Machine Translated by Google
chương
ENZYM
6.1 Giới thiệu về Enzyme 191
6.2 Enzyme hoạt động như thế nào 193
6.3 Động học enzyme như một cách tiếp cận để hiểu
Cơ chế 202
6.4 Ví dụ về phản ứng enzym 213
6.5 Enzyme điều hòa 225
Một cách để điều kiện này có thể được đáp ứng sẽ
nếu các phân tử khi kết hợp với enzym sẽ tạo thành
xa nhau hơn một chút so với khoảng cách cân bằng của chúng khi
[liên kết cộng hóa trị], nhưng gần hơn trạng thái cân bằng của chúng
khoảng cách khi rảnh rỗi. . . . Sử dụng khóa và chìa khóa của Fischer
Tương tự, chiếc chìa khóa không vừa với ổ khóa một cách hoàn hảo nhưng
gây áp lực nhất định lên nó.
—JBS Haldane, Enzyme, 1930
Xúc tác có thể được mô tả chính thức dưới dạng
ổn định trạng thái chuyển tiếp thông qua liên kết chặt chẽ với
chất xúc tác.
—William P. Jencks, bài viết trên tạp chí Advances in Enzymology, 1975
T đây là hai điều kiện cơ bản cho sự sống. Đầu tiên,
thực thể sống phải có khả năng tự tái tạo (một chủ đề
xem xét ở Phần III); thứ hai, cơ thể phải
có khả năng xúc tác các phản ứng hóa học một cách hiệu quả và
chọn lọc. Tầm quan trọng trung tâm của chất xúc tác có thể làm
ngạc nhiên một số sinh viên mới bắt đầu học hóa sinh, nhưng nó
dễ dàng để chứng minh. Như đã mô tả ở Chương 1, cuộc sống
hệ thống sử dụng năng lượng từ môi trường.
Ví dụ, nhiều người trong chúng ta tiêu thụ một lượng đáng kể
sucrose—đường ăn thông thường—làm một loại nhiên liệu,
dù ở dạng thức ăn và đồ uống có đường hay
như đường. Sự chuyển hóa sucrose thành CO2 và
190
6
H2O khi có mặt oxy là chất có tính tỏa nhiệt cao
quá trình, giải phóng năng lượng tự do mà chúng ta có thể sử dụng để suy nghĩ,
di chuyển, nếm thử và nhìn thấy. Tuy nhiên, một túi đường có
thể vẫn còn trên kệ trong nhiều năm mà không có bất kỳ sự
chuyển đổi rõ ràng nào thành CO2 và H2O. Mặc dù quá trình hóa học này
thuận lợi về mặt nhiệt động lực học, nó rất chậm! Tuy nhiên khi
sucrose được con người (hoặc gần như bất kỳ loại thực phẩm nào khác) tiêu thụ
sinh vật), nó giải phóng năng lượng hóa học trong vài giây.
Sự khác biệt là xúc tác. Không có chất xúc tác, hóa chất
các phản ứng như oxy hóa sucrose không thể xảy ra trên
một thang thời gian hữu ích, và do đó không thể duy trì sự sống.
Vì vậy, trong chương này, chúng tôi hướng sự chú ý của mình đến
chất xúc tác phản ứng của hệ thống sinh học: các enzym,
các protein đáng chú ý nhất và có tính chuyên biệt cao.
Enzyme có khả năng xúc tác phi thường, thường rất xa
lớn hơn so với các chất xúc tác tổng hợp hoặc vô cơ.
Chúng có mức độ đặc hiệu cao đối với cơ chất của chúng, chúng
đẩy nhanh các phản ứng hóa học cực kỳ nhanh chóng và chúng
hoạt động trong các dung dịch nước dưới điều kiện
điều kiện rất ôn hòa về nhiệt độ và pH. Rất ít chất xúc tác
phi sinh học có tất cả các đặc tính này.
Enzyme là trung tâm của mọi quá trình sinh hóa.
Hoạt động theo trình tự có tổ chức, chúng xúc tác cho hàng trăm
phản ứng từng bước làm phân hủy chất dinh dưỡng.
phân tử, bảo toàn và biến đổi năng lượng hóa học,
và tạo ra các đại phân tử sinh học từ các con trỏ trước đơn
giản. Thông qua hoạt động của các enzyme điều hòa,
con đường trao đổi chất được phối hợp chặt chẽ để mang lại một
sự tương tác hài hòa giữa nhiều hoạt động cần thiết để duy trì
sự sống.
Việc nghiên cứu enzyme có tầm quan trọng thực tiễn to
lớn. Trong một số bệnh, đặc biệt là các rối loạn di truyền,
có thể có sự thiếu hụt hoặc thậm chí thiếu hoàn toàn một hoặc
nhiều enzyme. Đối với các tình trạng bệnh khác, hoạt động quá
mức của một enzym có thể
nguyên nhân. Đo hoạt tính của enzyme trong
huyết tương, hồng cầu hoặc mẫu mô rất quan trọng trong việc
chẩn đoán một số bệnh. Nhiều loại thuốc phát huy tác dụng sinh
học thông qua tương tác với
enzyme. Và enzyme là công cụ thực tế quan trọng,
Machine Translated by Google

6.1 Giới thiệu về Enzyme 191

không chỉ trong y học mà còn trong công nghiệp hóa chất, thực phẩm cấu trúc và cơ chế hóa học của nhiều chất trong số chúng, và

chế biến, nông nghiệp. hiểu biết chung về hoạt động của enzyme.

Chúng ta bắt đầu bằng việc mô tả các đặc tính của en-zyme và

các nguyên tắc cơ bản về khả năng xúc tác của chúng. Hầu hết các enzyme là protein
sức mạnh, sau đó giới thiệu động học enzyme, một môn học
Ngoại trừ một nhóm nhỏ RNA xúc tác
cung cấp phần lớn khuôn khổ cho bất kỳ cuộc thảo luận nào về
phân tử (Chương 26), tất cả các enzyme đều là protein. Của họ
enzyme. Ví dụ cụ thể về cơ chế enzyme là
hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào tính toàn vẹn của cấu trúc protein
sau đó được cung cấp, minh họa các nguyên tắc được giới thiệu trước đó
tự nhiên của chúng. Nếu enzyme bị biến tính hoặc
trong chương. Chúng ta kết thúc bằng cuộc thảo luận về cách enzyme
phân ly thành các tiểu đơn vị của nó, hoạt động xúc tác thường là
hoạt động được điều tiết.
mất. Nếu một enzyme được chia thành các thành phần của nó

axit amin nên hoạt tính xúc tác của nó luôn bị phá hủy.

Vì vậy, cấp một, cấp hai, cấp ba và cấp bốn

6.1 Giới thiệu về Enzyme
Cấu trúc của các enzyme protein rất cần thiết cho hoạt động xúc

Phần lớn lịch sử hóa sinh là lịch sử nghiên cứu enzyme. Xúc tác tác của chúng.

sinh học lần đầu tiên được công nhận Enzyme, giống như các protein khác, có cấu trúc phân tử

và được mô tả vào cuối những năm 1700, trong các nghiên cứu về quá trọng lượng từ khoảng 12.000 đến hơn 1 triệu tấn. Một số enzyme

trình tiêu hóa thịt bằng dịch tiết của dạ dày, và nghiên cứu tiếp không cần nhóm hóa học để hoạt động ngoại trừ dư lượng axit amin

tục vào những năm 1800 với các cuộc kiểm tra về của chúng. Một số khác yêu cầu thành phần hóa học bổ sung được gọi

chuyển hóa tinh bột thành đường bằng nước bọt và các loại thực vật khác nhau là đồng yếu tố— một hoặc nhiều ion vô cơ, chẳng hạn như

chiết xuất. Vào những năm 1850, Louis Pasteur kết luận rằng quá

trình lên men đường thành rượu bằng nấm men được xúc tác bởi Fe2, Mg2, Mn2 hoặc Zn2 (Bảng 6–1) hoặc phức chất

“lên men.” Ông cho rằng những quá trình lên men này không thể tách phân tử hữu cơ hoặc hữu cơ kim loại gọi là coenzym

rời khỏi cấu trúc của tế bào nấm men sống; cái này (Bảng 6–2). Một số enzym cần cả coenzym

quan điểm, được gọi là chủ nghĩa sức sống, đã thịnh hành trong nhiều thập kỷ. Sau đó vào năm 1897

Eduard Buchner phát hiện ra rằng chất chiết xuất từ nấm men có thể

lên men đường thành rượu, chứng tỏ rằng quá trình lên men đã diễn ra BẢNG 6–1 Một số nguyên tố vô cơ
được thúc đẩy bởi các phân tử tiếp tục hoạt động khi Đóng vai trò là đồng yếu tố cho enzyme

được loại bỏ khỏi tế bào. Frederick W. Kühne gọi đây là

Cu2 Cytochrom oxydase
enzym phân tử . Như những quan niệm mang tính sống còn về cuộc sống đã
Fe2 hoặc Fe3 Cytochrome oxidase, catalase, peroxidase
bị bác bỏ, việc phân lập các enzyme mới và nghiên cứu các đặc tính
K pyruvat kinase
của chúng đã thúc đẩy khoa học hóa sinh.
Mg2 Hexokinase, glucose 6-phosphatase,

pyruvat kinase
Sự phân lập và kết tinh urease của James
Mn2 Arginase, ribonucleotide reductase
Sumner vào năm 1926 đã mang lại bước đột phá về enzyme ban đầu
Mo dinitrogenase
học. Sumner phát hiện ra rằng các tinh thể urease bao gồm
Ni2 urease
hoàn toàn bằng protein, và ông cho rằng tất cả các enzyme
Se Glutathione peroxidase
là các protein. Trong trường hợp không có các ví dụ khác, điều này
Zn2 Anhydrase carbonic, rượu
ý tưởng vẫn còn gây tranh cãi trong một thời gian. Chỉ trong
dehydrogenase, carboxypeptidase
Thập niên 1930 là kết luận của Sumner được chấp nhận rộng rãi, sau
A và B
John Northrop và Moses Kunitz đã kết tinh pepsin,

trypsin và các enzyme tiêu hóa khác và tìm thấy chúng

cũng phải là protein. Trong giai đoạn này,

JBS Haldane đã viết một chuyên luận có tựa đề

Enzyme. Mặc dù bản chất phân tử

enzyme vẫn chưa được đánh giá đầy đủ,

Haldane đã đưa ra đề xuất đáng chú ý

tương tác liên kết yếu giữa

một enzyme và cơ chất của nó có thể

dùng để xúc tác cho một phản ứng. Cái nhìn sâu sắc này
nằm ở trung tâm của sự hiểu biết hiện nay của

chúng ta về xúc tác enzym.

Kể từ phần sau của thế kỷ XX

thế kỷ này, nghiên cứu về enzyme đã được

căng. Nó đã dẫn đến sự thanh lọc Eduard Buchner, James Summer, JBS Haldane,
hàng ngàn enzyme, làm sáng tỏ 1860–1917 1887–1955 1892–1964
Machine Translated by Google

192 Chương 6 Enzyme

BẢNG 6–2 Một số Coenzym đóng vai trò vận chuyển tạm thời các nguyên tử hoặc nhóm chức năng cụ thể

Coenzym Ví dụ về các nhóm hóa học được chuyển giao Tiền chất dinh dưỡng ở động vật có vú

Biocytin CO2 biotin

Coenzym A Nhóm acyl Axit pantothenic và các hợp chất khác

5-Deoxyadenosylcobalamin Nguyên tử H và nhóm alkyl Vitamin B12

(coenzym B12)
Flavin adenine dinucleotide điện tử Riboflavin (vitamin B2)

Lipoat Electron và nhóm acyl Không cần thiết trong chế độ ăn kiêng

Nicotinamide adenine dinucleotide Ion hydroxit (:H) Axit nicotinic (niacin)

Pyridoxal photphat Nhóm amin Pyridoxin (vitamin B6)

Tetrahydrofolate Nhóm một carbon folate

Thiamine pyrophosphate Aldehyd Thiamin (vitamin B1)

Lưu ý: Cấu trúc và phương thức hoạt động của các coenzym này được mô tả ở Phần II.

và một hoặc nhiều ion kim loại cho hoạt động. Coenzim hoặc trước khi phản ứng cụ thể được xúc tác được biết đến.

ion kim loại liên kết rất chặt chẽ hoặc thậm chí liên kết cộng hóa trị Ví dụ, một loại enzyme được biết là có tác dụng tiêu hóa

với protein enzyme được gọi là nhóm giả. MỘT của thực phẩm được đặt tên là pepsin, từ pepsis trong tiếng Hy Lạp,

enzym hoàn chỉnh có hoạt tính xúc tác cùng với “tiêu hóa” và lysozyme được đặt tên theo khả năng phân giải

coenzym liên kết và/hoặc ion kim loại được gọi là holoen-zyme. Phần vách tế bào vi khuẩn. Vẫn còn những người khác được đặt tên theo

protein của enzyme như vậy được gọi là nguồn: trypsin, được đặt tên một phần từ tryein trong tiếng Hy Lạp,

apoenzim hoặc apoprotein. Coenzym đóng vai trò là chất vận chuyển “mòn đi,” có được bằng cách cọ xát tuyến tụy

tạm thời các nhóm chức năng cụ thể. Hầu hết đều bị thiếu vitamin, mô bằng glycerin. Đôi khi cùng một enzyme có

chất dinh dưỡng hữu cơ cần thiết với liều lượng nhỏ. hai hoặc nhiều tên hoặc hai enzyme khác nhau có cùng tên

lượng trong chế độ ăn uống. Chúng tôi xem xét coenzym ở nhiều khía cạnh hơn cùng tên. Vì sự mơ hồ như vậy và số lượng enzyme mới được phát hiện

chi tiết khi chúng ta gặp chúng trong quá trình trao đổi chất ngày càng tăng,

được thảo luận ở Phần II. Cuối cùng, một số protein enzyme được các nhà hóa sinh, theo thỏa thuận quốc tế, đã thông qua

được biến đổi cộng hóa trị bằng quá trình phosphoryl hóa, glycosyl hóa, một hệ thống đặt tên và phân loại enzyme. Hệ thống này chia enzyme

và các quá trình khác. Nhiều thay đổi trong số này có liên quan đến thành sáu lớp, mỗi lớp có các phân lớp, dựa trên loại phản ứng được

việc điều hòa hoạt động của enzyme. xúc tác (Bảng

6–3). Mỗi enzyme được chỉ định phân loại bốn phần

số và tên hệ thống, xác định phản ứng mà nó xúc tác. Ví dụ, tên hệ
Enzyme được phân loại theo phản ứng
thống chính thức của enzyme xúc tác cho phản ứng
Họ xúc tác

Nhiều enzym đã được đặt tên bằng cách thêm hậu tố

ATP D-glucose 88n ADP D-glucose 6-phosphate
“-ase” theo tên chất nền hoặc một từ hoặc

cụm từ mô tả hoạt động của họ. Vì vậy urease xúc tác là ATP:glucose phosphotransferase, chỉ ra rằng

thủy phân urê và DNA polymerase xúc tác cho quá trình nó xúc tác việc chuyển nhóm phosphoryl từ ATP

trùng hợp các nucleotide để tạo thành DNA. Các en-zyme khác được đặt thành glucose. Số Ủy ban Enzyme của nó (EC

tên theo những khám phá của chúng vì một chức năng rộng. số) là 2.7.1.1. Số đầu tiên (2) biểu thị

BẢNG 6–3 Phân loại quốc tế về enzyme

KHÔNG. Lớp học Loại phản ứng xúc tác

Oxidoreductase Sự chuyển electron (ion hiđrua hoặc nguyên tử H)

1 Chuyển giao Phản ứng chuyển nhóm
2 Hydrolase Phản ứng thủy phân (chuyển nhóm chức vào nước)
3 Lyase Việc bổ sung các nhóm vào liên kết đôi hoặc hình thành liên kết đôi bằng cách loại bỏ các nhóm
4 Đồng phân Chuyển các nhóm trong phân tử để tạo ra các dạng đồng phân
5 6 Dây chằng Sự hình thành các liên kết COC, COS, COO và CON bằng phản ứng ngưng tụ kết hợp với

sự phân cắt ATP

Lưu ý: Hầu hết các enzyme đều xúc tác cho sự chuyển điện tử, nguyên tử hoặc nhóm chức. Do đó chúng được phân loại, có mã

số và tên được gán tùy theo loại phản ứng chuyển giao, nhóm cho và nhóm nhận.
Machine Translated by Google

6.2 Enzyme hoạt động như thế nào 193

tên lớp (transferase); số thứ hai (7),

phân lớp (phosphotransferase); số thứ ba (1), a
phosphotransferase với nhóm hydroxyl làm chất nhận;
và số thứ tư (1), D-glucose là chất phosphoryl
người chấp nhận nhóm Đối với nhiều enzyme, một cái tên tầm thường là

được sử dụng phổ biến hơn—trong trường hợp này là hexokinase.

Một danh sách đầy đủ và mô tả về hàng ngàn en-zyme đã biết được
duy trì bởi Ủy ban Danh pháp của
Hiệp hội Quốc tế về Hóa sinh và Phân tử
Sinh học (www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzym). Cái này
chương này chủ yếu dành cho các nguyên tắc và tính chất chung
của tất cả các enzyme.

TÓM TẮT 6.1 Giới thiệu về Enzyme

■ Cuộc sống phụ thuộc vào sự tồn tại của sức mạnh và
chất xúc tác cụ thể: các enzyme. Hầu như mọi
phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi một
enzim.
HÌNH 6–1 Liên kết cơ chất với enzyme tại vị trí hoạt động.
■ Ngoại trừ một số RNA xúc tác, tất cả
Enzym chymotrypsin, với cơ chất liên kết màu đỏ (ID PDB
enzyme được biết đến là protein. Nhiều yêu cầu
7GCH). Một số dư lượng axit amin quan trọng tại vị trí hoạt động xuất hiện dưới dạng màu đỏ
coenzym hoặc đồng yếu tố phi protein cho chúng
vết bẩn trên bề mặt enzym.
chức năng xúc tác.

■ Enzyme được phân loại theo loại
phản ứng mà chúng xúc tác. Tất cả các enzym đều có dạng hình thức
Số và tên EC, và hầu hết đều có tầm thường
những cái tên.
phức hợp cơ chất, sự tồn tại của nó lần đầu tiên được đề xuất
của Charles-Adolphe Wurtz vào năm 1880, là trung tâm của hoạt
động của enzyme. Nó cũng là điểm khởi đầu cho các phương pháp
toán học xác định hành vi động học của

phản ứng xúc tác enzyme và mô tả lý thuyết về cơ chế enzyme.

6.2 Enzyme hoạt động như thế nào

Enzyme ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng chứ không phải trạng thái cân bằng
Xúc tác enzyme của các phản ứng là cần thiết cho hệ thống sống.

Trong các điều kiện liên quan đến sinh học, các phản ứng không Một phản ứng enzyme đơn giản có thể được viết
có xúc tác có xu hướng diễn ra chậm—hầu hết các phản ứng sinh học đều
ES yz yz ES
yz EP EP (6–1)
Các phân tử khá ổn định trong môi trường nước có độ pH trung
tính, nhiệt độ ôn hòa bên trong tế bào. Hơn nữa, nhiều phản ứng trong đó E, S và P đại diện cho enzyme, cơ chất và
phổ biến trong sinh hóa sản phẩm; ES và EP là các phức hợp tạm thời của en-zyme với cơ
kéo theo các sự kiện hóa học bất lợi hoặc khó xảy ra chất và với sản phẩm.
trong môi trường tế bào, chẳng hạn như thoáng qua Để hiểu chất xúc tác, trước tiên chúng ta phải đánh giá cao
hình thành các chất trung gian tích điện không ổn định hoặc sự sự khác biệt quan trọng giữa cân bằng phản ứng và
va chạm của hai hoặc nhiều phân tử theo hướng chính xác cần tốc độ phản ứng. Chức năng của chất xúc tác là làm tăng
thiết cho phản ứng. Phản ứng cần thiết để tiêu hóa tốc độ của một phản ứng. Chất xúc tác không ảnh hưởng đến phản ứng

thức ăn, gửi tín hiệu thần kinh hoặc co cơ chỉ cần làm
không xảy ra ở mức hữu ích nếu không có chất xúc tác.
Enzym giải quyết được những vấn đề này bằng cách cung cấp
một môi trường cụ thể trong đó một phản ứng nhất định có thể
xảy ra nhanh hơn. Tính năng phân biệt
của một phản ứng được xúc tác bởi enzyme là nó diễn ra
trong giới hạn của một cái túi trên enzyme gọi là
trang hoạt động (Hình 6–1). Phân tử bị ràng buộc
ở vị trí hoạt động và được tác động bởi enzyme được gọi là
chất nền. Bề mặt của vị trí hoạt động được lót
với các gốc axit amin với các nhóm thế
liên kết cơ chất và xúc tác cho quá trình biến đổi hóa học của
yz SP, đều có thể
sự cân bằng. Bất kỳ phản ứng nào, chẳng hạn như
được mô tả bằng sơ đồ tọa độ phản ứng (Hình 6–2), một
Hình ảnh sự biến thiên năng lượng trong phản ứng. BẰNG
thảo luận ở Chương 1, năng lượng trong hệ thống sinh học là
được mô tả dưới dạng năng lượng tự do, G. Trong tọa độ
sơ đồ, năng lượng tự do của hệ thống được vẽ theo
tiến trình của phản ứng (tọa độ phản ứng).
Điểm bắt đầu cho tiến hoặc lùi
phản ứng được gọi là trạng thái cơ bản, đóng góp vào
năng lượng tự do của hệ thống bởi một phân tử trung bình
(S hoặc P) trong một tập hợp các điều kiện nhất định. Để mô tả
thay đổi năng lượng tự do cho các phản ứng, các nhà hóa học xác định một

