 0.45 μm vào các vial.
Tiến hành sắc ký 2 dung dịch chuẩn trên, đồng lấy thêm kết quả sắc ký dung
dịch nồng độ 10 ppm để đánh giá S/N.
Giới hạn phát hiện (LOD):
Với sắc ký đồ của dung dịch 5 ppm thể hiện ở Hình 4.21, tỷ lệ S/N là khoảng
6.3, giá trị này cao gấp đôi so với S/N quy định tại nồng độ LOD (S/N = 3:1)
nên ở nồng độ 5 ppm không phải là LOD. Chúng tôi dự đoán LOD nằm ở
khoảng nồng độ từ 2.5 – 5 ppm.
48
200 200
DAD-CH1 345 nm
141021_CHUAN5PPM_N2DK43
Area
180 Name 180
Retention Time
1202401 Berberin 8.307 3044 7.30667 0.00000 1.09608 6.285176

Capacity factor
160 160
Resolution (USP)
Asymmetry
S/N (6 sigma)
140 140
120 120
100 100
mAU
mAU
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Minutes
Hình 4.21. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 5 ppm để xác định S/N

Hình 4.22 cho thấy sắc ký đồ của dung dịch 1 ppm có S/N rơi vào khoảng 1.3,
thấp hơn giá trị S/N quy định ở LOD, đồng thời không còn ghi nhận được pic của
berberin. Suy ra, nồng độ LOD có thể sẽ phải cao hơn 1 ppm. Điều này đã củng cố
thêm cho dự đoán LOD nằm trong khoảng 2.5 – 5 ppm.
200 200
DAD-CH1 345 nm
Area
180 Name 180
Retention Time
Capacity factor
160 160
221362 Berberin 8.340 3468 7.34000 0.00000 1.08296 1.298736
Resolution (USP)
Asymmetry
S/N (6 sigma)
140 140
120 120
100 100
mAU
mAU
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Minutes
49
Giới hạn định lượng (LOQ): Để xác định nồng độ LOQ, sắc ký đồ dung dịch
chuẩn 10 ppm với S/N được thể hiện ở Hình 4.23. S/N ghi nhận được là 12.4
cao hơn tiêu chuẩn S/N ở nồng độ LOQ (S/N = 10:1). Vì vậy, nếu dự đoán nồng
độ LOQ theo phương pháp này thì LOQ có thể sẽ nằm trong khoảng thấp hơn
10 ppm.
200 200
DAD-CH1 345 nm
Area
2407219 Berberin 8.240 2994 7.24000 0.00000 1.12754 12.406101

180 Name 180
Retention Time
Capacity factor
160 160
Resolution (USP)
Asymmetry
S/N (6 sigma)
140 140
120 120
100 100
mAU
mAU
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Minutes

c. So sánh kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng xác định bằng
2 phương pháp khác nhau (Bảng 4.4)
Bảng 4.4. LOD và LOQ xác định bằng phương pháp 1 và phương pháp 2
Phương pháp 1 Phương pháp 2
LOD 3,96 ppm 2,5 – 5 ppm
LOQ 12,01 ppm < 10 ppm
Nhận xét: Kết quả cho thấy nồng độ LOD có sự tương đồng, tuy nhiên nồng độ
LOQ lại có sự mâu thuẫn khi so sánh giữa 2 phương pháp. Nguyên nhân của sự
khác biệt này có thể là do chỉ tiến hành tiêm các mẫu thử 1 lần nên các số liệu
dùng cho tính toán (SD, a, S/N) chưa thật sự gần với các giá trị thực.
50
Tuy nhiên, phương pháp 2 đã xác định LOD, LOQ dựa trên đánh giá tỷ lệ S/N
thu được từ thực nghiệm đo lường, nên kết quả của phương pháp này có thể sẽ
tin cậy hơn so với kết quả ngoại suy tính toán của phương pháp 1. Vì vậy, dựa
vào phương pháp 2, nhóm chấp nhận giới hạn phát hiện của phương pháp là 5
ppm, giới hạn định lượng của phương pháp là 10 ppm do: mẫu thử ở 2 nồng độ
này được tiến hành sắc ký để khẳng định lại kết quả ngoại suy của phương pháp
1, đồng thời ở 2 nồng độ này cũng cho S/N phù hợp.
KẾT LUẬN: Dựa vào kết quả thu được LOD = 5 ppm và LOQ = 10 ppm, giới
hạn phân tích và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích thấp và có độ
nhạy cao.
So sánh kết quả thực nghiệm với một số nghiên cứu khác (Bảng 4.5)
Bảng 4.5. So sánh kết quả thực nghiệm với một số nghiên cứu khác
KHOẢNG
ST PHƯƠNG LOD LOQ
TÊN NGHIÊN CỨU TUYẾN
T PHÁP (ppm) (ppm)
TÍNH (ppm)
Định lượng Berberin

