Professional Documents
Culture Documents
KHOA Y DƯỢC
HÀ NỘI - 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
KHOÁ: QHY.2012
HÀ NỘI - 2017
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ
Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa
Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm
thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có
thể thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban
Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo
trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học
tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện
khóa luận này.
Sinh viên
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN.......................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen................................................................ 3
1.1.1. Cấu trúc, tính chất ................................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng dược lý..................................................................................... 4
1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen ................................................ 4
1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ ............................ 4
1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử ............ 5
1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......... 6
1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí ........................ 11
1.3. Thẩm định quy trình phân tích ................................................................. 11
1.3.1. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 11
1.3.2. Miền giá trị ............................................................................................ 12
1.3.3. Tính tuyến tính ...................................................................................... 12
1.3.4. Giới hạn phát hiện ................................................................................. 13
1.3.5. Giới hạn định lượng .............................................................................. 14
1.3.6. Độ đúng ................................................................................................. 15
1.3.7. Độ chính xác ......................................................................................... 15
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 17
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị .................................................................. 17
2.1.1. Dung môi, hoá chất................................................................................ 17
2.1.2. Trang thiết bị ......................................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 18
2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký .................................................................. 18
2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 18
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 20
3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký ..................................................................... 20
3.2. Tính đặc hiệu ............................................................................................ 23
3.2.1. Khả năng phân tách ............................................................................... 23
3.2.2. Thời gian lưu ......................................................................................... 25
3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị ................................................................. 27
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .............................................. 29
3.5. Độ đúng .................................................................................................... 29
3.6. Độ chính xác............................................................................................. 30
3.6.1. Độ lặp lại ............................................................................................... 30
3.6.2. Độ chính xác trung gian ........................................................................ 30
3.7. Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén .................................. 32
3.8. Bàn luận.................................................................................................... 32
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN ........................................................................... 35
4.1. Kết luận .................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị……………………………………………………………….35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC BẢNG
1
Mục tiêu của đề tài này nhằm tiến hành xây dựng và thẩm định quy
trình định lượng flurbiprofen trong dược phẩm bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD theo hướng dẫn của Cơ quan quản
lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency- EMA) [9] và Hội nghị quốc
tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người
(International conference on Harmonisation of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human use) [21].
2
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
3
1.1.2. Tác dụng dược lý
Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và
cảm nhận đau. Enzym cyclooxygenase (COX) có vai trò xúc tác cho quá
trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2) và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit
arachidonic. Flurbiprofen có tác dụng chất ức chế cyclooxygenase (COX)
không chọn lọc và ức chế sự hoạt động của cả hai COX-1 và COX-2. Từ đó,
flurbiprofen ngăn cản việc chuyển hoá axit arachidonic thành PGG2, PGH2 là
nguyên liệu trong quá trình tổng hợp các prostaglandin. Từ đó, làm giảm nồng
độ prostaglandin và cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt. Flurbiprofen
cũng là một trong những NSAIDs mạnh nhất về hoạt động ức chế
prostaglandin.
Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp
của hai đồng phân quang học (+) S và (-) R. Đồng phân S-enantiomer thể hiện
hầu hết trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt
tính giảm đau.
Flurbiprofen được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài
đối với bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính
khớp. Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong các trường hợp như
đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch,
viêm gân, chấn thương mô mềm). Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật
nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ. [7,11,16,26,29]
Theo dược điển châu Âu (EP) 2010 [20] và dược điển Hoa Kỳ (USP)
35 [22], phương pháp định lượng dựa vào phản ứng acid - base của gốc acid
trong cấu trúc flurbiprofen. Phương pháp được thực hiện bằng cách hòa tan
0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1
M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein, dừng lại khi dung dịch có màu hồng
bền hơn 30 giây [22]. Có thể thay thế chỉ thị phenolphthalein bằng phương
pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện thế [20]. 1 ml dung dịch NaOH
0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2.
4
Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ
chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và
người phân tích.
1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử
Trong nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã
giới thiệu hai phương pháp định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang
phổ phân tử. Phương pháp được hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH
và EMA [5].
Quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp thụ
quang đã được thẩm định. Trong đó, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV-
Vis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet
1 cm, tốc độ quét 600 nm/phút, dải quét 190 - 320 nm, độ rộng khe 2 nm.