nó. Thông thường, vị trí hoạt động bao quanh một chất nền, sắp bộ điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ 298 K; một phần
xếp nó hoàn toàn khỏi dung dịch. enzym- áp suất của mỗi khí 1 atm, hay 101,3 kPa; sự tập trung
Machine Translated by Google
194 Chương 6 Enzyme
Trạng thái chuyển tiếp (‡)
G‡
S P
G‡
Tái bút
ăG
no
g,
gnợư
ựN
l
t
d
S G
Đất
P
tình trạng
Đất
tình trạng
Tọa độ phản ứng
HÌNH 6–2 Sơ đồ tọa độ phản ứng của một phản ứng hóa học.
Năng lượng tự do của hệ được vẽ theo tiến trình phản ứng Sn P. Biểu đồ
loại này là sự mô tả năng lượng
thay đổi trong quá trình phản ứng, và trục hoành (tọa độ phản ứng)
phản ánh những thay đổi hóa học tiến triển (ví dụ, sự đứt gãy liên kết
hoặc sự hình thành) khi S được chuyển thành P. Năng lượng kích hoạt, G‡, vì
phản ứng Sn P và Pn S được chỉ định. G là stan- tổng thể
sự biến thiên năng lượng tự do theo hướng Sn P.
của mỗi chất tan 1 M) và biểu thị sự thay đổi năng lượng tự do
đối với hệ phản ứng này là G, độ biến thiên năng lượng tự do
tiêu chuẩn. Bởi vì các hệ thống sinh hóa thường
liên quan đến nồng độ H thấp hơn 1 M, các nhà hóa sinh
xác định sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn sinh hóa,
G, sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn ở pH 7,0; chúng tôi
sử dụng định nghĩa này trong suốt cuốn sách. Thêm nữa
định nghĩa đầy đủ về G được đưa ra trong Chương 13.
Sự cân bằng giữa S và P phản ánh sự khác biệt về năng lượng
tự do ở trạng thái cơ bản của chúng. TRONG
ví dụ trong Hình 6–2, năng lượng tự do của
trạng thái cơ bản của P thấp hơn trạng thái cơ bản của S, vì vậy G đối với
phản ứng âm tính và trạng thái cân bằng nghiêng về P.
Vị trí và hướng cân bằng không bị ảnh hưởng bởi
bất kỳ chất xúc tác nào.
Một trạng thái cân bằng thuận lợi không có nghĩa là
Chuyển đổi SnP sẽ xảy ra với tốc độ có thể phát hiện được. Các
tốc độ phản ứng phụ thuộc vào một yếu tố hoàn toàn khác
tham số. Có một rào cản năng lượng giữa S và P:
năng lượng cần thiết để liên kết các nhóm phản ứng,
hình thành các điện tích không ổn định nhất thời, sự sắp xếp
lại liên kết và các biến đổi khác cần thiết cho
phản ứng xảy ra theo một trong hai hướng. Điều này được minh họa
bằng “ngọn đồi” năng lượng trong Hình 6–2 và 6–3. ĐẾN
trải qua phản ứng, các phân tử phải vượt qua điều này
rào cản và do đó phải được nâng lên mức năng lượng cao hơn
mức độ. Đỉnh đồi năng lượng là điểm mà tại đó
phân rã về trạng thái S hoặc P đều có khả năng xảy ra như nhau (dù
sao thì nó cũng xuống dốc). Đây được gọi là trạng thái chuyển tiếp. Các
trạng thái chuyển tiếp không phải là một loại hóa chất có độ ổn
định đáng kể và không nên nhầm lẫn với chất trung gian phản ứng
(như ES hoặc EP). Nó đơn giản là một
khoảnh khắc phân tử thoáng qua trong đó các sự kiện như liên kết
đứt gãy, hình thành liên kết và phát triển điện tích
đã tiến tới điểm chính xác mà tại đó phân rã thành
chất nền hoặc sản phẩm đều có khả năng như nhau. Sự khác biệt
giữa mức năng lượng ở trạng thái cơ bản và
trạng thái chuyển tiếp là năng lượng kích hoạt, G‡ . Các
tốc độ phản ứng phản ánh năng lượng kích hoạt này: tốc độ phản ứng cao hơn
năng lượng kích hoạt tương ứng với phản ứng chậm hơn. Tốc độ
phản ứng có thể tăng lên bằng cách tăng nhiệt độ, do đó làm tăng
số lượng phân tử có
đủ năng lượng để vượt qua hàng rào năng lượng. Ngoài ra, năng
lượng kích hoạt có thể được giảm xuống bằng cách thêm
chất xúc tác (Hình 6–3). Chất xúc tác tăng cường tốc độ phản ứng
bằng cách giảm năng lượng kích hoạt.
Enzyme cũng không ngoại lệ với quy luật chất xúc tác
không ảnh hưởng đến cân bằng phản ứng. Các hàng mũi tên hai
chiều trong Công thức 6–1 thể hiện quan điểm này: bất kỳ enzyme nào
xúc tác cho phản ứng Sn P cũng xúc tác cho phản ứng
P n S. Vai trò của enzyme là đẩy nhanh quá trình chuyển đổi lẫn
nhau giữa S và P. Enzym không được sử dụng hết trong
quá trình và điểm cân bằng không bị ảnh hưởng. Tuy nhiên, phản
ứng đạt trạng thái cân bằng nhanh hơn nhiều khi
có mặt enzyme thích hợp vì tốc độ
phản ứng tăng lên.
Nguyên tắc chung này có thể được minh họa bằng cách xem xét
sự chuyển đổi sucrose và oxy thành carbon
dioxit và nước:
C12H22O11 12O2 88n 12CO2 11H2O
Sự chuyển đổi này diễn ra thông qua một loạt
phản ứng riêng biệt, có G rất lớn và âm ,
và ở trạng thái cân bằng lượng sucrose có mặt là không đáng kể.
Tuy nhiên, sucrose là một hợp chất ổn định, bởi vì
rào cản năng lượng kích hoạt phải được vượt qua trước khi
sucrose phản ứng với oxy khá cao. Sucrose có thể
được lưu trữ trong một thùng chứa oxy gần như vô thời hạn
mà không phản ứng. Tuy nhiên, trong tế bào, sucrose dễ dàng
bị phân hủy thành CO2 và H2O trong một loạt phản ứng
được xúc tác bởi enzyme. Những enzyme này không chỉ tăng tốc
Trạng thái chuyển tiếp (‡)
G‡
uncat
‡
G‡
g,
gn no
ợ ăG
ư
ựN
l
t
d
con mèo
ES EP
S
P
Tọa độ phản ứng
HÌNH 6–3 Sơ đồ tọa độ phản ứng so sánh các phản ứng có xúc tác và không
có xúc tác bằng enzyme. Trong phản ứng Sn P, ES
và các chất trung gian EP chiếm cực tiểu trong đường cong tiến triển năng lượng của
và G‡ đúng-
phản ứng có sự xúc tác của enzyme. Các điều khoản G‡
uncat con mèo
đáp ứng với năng lượng kích hoạt cho phản ứng không có xúc tác và
năng lượng hoạt hóa tổng thể cho phản ứng được xúc tác tương ứng. Các
năng lượng kích hoạt thấp hơn khi enzyme xúc tác cho phản ứng.
Machine Translated by Google

6.2 Enzyme hoạt động như thế nào 195

điều chỉnh các phản ứng, họ tổ chức và kiểm soát chúng sao cho tốc độ tác dụng được liên kết với năng lượng kích hoạt, G‡ . MỘT

phần lớn năng lượng được giải phóng sẽ được thu hồi ở nơi khác giới thiệu cơ bản về các mối quan hệ nhiệt động này
dạng hóa học và được cung cấp cho tế bào để sử dụng cho các hoạt động khác là bước tiếp theo để hiểu cách thức hoạt động của enzym.

nhiệm vụ. Con đường phản ứng mà sucrose (và các chất khác zy mô tả bởi một
Một trạng thái cân bằng như SP được

đường) được phân hủy là nguồn năng lượng chủ yếu hằng số cân bằng, Keq, hay đơn giản là K (tr. 26). Trong các điều
con đường cho tế bào, và các enzym của con đường này cho phép chuỗi kiện tiêu chuẩn dùng để so sánh các quá trình hóa sinh, hằng số

phản ứng diễn ra theo cơ chế sinh học cân bằng được ký hiệu là K eq
thang thời gian hữu ích. (hoặc K):

Bất kỳ phản ứng nào cũng có thể có nhiều bước, liên quan đến [P ]
K =
(6–2)
[S]
đẳng thức

sự hình thành và phân hủy của các loại hóa chất nhất thời được gọi là
chất trung gian phản ứng.* Chất trung gian phản ứng là Từ nhiệt động lực học, mối quan hệ giữa Keq
bất kỳ loài nào trên con đường phản ứng có giới hạn và G có thể được mô tả bằng biểu thức

tuổi thọ hóa học (dài hơn rung động phân tử,
G RT ln K eq (6–3)
~1013 giây). Khi phản ứng SP được xúczy
tác

bởi một enzyme, phức hợp ES và EP có thể được coi là chất trung trong đó R là hằng số khí, 8,315 J/mol K và T là

gian, mặc dù S và P ổn định nhiệt độ tuyệt đối, 298 K (25 C). Phương trình 6–3

loài hóa học (Eqn 6–1); phức hợp ES và EP được phát triển và thảo luận chi tiết hơn trong Chương 13.

chiếm các thung lũng trong sơ đồ tọa độ phản ứng (Hình 2). Điểm quan trọng ở đây là hằng số cân bằng có liên quan trực tiếp

6–3). Ngoài ra, các chất trung gian hóa học kém ổn định hơn thường đến sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn tổng thể của phản ứng

tồn tại trong quá trình phản ứng được xúc tác bởi enzyme. (Bảng 6–4). Giá trị âm lớn của G phản ánh phản ứng thuận lợi

Do đó, sự chuyển đổi lẫn nhau của hai chất trung gian phản ứng

tuần tự tạo thành một bước phản ứng. Khi một số trạng thái cân bằng – nhưng như đã lưu ý, điều này không có nghĩa là

bước xảy ra trong một phản ứng, tốc độ tổng thể được xác định phản ứng sẽ diễn ra với tốc độ nhanh.

theo bước (hoặc các bước) có năng lượng kích hoạt cao nhất; Tốc độ của bất kỳ phản ứng nào được xác định bởi nồng độ của

đây được gọi là bước giới hạn tỷ lệ. Trong một trường hợp đơn giản, chất phản ứng (hoặc các chất phản ứng) và bởi tốc độ

bước giới hạn tốc độ là điểm năng lượng cao nhất trong hằng số, thường được ký hiệu là k. Đối với đơn phân tử

sơ đồ chuyển đổi lẫn nhau của S và P. Trong thực tế, phản ứng S n P, tốc độ (hoặc vận tốc) của phản ứng,

bước giới hạn tốc độ có thể thay đổi tùy theo điều kiện phản ứng, V—đại diện cho lượng S phản ứng trên một đơn vị

và đối với nhiều enzym, một số bước có thể có các bước tương tự thời gian—được biểu thị bằng phương trình tốc độ:

năng lượng kích hoạt, có nghĩa là chúng đều một phần

Vk [S] (6–4)
hạn chế tỷ lệ.

Năng lượng kích hoạt là rào cản năng lượng đối với hóa chất Trong phản ứng này, tốc độ chỉ phụ thuộc vào nồng độ của S. Đây
phản ứng. Những rào cản này rất quan trọng đối với chính cuộc sống. Tỷ lệ được gọi là phản ứng bậc nhất. Hệ số k là hằng số tỷ lệ phản ánh

tại đó một phân tử trải qua một phản ứng cụ thể sẽ giảm khi hàng
rào kích hoạt cho phản ứng đó tăng lên. Nếu không có rào cản năng xác suất phản ứng trong một tập hợp các điều kiện nhất định

lượng như vậy, các phân tử vĩ mô phức tạp sẽ tự động trở lại trạng (pH, nhiệt độ, v.v.). Ở đây, k là bậc nhất
thái đơn giản hơn nhiều. tốc độ không đổi và có đơn vị thời gian nghịch đảo, chẳng hạn như s1 .

dạng phân tử, phức tạp và có trật tự cao Nếu phản ứng bậc một có hằng số tốc độ k là 0,03 s1 ,
cấu trúc và quá trình trao đổi chất của tế bào không thể tồn tại.

Trong quá trình tiến hóa, các enzym đã phát triển năng lượng hoạt

hóa thấp hơn một cách có chọn lọc cho các phản ứng. BẢNG 6–4 Mối quan hệ giữa K eq
Và g
cần thiết cho sự sống của tế bào.

K eq G (kJ/mol)
Tốc độ phản ứng và trạng thái cân bằng có độ chính xác
106 34,2
Định nghĩa nhiệt động lực học
105 28,5

Cân bằng phản ứng gắn bó chặt chẽ với sự thay đổi năng lượng tự do 104 22,8

tiêu chuẩn của phản ứng, G và tái 103 17.1

102 11.4

101 5,7

1 0,0
*Trong chương này, bước và bước trung gian đề cập đến các loại hóa chất trong

con đường phản ứng của một phản ứng có xúc tác enzyme. bên trong 101 5,7

bối cảnh của các con đường trao đổi chất liên quan đến nhiều enzym (thảo luận trong 102 11.4
Phần II), các thuật ngữ này được sử dụng hơi khác một chút. Toàn bộ phản ứng 103 17.1
enzyme thường được gọi là “bước” trong một con đường và

sản phẩm của một phản ứng enzyme (là cơ chất cho phản ứng enzyme tiếp theo)

enzyme trong con đường này) được gọi là “trung gian”. Lưu ý: Mối quan hệ được tính từ G RT ln K
eq (Phương trình 6–3).
Machine Translated by Google

196 Chương 6 Enzyme

điều này có thể được giải thích (định tính) có nghĩa là 3% chuỗi bên axit amin, ion kim loại và coenzym). Các nhóm chức xúc
của S có sẵn sẽ được chuyển đổi thành P trong 1 giây. Một phản tác trên enzyme có thể hình thành liên kết cộng hóa trị tạm thời
ứng có hằng số tốc độ 2.000 s1 sẽ kết thúc sau với cơ chất và hoạt hóa nó

một phần nhỏ của giây. Nếu tốc độ phản ứng phụ thuộc phản ứng, hoặc một nhóm có thể được chuyển tạm thời từ
vào nồng độ của hai hợp chất khác nhau, hoặc nếu phản ứng xảy ra chất nền cho enzyme. Trong nhiều trường hợp, những phản ứng này
giữa hai phân tử giống nhau chỉ xảy ra ở vị trí hoạt động của enzyme. cộng hóa trị

hợp chất, phản ứng là bậc hai và k là hằng số tốc độ bậc hai, với tương tác giữa enzyme và cơ chất làm giảm

đơn vị là M1 s1 . Các năng lượng kích hoạt (và do đó tăng tốc độ phản ứng)
phương trình tỷ lệ sau đó trở thành bằng cách cung cấp một đường phản ứng thay thế, năng lượng thấp hơn.

Các loại sắp xếp lại cụ thể xảy ra được mô tả trong Phần 6.4.
Vk [S1][S2] (6–5)

Từ lý thuyết trạng thái chuyển tiếp, chúng ta có thể rút ra một Phần thứ hai của lời giải thích nằm ở sự tương tác không
biểu thức liên hệ độ lớn của hằng số tốc độ với cộng hóa trị giữa enzyme và cơ chất.
năng lương̣̣ kich hoaṭ: Phần lớn năng lượng cần thiết để giảm năng lượng hoạt hóa có
nguồn gốc từ các tương tác yếu, không cộng hóa trị giữa cơ chất
kT
k eG‡/RT (6–6) và enzyme. Điều gì thực sự thiết lập enzym
h
Ngoài hầu hết các chất xúc tác khác là sự hình thành một
trong đó k là hằng số Boltzmann và h là hằng số Planck phức hợp ES cụ thể. Sự tương tác giữa chất nền

không thay đổi. Điểm quan trọng ở đây là mối quan hệ giữa hằng và enzyme trong phức hợp này được trung gian bởi cùng một

số tốc độ k và năng lượng kích hoạt G‡ là nghịch đảo và theo cấp lực ổn định cấu trúc protein, bao gồm liên kết hydro và tương

số nhân. Nói một cách đơn giản, tác kỵ nước và ion

đây là cơ sở cho tuyên bố rằng năng lượng hoạt hóa thấp hơn có (Chương 4). Sự hình thành từng tương tác yếu trong

nghĩa là tốc độ phản ứng nhanh hơn. Phức hợp ES đi kèm với việc giải phóng một lượng nhỏ

Bây giờ chúng ta chuyển từ hoạt động của enzyme sang cách chúng năng lượng tự do mang lại mức độ ổn định cho
làm đi. sự tương tác. Năng lượng thu được từ enzyme-cơ chất

tương tác được gọi là năng lượng liên kết, GB. Tầm quan trọng

Một số nguyên tắc giải thích khả năng xúc tác và của nó vượt ra ngoài sự ổn định đơn giản của

tính đặc hiệu của enzyme
Enzyme là chất xúc tác đặc biệt. Tỷ lệ cải thiện mà chúng mang
lại nằm trong khoảng từ 5 đến 17
bậc độ lớn (Bảng 6–5). Enzyme cũng rất
cụ thể, dễ dàng phân biệt giữa các chất nền với
cấu trúc khá giống nhau. Làm sao những thứ khổng lồ và
cải tiến tỷ lệ chọn lọc cao được giải thích? Cái gì
là nguồn năng lượng để giảm đáng kể
năng lượng kích hoạt cho các phản ứng cụ thể?
Câu trả lời cho những câu hỏi này có hai điểm khác biệt nhưng
các bộ phận đan xen nhau. Đầu tiên nằm ở việc sắp xếp lại
liên kết cộng hóa trị trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme.
Các phản ứng hóa học thuộc nhiều loại diễn ra giữa
cơ chất và nhóm chức năng của enzyme (đặc hiệu
tương tác enzyme-cơ chất. Năng lượng liên kết là một
nguồn năng lượng tự do chính được enzyme sử dụng để làm giảm
năng lượng hoạt hóa của các phản ứng.
Hai nguyên tắc cơ bản và có liên quan với nhau đưa ra lời
giải thích chung về cách enzyme sử dụng năng lượng liên kết không
cộng hóa trị:
1. Phần lớn khả năng xúc tác của enzym là
cuối cùng bắt nguồn từ năng lượng tự do được giải phóng
khi hình thành nhiều liên kết và tương tác yếu
giữa enzyme và cơ chất của nó. Sự ràng buộc này
năng lượng góp phần vào tính đặc hiệu cũng như
xúc tác.
2. Tương tác yếu được tối ưu hóa trong phản ứng
trạng thái chuyển tiếp; vị trí hoạt động của enzyme là

bổ sung không phải cho các chất nền mà là cho

các trạng thái chuyển tiếp mà chất nền đi qua
BẢNG 6–5 Một số cải tiến về giá
khi chúng được chuyển đổi thành sản phẩm trong một
Được sản xuất bởi enzyme
phản ứng enzym.

Cyclophilin 105
107 Những chủ đề này rất quan trọng đối với sự hiểu biết về en-zyme
anhydrase cacbonic
109 và giờ đây chúng trở thành trọng tâm chính của chúng tôi.
Triose photphat isomerase
Carboxypeptidase A 1011
1012 Tương tác yếu giữa enzyme và cơ chất
Phosphoglucomutase
Succinyl-CoA transferase 1013 Được tối ưu hóa ở trạng thái chuyển tiếp
urease 1014
Enzim sử dụng năng lượng liên kết như thế nào để làm giảm
Orotidine monophosphate decarboxylase 1017
năng lượng hoạt hóa cho phản ứng? Sự hình thành của ES
bản thân sự phức tạp không phải là lời giải thích, mặc dù một số
Machine Translated by Google

6.2 Enzyme hoạt động như thế nào 197

những cân nhắc sớm nhất về cơ chế enzyme bắt đầu từ ý tưởng này. Các Hãy xem xét một phản ứng tưởng tượng, sự phá vỡ một

nghiên cứu về tính đặc hiệu của enzyme do Emil Fischer thực hiện đã thanh kim loại có nam châm. Phản ứng không có xúc tác là

khiến ông đưa ra đề xuất vào năm 1894, được hiển thị trong Hình 6–5a. Chúng ta hãy xem xét hai tưởng tượng

rằng các enzym có cấu trúc bổ sung cho nhau enzyme—hai “stickase”—có thể xúc tác cho phản ứng này, cả hai đều sử

chất nền, sao cho chúng khớp với nhau như ổ khóa và chìa khóa dụng lực từ như một mô hình chuẩn cho năng lượng liên kết được sử dụng

(Hình 6–4). Ý tưởng tao nhã này, một ý tưởng cụ thể (độc quyền) bởi các enzyme thực. Chúng tôi

sự tương tác giữa hai phân tử sinh học được trung gian bởi các bề mặt đầu tiên thiết kế một loại enzyme bổ sung hoàn hảo cho

phân tử có hình dạng bổ sung, chất nền (Hình 6–5b). Vị trí hoạt động của Stickase này là

đã ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của hóa sinh, một túi có lót nam châm. Để phản ứng (phá vỡ), cây gậy

và những tương tác như vậy là trung tâm của nhiều quá trình sinh hóa. phải đạt tới trạng thái chuyển tiếp của phản ứng, nhưng

Tuy nhiên, giả thuyết “ổ khóa và chìa khóa” có thể gây hiểu nhầm khi thanh dính chặt vào vị trí hoạt động đến nỗi nó không thể uốn cong được,

áp dụng cho enzyme. bởi vì sự uốn cong sẽ loại bỏ một số từ tính

xúc tác. Một enzyme hoàn toàn bổ sung cho nó tương tác giữa thanh và enzyme. Một enzym như vậy

chất nền sẽ là một enzyme rất kém, vì chúng ta có thể cản trở phản ứng, thay vào đó là ổn định chất nền.
chứng minh. Trong sơ đồ tọa độ phản ứng (Hình 6–5b), loại này

của phức hợp ES sẽ tương ứng với một máng năng lượng

từ đó chất nền sẽ khó thoát ra. Một enzyme như vậy sẽ vô dụng.

Khái niệm hiện đại về xúc tác enzyme, lần đầu tiên được đề xuất

bởi Michael Polanyi (1921) và Haldane (1930),

được Linus Pauling phát triển vào năm 1946: để xúc tác cho các phản

ứng xúc tác, một enzyme phải bổ sung cho

trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Điều này có nghĩa là tối ưu

tương tác giữa cơ chất và enzyme chỉ xảy ra

ở trạng thái chuyển tiếp. Hình 6–5c minh họa cách

một enzyme như vậy có thể hoạt động. Thanh kim loại liên kết với

Stickase, nhưng chỉ một tập hợp con của các tương tác từ tính có thể

được sử dụng để hình thành phức hợp ES. Các

chất nền bị ràng buộc vẫn phải trải qua quá trình tăng lượng chất tự do

năng lượng cần thiết để đạt đến trạng thái chuyển tiếp. Tuy nhiên,

hiện nay, sự gia tăng năng lượng tự do cần thiết để thu hút

dính vào một hình dạng bị uốn cong và bị gãy một phần là

được bù đắp hoặc “được trả giá” bởi các tương tác từ tính (năng lượng

liên kết) hình thành giữa enzyme và cơ chất ở trạng thái chuyển tiếp.

Nhiều tương tác trong số này

liên quan đến các phần của cây gậy ở xa điểm

bị vỡ; do đó sự tương tác giữa Stickase và

các bộ phận không phản ứng của thanh cung cấp một số năng lượng cần

thiết để xúc tác làm gãy thanh. “Năng lượng” này

thanh toán” chuyển thành năng lượng kích hoạt ròng thấp hơn
và tốc độ phản ứng nhanh hơn.