1 có trong bột nguyên HPLC-PDA 10 – 80 3,96 12,01
liệu Berberin
Phân tích định lượng
Berberin trong công
UV- Vis
2 thức Homeopathic 10-50 51,89 157,26
(424 nm)
chứa Berberis vulgaris
L. bằng UV[18]
3 Xác định và phát triển HPLC – 10-30 0.19 0.59
các phương pháp phân UV/VIS
tích để định lượng (288 nm)
Berberin
Hydrochloride và
51
Embelin trong công
thức Polyherbal[13]
Nhận xét: Kết quả khoảng tuyến tính của nhóm rộng hơn so với cả 2 nghiên
cứu và kết quả LOD và LOQ nhóm xác định được cao hơn so với nghiên cứu
[19] và thấp hơn so với nghiên cứu [14]. Một số nguyên nhân có thể kể đến là
do sự khác biệt về điều kiện thí nghiệm phương pháp, thiết bị, hóa chất, nền
mẫu thực hiện và quy trình xử lý mẫu. Cụ thể, nhóm tác giả Ramdoss
Karthikeyan và cộng sự sử dụng phương pháp UV-Vis để định lượng trên nền
mẫu dược liệu Berberis vulgaris L. tại bước sóng 424 nm và nhóm tác giả
Ankita V Gondaliya và cộng sự dùng phương pháp HPLC đầu dò UV-Vis để
định lượng berberin hydrochloride trên nền mẫu là công thức Polyherbal tại
bước sóng 288 nm với pha tĩnh là pha thuận, pha động là hệ 0,1% trifluroacetic
acid:methanol chương trình gradient, những sự khác biệt dẫn đến các kết quả
khác nhau. Tuy nhiên, kết quả khoảng tuyến tính, LOD, LOQ của quy trình
định lượng berberin mà nhóm phát triển vẫn đáp ứng tốt các yêu cầu trong
nghiên cứu ứng dụng, định lượng các mẫu thực tế.
52
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN
Hiện nay, với tiềm năng ứng dụng cao của Berberin trong lĩnh vực y tế, với nhiều
hoạt tính sinh học đã được báo cáo như tác dụng trên hệ tiêu hóa, tim mạch, tác dụng
chống ung thư, chống viêm, hạ lipid máu, hạ đường huyết,... thì việc kiểm nghiệm chất
lượng của dược phẩm nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho người sử dụng
rất quan trọng, trong đó, kiểm nghiệm hàm lượng dược chất có trong nguyên liệu làm
thuốc cũng là một vấn đề đáng quan tâm. Hiện nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao ghép với đầu dò PDA là một trong những phương pháp hàng đầu trong định lượng
dược chất nói chung và Berberin trong nguyên liệu thuốc nói riêng. Với mong muốn
góp phần tìm kiếm quy trình phù hợp để kiểm nghiệm nguyên liệu dược phẩm thì việc
thẩm định quy trình phân tích để chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích
ứng dụng hay không là rất cần thiết. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài này để khảo sát
điều kiện sắc ký tối ưu và thực hiện thẩm định quy trình đề ra để chứng minh phương
pháp đáp ứng yêu cầu phân tích.
Bước đầu tiên cũng là bước quan trọng nhất của việc phát triển và thẩm định quy
trình định lượng bằng phương pháp sắc ký là thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu. Nhóm
chúng tôi đã tiến hành khảo sát điều kiện pha tĩnh tối ưu bằng việc dựa vào độ phân
cực của Berberin, đã tìm ra cột Phenylhexyl có 0,8As1,2 và N>2000 đảm bảo hiệu
suất tách của cột. Dựa vào các tính chất lý hóa về độ tan và pKa của berberin, các dung
môi đươc đề xuất làm dung môi pha động bao gồm: MeOH, ACN, H2O, dung dịch
đệm pH 3,5 (Buffer pH 3,5). Tiến hành khảo sát với 3 hệ dung môi khác nhau, được cố
định tỉ lệ dung môi là A‒B (80:20), chúng tôi đánh giá kết quả dựa vào các thông số
sắc ký đặc trưng cho HPLC, sự tách và hình dạng các pic, nhận thấy rằng hệ dung môi
ACN‒Buffer pH 3,5 là tối ưu nhất trong 3 hệ dung môi khảo sát. Đặc biệt với thông số
thời gian lưu và hệ số dung lượng, hệ dung môi này có thể có khả năng cao trong việc
tách pic berberin khỏi các pic của những thành phần khác (dung môi, tạp). Chúng tôi
đã tìm được tỷ lệ dung môi pha động tối ưu nhất cho hệ dung môi ACN‒Buffer pH 3,5
là 80:20. Giá trị pH của pha động là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong quá