Tín hiệu được xử lý trên phần mềm Statistical Product and Service Solutions
(SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết
lập trong khoảng nồng độ 1-14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn
định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml.
Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng
máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU
RF-5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm,
λex= 248 nm, λem= 308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product and Service
Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính
được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn
3,8% và LOQ có giá trị là 0,03 μg/ml.
Các phương pháp này có ưu điểm thời gian thực hiện ngắn, độ chính
xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các nồng độ rất
nhỏ. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi
các tạp chất lạ và phải kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh
khiết của mẫu.
5
1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân
tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự
phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền
với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,5,13,18].
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
- Thời gian lưu
tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào
hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký
tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0
W: là chiều rộng đáy pic.
W1/2: là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.
- Hệ số dung lượng k
6
Trong đó:
Vs : thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha động
Cần chọn cột, pha động ... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu:
1 < k’< 8.
- Hệ số chọn lọc
Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0
- Hệ số bất đối xứng As
Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2.
Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối.
- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
7
Trong đó
Trong đó:
tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn
vị. Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5.
Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng
8
thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng
của diện tích hoặc chiều cao pic.
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất
trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic
của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
Định lượng bằng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao ghép đầu dò DAD
Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ
thống HPLC - DAD [20]. Trong đó, dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp
acetonitril : nước 45:55. Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung
môi trên để được 100 ml. Pha tĩnh là octadecylsilyl silicagel kích thước 5 µm
trong cột thép kích thước 3,9 × 150 mm. Pha động là hỗn hợp axit axetic :
acetonitrile : nước tỷ lệ 5 : 35 : 60. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm là
10 µl. Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu
dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm.
Phương pháp có những ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy tốt tách
được các thành phần riêng biệt ra khỏi mẫu và có thể áp dụng được cho
những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Nhược điểm của phương pháp là
phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc
hiện đại.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ
Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen
và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC - MS/MS).
[8,14,15,18]
Ví dụ như nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng
phương pháp LC-MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin,
Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng
Zheng, Hui Chen thực hiện (2015) [8]. Trong đó hệ thống sắc ký lỏng
Shimadzu UFLC LC-30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối
phổ QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ
9
thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy
nguồn hoá ESI liệt kê trong bảng 1.
Bảng 1. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI
Thông số Giá trị
Áp suất khí phun 30 psi
Thế phun điện tử -4,5 kV
Nhiệt độ mao quản 400 oC
Nguồn ion 40 psi
Detector với các thông số năng lượng va chạm (CE) = - 12 V, thế phân
nhóm (DP) = - 26 V, Thế đầu vào (EP) = - 8 V, Năng lượng (CXP) = - 8 V.
Ion có dạng 242,9 → 198,7.
Pha tĩnh: cột silicagel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với
một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex.
Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 2.
Bảng 2. Chương trình pha động gradient
Kênh B
Kênh A
Tốc độ dòng (Acetonitril :
Thời gian (phút) (Acid formic :
(ml/phút) Acid formic
Nước 99,9 : 0,1)
99,9 : 0,1)
0,1 0,4 60 40
0,6 0,4 15 85
1 0,4 5 95
2 0,4 5 95
2,5 0,4 60 40
10
phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi,
phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền.
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương
pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của
ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11
năm 2005 [21], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần
thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và
miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc
phải có trong quy trình thẩm định.
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
11
- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có
ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn. [1,2,9,21]
Khái niệm
Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và
nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ
nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính
chất tuyến tính của phương pháp [1,2,9,21].
Yêu cầu
Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của
miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,9,21].
Khái niệm
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
12
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của
đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).
Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với
hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,9,21].
- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của
phương pháp.
- Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc
nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra
tính thích hợp của phương trình.
Yêu cầu
Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1, 2].
1.3.4. Giới hạn phát hiện
Khái niệm
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của
chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác
định chính xác hàm lượng [1,2,9,21].
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng
cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ
nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện.
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng
độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3.
13
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
Khái niệm
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp
nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ
chính xác phù hợp [1,2,9,21].
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính
xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng
biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy
trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp
nhận.
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là
nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
14
dựa vào đường cong chuẩn độ
1.3.6. Độ đúng
Khái niệm
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá
trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với
một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định
[1,2,8,20].
Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần
mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3
lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo
công thức sau:
ỷ ệ ụ ồ
Khái niệm
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất
cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,9,21].