Enzim thực sự hoạt động theo nguyên tắc tương tự. Một số

tương tác yếu được hình thành trong phức hợp ES, nhưng

bổ sung đầy đủ các tương tác như vậy giữa chất nền

và enzyme chỉ được hình thành khi cơ chất đạt tới

trạng thái chuyển tiếp. Năng lượng tự do (năng lượng liên kết)
HÌNH 6–4 Các hình dạng bổ sung của chất nền và liên kết của nó
được giải phóng một phần bởi sự hình thành các tương tác này
vị trí trên enzyme. Enzym dihydrofolate reductase với cơ chất NADP (màu đỏ), không
bù đắp năng lượng cần thiết để đạt đến đỉnh đồi năng lượng. Tổng hợp
liên kết (trên cùng) và liên kết (dưới cùng). Một ràng buộc khác
những điều không thuận lợi (tích cực)
chất nền, tetrahydrofolate (màu vàng), cũng có thể nhìn thấy được (PDB ID 1RA2). Các

NADP liên kết với một túi bổ sung cho nó về hình dạng và năng lượng kích hoạt G‡ và năng lượng liên kết thuận lợi (âm) GB dẫn

tính chất ion. Trên thực tế, sự bổ sung giữa protein và đến năng lượng kích hoạt ròng thấp hơn

phối tử (trong trường hợp này là chất nền) hiếm khi hoàn hảo, như chúng ta đã thấy trong Chương (Hình 6–6). Ngay cả đối với enzyme, trạng thái chuyển tiếp không phải

5. Sự tương tác của protein với phối tử thường liên quan đến những thay đổi về là trạng thái ổn định mà là một thời điểm ngắn mà chất nền tiêu tốn

hình dạng của một hoặc cả hai phân tử, một quá trình được gọi là cảm ứng trên đỉnh đồi năng lượng. Phản ứng có xúc tác enzyme diễn ra nhanh hơn

phù hợp. Sự thiếu hụt sự bổ sung hoàn hảo giữa enzyme và cơ chất (không rõ ràng nhiều so với phản ứng không có xúc tác

trong hình này) rất quan trọng đối với xúc tác enzyme. Tuy nhiên, quá trình này vì ngọn đồi nhỏ hơn nhiều. Các
Machine Translated by Google

198 Chương 6 Enzyme

‡
(a) Không có enzim

G‡

g,
gn no
ợ ăG
ư
ự N
l
t
d
S
Cơ chất Trạng thái chuyển tiếp Các sản phẩm P
(thanh kim loại) (cây gậy cong) (gậy gãy)

(b) Enzim bổ sung vào cơ chất

‡

Nam châm
G‡
uncat G‡ con mèo

g,
gn no
ợ ăG
ư
ự N
l
t
d
S
ES P GM
ES

(c) Enzyme bổ sung cho trạng thái chuyển tiếp

‡

G‡uncat GM
‡
G‡

g,
gn no
ợ ăG
ư
ự N
l
t
d
con mèo

S ES
P

ES ‡ + E
Tọa độ phản ứng

HÌNH 6–5 Một enzyme tưởng tượng (stickase) được thiết kế để xúc tác bù đắp cho sự gia tăng năng lượng tự do cần thiết để uốn cong

sự gãy của một thanh kim loại. (a) Trước khi chiếc gậy bị gãy, trước tiên nó phải dán. Sơ đồ tọa độ phản ứng (phải) thể hiện hệ quả năng lượng của sự bổ

bị uốn cong (trạng thái chuyển tiếp). Trong cả hai ví dụ về Stickase, sung cho cơ chất so với sự bổ sung cho

tương tác từ tính thay thế cho tương tác liên kết yếu giữa enzyme và cơ trạng thái chuyển tiếp (phức hợp EP bị bỏ qua). GM, sự khác biệt giữa năng

chất. (b) Một Stickase có túi lót nam châm bổ sung trong cấu trúc của lượng ở trạng thái chuyển tiếp của năng lượng không được xúc tác và được xúc tác

thanh (chất nền) giúp ổn định chất nền. Việc uốn bị cản trở bởi lực hút phản ứng, được tạo ra bởi sự tương tác từ tính giữa thanh

nam châm giữa thanh và dínhase. Khi enzyme bổ sung với cơ chất (b),

và dínhase. (c) Một enzyme có túi bổ sung cho trạng thái chuyển tiếp phức hợp ES ổn định hơn và có ít năng lượng tự do hơn trong lòng đất

phản ứng giúp làm mất ổn định thanh, góp phần trạng thái hơn là chất nền. Kết quả là sự gia tăng kích hoạt

xúc tác của phản ứng. Năng lượng liên kết của tương tác từ năng lượng.

nguyên tắc quan trọng là các tương tác liên kết yếu
giữa enzyme và cơ chất tạo ra động lực đáng kể cho quá trình
xúc tác enzyme. Các
các nhóm trên chất nền có liên quan đến những yếu tố này
các tương tác có thể ở một khoảng cách nào đó so với các liên kết
bị hỏng hoặc bị thay đổi. Tương tác yếu hình thành
chỉ ở trạng thái chuyển tiếp mới có vai trò chủ yếu trong quá
trình xúc tác.
phản ánh nhu cầu về cấu trúc thượng tầng để tiếp tục tương tác
các nhóm được định vị đúng cách và để giữ cho khoang không bị
sụp đổ.
Năng lượng liên kết góp phần vào tính đặc hiệu của phản ứng
và xúc tác
Chúng ta có thể chứng minh một cách định lượng rằng năng lượng liên kết

Yêu cầu về nhiều tương tác yếu để
xúc tác dẫn động là một trong những lý do tại sao enzym (và một số
coenzym) rất lớn. Một enzym phải cung cấp các nhóm chức năng
cho các liên kết ion, liên kết hydro và các tương tác khác, đồng
thời phải định vị chính xác các nhóm này.
để năng lượng liên kết được tối ưu hóa trong quá trình chuyển đổi
tình trạng. Sự ràng buộc đầy đủ được thực hiện dễ dàng nhất bằng cách
định vị chất nền trong khoang (vị trí hoạt động) nơi
nó được loại bỏ khỏi nước một cách hiệu quả. Kích thước của protein
giải thích cho sự gia tăng tốc độ rất lớn mang lại
bằng enzym? Đúng. Để tham khảo, Công thức 6–6
cho phép chúng ta tính toán rằng G‡ phải giảm đi khoảng
5,7 kJ/mol để tăng tốc độ phản ứng bậc nhất lên gấp 10 lần,
trong các điều kiện thường thấy trong tế bào.
Năng lượng có được từ sự hình thành tương tác yếu đơn lẻ thường
được ước tính là từ 4 đến 30 kJ/mol.
Do đó, năng lượng tổng thể có được từ một số tương tác như vậy
đủ để giảm năng lượng kích hoạt.
Machine Translated by Google

6.2 Enzyme hoạt động như thế nào 199

‡ Phản ứng này sắp xếp lại cacbonyl và hydroxyl

các nhóm trên cacbon 1 và 2. Tuy nhiên, hơn 80% sự tăng tốc độ
enzym có nguồn gốc từ
G‡ GB
uncat
‡ tương tác enzyme-cơ chất liên quan đến photphat
nhóm trên carbon 3 của chất nền. Điều này đã được xác định
G‡
g,
gn no
ợ ăG
ư
ự N
l
t
d

ES EP bằng cách so sánh cẩn thận các phản ứng được xúc tác bởi enzyme
con mèo

S
với glyceraldehyd 3-phosphate và với
P
glyceraldehyd (không có nhóm photphat ở vị trí 3) là
cơ chất.

Các nguyên tắc chung được nêu ở trên có thể được minh họa
Tọa độ phản ứng
bằng nhiều cơ chế xúc tác đã được công nhận.

HÌNH 6–6 Vai trò của năng lượng liên kết trong xúc tác. Để giảm
năng lượng kích hoạt cho một phản ứng, hệ thống phải thu được một lượng
năng lượng tương đương với lượng G‡ bị hạ xuống. Nhiều
năng lượng này đến từ năng lượng liên kết (GB) được tạo ra bởi sự
hình thành các tương tác không cộng hóa trị yếu giữa cơ chất và enzyme
ở trạng thái chuyển tiếp. Vai trò của GB tương tự như GM trong
Hình 6–5.
năng lượng từ 60 đến 100 kJ/mol cần thiết để giải thích hiện tượng
sự cải thiện tốc độ lớn được quan sát thấy đối với nhiều enzyme.
Năng lượng liên kết tương tự cung cấp năng lượng cho
Xúc tác cũng mang lại cho enzyme tính đặc hiệu, khả năng phân
biệt giữa cơ chất và chất cạnh tranh.
phân tử. Về mặt khái niệm, tính đặc hiệu rất dễ phân biệt
từ xúc tác, nhưng sự khác biệt này khó khăn hơn nhiều
để thực hiện bằng thực nghiệm, bởi vì khả năng xúc tác và tính đặc hiệu
phát sinh từ cùng một hiện tượng. Nếu một enzyme hoạt động
trang web có các nhóm chức năng được sắp xếp tối ưu để tạo thành một
nhiều loại tương tác yếu với một chất nền cụ thể
Các cơ chế này không loại trừ lẫn nhau và
enzyme nhất định có thể kết hợp một số loại trong
cơ chế hoạt động tổng thể. Đối với hầu hết các enzyme, rất khó
để định lượng sự đóng góp của bất kỳ chất xúc tác nào.
cơ chế về tỷ lệ và/hoặc tính đặc hiệu của một bệnh cụ thể
phản ứng có xúc tác enzym.
Như chúng tôi đã lưu ý, năng lượng liên kết đóng vai trò
quan trọng và đôi khi chiếm ưu thế trong quá trình xúc tác.
Xem xét những gì cần xảy ra để xảy ra phản ứng
địa điểm. Các yếu tố vật lý và nhiệt động nổi bật
đóng góp cho G‡ , rào cản phản ứng, có thể bao gồm (1)
sự giảm entropy, dưới dạng giảm sự tự do chuyển động của hai
phân tử trong dung dịch;
(2) vỏ hòa tan của nước liên kết hydro
bao quanh và giúp ổn định hầu hết các phân tử sinh học trong
dung dịch nước; (3) sự biến dạng của chất nền
phải xảy ra trong nhiều phản ứng; và (4) nhu cầu về
sự sắp xếp hợp lý của các nhóm chức xúc tác trên
enzim. Năng lượng liên kết có thể được sử dụng để khắc phục tất cả
những rào cản này.

ở trạng thái chuyển tiếp, enzyme sẽ không thể tương tác ở mức
độ tương tự với bất kỳ phân tử nào khác. Vì
Ví dụ, nếu chất nền có nhóm hydroxyl tạo thành
một liên kết hydro với gốc Gla cụ thể trên en-zyme, bất kỳ phân
tử nào thiếu nhóm hydroxyl ở vị trí đặc biệt đó sẽ là cơ chất
kém hơn cho enzyme.
Ngoài ra, bất kỳ phân tử nào có thêm một nhóm chức
mà enzyme không có túi hoặc vị trí liên kết
có khả năng bị loại khỏi enzyme. Nói chung, tính đặc hiệu bắt
nguồn từ việc hình thành nhiều tương tác yếu giữa enzyme và cơ
chất đặc hiệu của nó.
phân tử.
Tầm quan trọng của năng lượng liên kết với xúc tác có thể
được chứng minh một cách dễ dàng. Ví dụ, enzyme glycolytic
triose phosphate isomerase xúc tác quá trình chuyển đổi lẫn
nhau của glyceraldehyd 3-phosphate và dihy-droxyacetone
phosphate:
Đầu tiên, một hạn chế lớn trong chuyển động tương đối của
hai chất nền sẽ phản ứng hoặc khử entropy,
là một lợi ích rõ ràng của việc liên kết chúng với một enzyme.
Năng lượng liên kết giữ cho các chất nền ở hướng thích hợp để
phản ứng - một đóng góp đáng kể cho quá trình xúc tác, bởi vì
sự va chạm hiệu quả giữa các phân tử trong
giải pháp có thể cực kỳ hiếm. Cơ chất có thể được sắp xếp
chính xác trên enzyme, với nhiều tương tác yếu giữa mỗi cơ
chất và vị trí chiến lược.
các nhóm trên enzyme kẹp các phân tử cơ chất
vào những vị trí thích hợp. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc
hạn chế chuyển động của hai chất phản ứng có thể tạo ra tốc độ
cải tiến nhiều bậc độ lớn (Hình 6–7).
Thứ hai, hình thành liên kết yếu giữa chất nền
và enzyme cũng dẫn đến sự phân hủy cơ chất.
Tương tác giữa enzyme và cơ chất thay thế hầu hết hoặc toàn bộ
liên kết hydro giữa chất nền và nước.
Thứ ba, năng lượng liên kết bao gồm tương tác yếu

1 chỉ được hình thành ở trạng thái chuyển tiếp phản ứng giúp
HC ồ H2C Ồ bù nhiệt động cho bất kỳ sự biến dạng nào, chủ yếu là sự phân
2
HC OH C ồ phối lại electron mà chất nền phải
bộ ba
3 trải qua để phản ứng.
2 2
CH2OPO3 photphat
đồng phân
CH2OPO3 Cuối cùng, bản thân enzyme thường trải qua một quá trình

Glyceraldehyde Dihydroxyaceton thay đổi về hình dạng khi chất nền liên kết, gây ra bởi nhiều
3-photphat photphat tương tác yếu với chất nền.
Machine Translated by Google

200 Chương 6 Enzyme

Sự phản ứng lại Nâng cơ chế xúc tác tổng thể. Khi cơ chất được liên kết với enzyme, các
cao tỷ lệ
nhóm chức xúc tác được định vị thích hợp sẽ hỗ trợ quá trình phân tách
(Một) ồ và hình thành liên kết bằng nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm xúc tác
ồ

CH3 C HOẶC HOẶC axit-bazơ nói chung, xúc tác cộng hóa trị và xúc tác ion kim loại.
CH3 C
1
k ( M1s1 )
ồ
Chúng khác với các cơ chế dựa trên năng lượng liên kết, bởi vì chúng
ồ C
CH3
thường liên quan đến tương tác cộng hóa trị nhất thời với chất nền
CH3CO _ ồ hoặc sự chuyển nhóm đến hoặc từ chất nền.

(b) ồ ồ

C HOẶC HOẶC C Xúc tác axit-bazơ nói chung Nhiều phản ứng sinh hóa liên quan đến sự

hình thành các chất trung gian tích điện không ổn định có xu hướng
ồ 105 triệu

k (s1 ) phân hủy nhanh chóng thành các loại chất phản ứng cấu thành của chúng,
C ồ C
do đó cản trở phản ứng (Hình 6–8). Các chất trung gian tích điện thường
ồ ồ có thể được ổn định bằng cách chuyển proton đến hoặc từ chất nền hoặc

chất trung gian để tạo thành một loại dễ phân hủy thành sản phẩm hơn.

(c) ồ ồ ồ ồ Đối với các phản ứng không sử dụng enzyme, sự chuyển proton có thể chỉ
HOẶC
liên quan đến các thành phần của nước hoặc các chất cho hoặc nhận
C HOẶC C 108 triệu
ồ k (s1 ) proton yếu khác. Xúc tác loại này chỉ sử dụng ion H (H3O) hoặc OH có
ồ
trong nước được gọi là xúc tác axit-bazơ đặc hiệu. Nếu proton được
C ồ C
chuyển giao giữa chất trung gian và nước nhanh hơn chất trung gian
ồ phân hủy thành chất phản ứng thì chất trung gian sẽ được ổn định một

cách hiệu quả mỗi khi nó hình thành. Sẽ không có sự xúc tác bổ sung
HÌNH 6–7 Tăng cường tốc độ bằng cách giảm entropy. Dưới đây là phản ứng
nào được thực hiện bởi các chất nhận hoặc chất cho proton khác. Tuy
của este với nhóm cacboxylat để tạo thành anhydrit. Nhóm R giống nhau
nhiên, trong nhiều trường hợp, nước là không đủ. Thuật ngữ xúc tác
trong mỗi trường hợp. (a) Đối với phản ứng lưỡng phân tử này, hằng số
1
. axit-bazơ nói chung đề cập đến sự chuyển proton qua trung gian của các
tốc độ k là bậc hai, với đơn vị là M1 s (b) Khi hai nhóm phản ứng
loại phân tử khác. Đối với các phản ứng không có enzyme trong dung
nằm trong cùng một phân tử, phản ứng diễn ra nhanh hơn nhiều. Đối với
dịch nước, điều này chỉ xảy ra khi chất trung gian phản ứng không ổn
phản ứng không phân tử này, k có đơn vị là s1 .
định bị phân hủy thành chất phản ứng nhanh hơn tốc độ các proton có
Chia hằng số tốc độ của (b) cho hằng số tốc độ của (a) sẽ cho tốc độ
tăng lên khoảng 105 M. (Sự tăng cường có đơn vị là mol vì chúng ta thể được chuyển đến hoặc từ nước. Nhiều axit hữu cơ yếu có thể bổ sung

đang so sánh phản ứng đơn phân tử và phản ứng lưỡng phân tử.) Nói cách nước với tư cách là chất cho proton trong trường hợp này, hoặc các

khác, nếu chất phản ứng trong (b) có mặt ở nồng độ 1 M thì các nhóm bazơ hữu cơ yếu có thể đóng vai trò là chất nhận proton.

phản ứng sẽ hoạt động như thể chúng có mặt ở nồng độ 105 M. Lưu ý rằng

chất phản ứng ở (b) có khả năng tự do quay quanh ba liên kết (hiển thị
bằng các hàng mũi tên cong), nhưng điều này vẫn thể hiện sự giảm

entropy đáng kể so với (a). Nếu các liên kết quay trong (b) bị hạn chế
như trong (c), en-tropy sẽ giảm hơn nữa và phản ứng thể hiện tốc độ

tăng lên 108 M so với (a). Tại vị trí hoạt động của enzyme, một số chuỗi bên axit amin có

thể hoạt động tương tự như chất cho và chất nhận proton (Hình 6–9).

Các nhóm này có thể được định vị chính xác trong vị trí hoạt động của

enzyme để cho phép vận chuyển proton, mang lại sự cải thiện tốc độ

theo thứ tự từ 102 đến 105 . Loại xúc tác này xảy ra trên phần lớn các
Điều này được gọi là sự phù hợp cảm ứng, một cơ chế được Daniel
enzym. Trên thực tế, chuyển proton là phản ứng sinh hóa phổ biến nhất.
Koshland đưa ra vào năm 1958. Sự phù hợp cảm ứng có tác dụng đưa các

nhóm chức năng cụ thể trên enzyme vào vị trí thích hợp để xúc tác cho

phản ứng. Sự thay đổi về hình dạng cũng cho phép hình thành thêm các

tương tác liên kết yếu ở trạng thái chuyển tiếp. Trong cả hai trường
Xúc tác cộng hóa trị Trong xúc tác cộng hóa trị, một liên kết cộng
hợp, cấu trúc enzyme mới có đặc tính xúc tác được nâng cao. Như chúng
hóa trị tạm thời được hình thành giữa enzyme và cơ chất. Xét quá trình
ta đã thấy, sự phù hợp cảm ứng là một đặc điểm chung của liên kết thuận
thủy phân liên kết giữa nhóm A và B:
nghịch của phối tử với protein (Chương 5). Sự phù hợp cảm ứng cũng

rất quan trọng trong sự tương tác của hầu hết mọi enzyme với cơ chất

của nó.
H2O
AOB Trên AB

Với sự có mặt của chất xúc tác cộng hóa trị (một loại enzyme có nhóm
Nhóm xúc tác cụ thể góp phần xúc tác
nucleophilic X:) phản ứng trở nên

Trong hầu hết các enzyme, năng lượng liên kết được sử dụng để tạo thành
H2O
Khu phức hợp ES chỉ là một trong số những người đóng góp cho AOB X Trên AOX B Trên AXB
Machine Translated by Google

6.2 Enzyme hoạt động như thế nào 201

Điều này làm thay đổi con đường phản ứng và nó chỉ dẫn đến sự phản ứng lại. Một số chuỗi bên axit amin, bao gồm tất cả
xúc tác khi con đường mới có năng lượng kích hoạt thấp hơn các chuỗi trong Hình 6–9, và các nhóm chức năng của một số
con đường không được xúc tác. Cả hai bước mới phải nhanh đồng yếu tố enzyme có thể đóng vai trò là nucleophile trong
hơn bước không có xúc tác việc hình thành liên kết cộng hóa trị với cơ chất. Các phức

hợp cộng hóa trị này luôn trải qua phản ứng tiếp theo để
tái tạo enzyme tự do. Liên kết cộng hóa trị được hình thành
R1 R3
giữa enzyme và cơ chất có thể kích hoạt cơ chất để thực
HC OH C ồ Các loại
hiện phản ứng tiếp theo theo cách thường đặc trưng cho nhóm

R2 N H
chất phản ứng hoặc coenzym cụ thể.

Nếu không có chất xúc

R4
Xúc tác ion kim loại Kim loại , dù liên kết chặt chẽ với
tác, chất trung gian không
ổn định (tích điện) sẽ bị enzyme hay được đưa ra khỏi dung dịch cùng với cơ chất,
phân hủy nhanh đều có thể tham gia xúc tác theo nhiều cách. Tương tác ion
chóng để tạo thành chất phản ứng.
R1 R3 giữa kim loại liên kết với enzyme và chất nền có thể giúp
H
định hướng chất nền cho phản ứng hoặc ổn định trạng thái
HC ôi C
chuyển tiếp phản ứng tích điện. Việc sử dụng các tương tác
R2 N ồ

H
liên kết yếu giữa kim loại và cơ chất này tương tự như một
R4 số cách sử dụng năng lượng liên kết enzyme-cơ chất được mô
Ồ B
H2OH Hà tả trước đó. Kim loại cũng có thể điều hòa các phản ứng oxi
hóa khử bằng những thay đổi thuận nghịch ở trạng thái oxy
hóa của ion kim loại. Gần một phần ba tổng số enzyme đã
biết cần một hoặc nhiều ion kim loại để thực hiện hoạt động
HOH BH xúc tác.
HOH MỘT

Khi sự chuyển proton đến hoặc Khi quá trình vận

từ H2O nhanh hơn tốc độ chuyển proton đến hoặc từ
phân hủy các chất H2O chậm hơn tốc độ phân hủy
trung gian, thì sự có mặt các chất trung gian thì
của các chất cho hoặc chỉ một phần chất trung gian
chất nhận proton khác được hình thành là ổn định.
không làm tăng tốc độ phản Sự có mặt của các chất cho
ứng. proton thay thế (HA)
hoặc chất nhận proton
(B ) làm tăng tốc độ phản ứng.
Hầu hết các enzyme sử dụng sự kết hợp của một số chiến
lược xúc tác để mang lại sự nâng cao tốc độ. Một ví dụ điển
hình về việc sử dụng cả xúc tác cộng hóa trị và xúc tác axit-
bazơ nói chung là phản ứng được xúc tác bởi chymotrypsin.
Bước đầu tiên là phân cắt liên kết peptide, đi kèm với đó
là sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa gốc Ser trên
enzyme và phần

R1 R3
Dư lượng axit Dạng axit tổng quát Dạng bazơ tổng quát
H C ồ OC amin (chất cho proton) (chất nhận proton)

R2 H NH _

R4 Keo, Asp COO R H COO R

H
Lys, Arg R NH R NH2
H
R1 R3 R SH SR
Cys

H C ồ C ồ
RC CH RC CH
R2
Các sản phẩm
Của anh ấy
HN NH HN N
H H C C
H H
N
Ser R OH RO
R4

HÌNH 6–8 Chất xúc tác làm thế nào để tránh sự phát triển điện tích bất lợi Tyr R Ồ R ồ
trong quá trình phân tách amit. Phản ứng thủy phân liên kết amit, được trình

bày ở đây, là phản ứng tương tự như phản ứng được xúc tác bởi chymotrypsin

và các protease khác. Sự phát triển điện tích là không thuận lợi và có thể HÌNH 6–9 Axit amin trong xúc tác axit-bazơ nói chung. Nhiều phản ứng hữu cơ

bị phá vỡ bằng cách cho một proton bằng H3O (xúc tác axit đặc hiệu) hoặc HA được thúc đẩy bởi các chất cho proton (axit tổng quát) hoặc chất nhận proton

(xúc tác axit nói chung), trong đó HA đại diện cho bất kỳ axit nào. (bazơ chung). Vị trí hoạt động của một số enzyme chứa các nhóm chức năng

Tương tự, điện tích có thể được trung hòa bằng cách tách proton bằng OH axit amin, chẳng hạn như các nhóm được trình bày ở đây, có thể tham gia vào

(xúc tác bazơ đặc hiệu) hoặc B (xúc tác bazơ tổng quát), trong đó B đại quá trình xúc tác với tư cách là người cho proton hoặc người nhận proton.

diện cho bất kỳ bazơ nào.