trình phân tách các alkaloid trên HPLC pha đảo. Khả năng lưu giữ của các alkcaloid có
53
liên quan chặt chẽ với đặc tính kỵ nước của chúng trên cột pha đảo. Khi các alkaloid bị
ion hóa trong điều kiện môi trường axit, chúng trở nên ít kỵ nước hơn. Do đó, thời
gian lưu giữ của chúng trên cột pha đảo giảm đáng kể khi pH thấp hơn. Chúng tôi
cũng đã tìm được pH ở 3,5 là pH tối ưu trong điều kiện thực tế của thử nghiệm này.
Kế tiếp, chúng tôi tiến hành chứng minh tính đặc hiệu của phương pháp. Theo
các sắc ký đồ ghi nhận được từ các mũi tiêm là dung môi pha mẫu, dung môi pha
động, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu gây sốc (bởi các tác nhân UV,
nhiệt độ, acid, base, chất oxy hóa mạnh), có thể kết luận được rằng pic của mẫu thử và
chuẩn có thời gian lưu tương tự nhau và đó cũng là đỉnh hấp thu của hoạt chất chính
(berberin), pic của mẫu thử đạt độ tinh khiết theo yêu cầu. Sắc kí đồ của các mẫu dung
môi không xuất hiện pic ở thời gian lưu lân cận với pic hoạt chất, đồng thời tạp chất
hay hoạt chất phân hủy ra (nếu có) do các tác nhân gây sốc có pic tách riêng rẽ ra khỏi
pic của hoạt chất và kết quả định lượng không bị ảnh hưởng. Vậy, quy trình định
lượng bằng HPLC/PDA có tính đặc hiệu với berberin trong bột nguyên liệu thử
nghiệm.
Sau đó, chúng tôi xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và dự đoán LOD,
LOQ của quy trình định lượng Berberin. Tiến hành chuẩn bị dãy 6 mẫu chuẩn bằng
cách pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu với hệ số pha loãng khác nhau, tiến hành sắc ký
các mẫu, xác định đáp ứng pic và phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan
tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh. Chúng tôi nhận thấy quy trình định lượng
đạt tính tuyến tính và có phương trình là y=208506 x trong khoảng nồng độ 10 – 80
ppm. Chúng tôi cũng tiến hành dự đoán LOD, LOQ dựa trên 2 phương pháp: Dựa vào
đường tuyến tính, độ lệch chuẩn và dựa vào tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N –signal to
noise ratio). Tuy nhiên, phương pháp 2 đã xác định LOD, LOQ dựa trên đánh giá tỷ lệ
S/N thu được từ thực nghiệm đo lường, nên kết quả của phương pháp này có thể sẽ tin
cậy hơn so với kết quả ngoại suy tính toán của phương pháp 1. Vì vậy, dựa vào
phương pháp 2, nhóm chấp nhận giới hạn phát hiện của phương pháp là 5 ppm, giới
hạn định lượng của phương pháp là 10 ppm do: mẫu thử ở 2 nồng độ này được tiến
54
hành sắc ký để khẳng định lại kết quả ngoại suy của phương pháp 1, đồng thời ở 2
nồng độ này cũng cho S/N phù hợp.
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội
2. Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội
3. Bộ Y tế (2014), “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân
tích”,Thông tư 44/2014/TT-BYT Quy định việc đăng ký thuốc, tr.261-274.
4. Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn Văn Thuận,
Nguyễn Cẩm Vân, Nguyễn Tuấn Quang (2015), “Nghiên cứu định lượng
berberin chlorid trong “viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao”, Tạp chí y - dược học quân sự, 2, pp.75-80.
5. Phan Thị Trang, Nguyễn Thị Thu Trang, Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Quỳnh
Nga Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Văn Tài (2019), “Định lượng berberin trong
một số mẫu dược liệu bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí dược liệu, 24(1), pp.
28-33.
6. Quyết định của Cục trưởng Cục Quản lý Dược (2013), Sổ tay hướng dẫn đăng
ký thuốc, Quyết định số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013, phụ lục 8.
TIẾNG ANH
7. Anubhuti Pasrija, Rahul Singh, Chandra Kant Katiyar (2010),“Validated
HPLC-UV method for the determination of berberin in raw herb Daruharidra
(Berberis aristata DC), its extract, and in commercially marketed Ayurvedic