15
Phương pháp xác định
Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá
trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định
lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân
tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống
máy thay đổi.
Yêu cầu
Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu
phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên
dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở
giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD
càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2].
16
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị
Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo
Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự
động.
Đầu dò DAD Diode Array Detector Model: DAD - 3000 Dionex sử
dụng đèn Deuterium (D2) cho khoảng UV và tungsten (W) cho khoảng VIS,
khoảng bước sóng đo được 190 - 800 nm.
Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150
mm và cột C18 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150 mm.
Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang
bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.
Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân
phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo
Scientific, Hoa Kỳ. Bình định mức, ống đong, cối chày,..
17
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Dùng phương pháp HPLC pha đảo để nghiên cứu định lượng
flurbiprofen trong mẫu thử, thực hiện khảo sát các điều kiện phân tích như
sau.
- Cột sắc ký: tiến hành khảo sát trên các cột C18 và C8.
- Pha động: tiến hành sắc ký ở chế độ gradient và isocratic với các tỷ lệ
ACN, nước và acid acetic băng để lựa chọn pha động thích hợp.
- Detector: sử dụng đầu dò DAD quét phổ trong dải sóng 190 - 800 nm để
tìm bước sóng hấp thụ cực đại.
- Thể tích tiêm mẫu: khảo sát các thể thích tiêm là 5, 10, 15, 20 µl để lựa
chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.
Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý
với các yếu tố khác nhau như acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm
làm phân huỷ mẫu và xác định xem flurbiprofen có tách hoàn toàn ra khỏi sản
phẩm phân huỷ hay không.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 6 nồng độ là 20, 16, 12, 8, 4, 2
µg/ml.
Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy giữa
nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác định giá trị R2
Giới hạn phát hiện (LOD) được xác định bằng phương pháp pha loãng
mẫu. LOD là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 2 - 3 lần đường nền ở tất cả 3
lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần.
18
Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng (LOQ) được xác định bằng phương pháp pha
loãng mẫu. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền đường
nền ở tất cả 3 lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần.
Độ đúng
Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ
trong khoảng tuyến tính đã phân tích.
Độ chính xác
Độ lặp lại: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 20, 8, 2 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần
trong cùng một ngày.
Độ chính xác trung gian: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 20, 8, 2 µg/ml,
mỗi mẫu 3 lần. Thực hiện phân tích trong ba ngày khác nhau.
Xác định giá trị RSD của các lần đo.
Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.
Chuẩn bị mẫu dược phẩm để định lượng lấy viên nén flurbiprofen trong
vỉ, cạo lớp bao film và nghiền mịn trong cối sứ. Cân lượng bột thuốc tương
ứng với 5 mg flurbiprofen cho vào bình định mức 5 ml, thêm acetonitril đến
vạch, siêu âm khoảng 15 phút và lọc qua giấy lọc giấy lọc Whatman 40. Pha
loãng dung dịch trên 100 lần trong pha động sắc ký, thu được dung dịch có
nồng độ khoảng 10 μg/ml, lọc qua màng lọc màng lọc ptfe 0,2 μm. Tiến hành
sắc ký như điều kiện đã chọn.
19
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký
Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký được thực hiện với dung dịch
flurbiprofen có nồng độ 20 μg/ml. Tốc độ dòng là 1 ml/phút. Sử dụng đầu dò
DAD để quét phổ trong dải bước sóng 190 - 800 nm, kết quả cho thấy mẫu có
độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 247 nm.
247nm
20
Tiếp tục sắc ký ở chế độ isocratic với pha động nước : acetonitril lần
lượt là các tỷ lệ 20 : 80; 25 : 75; 30 : 70, 35 : 65; 40 : 60. Thời gian lưu và hệ
số bất đối As của mỗi tỉ lệ nước : acetonitril được ghi trong bảng 3.
Bảng 3. Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỷ lệ pha động khảo sát.
21
toàn lượng flurbiprofen ion hoá về dạng không ion hoá. Kết quả cho thấy hiện
tượng kéo đuôi được cải thiện nhưng không hoàn toàn biến mất, cả chiều cao,
diện tích pic đều tăng, thời gian lưu giảm từ 3,92 phút xuống còn 3,68 phút.
Kết quả được thể hiện trong bảng 4.