Machine Translated by Google
202 Chương 6 Enzyme
Chymotrypsin
Ser195 Ser195
B Hồ BH ồ enzyme, nhằm cung cấp một loại enzyme mới có năng lượng thấp hơn.
C đường phản ứng.
1
R2 N C R1 RO
H ồ H
R2 NH
HÌNH 6–10 Xúc tác cộng hóa trị và xúc tác axit-bazơ nói chung. Bước đầu tiên
trong phản ứng được xúc tác bởi chymotrypsin là bước acyl hóa. Các
Nhóm hydroxyl của Ser195 là nucleophile trong phản ứng được hỗ trợ bởi xúc
tác bazơ chung (bazơ là chuỗi bên của His57). Điều này cung cấp
một con đường mới để phân cắt thủy phân liên kết peptit. Xúc tác chỉ xảy
ra nếu mỗi bước trong con đường mới nhanh hơn phản ứng không có xúc tác.
Phản ứng chymotrypsin được mô tả chi tiết hơn
chi tiết trong Hình 6–21.
của chất nền; phản ứng được tăng cường bởi chung
xúc tác bazơ bởi các nhóm khác trên enzyme (Hình 2).
6–10). Phản ứng chymotrypsin được mô tả chi tiết hơn
chi tiết ở Mục 6.4.
TÓM TẮT 6.2 Cơ chế hoạt động của Enzyme
■ Enzyme là chất xúc tác có hiệu quả cao,
thường tăng tốc độ phản ứng theo hệ số
từ 105 đến 1017.
■ Đặc điểm của các phản ứng được xúc tác bởi enzyme
bằng cách hình thành phức hợp giữa cơ chất và
enzyme (phức hợp ES).
Liên kết cơ chất xảy ra trong một túi trên
enzym gọi là trung tâm hoạt động.
■ Chức năng của enzyme và các chất xúc tác khác là
để giảm năng lượng kích hoạt, G‡ , cho một
phản ứng và do đó làm tăng tốc độ phản ứng.
Trạng thái cân bằng của phản ứng không bị ảnh hưởng bởi
enzym.
■ Một phần đáng kể năng lượng được sử dụng cho
sự cải thiện tỷ lệ enzym có nguồn gốc từ
tương tác yếu (liên kết hydro và
tương tác kỵ nước và ion) giữa
chất nền và enzym. Vị trí hoạt động của enzym
được cấu trúc sao cho một số yếu tố này
tương tác xảy ra ưu tiên trong phản ứng
trạng thái chuyển tiếp, do đó ổn định quá trình chuyển đổi
tình trạng. Nhu cầu tương tác đa dạng là một
nguyên nhân kích thước lớn của enzyme. Các
năng lượng liên kết, GB, có thể được sử dụng để giảm
entropy cơ chất hoặc gây ra một hình dạng
thay đổi enzym (gây ra sự phù hợp). Ràng buộc
năng lượng cũng tạo nên sự tinh tế
tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất của chúng.
■ Cơ chế xúc tác bổ sung được sử dụng bởi
enzyme bao gồm xúc tác axit-bazơ nói chung,
xúc tác cộng hóa trị và xúc tác ion kim loại.
Xúc tác thường liên quan đến cộng hóa trị thoáng qua
tương tác giữa chất nền và
enzym hoặc chuyển nhóm đến và đi từ
6.3 Động học enzyme như một phương
pháp tiếp cận để hiểu cơ chế
Các nhà hóa sinh thường sử dụng một số phương pháp để nghiên cứu
cơ chế hoạt động của enzyme tinh khiết. Kiến thức về cấu trúc ba
chiều của protein
cung cấp thông tin quan trọng và giá trị của thông tin về cấu trúc
được tăng cường đáng kể nhờ hóa học protein cổ điển và các phương
pháp gây đột biến định hướng tại chỗ hiện đại (thay đổi trình tự
axit amin của một
protein bằng kỹ thuật di truyền; xem Hình 9–12). Những cái này
công nghệ cho phép các nhà enzyme kiểm tra vai trò
của từng axit amin trong cấu trúc và hoạt động của enzyme. Tuy
nhiên, phương pháp trung tâm để nghiên cứu
Cơ chế của phản ứng được xúc tác bởi enzyme là xác định tốc độ
phản ứng và sự thay đổi của nó trong
phản ứng với những thay đổi trong các thông số thí nghiệm, một
quy luật được gọi là động học enzyme. Đây là cái lâu đời nhất
cách tiếp cận để hiểu cơ chế enzyme và vẫn là quan trọng nhất. Ở
đây chúng tôi cung cấp phần giới thiệu cơ bản về động học của các
phản ứng được xúc tác bằng enzyme. Các phương pháp điều trị tiên
tiến hơn hiện có tại
nguồn được trích dẫn ở cuối chương.
Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến tốc độ
phản ứng được xúc tác bởi enzyme
Yếu tố chính ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng được xúc tác
bởi enzyme là nồng độ cơ chất, [S].
Tuy nhiên, việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất rất phức
tạp do [S] thay đổi trong quá trình
quá trình phản ứng in vitro khi cơ chất được chuyển đổi thành sản
phẩm. Một cách tiếp cận đơn giản hóa trong động học
thí nghiệm là để đo tốc độ ban đầu ( hoặc
vận tốc), được ký hiệu là V0, khi [S] lớn hơn nhiều so với
nồng độ enzyme, [E]. Trong một phản ứng điển hình,
enzyme có thể hiện diện ở lượng nanomol,
trong khi [S] có thể có năm hoặc sáu bậc độ lớn
cao hơn. Nếu chỉ theo dõi thời điểm bắt đầu phản ứng
(thường là 60 giây đầu tiên hoặc ít hơn), những thay đổi trong [S] có thể
bị giới hạn ở một vài phần trăm và [S] có thể được coi là
không thay đổi. V0 sau đó có thể được khám phá như một hàm của [S],
được điều tra viên điều chỉnh. Tác dụng lên V0
có [S] thay đổi khi nồng độ enzyme được giữ
hằng số được thể hiện trong Hình 6–11. Ở nồng độ cơ chất tương
đối thấp, V0 tăng gần như tuyến tính
Machine Translated by Google

6.3 Động học enzyme như một phương pháp tiếp cận để hiểu cơ chế 203

cơ chất của nó để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất trong

bước đảo ngược tương đối nhanh:
Vmax
k1
ES yz ES (6–7)
k1

Phức hợp ES sau đó bị phân hủy trong một giây chậm hơn
,ú
)t
/n
u
Mập
ch
ố
a
ầ
0t
b
đ
V
(

1 Bước để tạo ra enzyme tự do và sản phẩm phản ứng P:

2 Vmax

k2
ES yz EP (6–8)
k2

Bởi vì phản ứng thứ hai chậm hơn (phương trình 6–8) phải
giới hạn tốc độ của phản ứng tổng thể, tốc độ tổng thể
km phải tỷ lệ thuận với nồng độ của loài
Nồng độ cơ chất, [S] (mM) phản ứng ở bước thứ hai, tức là ES.

HÌNH 6–11 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc ban đầu Tại bất kỳ thời điểm nào trong phản ứng có xúc tác enzyme,
enzyme tồn tại ở hai dạng, dạng E tự do hoặc không kết hợp và
tính chất của phản ứng có xúc tác enzyme. Vmax được ngoại suy từ

âm mưu, bởi vì V0 tiến đến gần nhưng không bao giờ đạt đến Vmax. Nồng độ cơ
dạng kết hợp ES. Ở mức [S] thấp,

chất tại đó V0 đạt cực đại một nửa là Km, Michaelis hầu hết enzyme ở dạng không kết hợp E. Ở đây,

không thay đổi. Nồng độ enzyme trong một thí nghiệm như thế này tỷ lệ này tỷ lệ thuận với [S] vì trạng thái cân bằng

nói chung là thấp đến mức [S] [E] ngay cả khi [S] được mô tả là ở mức thấp của phương trình 6–7 được đẩy theo hướng hình thành nhiều ES hơn

hoặc tương đối thấp. Các đơn vị được hiển thị là điển hình cho xúc tác enzyme khi [S] tăng lên. Tốc độ ban đầu tối đa của phản ứng cat-alyzed

phản ứng và được đưa ra chỉ để giúp minh họa ý nghĩa của V0 và
[S]. (Lưu ý rằng đường cong mô tả một phần của hyperbol hình chữ nhật,
với một tiệm cận tại Vmax. Nếu đường cong tiếp tục ở dưới [S] 0,
nó sẽ tiến tới một tiệm cận đứng tại [S] Km.)
với sự gia tăng [S]. Ở nồng độ cơ chất cao hơn, V0 tăng dần
theo lượng nhỏ hơn trong
phản ứng với sự gia tăng trong [S]. Cuối cùng cũng đạt được một điểm
ngoài mức đó mức tăng của V0 nhỏ đến mức không thể tin được
[S] tăng lên. Vùng V0 giống như cao nguyên này nằm gần
vận tốc cực đại, Vmax.
Phức hợp ES là chìa khóa để hiểu điều này
hành vi động học, giống như nó là điểm khởi đầu cho
thảo luận về xúc tác. Mô hình động học trong Hình 6–11
(Vmax) được quan sát thấy khi hầu như tất cả
enzyme hiện diện dưới dạng phức hợp ES và [E] rất nhỏ. Dưới
những điều kiện này, enzyme được
“bão hòa” với chất nền của nó, do đó tăng thêm
trong [S] không ảnh hưởng đến tốc độ. Điều kiện này tồn tại khi
[S] đủ cao để về cơ bản toàn bộ en-zyme tự do đã được chuyển
hóa thành dạng ES. Sau ES
phức tạp bị phân hủy tạo thành sản phẩm P, en-zyme có thể tự
do xúc tác cho phản ứng của một phân tử khác của
cơ chất. Hiệu ứng bão hòa là một đặc điểm nổi bật của các chất
xúc tác enzyme và chịu trách nhiệm cho
cao nguyên được quan sát trong Hình 6–11. Mô hình được nhìn thấy
trong Hình 6–11 đôi khi được gọi là độ bão hòa
động học.

đã dẫn dắt Victor Henri, theo sự dẫn dắt của Wurtz, đề xuất Khi lần đầu tiên enzyme được trộn với một lượng dư lớn
vào năm 1903 rằng sự kết hợp của một enzyme với phân tử cơ chất của chất nền, có một khoảng thời gian ban đầu, ổn định trước
của nó để tạo thành phức hợp ES là cần thiết trạng thái, trong đó nồng độ ES tích tụ.
bước xúc tác enzym. Ý tưởng này đã được mở rộng thành Khoảng thời gian này thường quá ngắn để có thể dễ dàng quan sát được,

một lý thuyết chung về hoạt động của enzyme, đặc biệt là bởi
Leonor Michaelis và Maud Menten vào năm 1913. Họ cho rằng
enzyme đầu tiên kết hợp thuận nghịch với
chỉ kéo dài vài micro giây. Phản ứng nhanh chóng đạt được
trạng thái ổn định trong đó [ES] (và nồng độ
của bất kỳ sản phẩm trung gian nào khác) gần như không đổi theo
thời gian. Khái niệm trạng thái ổn định được GE Briggs và
Haldane đưa ra vào năm 1925.
V0 đo được thường phản ánh trạng thái ổn định, thậm chí
mặc dù V0 bị giới hạn ở phần đầu của phản ứng,
và phân tích các tỷ lệ ban đầu này được gọi là
động học trạng thái ổn định.

Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất

và tốc độ phản ứng có thể được biểu thị một cách định lượng

Đường cong biểu thị mối quan hệ giữa [S] và

V0 (Hình 6–11) có hình dạng chung giống nhau đối với hầu hết

Leonor Michaelis, Maud Menten, enzyme (nó tiếp cận một hyperbola hình chữ nhật), trong đó
1875–1949 1879–1960 có thể được biểu diễn bằng đại số bởi Michaelis-Menten
Machine Translated by Google

204 Chương 6 Enzyme

phương trình. Michaelis và Menten suy ra phương trình này k1([Et] [ES])[S] k1[ES] k2[ES] (6–14)
bắt đầu từ giả thuyết cơ bản của họ rằng bước giới hạn tốc độ trong
Bước 3 Trong một loạt các bước đại số, bây giờ chúng ta giải
các phản ứng enzyme là sự phân hủy
Phương trình 6–14 cho [ES]. Đầu tiên, vế trái được nhân lên
của phức hợp ES thành sản phẩm và enzyme tự do. Các
ra và phía bên phải được đơn giản hóa để cung cấp
phương trình là

k1[Et][S] k1[ES][S] (k1 k2)[ES] (6–15)

V.ma x [S ]
V0 (6–9)
K tôi [S ] Cộng số hạng k1[ES][S] vào cả hai vế của phương trình

và đơn giản hóa mang lại

Các thuật ngữ quan trọng là [S], V0, Vmax và hằng số

được gọi là hằng số Michaelis, Km. Tất cả những điều khoản này đều k1[Et][S] (k1[S] k1 k2)[ES] (6–16)
dễ dàng đo được bằng thực nghiệm.
Sau đó chúng ta giải phương trình này cho [ES]:
Ở đây chúng ta phát triển logic cơ bản và đại số

các bước trong một phiên bản hiện đại của Michaelis-Menten k 1 [E t] [S
[ES] (6–17)
phương trình, trong đó bao gồm giả định trạng thái ổn định k1[S ] ] k 1 k2

được giới thiệu bởi Briggs và Haldane. Đạo hàm bắt đầu
Điều này bây giờ có thể được đơn giản hóa hơn nữa, kết hợp tỷ lệ
với hai bước cơ bản là hình thành và phân rã ES (phương trình 6–7
các hằng số thành một biểu thức:
và 6–8). Ở giai đoạn đầu phản ứng,

nồng độ của sản phẩm [P] là không đáng kể và [Vết ] [S]

[ES] (6–18)
chúng ta đưa ra giả định đơn giản hóa rằng phản ứng ngược, P n S [S] (k2 k1)/k1
(được mô tả bằng k2), có thể được bỏ qua. Cái này
Số hạng (k2 k1)/k1 được định nghĩa là Michaelis
giả định không quan trọng nhưng nó đơn giản hóa nhiệm vụ của chúng tôi. Các
không đổi, Km. Thay thế phương trình này vào phương trình 6–18
phản ứng tổng thể sau đó giảm xuống
đơn giản hóa biểu thức thành

k2 [v.v.
ES k1 yz ES trên EP [S]
(6–10) [ES] (6–19)
k1 K tôi [S]

V0 được xác định bằng sự phân tách ES để tạo thành sản phẩm, được Bước 4 Bây giờ chúng ta có thể biểu diễn V0 theo [ES]. Thay thế vế
xác định bởi [ES]: phải của Công thức 6–19 cho [ES] trong Công thức 6–11 sẽ cho

V0 k2[ES] (6–11)

k2 [E t][S ]
Bởi vì [ES] trong phương trình 6–11 không dễ đo được V0 (6–20)
K tôi [S ]
về mặt thực nghiệm, chúng ta phải bắt đầu bằng cách tìm một giải pháp thay thế

cách diễn đạt cho thuật ngữ này. Đầu tiên chúng tôi giới thiệu thuật ngữ
[Et], đại diện cho tổng nồng độ enzyme (the
tổng lượng enzyme tự do và enzyme liên kết với cơ chất). Khi đó,
enzyme tự do hoặc không liên kết có thể được biểu thị bằng [Et] [ES].
Ngoài ra, vì [S] thường lớn hơn nhiều so với [Et] nên
Phương trình này có thể được đơn giản hóa hơn nữa. Bởi vì
Vận tốc tối đa xảy ra khi enzyme được xếp hạng bão hòa (nghĩa là
với [ES] [Et]) Vmax có thể được định nghĩa là
k2[Et]. Thay thế giá trị này vào Công thức 6–20 sẽ được Công thức
6–9:

lượng cơ chất được liên kết bởi enzyme ở bất kỳ thời điểm nào
V.ma x [S
thời gian không đáng kể so với tổng [S]. Với những điều này V0
K tôi S]
] [

với các điều kiện đã lưu ý, các bước sau đây sẽ dẫn chúng ta đến

biểu thức cho V0 dưới dạng các thông số có thể đo lường được dễ dàng. Đây là phương trình Michaelis-Menten, tỷ lệ

Bước 1 Tốc độ hình thành và phân hủy ES
được xác định bởi các bước được điều chỉnh bởi hằng số tốc độ k1
(hình thành) và k1 k2 (phân tách), theo biểu thức
Tốc độ hình thành ES k1([Et] [ES])[S]
Tỷ lệ phân tích ES k1[ES] k2[ES]
phương trình phản ứng với một cơ chất được xúc tác bởi enzyme. Đó
là sự phát biểu về mối quan hệ định lượng
giữa vận tốc ban đầu V0 thì vận tốc cực đại
Vmax và nồng độ cơ chất ban đầu [S], tất cả đều được
tính lại thông qua hằng số Michaelis Km. Lưu ý rằng Km
có đơn vị nồng độ. Phương trình có phù hợp với các quan sát thực
(6–12)
nghiệm không? Đúng; chúng ta có thể xác nhận điều này bằng cách
(6–13) xem xét các tình huống giới hạn trong đó [S] rất cao

Bước 2 Bây giờ chúng ta đưa ra một giả định quan trọng: rằng hoặc rất thấp, như trong Hình 6–12.

tốc độ phản ứng ban đầu phản ánh trạng thái ổn định trong đó Một mối quan hệ số học quan trọng xuất hiện từ

[ES] là hằng số, nghĩa là tốc độ hình thành ES là phương trình Michaelis-Menten trong trường hợp đặc biệt khi

bằng với tốc độ phân hủy của nó. Đây được gọi là V0 chính xác bằng một nửa Vmax (Hình 6–12). Sau đó

giả định trạng thái ổn định Các biểu thức trong các phương trình 6–
Vm cây rìu
V.ma x [S
12 và 6–13 có thể được coi là tương đương với trạng thái ổn định, (6–21)
2 K tôi S]
] [

cho đi
Machine Translated by Google

6.3 Động học enzyme như một phương pháp tiếp cận để hiểu cơ chế 205

1
Km [S] khi V0 ⁄ 2Vmax (Eqn 6–23) giữ cho tất cả các enzyme
Vmax [S] V0 Vmax
V0 tuân theo động học Michaelis-Menten. (Nhất
km
những ngoại lệ quan trọng đối với động học Michaelis-Menten là
các enzyme điều hòa, được thảo luận trong Phần 6.5.) Tuy nhiên,
phương trình Michaelis-Menten không phụ thuộc vào
về cơ chế phản ứng hai bước tương đối đơn giản
do Michaelis và Menten đề xuất (Eqn 6–10). Nhiều
/h
)tú 0p
M V
(

1
2 Vmax enzyme tuân theo động học Michaelis-Menten có
cơ chế phản ứng và enzyme hoàn toàn khác nhau
xúc tác cho các phản ứng với sáu hoặc tám bước có thể xác định được, trong số

mười bước đều thể hiện hành vi động học ở trạng thái ổn định giống nhau. Thậm chí

mặc dù Công thức 6–23 đúng với nhiều enzym,

km
Km có thể khác nhau tùy theo loại enzyme. Đây là
[S] (mM)
HÌNH 6–12 Sự phụ thuộc của vận tốc ban đầu vào nồng độ cơ chất. Biểu đồ
này hiển thị các thông số động học xác định giới hạn
của đường cong ở mức cao và thấp [S]. Ở mức [S] thấp, Km [S] và [S]
số hạng trong mẫu số của phương trình Michaelis-Menten (Eqn 6–9)
trở nên không đáng kể. Phương trình được đơn giản hóa thành V0 Vmax[S]/Km và
V0 thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính vào [S], như được quan sát ở đây. Ở mức [S] cao,
ở đâu [S] Km, số hạng Km trong mẫu số của phương trình Michaelis-
Menten trở nên vô nghĩa và phương trình được đơn giản hóa thành
cả độ lớn và ý nghĩa thực sự của Vmax và
hạn chế quan trọng của phương pháp tiếp cận trạng thái ổn định
đối với động học của enzyme. Các thông số Vmax và Km có thể thu
được bằng thực nghiệm đối với bất kỳ enzyme nào, nhưng bằng
bản thân họ cung cấp rất ít thông tin về
số lượng, tỷ lệ hoặc tính chất hóa học của các bước riêng biệt trong
các phản ứng. Tuy nhiên, động học ở trạng thái ổn định là
ngôn ngữ tiêu chuẩn mà các nhà hóa sinh sử dụng để so sánh và
nêu đặc điểm hiệu suất xúc tác của enzyme.