dosage forms”, Int J Ayurveda Res, 1(4),pp.243–246
8. Bae FA, Han MJ, Kim NJ, Kim DH, (1998), “Anti-Helicobacter pylori activity
of herbal medicines”, Biol Pharm Bull, 21(9), pp. 990– 992.
9. Bharathi Avula, Yan-Hong Wang, Ikhlas A Khan (2012), “Quantitative
Determination of Alkaloids from Roots of Hydrastis canadensis L. and Dietary
Supplements Using Ultra-Performance Liquid Chromatography with UV
56
Detection”, Journal of AOAC INTERNATIONAL, volume 95, issue 5, pp.
1398–1405
10. British Pharmacopoeia (2018), Herbal Drugs: Herbal Drug Preparations and
Herbal Medicinal Products, Chinese Goldthread Rhizome.
11. China Pharmacopoeia Committee (2005), Pharmacopoeia of the people’s
republic of China, volum 3, pp. 94-96
12. Fogacci F, Grassi D, Rizzo M, Cicero AFG (2019), “Metabolic effect of
berberin-silymarin association: a meta-analysis of randomized, double-blind,
placebo-controlled clinical trials”, Phytother Res, 33(4), pp.862–870.
13. Gao N, Zhao TY, Li XJ (2011), “The protective effect of berberin on b-cell
lipoapoptosis”, J Endocrinol Invest, 34(2), pp.124–130.
14. Gondaliya V. A., Vikani K., Kapupara P. K. (2014), “Development and
validation of analytical method for simultaneous estimation of berberin
hydrochloride and embelin in polyherbal formulation”, International Bulletin of
Drug Research, 4(6), pp.35-44.
15. Han X, Tai H, Wang X, Wang Z, Zhou J, Wei X, Ding Y, Gong H, Mo C,
Zhang J, Qin J, Ma Y, Huang N, Xiang R, Xiao H (2016), “AMPK activation
protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux
restoration and intracellular NAD(+) eleva-tion”, Aging Cell, 15(3), pp.416–
427.
16. Hou D, Xu G, Zhang C, Li B, Qin J, Hao X, Liu Q, Zhang X, Liu J, Wei J,
Gong Y, Liu Z, Shao C (2017), “Berberin induces oxidative DNA damage and
impairs homologous recombination repair in ovarian cancer cells to confer
increased sensitivity to PARP inhibition”, Cell Death Dis, 8(10), pp.3070.
17. ICH Harmonised tripartile guideline (2005), Validation of analytical
procedures: text and methodology, pp.1-3.
18. Jiahui Wang, Yanyan Jiang, Bing Wang, Ning Zhang (2019), “A review on
analytical methods for natural berberin alkaloids”, J Sep Sci,42, pp.1794– 1815.
57
19. Karthikeyan R., Babu C. s, Babu P.S., (2014), “Quantitative analysis of
berberin in homeopathic formulation containing Berberis vulgaris L. by UV”,
Electronic Journal of Biosciences, 02(1), pp. 91-98
20. Kim, Eun-Kyung, Jeong, Eun-Kyung, Han, Sang-Beom, Hong, Jongki (2011),
“HPLC Separation of Isoquinoline Alkaloids for Quality Control of Corydalis
species”, Bulletin of the Korean Chemical Society, 32(10), 3597–3602.
21. Kong W, Wei J, Abidi P, et al (2004), “Berberin is a novel cholesterol-lowering
drug working through a unique mechanism distinct from statins”, Nat Med,
10(12), pp.1344–1351.
22. Kuo CL, Chi CW, Liu TY (2004), “The anti-inflammatory potential of berberin
in vitro and in vivo”, Cancer Lett, 203(2), pp.127–137
23. Kulkarni SK, Dhir A (2008), “On the mechanism of antidepressant like action
of berberin chloride, Eur J Pharmacol, 589, pp.163–172.
24. Li, X., Liu, H., Li, J., Zhao, X., Wang, S., & Zheng, X. (2009), ”Simultaneous
Determination of Berberin and Palmatine in Rabbit Plasma by LC-MS–MS and
Its Application in Pharmacokinetic Study After Oral Administration of Coptidis
and Coptidis–Gardeniae Couple Extract”, Chromatographia, 70(7-8), 1113–
1119.
25. Li Y, Huang J, Li L, Liu L (2017), “Synergistic activity of berberin with
azithromycin against Pseudomonas aeruginosa isolated from patients with
cystic fibrosis of lung in vitro and in vivo”, Cell Physiol Biochem, 42(4),
pp.1657–1669.
26. Liu X, Zhang N, Liu Y, Liu L, Zeng Q, Yin M, Wang Y, Song D, Deng H