Bảng 4. Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi thêm 7,5% AcOH trong
pha động
Thời gian Diện tích pic Chiều cao pic
%CAcOH As
lưu (phút) (mAU.min) (mAU)
0 3,92 13,26 161,944 1,16
7,5 3,683 14,667 188,982 1,13
Hiện tượng kéo đuôi vẫn còn có thể là do thể tích tiêm mẫu quá lớn nên
chưa phù hợp. Giảm thể tích tiêm mẫu từ 20, 15, 10 và 5 µl. Kết quả cho thấy,
ở thể tích tiêm mẫu 10 µl, pic cân xứng hơn và tỉ lệ diện tích pic/nồng độ
cũng như tỷ lệ chiều cao/nồng độ cao nhất.
Hiện tượng kéo đuôi chưa mất hẳn có thể là do pha tĩnh chưa phù hợp.
Tiến hành sắc ký với cột C8 thay cột C18 ở các điều kiện đã khảo sát được:
pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm
mẫu 10 µl, pic flurbiprofen gần như không còn hiện tượng kéo đuôi
(As=1,08), mẫu có thời gian lưu 3,73 phút. Thời gian sắc ký được điều chỉnh
thành 8 phút (bằng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen).
Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu là pha tĩnh cột silicagel
C8, pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích
tiêm mẫu 10 µl, thời gian tiêm 8 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, dectector ghi tại
bước sóng 247 nm. Sắc ký đồ được thể hiện trong hình 5.
22
Hình 5. Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá
Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý
với các yếu tố khác nhau acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm
phân huỷ mẫu. Điều kiện cụ thể như sau:
Acid và base
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml
dung dịch HCl 5 M hoặc 2 ml NaOH 5 M vào ống, đun nóng ở nhiệt độ
khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ, để nguội về nhiệt độ phòng, rồi trung hoà hỗn
hợp bằng lượng acid hoặc base tương ứng.
Oxi hoá
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml
dung dịch H2O2 6% và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ.
Nhiệt độ
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml
dung dịch pha động và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ.
23
Ánh sáng
Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm, cho tiếp xúc với
ánh nắng mặt trời trong 5 giờ.
Sau khi xử lý, các mẫu trên được pha loãng đến nồng độ khoảng 20
µg/ml trong pha động, lọc qua màng 0,45 µm. Tiến hành sắc ký rồi xác định
xem trong điều kiện phân tích flurbiprofen có tác được hoàn toàn khỏi các sản
phẩm phân huỷ hay không.
Kết quả cho thấy flurbiprofen chỉ bị phân huỷ khi xử lý với hydrogen
peroxide. Trên sắc ký đồ xuất hiện pic mới có thời gian lưu 1,68 phút, tách ra
hoàn toàn khỏi pic flurbiprofen.
Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic (peak purity) cho thấy
pic flurbiprofen tinh khiết với độ tương xứng đạt hơn 999.
24
t = 1,68 phút
t = 3,69 phút
Hình 7. Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời gian lưu của các pic
25
của flurbiprofen trong 3,73 phút. Các giá trị thời gian lưu của pic trong sắc
ký đồ mẫu phân tích và mẫu chuẩn được liệt kê trong bảng 5.
Bảng 5. Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu phân tích và
mẫu chuẩn
3,59 3,71
Acid 3,65
3,60
3,68 3,66
3,61 3,67
3,69 3,67
3,63 3,68
3,69 3,69
3,64 3,70
4,00 3,66
3,65 3,66
3,70 3,67
26
Qua trắc nghiệm thống kê cho thấy có thời gian lưu của pic ở các mẫu
thử khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc
ký đồ mẫu chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = 2,048).
Từ các kết quả trên cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao.
Chuẩn bị 6 mẫu có nồng độ lần lượt là 20, 16, 12, 8, 4, 2 µg/ml bằng
cách pha loãng từ dung dịch mẹ có nồng độ 1000 µg/ml.
Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần với điều kiện đã chọn. Kết quả được
trình bày trong bảng 6 và hình 8.
Bảng 6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ lý thuyết và
diện tích pic của flurbiprofen
1 20 13,76
2 16 10,68
3 12 8,24
4 8 5,53
5 4 2,73
6 2 1,38
27
16.00
14.00 y = 0.6804x + 0.0221
R² = 0.9993
Hình 8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ chất phân tích
và diện tích pic
Từ phân tích thống kê thu được phương trình y = 0,68x + 0,022
Trong đó, y (mAU.min) là diện tích pic, x (µg/ml) là nồng độ mẫu phân
tích.
Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là có tính
tương thích (F = 5907,328 > F0,05 = 10,13).
Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát
2 - 20 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ flurbiprofen và diện
tích pic. Hệ số tương quan là R2 = 0,999. Mức độ tương quan tốt, độ tuyến
tính chặt chẽ. Độ lệch của các giá trị thực nghiêm với giá trị hồi quy rất gần
với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp.
28
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen đến
khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt khoảng
2-3. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện
(LOD) của phương pháp ứng với từng chất.
Giới hạn định lượng: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen
đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt
khoảng 10. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát
hiện (LOQ) của phương pháp ứng với từng chất.
Kết quả phân tích cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp
LOD = 0,05 µg/ml và giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 0,15
µg/ml.
3.5. Độ đúng
Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ
trong khoảng tuyến tính đã phân tích.
Bảng 7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp.
29
Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng với các giá trị của độ phục hồi
đều nằm trong khoảng 100±2%.
- Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là: 20, 8, 2 µg/ml pha trong
pha động.
- Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần.
Bảng 8. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp
Nồng độ lý Diện tích pic
Diện tích pic RSD
thuyết trung bình SD
(mAU.min) (%)
(µg/ml) (mAU.min)
13,78
5,55
5,53 0,03
8,00 5,53 0,46
5,50
1,34
Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ
lặp lại đều nhỏ hơn 2,34%.
- Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là: 20, 8, 2 µg/ml pha trong
dung dịch pha động.
30
- Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần.
- Lặp lại thí nghiệm trong ba ngày khác nhau.
Bảng 9. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp
Diện tích
Nồng độ lý Diện tích RSD
pic trung
thuyết Ngày pic SD
bình (%)
(µg/ml) (mAU.min)
(mAU.min)
1 14,00
1 5,53
1 1,38
Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ chính xác
trung gian đều nhỏ hơn 1,73%.
Nhận xét: So sánh giá trị RSD của phương pháp được xây dựng với
một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được báo cáo.
31
Bảng 10. So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp định lượng
RSD (%) của độ chính
Tên phương pháp RSD (%) của độ lặp lại
xác trung gian
Đo độ hấp thu quang [5] ≤ 3,10 ≤ 3,20
Đo độ phát xạ huỷnh
≤ 2,05 ≤ 3,80
quang [5]
LC-MS/MS [8] ≤ 2,20 ≤ 3,40
GC-MS [25] ≤ 2,65 ≤ 3,64
Phương pháp xây dựng ≤ 2,34 ≤ 1,73
RSD của độ lặp có giá trị trong khoảng trung gian so với phương pháp
trên. RSD độ lặp lại của phương pháp xây dựng nhỏ hơn kết quả trong nghiên
cứu sử dụng phương pháp đo độ hấp thu quang và GC-MS. RSD độ chính xác
trung gian của phương pháp xây dựng đạt được thấp hơn giá trị trong cả bốn
nghiên cứu đã được giới thiệu. Từ đó khẳng định phương pháp có độ chính
xác cao.
Áp dụng phương pháp được xây dựng thẩm định để định lượng
flurbiprofen có trong viên nén Anadys 100mg Theramex, Pháp. Theo USP 35,
hàm lượng flurbiprofen phải đạt từ 90 - 110%. [22]
Kết quả thu được diện tích pic trung bình là 5,96 mAU.min. Nồng độ
dung dịch định lượng là 9,31 µg/ml. Như vậy, hàm lương flurbiprofen trong
32
phương pháp đo độ hấp thụ UV-Vis đem lại: có khả năng tách các chất ra
hoàn toàn nên tính đặc hiệu cao, có khả năng kiểm tra độ tinh khiết của mẫu,
độ chính xác cao và nhạy với các nồng độ nhỏ. Bên cạnh đó, phương pháp
cũng có một số nhược điểm như hệ dung môi đắt tiền, cần một hệ thống máy
móc hiện đại.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thì một số đại lượng sau cần lưu ý.