V0 Vmax; điều này phù hợp với cao nguyên được quan sát ở [S] cao. Các
Do đó, phương trình Michaelis-Menten phù hợp với kết quả quan sát được
sự phụ thuộc của V0 vào [S] và hình dạng của đường cong được xác định bởi
Vmax /Km ở [S] thấp và Vmax ở [S] cao.
Giải thích Vmax và Km Hình 6–12 cho thấy một cách đơn giản
phương pháp đồ họa để thu được giá trị gần đúng
cho Km. Một quy trình thuận tiện hơn, sử dụng biểu đồ nghịch
đảo kép, được trình bày trong Hộp 6–1. Km có thể
khác nhau rất nhiều giữa các enzyme và thậm chí đối với các cơ

Khi chia cho Vmax, chúng ta thu được chất khác nhau của cùng một enzyme (Bảng 6–6). Các
thuật ngữ đôi khi được sử dụng (thường không thích hợp) như một
1 [S]
(6–22) chất chỉ thị ái lực của enzyme với cơ chất của nó.
2 km [S]
Ý nghĩa thực tế của Km phụ thuộc vào các khía cạnh cụ thể
Giải Km, ta được Km [S] 2[S], hoặc của cơ chế phản ứng như số lượng và tốc độ tương đối của các

1 bước riêng lẻ. Đối với phản ứng với

Km [S], khi V0 Vmax (6–23) hai bước,
2

k2 k1
Đây là một định nghĩa rất hữu ích và thực tế về Km: Km là km (6–24)
k1
tương đương với nồng độ cơ chất mà tại đó V0 đạt

một nửa Vmax. Khi k2 bị giới hạn tốc độ, k2 k1 và Km giảm xuống
Phương trình Michaelis-Menten (Eqn 6–9) có thể là k1/k1, được định nghĩa là hằng số phân ly,

được chuyển đổi đại số thành các phiên bản hữu ích Kd, của phức hợp ES. Khi những điều kiện này được giữ, Km
trong việc xác định thực tế Km và Vmax (Hộp 6–1) đại diện cho thước đo ái lực của enzyme

và, như chúng tôi sẽ mô tả sau, trong phân tích về

hành động ức chế (xem Hộp 6–2 trang 210). BẢNG 6–6 Km đối với một số enzyme và cơ chất

enzym Cơ chất Km (mM)

Các thông số động học được sử dụng để so sánh

Hoạt động của enzyme Hexokinase (não) ATP 0,4

D-glucose 0,05
Điều quan trọng là phải phân biệt giữa
D-fructose 1,5
Phương trình Michaelis-Menten và phương trình cụ thể
anhydrase cacbonic HCO3 26
cơ chế động học mà nó ban đầu được áp dụng
Chymotrypsin Glycyltyrosinylglycine 108
dựa trên. Phương trình mô tả hành vi động học của
N-Benzoyltyrosinamide 2,5
rất nhiều enzyme và tất cả các enzyme biểu hiện sự
-Galactosidase D-Lactose 4.0
phụ thuộc hyperbol
Threonine dehydratase L-Threonine 5.0
của V0 trên [S] được cho là tuân theo động học
Michaelis-Menten. Quy luật thực tiễn đó
Machine Translated by Google

206 Chương 6 Enzyme

HỘP 6–1 LĨNH VỰC SINH HỌC

Sự biến đổi của Michaelis-Menten là 1/Km trên trục 1/[S]. Biểu diễn nghịch đảo kép, còn

Phương trình: Âm mưu đối ứng kép được gọi là biểu đồ Lineweaver-Burk, có ưu điểm lớn là cho
phép xác định Vmax chính xác hơn , chỉ có thể xấp xỉ từ
Phương trình Michaelis-Menten
biểu đồ đơn giản của V0 so với [S] (xem Hình 2). 6–12).
V.ma x [S ]
V0
K tôi [ S] Các biến đổi khác của Michaelis-Menten

có thể được chuyển đổi đại số thành các phương trình hữu
ích hơn trong việc vẽ đồ thị dữ liệu thực nghiệm. Một phép
biến đổi phổ biến được rút ra đơn giản bằng cách lấy nghịch
đảo cả hai vế của phương trình Michaelis-Menten:
1 K tôi
V 0 V.ma
phương trình đã được rút ra, mỗi phương trình đều có một
số lợi thế đặc biệt trong việc phân tích dữ liệu động học
của enzym. (Xem Vấn đề 11 ở cuối chương này.)
Biểu đồ nghịch đảo kép của tốc độ phản ứng enzyme rất
hữu ích trong việc phân biệt giữa một số loại cơ chế phản
ứng enzyme (xem Hình 6–14) và trong phân tích sự ức chế
[S ]
enzyme (xem Hộp 6–2).
x [ S]

Việc tách các thành phần của tử số ở vế phải của phương

trình sẽ cho
km
Dốc
Vmax
1 K tôi [S]

)
V.0 Vm cây rìu [S] Vm [S]
cây rìu

1
điều đó đơn giản hóa thành

/V(
M
p
1 K 1

1
tôi

tú0h
V.0 Vm cây rìu [S] Vm cây rìu

Dạng phương trình Michaelis-Menten này được gọi là phương

1
trình Lineweaver-Burk. Đối với các enzyme tuân theo mối
Vmax
quan hệ Michaelis-Menten, đồ thị 1/V0 so với 1/[S] (“đối
ứng kép” của đồ thị V0 so với [S] mà chúng ta đã sử dụng 1 1
cho đến thời điểm này) tạo ra một đường thẳng ( Hình 1). km [S]1 ( ) mM

Đường này có độ dốc Km/Vmax, điểm giao nhau là 1/Vmax trên

trục 1/V0 và điểm giao nhau là HÌNH 1 Một biểu đồ nghịch đảo kép hoặc Lineweaver-Burk.

cho cơ chất của nó trong phức hợp ES. Tuy nhiên, kịch bản k1 k2 k3
này không áp dụng cho hầu hết các enzyme. Đôi khi là k2 k1, ES yz yz ES
yz k2 EP EP (6–25)
k1
rồi Km k2/k1. Trong các trường hợp khác, k2 và k1 có thể so
sánh được và Km vẫn là một hàm phức tạp hơn của cả ba hằng Trong trường hợp này, hầu hết enzyme ở dạng EP khi bão hòa
số tốc độ (Eqn 6–24). Phương trình Michaelis-Menten và trạng và Vmax k3[Et]. Sẽ rất hữu ích khi xác định hằng số tốc độ
thái bão hòa đặc trưng của enzyme vẫn được áp dụng, nhưng tổng quát hơn, kcat, để mô tả tốc độ giới hạn của bất kỳ
Km không thể được coi là thước đo đơn giản về ái lực cơ chất. phản ứng xúc tác enzyme nào ở trạng thái bão hòa.
Nếu phản ứng có nhiều bước và một bước rõ ràng là giới
Phổ biến hơn nữa là những trường hợp phản ứng trải qua nhiều hạn tốc độ, thì kcat tương đương với hằng số tốc độ cho
bước sau khi hình thành ES; Km khi đó có thể trở thành một bước giới hạn đó. Đối với phản ứng đơn giản của phương
hàm rất phức tạp với nhiều hằng số tốc độ. trình 6–10, kcat k2. Đối với phản ứng của phương trình 6–25, kcat k3.
Số lượng Vmax cũng thay đổi rất nhiều tùy theo từng en- Khi một số bước bị giới hạn tốc độ một phần, kcat có thể trở
zyme. Nếu một enzyme phản ứng theo cơ chế Michaelis-Menten thành một hàm phức tạp của một số hằng số tốc độ xác định
hai bước, Vmax k2[Et], trong đó k2 là tốc độ giới hạn. Tuy từng bước phản ứng riêng lẻ. Trong phương trình Michaelis-
nhiên, số bước phản ứng và đặc điểm của (các) bước giới hạn Menten, kcat Vmax/[Et] và phương trình 6–9 trở thành
tốc độ có thể khác nhau tùy theo loại enzyme. Ví dụ, hãy xem
xét tình huống khá phổ biến khi việc phát hành sản phẩm, EP
kt ca [ Và ] [S]
n EP, bị giới hạn tỷ lệ. Ở giai đoạn đầu của phản ứng (khi V0 (6–26)
K tôi [ S]
[P] ở mức thấp), phản ứng tổng thể có thể được mô tả bằng sơ
đồ Hằng số kcat là hằng số tốc độ bậc nhất và do đó có đơn
vị thời gian nghịch đảo. Nó còn được gọi là
Machine Translated by Google

6.3 Động học enzyme như một phương pháp tiếp cận để hiểu cơ chế 207

số lượng doanh thu. Nó tương đương với

số lượng phân tử cơ chất được chuyển hóa thành BẢNG 6–7 Số vòng quay, kcat, của một số enzyme

sản phẩm trong một đơn vị thời gian nhất định trên một đơn hàng
enzym Cơ chất kcat (s1 )
phân tử enzyme khi enzyme bão hòa với cơ chất.
Những con số doanh thu Catalase 40.000.000
H2O2
của một số enzyme được đưa ra trong Bảng 6–7. anhydrase cacbonic HCO 400.000
3
Acetylcholinesterase Acetylcholin 14.000
So sánh cơ chế xúc tác và hiệu quả -lactamase Benzylpenicillin 2.000
Các thông số động học kcat và Km nhìn chung rất Fumarase Fumarat 800
hữu ích cho việc nghiên cứu và so sánh Protein RecA (một ATPase) ATP 0,4
của các enzyme khác nhau, cho dù phản ứng của chúng
cơ chế đơn giản hoặc phức tạp. Mỗi
1
enzyme có giá trị kcat và Km phản ánh môi trường tế bào, nồng hằng số có đơn vị là M1 s . Có giới hạn trên
độ cơ chất thông thường tới kcat/Km, được áp đặt bởi tốc độ mà E và S có thể
gặp phải trong cơ thể bởi enzym và tính chất hóa học khuếch tán cùng nhau trong dung dịch nước. Giới hạn kiểm soát
1
của phản ứng được xúc tác. khuếch tán này là 108 đến 109 M1 s , và nhiều enzym
Các thông số kcat và Km cũng cho phép chúng ta đánh giá có kcat/Km gần phạm vi này (Bảng 6–8). Những enzyme như vậy
hiệu suất động học của enzyme, nhưng một trong hai tham số được cho là đã đạt được độ xúc tác hoàn hảo.
một mình là không đủ cho nhiệm vụ này. Hai enzyme xúc tác Lưu ý rằng các giá trị khác nhau của kcat và Km có thể tạo ra
các phản ứng khác nhau có thể có cùng kcat (số doanh thu), tuy tỷ lệ tối đa.

nhiên tốc độ của các phản ứng không được xúc tác có thể cao hơn
khác nhau và do đó việc cải thiện tỷ lệ mang lại
bởi các enzyme có thể khác nhau rất nhiều. Trong thực nghiệm, Km
vì một enzym có xu hướng tương tự như nồng độ cơ chất của nó
trong tế bào. Enzim tác động lên cơ chất
hiện diện ở nồng độ rất thấp trong tế bào thường có
Km thấp hơn enzyme hoạt động trên cơ chất
thì phong phú hơn.
Cách tốt nhất để so sánh hiệu quả xúc tác
của các enzyme khác nhau hoặc sự chuyển hóa các cơ chất khác
nhau của cùng một enzyme là để so sánh tỷ lệ
kcat/Km cho hai phản ứng. Tham số này, đôi khi được gọi là
hằng số đặc hiệu, là hằng số tốc độ chuyển đổi ES thành E P.
Khi [S]
Km, phương trình 6–26 rút gọn về dạng
kcTại
(6–27)
V0
K tôi [Et][S]
V0 trong trường hợp này phụ thuộc vào nồng độ của hai chất
phản ứng [Et] và [S]; do đó đây là tỷ lệ bậc hai
phương trình và hằng số kcat/Km là tốc độ bậc hai
Nhiều enzyme xúc tác phản ứng
với hai hoặc nhiều cơ chất
Chúng ta đã thấy [S] ảnh hưởng như thế nào đến tốc độ của một
phản ứng enzyme đơn giản (Sn P) chỉ với một phân tử cơ chất.
Tuy nhiên, trong hầu hết các phản ứng enzyme, hai (và
đôi khi nhiều hơn) các phân tử cơ chất khác nhau liên kết với
enzym và tham gia phản ứng. Ví dụ, trong phản ứng được xúc tác
bởi hexokinase, ATP và
glucose là các phân tử cơ chất, còn ADP và glu-cose 6-
phosphate là các sản phẩm:
ATP glucose Trên ADP glucose 6-phosphate
Tốc độ của các phản ứng hai cơ chất như vậy cũng có thể được
phân tích bằng phương pháp Michaelis-Menten. Hexokinase có
một Km đặc trưng cho mỗi chất nền của nó (Bảng 6–6).
Phản ứng enzym với hai cơ chất thường liên quan đến
việc chuyển một nguyên tử hoặc một nhóm chức năng từ một cơ chất
chất nền này sang chất nền khác. Các phản ứng này diễn ra theo một

1
BẢNG 6–8 Enzyme có kcat/Km gần với giới hạn kiểm soát khuếch tán (108 đến 109 M1 s )

km kcat /Km
1
enzym Cơ chất kcat (s1 ) (M) (M1 giây )

Acetylcholinesterase Acetylcholin 1,4 104 9 105 1,2 1.6 108

anhydrase cacbonic CO2 1,1 106 102 2,6 102 8.3 107

HCO3 1,4 105 1,1 100 2 1,5 107

Catalase H2O2 1,4 107 105 5 106 4 107
Crotonase Crotonyl-CoA 5,7 103 2,5 105 2 2,8 108
Fumarase Fumarat 1,8 102 105 1.6 108
Malat 1,9 102 3.6 107
-lactamase Benzylpenicillin 2,0 103 1 108

Nguồn: Fersht, A. (1999) Cấu trúc và Cơ chế trong Khoa học Protein, tr. 166, WH Freeman và Công ty, New York.
Machine Translated by Google

208 Chương 6 Enzyme

(Một) Phản ứng enzyme liên quan đến phức hợp bậc ba HÌNH 6–13 Các cơ chế chung của xúc tác enzyme
phản ứng lưỡng chất. (a) Enzim và cả hai cơ chất kết hợp với
Thứ tự ngẫu nhiên
nhau tạo thành phức hợp bậc ba. Trong ràng buộc theo thứ tự,
ES 1
chất nền 1 phải liên kết trước khi chất nền 2 có thể liên kết hiệu quả.

E ES1S2 E P2 P1 Trong liên kết ngẫu nhiên, các chất nền có thể liên kết theo một trong hai thứ tự.

(b) Một phức hợp enzyme-cơ chất hình thành, một sản phẩm rời khỏi
ES 2
phức hợp, enzyme bị biến đổi sẽ tạo thành phức hợp thứ hai với
Đã đặt hàng
S2 một phân tử cơ chất khác và sản phẩm thứ hai rời đi,

E S1 ES1 ES1S2 E P1 P2 tái tạo enzyme. Chất nền 1 có thể chuyển một chức năng

nhóm với enzyme (để tạo thành E biến đổi cộng hóa trị),

sau đó được chuyển sang chất nền 2. Điều này được gọi là

(b)Phản ứng enzyme trong đó không có phức chất bậc ba được hình thành một cơ chế Ping-Pong hoặc dịch chuyển kép.

P1 S2
E S1 ES1 E P1 E ES2 Tập 2

của nhiều con đường khác nhau. Trong một số trường hợp, cả hai cơ rất ngắn, các thí nghiệm thường đòi hỏi các kỹ thuật đặc biệt để

chất được liên kết đồng thời với enzyme ở một số thời điểm. trộn và lấy mẫu rất nhanh. Một

điểm trong quá trình phản ứng, tạo thành phức hợp ba ngôi không cộng Mục tiêu là để có được một bức tranh đầy đủ và định lượng

hóa trị (Hình 6–13a); chất nền liên kết của sự thay đổi năng lượng trong quá trình phản ứng. Như những gì chúng ta có

theo một trình tự ngẫu nhiên hoặc theo một thứ tự cụ thể. Ở nơi khác đã được lưu ý, tốc độ phản ứng và trạng thái cân bằng có liên quan

trường hợp, chất nền đầu tiên được chuyển thành sản phẩm và đến sự thay đổi năng lượng tự do trong quá trình phản ứng. đo-

phân ly trước khi chất nền thứ hai liên kết, vì vậy không

)
phức hợp bậc ba được hình thành. Một ví dụ về điều này là Tăng dần

Cơ chế Ping-Pong, hay cơ chế dịch chuyển kép (Hình 2). [S2]

1
6–13b). Động học ở trạng thái ổn định thường có thể giúp phân biệt

/(M
p
trong số những khả năng này (Hình 6–14).

1
Động học ở trạng thái tiền ổn định có thể cung cấp bằng

chứng cho các bước phản ứng cụ thể túh

0 V
Chúng tôi đã giới thiệu động học làm phương pháp chính để

nghiên cứu các bước trong phản ứng enzyme và chúng tôi có
cũng nêu ra những hạn chế của động học phổ biến nhất
1
các thông số trong việc cung cấp thông tin đó. Hai nhất [S1]1(
(Một)
) mM
các thông số thí nghiệm quan trọng thu được từ

động học ở trạng thái ổn định là kcat và kcat/Km. Sự thay đổi trong
)
kcat và kcat/Km với những thay đổi về độ pH hoặc nhiệt độ có thể Tăng dần
1

cung cấp thêm thông tin về các bước trong phản ứng [S2]
/V(
M
p

con đường. Trong trường hợp phản ứng hai chất nền, động học ở trạng
1

thái ổn định có thể giúp xác định xem liệu ba cơ chất có

tú0h

phức chất được hình thành trong quá trình phản ứng (Hình 6–14). MỘT

bức tranh hoàn chỉnh hơn thường đòi hỏi các phương pháp động học

phức tạp hơn vượt ra ngoài phạm vi của một

văn bản giới thiệu. Sau đây chúng tôi xin giới thiệu ngắn gọn một trong những

Các phương pháp động học quan trọng nhất để nghiên cứu phản ứng

cơ chế, động học trạng thái tiền ổn định.

1
Một mô tả đầy đủ về một phản ứng được xúc tác bởi enzyme đòi
(b) [S1]1 ( ) mM
hỏi phải đo trực tiếp tốc độ của các bước phản ứng riêng lẻ, ví dụ:

đo
HÌNH 6–14 Phân tích động học ở trạng thái ổn định của các phản ứng trên cơ chất.
sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất để tạo thành ES Trong các biểu đồ nghịch đảo kép này (xem Hộp 6–1), nồng độ của
tổ hợp. Chính trong trạng thái tiền ổn định mà tỷ giá chất nền 1 thay đổi trong khi nồng độ chất nền 2 được giữ nguyên

của nhiều bước phản ứng có thể được đo lường độc lập. stan. Điều này được lặp lại cho một số giá trị của [S2], tạo ra một số dòng

Người thí nghiệm điều chỉnh điều kiện phản ứng sao cho riêng biệt. (a) Các đường giao nhau chỉ ra rằng phức hợp bậc ba là

có thể quan sát các sự kiện trong quá trình phản ứng của một chất nền hình thành trong phản ứng; (b) các đường thẳng song song biểu thị đường dẫn

phân tử. Bởi vì giai đoạn trước trạng thái ổn định là Ping-Pong (độ dịch chuyển kép).
Machine Translated by Google

6.3 Động học enzyme như một phương pháp tiếp cận để hiểu cơ chế 209

Tốc độ của các bước phản ứng riêng lẻ cho thấy cách sử dụng năng (a) Ức chế cạnh tranh
lượng của một enzyme cụ thể, đây là thành phần quan trọng của
ES ES EP
cơ chế phản ứng tổng thể. trong một
số trường hợp điều tra viên đã ghi lại được S S
TÔI

tốc độ của từng bước riêng lẻ trong phản ứng enzyme nhiều bước.
Một số ví dụ về ứng dụng của
KI
Động học ở trạng thái tiền ổn định được bao gồm trong phần mô
tả các enzyme cụ thể ở Phần 6.4.
EI
TÔI TÔI

Enzyme có thể bị ức chế thuận nghịch

hoặc không thể đảo ngược (b) Ức chế phi cạnh tranh

ES ES EP
Chất ức chế enzyme là tác nhân phân tử can thiệp vào
với xúc tác, làm chậm hoặc dừng các phản ứng enzyme.
TÔI

Enzyme xúc tác hầu như tất cả các quá trình của tế bào, vì vậy nó S
không có gì đáng ngạc nhiên khi các chất ức chế enzym
KI S
trong số các đại lý dược phẩm quan trọng nhất
được biết đến. Ví dụ, aspirin (acetylsalicylate) ức chế ESI
enzyme xúc tác bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp
TÔI

prostaglandin, các hợp chất liên quan đến nhiều

các quá trình, bao gồm một số quá trình tạo ra đau đớn. Nghiên cứu TÔI

chất ức chế enzyme cũng đã cung cấp thông tin có giá trị về cơ
S
chế enzyme và giúp xác định rõ một số con đường trao đổi chất.
Có hai rộng
(c) Ức chế hỗn hợp
Các nhóm chất ức chế enzyme: có thể đảo ngược và không thể đảo ngược.

ES ES EP
Sự ức chế có thể đảo ngược Một loại phổ biến của sự ức chế có thể đảo ngược

sự ức chế được gọi là cạnh tranh (Hình 6–15a). Chất ức chế cạnh TÔI TÔI

S
tranh cạnh tranh với cơ chất để giành
vị trí hoạt động của một enzym. Trong khi chất ức chế (I) chiếm KI KI S

vị trí hoạt động, nó ngăn cản sự liên kết của chất nền
EI S ESI
tới enzym. Nhiều chất ức chế cạnh tranh là những hợp chất giống
cơ chất và kết hợp với TÔI TÔI

enzyme tạo thành phức hợp EI, nhưng không có đầu

để xúc tác. Ngay cả sự kết hợp thoáng qua của loại hình này cũng sẽ S

làm giảm hiệu suất của enzym. Bằng cách tính đến hình dạng phân S
tử của chất ức chế giống với chất nền, chúng ta có thể đưa ra TÔI TÔI

kết luận về chất nào

phần của chất nền bình thường liên kết với enzyme. Sự ức chế
cạnh tranh có thể được phân tích định lượng bằng
động học trạng thái ổn định. Trước sự xuất hiện của sự cạnh tranh
chất ức chế, phương trình Michaelis-Menten (Eqn 6–9) trở thành
HÌNH 6–15 Ba loại ức chế thuận nghịch. (a) Cạnh tranh
chất ức chế liên kết với vị trí hoạt động của enzyme. (b) Chất ức chế không cạnh tranh
liên kết ở một vị trí riêng biệt nhưng chỉ liên kết với phức hợp ES. KI là
hằng số cân bằng của chất ức chế liên kết với E; KI là hằng số cân bằng của
chất ức chế liên kết với ES. (c) Các chất ức chế hỗn hợp liên kết ở một vị

trí riêng biệt, nhưng có thể liên kết với E hoặc ES.