(2019), “MPB, a novel berberin derivative, enhances lysosomal and bactericidal
properties via TGF-β-activated kinase 1-depen-dent activating the transcription
factor EB”, Faseb J, 33 (1), pp.1468–1481.
27. Liu, G., He, W., Cai, H., Sun, X., Hou, W., Lin, M., … Liao, Q. (2014), “The
simultaneous determination of berberin, palmatine, coptisine, epiberberin and
jatrorrhizine in rat plasma by LC-MS/MS and a pharmacokinetic comparison
58
after the oral administration of Rhizoma coptidis and Jiao-Tai-Wan extract”
Analytical Methods, 6(9), 2998
28. Moraca F, Amato J, Ortuso F, Artese A, Pagano B, Novellino E, Alcaro S,
Parrinello M, Limongelli V (2017), “Ligand binding to telomeric G-quadruplex
DNA investigated by funnel-metadynamics simulations”, Proc Natl Acad Sci
USA, 114(11), pp.2136–2145.
29. Neag, M. A., Mocan, A., Echeverría, J., Pop, R. M., Bocsan, C. I., Crişan, G., &
Buzoianu, A. D. (2018), Berberin: Botanical Occurrence, Traditional Uses,
Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic,
and Renal Disorders, Frontiers in Pharmacology, 9.
30. Oshiba S, Ueno H, Mihara H, Okamoto S (1974), “Effect of berberin on bile
secretion”, Nihon Univ J Med, 16, pp.69–79.
31. Peng WH, Wu CR, Chen CS et al (2004), “Anxiolytic effect of berberin on
exploratory activity of the mouse in two experimental anxiety models:
interaction with drugs acting at 5-HT receptors”, Life Sci, 75, pp.2451–2462.
32. Pharmacopoeia of the People's Republic of China(ấn bản 5), pp. 875, ISBN:
978-7-5067-7337-9
33. Rabbani GH, Butler T, Knight J, Sanyal SC, Alam K, (1987), “Randomized
controlled trial of berberin sulfate therapy for diarrhea due to enterotoxigenic
Escherichia coli and Vibrio cholerae”, J Infect Dis, 155(5), pp.979–984.
34. Rayasam GV, Tulasi VK, Sundaram S et al (2010), “Identification of berberin
as a novel agonist of fatty acid receptor GPR40”, Phytother Res, 24(8),
pp.1260–1263.
35. Shouzhong Yang (1998), The divine farmer's materia medica: a translation of
the Shen Nong Ben Cao Jing, Boulder, CO: Blue Poppy Press ISBN:
9780936185965, OCLC: 41048949
36. Subbaiah TV, Amin AH (1967), “Effect of berberin sulphate on Entamoeba
histolytica”, Nature, 215(5100), pp.527–528
59
37. Wang S, Setlow B, Setlow P, Li YQ (2016), “Uptake and levels of the
antibiotic berberin in individual dormant and germinating Clostridium difficile
and Bacillus cereus spores as measured by laser tweezers Raman
spectroscopy”, J Antimicrob Chemother, 71(6), pp.1540–1546.
38. Wang Y, Huang Y, Lam KS, Li Y, Wong W, Ye H, Lau CW, Vanhoutte PM,
Xu A (2009), “Berberin prevents hyperglycemia-induced endothelial injury and
enhances vasodilatation via adenosine monophosphate-activated protein kinase
and endothelial nitric oxide synthase”, Cardiovasc Res, 82(3), pp.484–492.
39. Wang Zeng-si LF, Xu L, Dong H (2010), “Berberin reduces endoplasmic
reticulum stress and improves insulin signal transduction in Hep G2 cells” Acta
Pharmacol Sin, 31(5), pp.578–584.
40. Yoo KY, Hwang IK, Lim BO et al (2006), “Berberry extract reduces neuronal
damage and N-Methyl-D-aspartate receptor 1 immunoreactivity in the gerbil
hippocampus after transient forebrain ischemia”, Biol Pharm Bull, 29, pp.623–
628.
41. Zhu F, Qian C (2006), “Berberin chloride can ameliorate the spatial memory
impairment and increase the expression of interleukin-1beta and inducible nitric
oxide synthase in the rat model of Alzheimer’s disease”, BMC Neurosci, 7,
pp.78.
TRANG WEB
42. https://riff.vn/vi/bot-berberin
43. https://text.123docz.net/document/3582302-so-sanh-hai-phuong-phap-dinh-
luong-berberin-nguyen-lieu-bang-hplc-theo-duoc-dien-trung-quoc-2005-va-
bang-do-quang-pho-hap-thu-uv-vis-theo-duoc-dien-viet-nam-iii.htm
60