Thời gian lưu tR là thời gian tính từ khi chất được tiêm vào hệ thống sắc ký
đến khi phát hiện ở nồng độ cực đại. Thông thường thời gian sắc ký thường
gấp đôi thời gian lưu. Hệ số dung lượng k’ cần nằm trong khoảng tối ưu
1< k’ < 8 căn cứ vào pha tĩnh, pha động,…Hệ số As cho biết mức độ cân đối
của pic và thường nằm trong khoảng 0,9 - 2,5 pic càng cân đối thì hiệu lực
tách của cột càng tốt.
Phương pháp sử dụng cột sắc ký pha đảo. Pha động sử dụng dung môi
có độ phân cực cao là hỗn hợp acetonitril, acid acetic và nước. Flurbiprofen
tan trong acetonirtil tốt hơn với nước nên khi tăng tỷ lệ acetonitril thì thời
gian lưu của flurbiprofen cũng giảm dần. Khi tỷ lệ nước : acetonitril là
35 : 65, diện tích pic và chiều cao pic được tối ưu hoá. Acid acetic được thêm
có tác dụng chuyển flurbiprofen dạng ion hoá về dạng không bị ion hoá nhằm
giảm hiện tượng kéo đuôi ở pic. Về thành phần cấu tạo, silicagel C8 có độ
phân cực cao hơn silicagel C18. Khi độ phân cực pha tĩnh tăng thì tương tác
với chất phân tích sẽ lớn hơn. Vì vậy, khi thay cột C18 bằng cột C8, thời gian
lưu của flurbiprofen tăng từ 3,14 – 3,73 phút.
Các thể tích tiêm mẫu đã khảo sát là 20, 15, 10 và 5 μl. Kết quả cho
thấy ở nhưng thể tích như 15 và 20 μl, pic có hiện tượng kéo đuôi có thể là do
thể tích tiêm quá lớn nên lượng flurbiprofen đi qua đầu dò không ổn định theo
thời gian. Ở thể tích tiêm 5 μl, chiều cao và diện tích pic nhỏ nên sai số ở
những nồng độ thấp sẽ cao và LOD, LOQ của phương pháp sẽ thấp. Kết quả
cho thấy, tại thể tích tiêm mẫu 10 μl, hệ số bất đối, diện tích pic và chiều cao
pic là tối ưu nhất.
Lựa chọn cài đặt đầu dò DAD tại bước sóng có độ hấp thụ cực đại
247 nm. Tại bước sóng đó, độ hấp thụ có giá trị lớn nhất, đường chuẩn định
lượng có độ dốc a cao sẽ làm cho phương pháp độ chính xác cao hơn.
33
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy trong điều kiện khảo sát,
flurbiprofen khá bền trong acid, base, nhiệt độ và ánh sáng nhưng dễ bị phân
huỷ bởi tác nhân oxi hoá. Vì vậy trong bảo quản cần tránh để flurbiprofen tiếp
xúc với các tác nhân oxi hoá làm giảm chất lượng thuốc.
34
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN
Dựa trên các tài liệu về thẩm định quy trình phân tích của ICH và
EMA, nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định
lượng flurbiprofen bằng hệ thống HPLC - DAD với các thông số: pha tĩnh là
silicagel C8 trong cột 5 μm, 4,6×150 mm, pha động acetonitril : nước : acid
acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm mẫu là 10 µl, thời gian sắc ký là
8 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, đầu dò DAD tại bước sóng 247 nm.
Bằng các quá trình thực nghiệm đã chứng tỏ được quy trình định lượng
flurbiprofen đạt các yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ
chính xác theo hướng dẫn chung của ICH và EMA. Kết quả cho thấy phương
pháp có đặc hiệu với flubiprofen. Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa
đáp ứng phân tích và nồng độ flurbiprofen trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml
với hệ số tương quan R2 = 0,999. Phương pháp có độ đúng tốt (100±2%), độ
lặp lại đảm bảo (RSD ≤ 2,34%). Phương pháp đã được ứng dụng để định
lượng một dược phẩm chứa flurbiprofen dạng viên nén.
Ứng dụng phương pháp để định lượng flurbiprofen trong các dạng bào
chế khác như thuốc nhỏ mắt, viên nang, cao dán. Phương pháp cũng là cơ sở
cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm đau, chống viêm
chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu tương đương sinh
học và dược động học của chúng.
35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
[1] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học),
Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp.135-184.
[2] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương
pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ
thuật,pp.10-59.
[3] Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB
Y học, pp.68-84.
Tiếng anh