V.tôi cây rìu [S ]

V0 (6–28)
K tôi [S ]

Ở đâu lớp phủ bằng cách thêm nhiều chất nền. Khi [S] vượt xa [I],
xác suất để một phân tử chất ức chế sẽ liên kết với
[]
TÔI
[E ][ ]
TÔI

1 và KI enzyme được giảm thiểu và phản ứng thể hiện một

K TÔI
Phương trình 6–28 mô tả các đặc điểm quan trọng của
ức chế cạnh tranh. Bằng thực nghiệm đã xác định
biến Km , Km quan sát được khi có sự hiện diện của
chất ức chế, thường được gọi là Km “rõ ràng”.
Vì chất ức chế liên kết thuận nghịch với enzyme nên
sự cạnh tranh có thể thiên vị để ủng hộ chất nền sim-
[E ]
TÔI
1
Vmax bình thường Tuy nhiên, [S] tại đó V0 Vmax ,
2
Km biểu kiến , tăng khi có mặt chất ức chế
nhân tố . Hiệu ứng này trên Km rõ ràng, kết hợp với
sự vắng mặt của tác động lên Vmax được chẩn đoán là có sự ức
chế cạnh tranh và dễ dàng được bộc lộ trong biểu đồ đối ứng kép
(Hộp 6–2). Hằng số cân bằng cho
liên kết chất ức chế, KI, có thể thu được từ cùng một âm mưu.
Machine Translated by Google

210 Chương 6 Enzyme

HỘP 6–2 LĨNH VỰC SINH HỌC

Kiểm tra động học để xác định từ sự thay đổi độ dốc tại bất kỳ [I] nào. Biết [I] và chúng
ta có thể
, tính KI từ biểu thức
Cơ chế ức chế
[
1
TÔI]

Biểu đồ tương hỗ kép (xem Hộp 6–1) đưa ra một cách dễ dàng để
K TÔI

xác định xem chất ức chế enzyme là cạnh tranh, không cạnh
Đối với sự ức chế không cạnh tranh và hỗn hợp, các biểu
tranh hay hỗn hợp. Hai bộ thí nghiệm tốc độ được thực hiện,
đồ dữ liệu tốc độ tương tự cung cấp các họ đường được hiển
với nồng độ enzyme được giữ không đổi trong mỗi bộ. Trong tập
thị trong Hình 2 và 3. Những thay đổi trong trục chặn các
đầu tiên, [S] cũng được giữ không đổi, cho phép đo tác động
thay đổi tín hiệu trong Vmax và Km.
của việc tăng nồng độ chất ức chế [I] lên tốc độ ban đầu V0
(không hiển thị). Trong tập thứ hai, [I] được giữ không đổi
nhưng [S] thay đổi. Các kết quả được vẽ dưới dạng 1/V0 so với
1
V0 (Vmax
km
)[S]
1
Vmax
1/[S].

2 [TÔI]

Hình 1 thể hiện một tập hợp các sơ đồ tương hỗ kép, một

)
sơ đồ thu được khi không có chất ức chế và hai sơ đồ thu được 1,5

1
ở các nồng độ khác nhau của chất ức chế cạnh tranh. [I] tăng 1

/V(
M
p
dần dẫn đến một họ các đường có điểm chặn chung trên trục 1/

1
tú0h
V0 nhưng có độ dốc khác nhau.
Bởi vì điểm chặn trên trục 1/V0 bằng 1/Vmax, nên chúng ta
biết rằng Vmax không thay đổi khi có sự hiện diện của chất ức
1
chế cạnh tranh. Nghĩa là, bất kể nồng độ của chất ức chế km
cạnh tranh là bao nhiêu, nồng độ cơ chất đủ cao sẽ luôn đẩy
chất ức chế ra khỏi vị trí hoạt động của enzyme. Phía trên
1
biểu đồ là sự sắp xếp lại của Phương trình 6–28 làm cơ sở cho
[S]1 ( ) mM
biểu đồ. Giá trị của có thể được tính
HÌNH 2 Sự ức chế không cạnh tranh.

1
(Vmax
km
)[S]
1 1
V0 Vmax 1
V0 (Vmax
km
)[S]
1
Vmax
)
[TÔI]

3
)

[TÔI]
1
1

2
/V(
M
p
/V(
M
p

1
tú0h
1

1
tú0h

Không có chất ức chế Không có chất ức chế

1 km
Dốc
Vmax Vmax

1 1
[S]1 [S] 1
( ) mM ( ) mM

HÌNH 1 Ức chế cạnh tranh. HÌNH 3 Ức chế hỗn hợp.

Một liệu pháp y tế dựa trên sự cạnh tranh tại vị trí
hoạt động được sử dụng để điều trị cho những bệnh nhân
đã uống phải metanol, một dung môi có trong chất chống đông
dòng khí. Enzym gan dehydrogenase chuyển hóa metanol thành
formaldehyde, chất này gây tổn hại cho nhiều mô. Mù mắt là kết
mắt đặc biệt nhạy cảm với formaldehyde.
Ethanol cạnh tranh hiệu quả với metanol như một chất nền thay
thế cho rượu dehydrogenase. Tác dụng của ethanol rất giống tác
dụng của chất ức chế cạnh tranh, với điểm khác biệt là ethanol
cũng là chất nền cho enzyme dehydrogenase của rượu và nồng độ

quả phổ biến của việc uống phải metanol, bởi vì của nó sẽ giảm dần theo thời gian.
Machine Translated by Google
6.3 Động học enzyme như một phương pháp tiếp cận để hiểu cơ chế
thời gian enzyme chuyển nó thành acetaldehyde. Phương pháp điều trị
ngộ độc metanol là truyền tĩnh mạch chậm
ethanol, với tốc độ duy trì nồng độ được kiểm soát trong máu trong vài
giờ. Điều này làm chậm
sự hình thành formaldehyde, làm giảm bớt sự nguy hiểm
trong khi thận lọc metanol để thải ra ngoài
vô hại trong nước tiểu. ■
Hai loại ức chế thuận nghịch khác, không cạnh tranh và hỗn hợp,
mặc dù thường được định nghĩa theo thuật ngữ enzyme một cơ chất, trong
thực tế chỉ được quan sát thấy với
enzyme có từ hai cơ chất trở lên. Một chất ức chế không cạnh tranh
(Hình 6–15b) liên kết ở một vị trí khác biệt
từ vị trí hoạt động của chất nền và, không giống như vị trí cạnh tranh
chất ức chế, chỉ liên kết với phức hợp ES. Trong sự hiện diện
của chất ức chế không cạnh tranh, Michaelis-Menten
phương trình được thay đổi thành
V.rìu m [ S]
V0
K tôi [S]
Ở đâu
[ [ES ][ ]
1 và K
TÔI
TÔI ]
K [ES ]
TÔI
TÔI
TÔI
Như được mô tả trong phương trình 6–29, ở nồng độ cao
của chất nền, V0 tiến tới Vmax/. Do đó, chất ức chế không cạnh tranh
sẽ làm giảm Vmax đo được. Rõ ràng
Km cũng giảm, vì [S] cần đạt
một nửa Vmax giảm theo hệ số .
Một chất ức chế hỗn hợp (Hình 6–15c) cũng liên kết tại một vị trí
khác biệt với vị trí hoạt động của cơ chất, nhưng nó liên kết với E
hoặc ES. Phương trình tốc độ mô tả chất ức chế hỗn hợp là
V.rìu m [S]
V0
K tôi [ S]
ở đâu và được định nghĩa như trên. Chất ức chế hỗn hợp
thường ảnh hưởng đến cả Km và Vmax. Trường hợp đặc biệt của
, hiếm khi gặp trong các thí nghiệm, theo cách cổ điển
được định nghĩa là sự ức chế không cạnh tranh. Ex-amine Công thức 6–30
để hiểu tại sao chất ức chế không cạnh tranh sẽ ảnh hưởng đến Vmax mà
không ảnh hưởng đến Km.
Phương trình 6–30 đóng vai trò là biểu thức tổng quát cho
tác dụng của các chất ức chế thuận nghịch, đơn giản hóa thành các biểu
thức ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh khi
1.0 hoặc 1.0 tương ứng. Từ biểu thức này
chúng ta có thể tóm tắt tác dụng của chất ức chế đối với từng cá nhân
các thông số động học. Đối với tất cả các chất ức chế thuận nghịch, rõ ràng
Vmax Vmax/, vì vế phải của Công thức 6–30
luôn đơn giản hóa thành Vmax/ ở chất nền đủ cao
nồng độ. Đối với các chất ức chế cạnh tranh, 1.0 và
do đó có thể được bỏ qua. Lấy biểu thức này làm rõ ràng
Vmax, chúng ta cũng có thể rút ra biểu thức tổng quát cho Km biểu kiến
để chỉ ra tham số này thay đổi như thế nào khi có mặt các chất ức chế
thuận nghịch. Km rõ ràng , như mọi khi,
bằng [S] tại đó V0 là Vmax biểu kiến một nửa hoặc,
tổng quát hơn, khi V0 Vmax/2. Điều kiện này là
211
BẢNG 6–9 Tác dụng của thuốc ức chế thuận nghịch trên
Vmax biểu kiến và Km biểu kiến
Loại chất ức chế Vmax rõ ràng Km rõ ràng
Không có Vmax km
Cạnh tranh
Vmax km
Không cạnh tranh
Vmax/ Km/
Trộn Vmax/ Km/
gặp nhau khi [S] Km/. Như vậy, biểu kiến Km Km/.
Biểu thức này đơn giản hơn khi hoặc bằng 1,0 (đối với
chất ức chế không cạnh tranh hoặc cạnh tranh), như đã tóm tắt
trong Bảng 6–9.
Trong thực tế, sự ức chế không cạnh tranh và hỗn hợp
(6–29) chỉ được quan sát đối với các enzyme có hai cơ chất trở lên—chẳng hạn
như S1 và S2—và rất quan trọng trong quá trình
phân tích thực nghiệm của các enzyme như vậy. Nếu chất ức chế
liên kết với vị trí thường được S1 chiếm giữ, nó có thể hoạt động như
một chất ức chế cạnh tranh trong các thí nghiệm trong đó [ S1]
đa dạng. Nếu một chất ức chế liên kết với vị trí thường được S2 chiếm
giữ , thì nó có thể hoạt động như một chất ức chế hỗn hợp hoặc không
cạnh tranh của S1. Các kiểu ức chế thực tế được quan sát phụ thuộc vào
việc liệu các sự kiện liên kết với S1 và S2 có
được sắp xếp theo thứ tự hoặc ngẫu nhiên, và do đó thứ tự các chất nền
liên kết và các sản phẩm rời khỏi vị trí hoạt động có thể là
xác định. Sử dụng một trong các sản phẩm phản ứng làm chất
chất ức chế thường đặc biệt mang tính thông tin. Nếu chỉ một trong
Có hai sản phẩm phản ứng, không có phản ứng nghịch
có thể xảy ra. Tuy nhiên, một sản phẩm thường liên kết với
một phần của trung tâm hoạt động, do đó đóng vai trò là chất ức chế.
(6–30) Các nhà nghiên cứu enzyme có thể sử dụng các nghiên cứu động học phức
tạp liên quan đến sự kết hợp và số lượng sản phẩm khác nhau và
chất ức chế để phát triển một bức tranh chi tiết về cơ chế của phản
ứng hai chất nền.
Sự ức chế không thể đảo ngược Các chất ức chế không thể đảo ngược là
những chất liên kết cộng hóa trị với hoặc phá hủy một chức năng
nhóm trên một enzyme cần thiết cho hoạt động của enzyme
hoạt động, hoặc những hoạt động tạo thành một liên kết không cộng hóa
trị đặc biệt ổn định. Sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa
một chất ức chế không thể đảo ngược và một enzyme là phổ biến. Các
chất ức chế không thể đảo ngược là một công cụ hữu ích khác để nghiên
cứu các cơ chế phản ứng. Axit amin có chất xúc tác chính
các chức năng trong trang hoạt động đôi khi có thể được xác định
bằng cách xác định dư lượng nào liên kết cộng hóa trị với
chất ức chế sau khi enzym bị vô hoạt. Một ví dụ là
được hiển thị trong Hình 6–16.
Một loại chất ức chế không thể đảo ngược đặc biệt là chất bất
hoạt tự sát. Các hợp chất này tương đối không phản ứng cho đến khi
chúng liên kết với vị trí hoạt động của một chất cụ thể.
enzim. Một người ngừng hoạt động tự sát trải qua vài giai đoạn đầu tiên
các bước hóa học của phản ứng enzyme thông thường, nhưng thay vì được
chuyển hóa thành sản phẩm thông thường,
Machine Translated by Google

212 Chương 6 Enzyme

ồ CH3
Enz CH2 O H F PCHồ
(Ser195)
ồ CH3
C

oV
g0l
H3C H CH3
DIFP
FH

ồ CH3
Enz CH2 ôi P CH 246
pH
ồ CH3
(Một) Pepsin
C
H3C H CH3

HÌNH 6–16 Sự ức chế không thể đảo ngược. Phản ứng của chymotrypsin với

diisopropylfluorophosphate (DIFP) ức chế enzyme này không thể phục hồi.

Điều này đã dẫn đến kết luận rằng Ser195 là Ser trang hoạt động chính
dư lượng trong chymotrypsin.

oV
g0 l
chất khử hoạt tính được chuyển thành hợp chất rất dễ phản ứng
kết hợp không thuận nghịch với enzyme. Những hợp chất này còn
được gọi là chất bất hoạt dựa trên cơ chế, vì chúng cướp đi phản
6 số 8 10
ứng enzyme bình thường.
pH
cơ chế vô hoạt enzyme. Chất bất hoạt tự sát đóng một vai trò
(b) Glucose 6-phosphatase
quan trọng trong việc thiết kế thuốc hợp lý, một
cách tiếp cận hiện đại để có được dược phẩm mới HÌNH 6–17 Đặc tính pH hoạt động của hai enzyme. Những đường cong này
tác nhân trong đó các nhà hóa học tổng hợp các chất nền mới được xây dựng từ các phép đo vận tốc ban đầu khi tái

dựa trên kiến thức về cơ chất và cơ chế phản ứng. Một thiết bị hành động được thực hiện trong các bộ đệm có độ pH khác nhau. Bởi vì pH là thang

bất hoạt tự sát được thiết kế tốt dành riêng cho loga-rithmic phản ánh những thay đổi gấp 10 lần của [H], nên những thay đổi trong V0 là

một enzyme duy nhất và không có phản ứng cho đến khi nằm trong vị trí cũng được vẽ theo thang logarit. pH tối ưu cho hoạt động
hoạt động của enzyme đó, vì vậy các loại thuốc dựa trên phương pháp này có thể của enzyme thường gần với pH của môi trường trong đó
mang lại lợi ích quan trọng là ít tác dụng phụ (xem enzyme thường được tìm thấy. (a) Pepsin, thủy phân một số chất

Ô 22–2). liên kết peptide của protein trong quá trình tiêu hóa ở dạ dày, có độ pH

tối ưu khoảng 1,6. Độ pH của dịch dạ dày nằm trong khoảng từ 1 đến 2.

Hoạt động của enzyme phụ thuộc vào độ pH (b) Glucose 6-phosphatase của tế bào gan (tế bào gan), có độ
pH tối ưu khoảng 7,8, chịu trách nhiệm giải phóng glucose vào máu.
Enzyme có độ pH tối ưu (hoặc phạm vi pH) mà tại đó Độ pH bình thường của bào tương của tế bào gan là khoảng 7,2.
hoạt động của chúng là tối đa (Hình 6–17); ở mức cao hơn hoặc thấp hơn

pH, hoạt tính giảm. Điều này không có gì đáng ngạc nhiên. Axit amin
chuỗi bên có thể được thay đổi đáng kể. Ví dụ, một
chuỗi bên trong vị trí hoạt động có thể hoạt động như axit yếu và
điện tích dương gần đó có thể làm giảm pKa của Lys
bazơ có chức năng quan trọng phụ thuộc vào việc duy trì trạng
dư lượng và điện tích âm gần đó có thể làm tăng nó.
thái ion hóa nhất định và những nơi khác trong
Những hiệu ứng như vậy đôi khi dẫn đến pKa bị dịch chuyển bởi
chuỗi bên bị ion hóa protein có thể đóng vai trò thiết yếu
vài đơn vị pH so với giá trị của nó trong axit amin tự do.
vai trò trong các tương tác duy trì cấu trúc protein.
Ví dụ, trong enzyme acetoacetate decarboxylase,
Ví dụ, loại bỏ một proton khỏi dư lượng của Ngài,
một dư lượng Lys có pKa là 6,6 (so với 10,5
có thể loại bỏ sự tương tác ion cần thiết để ổn định cấu trúc
trong lysine tự do) do tác dụng tĩnh điện của các điện tích
hoạt động của enzyme. Một nguyên nhân ít phổ biến hơn gây ra độ
dương gần đó.
nhạy pH là việc chuẩn độ một nhóm trên
cơ chất.

Khoảng pH mà enzyme trải qua TÓM TẮT 6.3 Động học enzyme như một cách tiếp cận

những thay đổi trong hoạt động có thể cung cấp manh mối về loại
dư lượng axit amin có liên quan (xem Bảng 3–1). Một sự thay đổi
chẳng hạn, trong hoạt động gần pH 7,0, thường phản ánh sự chuẩn
độ của dư lượng His. Tuy nhiên, những ảnh hưởng của độ pH phải
được dự đoán trước một cách thận trọng. Một cách chặt chẽ
Môi trường đóng gói của protein, pKa của axit amin
để hiểu cơ chế
■ Hầu hết các enzyme đều có những đặc tính động học
chung nhất định. Khi chất nền được thêm vào
enzyme, phản ứng nhanh chóng đạt được trạng thái ổn định
trạng thái trong đó tốc độ ES
Machine Translated by Google

6.4 Ví dụ về phản ứng enzym 213

các dạng phức tạp cân bằng tốc độ mà nó dạng, (2) cấu trúc của từng chất trung gian và mỗi
phản ứng. Khi [S] tăng, trạng thái ổn định trạng thái chuyển tiếp, (3) tốc độ chuyển đổi lẫn nhau giữa các
Hoạt động của nồng độ enzyme cố định chất trung gian, (4) mối quan hệ cấu trúc của
tăng theo kiểu hyperbol để tiếp cận một enzyme cho từng chất trung gian và (5) năng lượng
tốc độ tối đa đặc trưng, Vmax, tại đó được đóng góp bởi tất cả các nhóm phản ứng và tương tác để
về cơ bản tất cả các enzyme đã hình thành một phức chất trung gian và trạng thái chuyển tiếp. Cho đến nay,
phức tạp với chất nền. có lẽ không có enzyme nào mà chúng ta hiểu biết đáp ứng được tất

■ Nồng độ cơ chất dẫn đến cả những yêu cầu này. Nhiều

Tuy nhiên, nhiều thập kỷ nghiên cứu đã tạo ra thông tin cơ học
tốc độ phản ứng bằng một nửa Vmax là
về hàng trăm enzym, và trong
Hằng số Michaelis Km, đặc trưng
một số trường hợp thông tin này rất chi tiết.
của mỗi enzym tác động lên một cơ chất nhất định.
Chúng tôi trình bày ở đây cơ chế của bốn enzyme:
Phương trình Michaelis-Menten
chymotrypsin, hexokinase, enolase và lysozyme.
V.ma x [S ] Những ví dụ này không nhằm mục đích bao gồm tất cả những gì có thể
V0 K tôi
[S ] các lớp hóa học enzyme. Họ được chọn một phần

bởi vì chúng là một trong những enzyme được hiểu rõ nhất,

liên hệ vận tốc ban đầu với [S] và Vmax thông qua
và một phần vì chúng minh họa rõ ràng một số vấn đề chung
hằng số Km. Động học Michaelis-Menten là
nguyên tắc được nêu trong chương này. Cuộc thảo luận tập trung
còn được gọi là động học trạng thái ổn định.
vào các nguyên tắc được lựa chọn, cùng với một số vấn đề chính
■ Km và Vmax có ý nghĩa khác nhau đối với những thí nghiệm đã giúp mang lại những nguyên tắc này
enzym khác nhau. Tỷ lệ giới hạn của một vào trọng tâm. Chúng tôi sử dụng ví dụ chymotrypsin để xem xét
phản ứng xúc tác enzyme ở trạng thái bão hòa là một số quy ước được sử dụng để mô tả cơ chế enzyme. Nhiều chi
được mô tả bằng hằng số kcat, doanh thu tiết máy móc và bằng chứng thực nghiệm nhất thiết phải bị bỏ qua;
con số. Tỷ lệ kcat/Km mang lại kết quả tốt
không một cuốn sách nào có thể ghi lại đầy đủ lịch sử thực nghiệm
thước đo hiệu suất xúc tác. Phương trình Michaelis- phong phú của những
Menten cũng có thể áp dụng cho bisubstrate enzyme. Cũng vắng mặt trong các cuộc thảo luận này là sự đóng
phản ứng xảy ra theo phức chất bậc ba hoặc góp đặc biệt của coenzym cho hoạt động xúc tác.
Con đường Ping-Pong (chuyển dịch kép). của nhiều enzym. Chức năng của coenzym rất đa dạng về mặt hóa

■ Sự ức chế thuận nghịch của một enzym là học và chúng tôi mô tả từng loại khi gặp phải.

cạnh tranh, không cạnh tranh hoặc hỗn hợp. ở Phần II.