Báo-cáo-Berberin-1-1 2

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Báo-cáo-Berberin-1-1 2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LỚP DƯỢC K43

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS.TS.ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

CẦN THƠ, NGÀY 24 THÁNG 10 NĂM 2021

2 MAE Microwave-assisted extraction Hỗ trợ vi sóng

3 PLE Pressure Liquid Extraction Chiết xuất chất lỏng có áp

4 SPE Solid Phase Extraction Chiết xuất chất lỏng siêu

5 LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein cholesterol tỷ

6 LOD Limit Of Detection Giới hạn phát hiện

7 LOQ Limit Of Quantitation Giới hạn định lượng

8 LLOQ Lower Limit Of Quatification Giới hạn định lượng dưới

9 GC Gas Chromatography Sắc ký khí

10 LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng

12 TLC Thin layer Chromatoprophy Sắc ký lớp mỏng

13 CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

Hiệu quả tách cao, độ nhạy cao,

Tách hiệu quả cao, nhanh hơn

3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH

Retention Time Retention Time

1400 Asymmetry 1400

Khảo sát dung môi pha động tối ưu

Berberin 3.133 15868817 2659 2.13333 1.20583

B erb erin8.233 16 05920 232 05 7.233331.17075

Berberin 8.233 16059202 3205 7.23333 1.17075

Hình 4.8. Sắc kí đồ của berberin ở pH 3,5

Hình 4.11. Sắc ký đồ ở chế độ mixed-view của mẫu thử berberin

Hình 4.13. Pic purity của mẫu thử

FTN 2310.6 > F0,05(1,4) = 7.7086

ta 48.0687 > t0,05(4) = 2.2764

tb 0.912902 < t0,05(4) = 2.2764

Phương trình tuyến tính y=208506 x

Khoảng tuyến tính 10 – 80 ppm

1202401 Berberin 8.307 3044 7.30667 0.00000 1.09608 6.285176

Hình 4.21. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 5 ppm để xác định S/N

Hình 4.22. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 1 ppm để xác định S/N

2407219 Berberin 8.240 2994 7.24000 0.00000 1.12754 12.406101

Hình 4.23. Sắc ký đồ mẫu chuẩn 10 ppm để xác định S/N

Định lượng Berberin

You might also like