Chất ức chế cạnh tranh cạnh tranh với cơ chất

bằng cách liên kết thuận nghịch với vị trí hoạt
động, nhưng chúng không bị biến đổi bởi enzyme.
Các chất ức chế không cạnh tranh chỉ liên kết với ES
phức tạp, tại một địa điểm khác biệt với địa điểm đang hoạt động.
Các chất ức chế hỗn hợp liên kết với E hoặc ES, một lần nữa ở
một trang web khác biệt với trang web đang hoạt động. Không thể đảo ngược
sự ức chế chất ức chế liên kết vĩnh viễn với một
vị trí hoạt động bằng cách hình thành một liên kết cộng hóa trị hoặc một liên kết rất
tương tác không cộng hóa trị ổn định.
■ Mỗi enzyme đều có độ pH tối ưu (hoặc độ pH
phạm vi) mà tại đó nó có hoạt động tối đa.
Cơ chế Chymotrypsin liên quan đến quá trình
acyl hóa và khử acyl hóa dư lượng Ser
chymotrypsin tuyến tụy của bò (Mr 25,191) là một pro-tease, một
loại enzyme xúc tác quá trình phân cắt thủy phân
của liên kết peptit. Protease này đặc hiệu cho peptide
liên kết liền kề với các gốc axit amin thơm (Trp,
Phe, Tyr). Cấu trúc ba chiều của chymo-trypsin được thể hiện
trong Hình 6–18, với các nhóm chức năng
trong trang hoạt động được nhấn mạnh. Phản ứng được xúc tác bởi
enzyme này minh họa nguyên tắc trạng thái chuyển tiếp
ổn định và cũng cung cấp một ví dụ cổ điển về

6.4 Ví dụ về phản ứng enzym
Cho đến nay chúng ta đã tập trung vào các nguyên tắc chung của
xúc tác và giới thiệu một số thông số động học dùng để mô tả hoạt
động của enzyme. Bây giờ chúng ta rẽ
một số ví dụ về cơ chế phản ứng enzyme cụ thể.
Sự hiểu biết về cơ chế hoạt động hoàn chỉnh của một enzyme
tinh khiết đòi hỏi phải xác định được tất cả
chất nền, đồng yếu tố, sản phẩm và chất điều hòa. Hơn nữa, nó
xúc tác axit-bazơ nói chung và xúc tác cộng hóa trị.
Chymotrypsin tăng cường tỷ lệ liên kết peptide
thủy phân với hệ số ít nhất là 109 . Nó không xúc tác sự tấn công
trực tiếp của nước vào liên kết peptide; thay vào đó, một chất
trung gian acyl-enzym cộng hóa trị thoáng qua là
hình thành. Phản ứng do đó có hai giai đoạn riêng biệt. TRONG
giai đoạn acyl hóa, liên kết peptit bị cắt và
Liên kết este được hình thành giữa peptit cacbonyl
cacbon và enzym. Trong giai đoạn khử acyl,
Liên kết este bị thủy phân và enzyme không bị acyl hóa
được tái sinh.
Bằng chứng đầu tiên về chất trung gian acyl-enzym cộng hóa

đòi hỏi kiến thức về (1) trình tự thời gian trong đó phản ứng trị đến từ một ứng dụng cổ điển của quá trình tiền ổn định.
gắn enzyme trung gian động học trạng thái. Ngoài tác dụng lên các polypeptide,
Machine Translated by Google

214 Chương 6 Enzyme

một chuỗi
13
16

42
S
S
S
của anh57

S 58

Chuỗi B

Asp102 (b) (c)

122

136
146
149

S
168
S S
S
182 Ser195

191 Cơ chất
Ser195
S chuỗi C
201
S

220
của anh57

245
(Một) (d)

HÌNH 6–18 Cấu trúc của chymotrypsin. (PDB ID 7GCH) (a) Sự tái ừ 6–21. (c) Xương sống polypeptide như một cấu trúc dải băng. Liên

hiện cấu trúc bậc một, thể hiện các liên kết disulfua và các gốc kết disul-fide có màu vàng; ba chuỗi được tô màu như trong phần (a).

axit amin thiết yếu cho xúc tác. Protein bao gồm ba chuỗi (d) Cận cảnh vị trí hoạt động với chất nền (chủ yếu là màu xanh lá cây).

polypeptide được liên kết bằng liên kết disulfide. (Việc đánh số
các gốc trong chymotrypsin, với các gốc “thiếu” 14, 15, 147 và
148, được giải thích trong Hình 6–33.) Các gốc axit amin ở vị trí
hoạt động được nhóm lại với nhau trong cấu trúc ba chiều. (b)
Hình mô tả enzym làm nổi bật bề mặt của nó. Túi trong đó chuỗi
bên axit amin thơm của cơ chất được liên kết được thể hiện trong
màu xanh lá. Dư lượng chính của trang hoạt động, bao gồm Ser195, His57 và Asp102,
có màu đỏ. Vai trò của các dư lượng này trong xúc tác được minh họa trong hình-
Hai trong số các dư lượng của vị trí hoạt động, Ser195 và His57
(cả hai đều màu đỏ), có thể nhìn thấy được một phần. Ser195 tấn
công nhóm carbonyl của cơ chất (oxy có màu tím); điện tích âm đang
phát triển trên oxy được ổn định nhờ lỗ oxyanion (nitơ amit màu
cam), như được giải thích trong Hình 6–21. Trong cơ chất, chuỗi
bên axit amin thơm và nitơ amit của liên kết peptit cần cắt (nhô
ra về phía người xem và chiếu đường đi của phần còn lại của chuỗi
polypeptide cơ chất) có màu xanh lam.

chymotrypsin cũng xúc tác quá trình thủy phân các este và
amit nhỏ. Những phản ứng này chậm hơn nhiều so với quá
trình thủy phân peptide vì năng lượng liên kết có sẵn ít
hơn với các chất nền nhỏ hơn và do đó chúng dễ nghiên cứu
hơn. Các cuộc điều tra của BS Hartley và BA Kilby vào năm
1954 đã phát hiện ra rằng quá trình thủy phân chymotrypsin
của este p-nitrophenylacetate, được đo bằng cách giải phóng
p-nitrophenol, đã diễn ra với tốc độ bùng nổ nhanh chóng
trước khi chững lại ở tốc độ chậm hơn (Hình 6–19). Bằng
cách ngoại suy trở lại thời gian bằng 0, họ kết luận rằng
pha nổ tương ứng với chỉ dưới một phân tử p-nitrophenol
được giải phóng cho mỗi phân tử enzyme có mặt. Hartley và
Kilby cho rằng điều này phản ánh quá trình acyl hóa nhanh
chóng tất cả các phân tử enzyme (với sự giải phóng p-
nitrophenol), với tốc độ quay vòng tiếp theo của enzyme bị
giới hạn bởi bước khử acyl chậm. Kết quả tương tự cũng thu
được với nhiều enzyme khác. Việc quan sát pha bùng nổ cung
cấp một ví dụ khác về việc sử dụng động học để chia một
phản ứng thành các bước cấu thành của nó.
Machine Translated by Google

6.4 Ví dụ về phản ứng enzym 215

3.0 Số hạng 1/Km phản ánh sự ion hóa của nhóm -amino
của Ile16 (ở đầu tận cùng amino của một trong ba chuỗi
polypeptide của chy-motrypsin). Nhóm này hình thành
cầu muối tới Asp194, ổn định cấu hình hoạt động của enzyme.
2.0 Khi nhóm này mất proton ở
độ pH cao, cầu muối bị loại bỏ và sự thay đổi về hình dạng sẽ
đóng túi kỵ nước nơi
he
lone) oy
pm
/ rz
l tn
o
l -e
i
m
o p
N
(
m

1.0
(Một)

0
0 123
v
Thời gian (phút)

ồ
B
O2N OOC CH3
ồ

O2N Ồ
678 9 10
p-Nitrophenylaxetat p-Nitrophenol pH

(b)
nhanh
ồ
B
Enz ồ

Ồ EnzO ồ OC CH3 ồ

chậm

mèo
ồ H2O
B

CH3 C OH
ồ ồ

A-xít a-xê-tíc

6 7 số 8 9 10
HÌNH 6–19 Bằng chứng động học ở trạng thái tiền ổn định của enzyme acyl
pH
trung cấp. Quá trình thủy phân p-nitrophenylacetate bằng chymotrypsin
được đo bằng cách giải phóng p-nitrophenol (một sản phẩm có màu). Ban đầu, (c)
phản ứng giải phóng nhanh chóng p-nitrophenol gần như theo phép
đo cân bằng hóa học với lượng enzyme có mặt. Điều này phản ánh
giai đoạn acyl hóa nhanh của phản ứng. Tốc độ tiếp theo chậm hơn vì
Tốc độ luân chuyển enzyme bị hạn chế bởi tốc độ của giai đoạn khử acyl chậm hơn. 1
km

Các tính năng bổ sung của cơ chế chymotrypsin

đã được làm sáng tỏ bằng cách phân tích sự phụ thuộc của
phản ứng trên pH. Tỷ lệ xúc tác chymotrypsin
sự phân tách thường biểu hiện pro-file tỷ lệ pH hình chuông
(Hình 6–20). Tỷ lệ được vẽ trong Hình 6–20a là
thu được ở nồng độ cơ chất thấp (bão hòa) và do đó đại diện
cho kcat/Km. Cốt truyện có thể là
được mổ xẻ sâu hơn bằng cách đầu tiên đạt được tỷ lệ tối đa
ở mỗi độ pH, sau đó vẽ đồ thị kcat theo pH (Hình 2).
6–20b); sau khi thu được Km ở mỗi độ pH, các nhà nghiên cứu
sau đó có thể vẽ đồ thị 1/Km (Hình 6–20c). Động học và cấu trúc
các phân tích đã tiết lộ rằng sự thay đổi trong kcat phản ánh
trạng thái ion hóa của His57. Sự suy giảm của kcat ở mức thấp
pH là kết quả của sự proton hóa His57 (do đó nó không thể
tách proton từ Ser195 ở bước 1 của phản ứng;
xem Hình 6–21). Sự giảm tốc độ này minh họa tầm quan trọng
của xúc tác axit và bazơ nói chung trong
678 9 10
pH
HÌNH 6–20 Sự phụ thuộc pH của các phản ứng được xúc tác bởi
chymotrypsin. (a) Tốc độ phân cắt qua trung gian chymotrypsin
tạo ra biểu đồ tốc độ pH hình chuông với mức tối ưu ở pH 8,0. Tỷ lệ (v) là
âm mưu là ở nồng độ cơ chất thấp và do đó phản ánh
hạn kcat/Km. Đồ thị có thể được chia thành các thành phần bằng cách sử
dụng phương pháp động học để xác định các số hạng kcat và Km riêng biệt tại
mỗi độ pH. Khi điều này được thực hiện (b và c), có thể thấy rõ rằng sự
chuyển vị ngay trên pH7 là do sự thay đổi của kcat, trong khi sự chuyển tiếp
trên pH 8,5 là do sự thay đổi trong 1/Km. Các nghiên cứu động học và cấu
trúc đã chỉ ra rằng các chuyển đổi được minh họa trong (b) và (c) phản ánh
trạng thái ion hóa của chuỗi bên His57 (khi cơ chất không bị ràng buộc)
và nhóm -amino của Ile16 (ở đầu amino của chuỗi B),
tương ứng. Để có hoạt động tối ưu, His57 phải không được kích thích và Ile16

cơ chế của chymotrypsin Những thay đổi trong phải được proton hóa.
Machine Translated by Google

216 Chương 6 Enzyme

Chymotrypsin
(enzim tự do)

Chất nền (một polypeptide)

Cách đọc Cơ chế phản ứng— O
J AAnOC OC HONHOC OCHOHOAAn
Một buổi bồi dưỡng Asp102 CG B B
R1
MỘT

ồ
của anh57
ồ ồ
Các cơ chế phản ứng hóa học, theo dõi sự
H
hình thành và phá vỡ các liên kết cộng G
N
hóa trị, được truyền đạt bằng các dấu chấm N 1
và mũi tên cong, một quy ước được gọi HO Ser195
một cách không chính thức là “đẩy điện tử”. Khi chất nền liên kết, mặt
Liên kết cộng hóa trị bao gồm một cặp Túi kỵ nước chuỗi dư lượng liền kề với
liên kết peptit bị cắt
electron dùng chung. Các electron không
nép mình trong một túi kỵ nước
liên kết quan trọng đối với cơ chế phản H H
Trang web đang hoạt động

D G
trên enzyme, định vị vị trí
ứng được ký hiệu bằng dấu chấm (OH). Mũi N N liên kết peptit để tấn công.
lỗ oxyanion
tên cong ( ) biểu thị chuyển động của các Gly193 Ser195

cặp electron. Để chuyển động của một

electron (như trong phản ứng gốc tự do), người ta
7
sử dụng mũi tên một đầu (kiểu lưỡi câu) ( ). Hầu hết Sản phẩm enzyme
các bước phản ứng đều liên quan đến cặp electron không chia Sản phẩm 2 2 phức hợp
sẻ (như trong cơ chế chymotrypsin). HOO OCHONH
C OAAn
B
của anh57
Một số nguyên tử có độ âm điện lớn hơn những nguyên tử khác; nghĩa ồ

là chúng hút electron mạnh hơn. Độ âm điện tương đối của các nguyên H
G
tử gặp trong văn bản này là F > O > N > C ≈ S > P ≈ H. Ví dụ, hai cặp N
Sự khuếch tán của N
electron tạo thành liên kết CO (cacbonyl) không chia sẻ như nhau;
sản phẩm thứ hai H O Ser195
carbon tương đối thiếu điện tử vì oxy hút đi các điện tử. Nhiều từ hoạt động
HOOC OCHOHOAAn
phản ứng liên quan đến một nguyên tử giàu electron (một nucleophile) trang web tái sinh B

phản ứng với một nguyên tử thiếu electron (một electrophile). Một enzim tự do. ồ

số nucleophile và electrophile phổ biến trong hóa sinh được H H

D G
trình bày ở bên phải. N N
Ser195
Nói chung, một cơ chế phản ứng được bắt đầu ở một cặp electron Gly193

không chia sẻ của nucleophile. Trong sơ đồ cơ chế, đáy của mũi tên
đẩy electron xuất phát gần các chấm của cặp electron và đầu mũi
tên hướng thẳng vào trung tâm ái điện đang bị tấn công. Trong
Nucleophiles điện di
trường hợp cặp electron không chia sẻ tạo ra điện tích âm chính
thức cho nucleophile, bản thân ký hiệu điện tích âm có thể đại diện :R

cho cặp electron không chia sẻ và đóng vai trò là chân đế của mũi O- C
tên. Trong cơ chế chymotrypsin, cặp electron nucleophilic trong tích điện âm ồ
phức hợp ES giữa bước 1 và 2 được cung cấp bởi oxy của nhóm hydroxyl oxy (như trong một
nguyên tử cacbon của một
Ser195 . Cặp electron này (2 trong số 8 electron hóa trị của oxy hydroxyl không proton
nhóm cacbonyl (các
nhóm hoặc bị ion hóa
hydroxyl) tạo thành đáy của mũi tên cong. Trung tâm ái điện bị độ âm điện lớn hơn
axit cacboxylic)
tấn công là cacbonyl cacbon của liên kết peptit bị cắt. Các oxy của cacbonyl
nguyên tử C, O và N có tối đa 8 electron hóa trị và H có tối đa S- nhóm kéo electron ra

2. Những nguyên tử này đôi khi được tìm thấy ở trạng thái không ổn khỏi nguyên tử cacbon)
tích điện âm
định với số electron hóa trị ít hơn mức phân bổ tối đa của chúng, sulfhydryl :R
ngoại trừ C, O và N. không thể có nhiều hơn 8. Do đó, khi cặp +
C N
electron từ Ser195 của chymo-trypsin tấn công carbonyl carbon của C-
H
chất nền, một cặp electron bị dịch chuyển khỏi lớp vỏ hóa trị
carbon (bạn không thể có 5 liên kết với carbon!). Những cacbanion Nhóm imine phát âm

electron này di chuyển về phía oxy cacbonyl có độ âm điện lớn (được kích hoạt cho nucleophilic
:

N tấn công carbon bằng cách

hơn. Oxy có 8 electron hóa trị cả trước và sau quá trình hóa học
sự proton hóa của imine)
này, nhưng số electron chia sẻ với carbon giảm từ 4 xuống 2 và
Chưa tính phí
oxy carbonyl thu được điện tích âm. Trong bước tiếp theo, cặp electron ồ
:R
nhóm amin
mang điện tích âm cho oxy di chuyển trở lại để hình thành lại liên OPO
kết với carbon và thiết lập lại liên kết carbonyl. Một lần nữa, một
ồ
cặp electron phải được dịch chuyển khỏi carbon và lần này là cặp
HN N:
Phốt pho của
electron được chia sẻ với nhóm amino của liên kết peptide. Điều
một nhóm photphat
này phá vỡ liên kết peptide. Các bước còn lại thực hiện theo mô hình Imidazol

tương tự. :R
HO– H+

Ion hydroxit proton

Machine Translated by Google

6.4 Ví dụ về phản ứng enzym 217

Sự tương tác của Ser195 và His57 tạo ra ion

alkoxide nucleophilic mạnh trên Ser195; ion tấn
công nhóm peptide carbonyl, tạo thành enzyme acyl Sự mất ổn định của điện tích âm trên cơ
tứ diện. Điều này đi kèm với chất oxy carbonyl dẫn đến sự sụp đổ của chất
phức hợp ES
sự hình thành điện tích trung gian tứ diện; sự tái hình thành
âm tồn tại trong thời của anh57
liên kết đôi với carbon làm thay thế liên kết
gian ngắn trên giữa carbon và nhóm amino của liên kết peptide,
H
G
tồn tại trong thời gian ngắn
oxy carbonyl của phá vỡ liên kết peptide. Amino rời đi
N trung cấp
chất nền, được ổn N
(acyl hóa)
định bằng liên Ser195
H O
kết hydro trong lỗ nhóm được proton hóa bởi
của anh57

oxyanion. AAnOC OC H O NHOC OCHOHOAAn His57, tạo điều kiện cho

B B
H
R1 G sự dịch chuyển của nó.
MỘT

ồ ồ
N
2 NH
H H
D G
H
MỘT

N N Ơ Ser195
Gly193 Ser195
AAnOC OC H O NHOCOCHONHOAAn
MỘT

B
R1
MỘT MỘT

ồ ồ
H
D H
G
N N
Gly193 Ser195 Sản phẩm 1
CƠ CHẾ HÌNH 6–21 Sự phân cắt thủy phân liên kết peptit bằng
chymotrypsin. Phản ứng có hai giai đoạn. Trong giai đoạn acyl hóa
AA NOC OC H ONHH
3 B
R1
MỘT

(bước 1 đến 3), sự hình thành chất trung gian acyl-enzym cộng hóa trị là ồ

kết hợp với sự phân cắt liên kết peptit. Trong giai đoạn khử acyl

(bước 4 đến 7), quá trình khử acyl sẽ tái tạo enzyme tự do; về cơ bản đây
của anh57

là sự đảo ngược của giai đoạn acyl hóa, với sự phản chiếu của nước, trong
H
ngược lại, vai trò của thành phần amin của cơ chất. Cơ chế G
N
Chymo-trypsin N

Ơ Ser195

C OCHOHOAAn
MỘT

B
ồ
tồn tại trong thời gian ngắn

trung cấp H H
D G
(khử acyl) N N
H Gly193 Ser195
D
của anh57 HOO

H Enzym acyl Enzym acyl

6 G trung cấp trung cấp
N
NH Hồ
4

ồ Ser195 của anh57

HOO OCCHOA HƠN

MỘT

An H
ồ

G
N Một phân tử nước đi
MỘT

ồ
5 N vào bị khử proton bởi xúc tác
H H
D G ồ Ser195 bazơ thông thường, tạo ra ion
Sự sụp đổ H
của tứ
N N D hydroxit nucleophilic
HOO HƠN An
C OC HOA
MỘT

Gly193 Ser195
diện B mạnh.
ồ Sự tấn công của hydroxit vào
hình thức trung
gian thứ hai H H liên kết este của enzyme
D G acyl tạo ra chất trung gian tứ
sản phẩm, một anion cacboxylat, N N
Gly193 Ser195 diện thứ hai, với
và thay thế Ser195.
oxy trong lỗ oxyanion lại mang
điện tích âm.

*Chất trung gian tứ diện trong con đường phản ứng chymotrypsin, hình thành liên kết, trong khi trạng thái chuyển tiếp là một phần của quá trình
và chất trung gian tứ diện thứ hai hình thành sau này đôi khi được gọi là sự phản ứng lại. Trong trường hợp của chymotrypsin, do mối quan hệ chặt chẽ giữa

trạng thái chuyển tiếp, điều này có thể dẫn đến nhầm lẫn. MỘT trạng thái chuyển tiếp trung gian và trạng thái chuyển tiếp thực tế nên sự khác biệt

trung gian là bất kỳ loại hóa chất nào có thời gian tồn tại hữu hạn, “hữu hạn” giữa chúng thường xuyên được che đậy. Hơn nữa, sự tương tác
được định nghĩa là dài hơn thời gian cần thiết cho một dao động phân tử của oxy tích điện âm với nitơ amit trong
(~1013 giây). Trạng thái chuyển tiếp đơn giản là loại năng lượng tối đa lỗ oxyanion, thường được gọi là ổn định trạng thái chuyển tiếp, cũng
được hình thành trên tọa độ phản ứng và không có phục vụ để ổn định chất trung gian trong trường hợp này. Không phải tất cả các sản phẩm trung gian

cuộc sống hữu hạn. Các chất trung gian tứ diện được hình thành trong phản tồn tại rất ngắn đến mức chúng giống với các trạng thái chuyển tiếp. Chất
ứng chy-motrypsin gần giống nhau, cả về mặt năng lượng và cấu trúc, các trung gian chy-motrypsin acyl-enzym ổn định hơn và hiệu quả hơn
trạng thái chuyển tiếp dẫn đến sự hình thành và phân hủy của chúng. dễ dàng được phát hiện và nghiên cứu, và nó không bao giờ bị nhầm lẫn với trạng thái

Tuy nhiên, sản phẩm trung gian đại diện cho một giai đoạn cam kết hoàn thành chuyển tiếp.
Machine Translated by Google

218 Chương 6 Enzyme

chuỗi bên axit amin thơm của chất nền chèn (Một)

(Hình 6–18). Chất nền không còn có thể liên kết đúng cách,
được đo động học khi tăng Km.
Chất nucleophile trong pha acyl hóa là oxy-gen của Ser195.
(Protease có dư lượng Ser đóng vai trò
vai trò này trong các cơ chế phản ứng được gọi là pro-tease
serine.) pKa của nhóm hydroxyl Ser nói chung là
quá cao để dạng không proton có mặt ở nồng độ đáng kể ở pH sinh
lý. Tuy nhiên, trong
chymotrypsin, Ser195 được liên kết với His57 và Asp102 trong một
mạng lưới liên kết hydro được gọi là chất xúc tác
bộ ba. Khi chất nền peptide liên kết với chymotrypsin,
một sự thay đổi nhỏ về hình dạng sẽ nén liên kết hydro giữa
His57 và Asp102, dẫn đến
tương tác mạnh hơn, được gọi là hydro có rào cản thấp
liên kết. Sự tương tác nâng cao này làm tăng pKa của
(b)
His57 từ ~7 (đối với histidine miễn phí) xuống 12, cho phép
Dư lượng của anh ta hoạt động như một cơ sở chung được tăng cường có thể

loại bỏ proton khỏi nhóm hydroxyl Ser195 . Sự khử proton ngăn

chặn sự phát triển của một chất rất không ổn định
điện tích dương trên hydroxyl Ser195 và tạo ra
Chuỗi bên Ser là một nucleophile mạnh hơn. Ở phản ứng sau
giai đoạn, His57 cũng hoạt động như một nhà tài trợ proton, tạo ra proton

nhóm amino ở phần bị dịch chuyển của cơ chất

(nhóm rời đi).
Khi oxy Ser195 tấn công nhóm carbonyl của
chất nền, một chất trung gian tứ diện có thời gian tồn tại rất
ngắn được hình thành trong đó oxy cacbonyl thu được một
điện tích âm (Hình 6-21). Điện tích này, hình thành bên trong
HÌNH 6–22 Cảm ứng phù hợp trong hexokinase. (a) Hexokinase có cấu trúc
một túi trên enzyme gọi là lỗ oxyanion, được ổn định nhờ các
hình chữ U (PDB ID 2YHX). (b) Các đầu chụm lại về phía nhau
liên kết hydro do amit tạo ra
khác trong sự thay đổi về hình dạng gây ra bởi sự liên kết của D-glucose
nhóm gồm hai liên kết peptit ở xương sau chymotrypsin. Một (màu đỏ) (bắt nguồn từ PDB ID 1HKG và PDB ID 1GLK).
trong những liên kết hydro này (được đóng góp bởi
Gly193) chỉ hiện diện ở dạng trung gian này và ở dạng
trạng thái chuyển tiếp cho sự hình thành và phân hủy của nó; nó Hydroxyl ở C-6 của glucose (mà -
làm giảm năng lượng cần thiết để đạt được các trạng thái này. Đây là phosphoryl của ATP được chuyển trong phản ứng hexokinase) có
một ví dụ về việc sử dụng năng lượng liên kết trong xúc tác. khả năng phản ứng hóa học tương tự với nước và
Vai trò của tính bổ sung trạng thái chuyển tiếp trong môi trường nước tự do đi vào trung tâm hoạt động của enzym. Tuy nhiên,
Xúc tác zyme được khám phá sâu hơn trong Hộp 6-3. hexoki-nase lại ủng hộ phản ứng với glucose với hệ số 106 .
Enzym có thể phân biệt giữa glucose và nước do sự thay đổi về

Hexokinase trải qua sự phù hợp cảm hình dạng của enzyme
khi chất nền phù hợp liên kết (Hình 6–22). Do đó, Hexoki-nase
ứng trên liên kết cơ chất
cung cấp một ví dụ điển hình về sự phù hợp được tạo ra. Khi
Men hexokinase (Mr 107,862) là enzyme bisubstrate không có glucose, enzyme ở trạng thái không hoạt động với chuỗi
xúc tác cho phản ứng thuận nghịch bên axit amin ở vị trí hoạt động nằm ngoài

vị trí để phản ứng. Khi glucose (không phải nước)

Mg ATP 2
CH2OH CH2OPO3 và liên kết Mg ATP, năng lượng liên kết có nguồn gốc từ điều này

ồ Mg ADP ồ tương tác gây ra sự thay đổi về hình dạng của hexoki-nase thành
H Ồ H Ồ dạng hoạt động xúc tác.
H H

ôi H ôi H Mô hình này đã được củng cố bằng các nghiên cứu động học.
hexokinase
H O H H O H Đường xyloza 5 cacbon, có cấu trúc hóa học tương tự
với glucose nhưng ngắn hơn một carbon, liên kết với hexokinase
H Ồ H Ồ
-D-Glucose nhưng ở một vị trí mà nó không thể bị phosphoryl hóa.
Glucose 6-photphat
Tuy nhiên, việc bổ sung xyloza vào hỗn hợp phản ứng sẽ làm tăng
ATP và ADP luôn liên kết với các enzyme dưới dạng phức hợp với tốc độ thủy phân ATP. Rõ ràng,
ion kim loại Mg2. liên kết của xyloza đủ để gây ra sự thay đổi trong
Machine Translated by Google

6.4 Ví dụ về phản ứng enzym 219

hexokinase về dạng hoạt động của nó và enzyme dư lượng axit amin tại chỗ (những thứ được đưa vào vị trí
do đó bị “lừa” vào nước phosphoryl hóa. Các bởi sự thay đổi về hình dạng theo sau chất nền
Phản ứng hexokinase cũng minh họa rằng tính đặc hiệu của enzyme liên kết) tham gia vào quá trình xúc tác axit-bazơ nói chung và
không phải lúc nào cũng là vấn đề đơn giản liên kết với hợp ổn định trạng thái chuyển tiếp.

chất này chứ không phải hợp chất khác. Trong trường hợp hexokinase,
tính đặc hiệu không được quan sát thấy trong sự hình thành ES Cơ chế phản ứng Enolase

phức tạp nhưng ở tốc độ tương đối của các bước xúc tác tiếp Yêu cầu ion kim loại
theo. Nước không bị loại trừ khỏi vị trí hoạt động,
Một enzyme glycolytic khác, enolase, xúc tác quá trình khử nước
nhưng tốc độ phản ứng tăng lên rất nhiều khi có mặt
có thể đảo ngược của 2-phosphoglycerate thành phospho-
chất nhận nhóm phosphoryl chức năng (glucose).
enolpyruvate:
H O H O
ồ ồ
C C ôi D ôi D
C ồ C ồ
H OHC H OHC B enolase B

2O
MỘT MỘT

H ồ

C ồ

ôi P ồ

ồ C ồ

ồ ồ

P ồ

ồ H
H O C H H O C H B
H O CH2
MỘT MỘT MỘT

ồ ồ
CH2
ồ

H C Ồ H
CH2OH H OH C
Xylose
Sự phù hợp cảm ứng chỉ là một khía cạnh của cơ chế xúc tác
của hexokinase—như chymotrypsin, hexokinase
sử dụng một số chiến lược xúc tác. Ví dụ, hoạt động-
C Ồ
2-Phosphoglycerate Phosphoenolpyruvat
Nấm men enolase (Mr 93.316) là dimer có 436 axit amin
CH2OH dư lượng trên mỗi tiểu đơn vị. Phản ứng enolase minh họa một
Glucose
loại xúc tác ion kim loại và cung cấp thêm
ví dụ về xúc tác axit-bazơ nói chung và ổn định trạng thái
chuyển tiếp. Phản ứng xảy ra theo hai bước
(Hình 6–23a). Đầu tiên, Lys345 hoạt động như một chất xúc tác bazơ chung,

Mg2 PO23 Mg2 PO23

ồ
ồ H
ồ
ồ H PO23
HOH
Mg2 C CC H Mg2 CCCH ồ
ồ H
ồ 1 ồ 2
H Ồ Ồ CC C
HO Ơ HO Ơ ồ H
H
HNHC HNHC
Enolase
Lys345 Glam211 Lys345 Glam211

(Một) 2-Phosphoglycerate liên kết với enzyme Enolic trung gian Phosphoenolpyruvat

Lys345
Mg2

CƠ CHẾ HÌNH 6–23 Phản ứng hai bước có xúc tác

bằng enolase. (a) Cơ chế chuyển hóa enolase

2-PGA 2-phosphoglycerate (2-PGA) thành phosphoenolpyruvate. Các
Mg2
nhóm carboxyl của 2-PGA được phối hợp bởi hai magie
ion tại vị trí hoạt động. Một proton được trừu tượng hóa ở bước 1 bằng cách

xúc tác bazơ chung (Lys345), và chất trung gian enolic

thu được được ổn định bởi hai ion Mg2. Loại bỏ
của OOH ở bước 2 được tạo điều kiện thuận lợi bởi axit chung

Glam211 xúc tác (Glam211). (b) Chất nền, 2-PGA, liên quan đến
các ion Mg2 , Lys345 và Glam211 trong hoạt chất enolase
địa điểm. Nguyên tử hydro không được hiển thị. Tất cả các nguyên tử oxy

của 2-PGA có màu xanh nhạt; phốt pho có màu cam (ID PDB

(b) 1 MỘT).
Machine Translated by Google

HỘP 6–3 LÀM VIỆC TRONG LĨNH SINH HỌC

Bằng chứng về sự bổ sung trạng

thường xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptit
thái chuyển tiếp-Enzym bên cạnh các axit amin thơm. Các chất nền thể hiện trong

Trạng thái chuyển tiếp của một phản ứng rất khó nghiên cứu
vì nó rất ngắn ngủi. Để hiểu được enzyme
Tuy nhiên, trong quá trình xúc tác, chúng ta phải phân tích sự tương
tác giữa enzyme và thời điểm phù du này trong
quá trình của một phản ứng. Sự bổ sung giữa en-zyme và trạng thái
chuyển tiếp gần như là một yêu cầu
cho chất xúc tác, bởi vì ngọn đồi năng lượng mà trên đó
trạng thái chuyển tiếp là mức mà enzyme phải hạ xuống nếu
xúc tác sẽ xảy ra. Làm thế nào chúng ta có thể có được bằng chứng cho
Sự bổ sung trạng thái chuyển tiếp-enzim? May mắn thay,
Hình 1 là các mô hình nhỏ hơn thuận tiện cho các chất nền tự nhiên
(polypeptide và protein dài). Các
nhóm hóa chất bổ sung được thêm vào trong mỗi chất nền
(A đến B đến C) được tô bóng. Như bảng cho thấy, sự tương tác giữa
enzyme và các nhóm chức năng được thêm vào này có ảnh hưởng tối
thiểu đến Km (xem ở đây
như sự phản ánh của Kd) nhưng lại có tác động tích cực lớn đến kcat
và kcat/Km. Đây là điều chúng ta mong đợi nếu sự tương tác đóng góp
phần lớn vào sự ổn định của
trạng thái chuyển tiếp. Kết quả cũng chứng minh rằng

chúng ta có nhiều cách tiếp cận khác nhau, cũ và mới, để giải quyết tốc độ phản ứng có thể bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự tương tác giữa
vấn đề này, mỗi cách đều cung cấp bằng chứng thuyết phục enzyme và cơ chất ở xa về mặt vật lý.
ủng hộ nguyên lý hoạt động chung này của enzyme. các liên kết cộng hóa trị bị thay đổi trong phản ứng được xúc tác

bởi enzyme. Chymotrypsin được mô tả nhiều hơn

Mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt động
chi tiết trong văn bản.
Nếu enzyme bổ sung cho quá trình chuyển đổi phản ứng
Một phương pháp thử nghiệm bổ sung là biến đổi enzyme, loại bỏ
trạng thái, thì một số nhóm chức năng trong cả cơ chất và enzyme
một số cơ chất enzyme
phải tương tác ưu tiên trong
tương tác bằng cách thay thế dư lượng axit amin cụ thể
trạng thái chuyển tiếp chứ không phải ở phức hợp ES.
thông qua đột biến định hướng tại chỗ (xem Hình 9–12).
Việc thay đổi các nhóm này sẽ ít ảnh hưởng đến
Kết quả từ những thí nghiệm như vậy một lần nữa chứng minh
sự hình thành phức hợp ES và do đó không nên
tầm quan trọng của năng lượng liên kết trong việc ổn định trạng
ảnh hưởng đến các thông số động học (hằng số phân ly,
thái chuyển tiếp.
Kd; hoặc đôi khi là Km, nếu Kd Km) phản ánh
Cân bằngyz
ES ES. Thay đổi các nhóm tương tự Tương tự trạng thái chuyển tiếp

sẽ có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ chung (kcat hoặc Mặc dù các trạng thái chuyển tiếp không thể được quan sát trực tiếp
Tuy nhiên, kcat/Km) của phản ứng là do giới hạn nhưng các nhà hóa học thường có thể dự đoán gần đúng
chất nền thiếu các tương tác liên kết tiềm năng cần thiết cấu trúc của trạng thái chuyển tiếp dựa trên tích lũy

để giảm năng lượng kích hoạt. kiến thức về cơ chế phản ứng. Sự chuyển tiếp
Một ví dụ tuyệt vời về hiệu ứng này được thấy trong trạng thái theo định nghĩa là nhất thời và không ổn định đến mức
động học liên kết với một loạt các chất nền liên quan phép đo trực tiếp sự tương tác ràng buộc giữa
đối với enzyme chymotrypsin (Hình 1). Chymotrypsin loài này và enzyme là không thể. Trong một số

kcat Km kcat/Km
ồ ồ (s1 ) (mM) (M1 )S 1
CH2
B MỘT B

Chất nền A CH3 ôi CôiNHOC CH ồ

NH2 0,06 31 2

ồ CH2 ồ ồ
B MỘT B B
Chất nền B CH3
ôi ôi

C NH CH C ôi ồ

NH CH2 ONH2 C 0,14 15 10

ồ CH2 ồ CH3 ồ
B B B
114
MỘT MỘT

Chất nền C CH3

ôi ôi

C NH CH C ồ

NH ồ

CH ồ

CONH2 2,8 25

HÌNH 1 Ảnh hưởng của những thay đổi nhỏ về cấu trúc trong chất nền đến các thông số động học của quá trình thủy phân amit được xúc tác bởi chymotrypsin.

220
Machine Translated by Google

tuy nhiên, trong các trường hợp, các phân tử ổn định có thể được Các kháng thể xúc tác thường không đạt được hiệu quả xúc tác
thiết kế giống với trạng thái chuyển tiếp. Chúng được gọi là chất của enzyme, tuy nhiên việc sử dụng chúng trong y tế và công nghiệp

tương tự trạng thái chuyển tiếp. Về nguyên tắc, chúng phải liên vẫn đang nổi lên. Ví dụ, các kháng thể xúc tác được thiết kế để

kết với en-zyme chặt hơn so với chất nền trong phức hợp ES, vì chúng phân hủy co-caine đang được nghiên cứu như một phương pháp hỗ trợ

phải phù hợp với vị trí hoạt động tốt hơn (nghĩa là hình thành số tiềm năng trong việc điều trị chứng nghiện cocaine.

lượng tương tác yếu lớn hơn) so với chính chất nền. Ý tưởng về các
chất tương tự trạng thái chuyển tiếp được Pauling đề xuất vào những

năm 1940 và nó đã được khám phá bằng cách sử dụng một số enzyme.
Thủy phân este
Những thí nghiệm này có hạn chế là chất tương tự trạng thái chuyển
Ồ
tiếp không thể mô phỏng hoàn hảo trạng thái chuyển tiếp. Tuy nhiên,

một số chất tương tự liên kết enzyme chặt hơn từ 102 đến 106 lần so
R1
H EO H
C R2
với cơ chất thông thường, cung cấp bằng chứng rõ ràng rằng các vị
B
trí hoạt động của enzyme thực sự bổ sung cho các trạng thái chuyển ồ
tiếp. Nguyên tắc tương tự hiện nay được sử dụng trong ngành dược

phẩm để thiết kế các loại thuốc mới.

‡
Các loại thuốc chống HIV mạnh mẽ được gọi là chất ức chế protease

được thiết kế một phần dưới dạng chất tương tự trạng thái chuyển Ồ Vài
bước
tiếp liên kết chặt chẽ hướng vào vị trí hoạt động của protease HIV. Các sản phẩm
R1 HEHO
R2
ł

Kháng thể xúc tác Nếu ồ

một chất tương tự ở trạng thái chuyển tiếp có thể được thiết kế Trạng thái chuyển tiếp

cho S nP phản ứng, thì một kháng thể liên kết chặt chẽ với chất
ồ
tương tự này có thể sẽ xúc tác cho S nP. Kháng thể (globulin miễn R1
HEHO
dịch; xem Hình 5–23) là thành phần chính của phản ứng miễn dịch. P R2
Khi một chất tương tự ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng làm
ồ
epitope gắn với protein để kích thích sản xuất kháng thể, các kháng
Chất tương tự (ester photphonate)
thể liên kết với nó là chất xúc tác tiềm năng của phản ứng tương

ứng. Thủy phân cacbonat

Việc sử dụng “kháng thể xúc tác” lần đầu tiên được đề xuất bởi Ồ
H
William P. Jencks vào năm 1969, đã trở nên thiết thực nhờ sự phát G ồ ồ
H ANH TA
N
C
ồ

triển của các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm để tạo ra số lượng D
kháng thể giống hệt nhau liên kết với một kháng nguyên cụ thể (kháng H B
ồ NO2
thể đơn dòng; xem Chương 5).

Công việc tiên phong trong phòng thí nghiệm của Richard Lerner
và Peter Schultz đã dẫn đến việc phân lập một số kháng thể đơn dòng

xúc tác quá trình thủy phân este hoặc cacbonat (Hình 2). Trong ‡
những phản ứng này, sự tấn công của nước (OH) lên carbonyl carbon Ồ Vài
H bước
tạo ra trạng thái chuyển tiếp tứ diện trong đó một phần điện tích G ồ ồ Các sản phẩm
H ANH TA
N
C
ồ

âm đã phát triển trên oxy car-bonyl. Các hợp chất este photphonat D
H
bắt chước cấu trúc và sự phân bố điện tích của trạng thái chuyển ồ NO2
tiếp này trong quá trình thủy phân este, khiến chúng trở thành chất
Trạng thái chuyển tiếp
tương tự trạng thái chuyển tiếp tốt; Các hợp chất este photphat

được sử dụng cho phản ứng thủy phân cacbonat. Các kháng thể liên
H ồ
kết chặt chẽ với hợp chất phosphonate hoặc photphat đã được phát G ồ ANH TAồ
H ồ

N P
hiện là có thể đẩy nhanh phản ứng thủy phân este hoặc cacbonat
D
tương ứng theo hệ số từ 103 đến 104 . Các phân tích cấu trúc của H
ồ
NO2
một số kháng thể xúc tác này đã chỉ ra rằng một số chuỗi bên axit
Chất tương tự (ester photphat)
amin xúc tác được sắp xếp sao cho chúng có thể tương tác với cơ

chất ở trạng thái chuyển tiếp. HÌNH 2 Các trạng thái chuyển tiếp dự kiến của các phản ứng thủy phân este

hoặc cacbonat. Các hợp chất este photphonat và este photphat tương ứng

tạo ra các chất tương tự trạng thái chuyển tiếp tốt cho các phản ứng này.

221
Machine Translated by Google
222 Chương 6 Enzyme
tách proton từ C-2 của 2-phosphoglycerate;
sau đó Glam211 đóng vai trò như một chất xúc tác axit nói chung, tạo ra một
proton vào nhóm rời khỏi OOH. Proton ở C-2 của
2-phosphoglycerate không có tính axit cao và do đó không
dễ dàng loại bỏ. Tuy nhiên, ở vị trí hoạt động của enzyme, 2-
photphoglycerate trải qua tương tác ion mạnh
với hai ion Mg2 liên kết (Hình 6–23b), làm cho proton C-2 có
tính axit cao hơn (giảm pKa ) và dễ dàng điều chỉnh hơn
trừu tượng. Liên kết hydro với amino tại vị trí hoạt động khác
dư lượng axit cũng góp phần vào cơ chế tổng thể.
Các tương tác khác nhau ổn định một cách hiệu quả cả
enolate trung gian và trạng thái chuyển tiếp trước đó
sự hình thành của nó.
Lysozyme sử dụng hai nucleophilic liên tiếp
Phản ứng dịch chuyển
Lysozyme là chất kháng khuẩn tự nhiên được tìm thấy trong nước mắt
và lòng trắng trứng. Lysozyme lòng trắng trứng gà (Mr 14,296)
là một monome có 129 gốc axit amin. Đây là
enzyme đầu tiên có cấu trúc ba chiều
được xác định bởi David Phillips và các đồng nghiệp vào năm 1965.
Cấu trúc bộc lộ bốn liên kết disulfide ổn định
và một khe hở chứa vị trí hoạt động (Hình 6–24a; xem
cũng như Hình 4–18). Hơn 5 thập kỷ nghiên cứu về lysozyme đã
cung cấp một bức tranh chi tiết về
cấu trúc và hoạt động của enzyme, và một điều thú vị
câu chuyện về sự phát triển của khoa học sinh hóa.
Chất nền của lysozyme là peptidoglycan, một carbohydrat
được tìm thấy trong nhiều thành tế bào vi khuẩn (xem hình 2).
7–22). Lysozyme phân cắt (1n4) glycosid COO
liên kết giữa hai loại cặn đường trong phân tử là axit N-
acetylmuramic (Mur2Ac) và N-acetyl-glucosamine (GlcNAc), thường
được gọi là NAM và
NAG, tương ứng, trong tài liệu nghiên cứu về enzyme (Hình 6–
24b). Sáu dư lượng xen kẽ
Mur2Ac và GlcNAc trong peptidoglycan liên kết ở trạng thái hoạt động
trang web, trong các trang web liên kết được gắn nhãn từ A đến
F. Việc xây dựng mô hình đã chỉ ra rằng chuỗi bên lactyl của
Mur2Ac không thể được cung cấp ở các trang web C và E, hạn chế
Mur2Ac liên kết với các trang B, D và F. Chỉ một trong các
liên kết glycosid liên kết bị cắt, giữa một
Dư lượng Mur2Ac ở vị trí D và dư lượng GlcNAc ở vị trí
E. Dư lượng axit amin xúc tác chính trong hoạt chất
địa điểm là Glam35 và Asp52 (Hình 6–25a). Phản ứng là một
sự thay thế nucleophilic, với OOH từ nước đặt lại GlcNAc ở C-1
của Mur2Ac.
Với các vị trí hoạt động đã được xác định và cấu trúc chi
tiết của enzyme có sẵn, con đường dẫn đến
sự hiểu biết cơ chế phản ứng dường như mở ra trong
những năm 1960. Tuy nhiên, bằng chứng chắc chắn cho một trường hợp cụ thể
cơ chế này đã lảng tránh các nhà điều tra trong gần bốn thập kỷ.
Có hai cơ chế hợp lý về mặt hóa học
có thể tạo ra sản phẩm quan sát được của sự phân cắt qua trung
gian lysozyme của liên kết glycosid. Phillips và
các đồng nghiệp đã đề xuất một cơ chế phân ly (loại SN1) (Hình
6–25a, bên trái), trong đó GlcNAc ban đầu
phân ly ở bước 1 để lại cation glycosyl
(một cacbocation) trung gian. Trong cơ chế này,
GlcNAc rời khỏi được proton hóa nhờ xúc tác axit thông thường
bởi Glam35, nằm trong túi kỵ nước tạo ra
nhóm carboxyl của nó có pKa cao bất thường. Carboca-tion được
ổn định bằng sự cộng hưởng liên quan đến các hạt liền kề
oxy vòng, cũng như bằng tương tác tĩnh điện với
điện tích âm trên Asp52 gần đó. Ở bước 2, nước tấn công vào C-1
của Mur2Ac để tạo ra sản phẩm. Các
cơ chế thay thế (Hình 6–25a, bên phải) bao gồm hai
các bước dịch chuyển trực tiếp liên tiếp (loại SN2). TRONG
bước 1 , Asp52 tấn công C-1 của Mur2Ac để thay thế
GlcNAc. Như trong cơ chế đầu tiên, Glam35 hoạt động như một
axit thông thường để proton hóa GlcNAc đang rời đi. Ở bước 2 ,
nước tấn công vào C-1 của Mur2Ac để thay thế Asp52
và tạo ra sản phẩm.
Cơ chế Phillips (SN1), dựa trên cấu trúc
cân nhắc và được củng cố bởi nhiều ràng buộc khác nhau
nghiên cứu với chất nền nhân tạo, đã được chấp nhận rộng rãi
trong hơn ba thập kỷ. Tuy nhiên, một số tranh cãi vẫn tiếp diễn
và các cuộc thử nghiệm vẫn tiếp tục. Ngành khoa học
phương pháp đôi khi tiến triển một vấn đề một cách chậm chạp và
thí nghiệm thực sự sâu sắc có thể khó thiết kế.
Một số lập luận ban đầu chống lại cơ chế Phillips
mang tính gợi ý nhưng chưa hoàn toàn thuyết phục. Ví dụ, thời
gian bán hủy của cation glycosyl được đề xuất là
ước tính là 1012 giây, chỉ dài hơn một rung động phân tử và
không đủ dài cho thời gian cần thiết
khuếch tán của các phân tử khác. Quan trọng hơn, lysozyme
là thành viên của một họ enzyme gọi là “giữ lại
glycosidase”, tất cả đều xúc tác cho các phản ứng trong đó
sản phẩm có cấu hình dị thường giống như
chất nền (cấu hình dị thường của carbohydrate được xem xét trong
Chương 7), và tất cả chúng đều
được biết là có các chất trung gian cộng hóa trị phản ứng như
được hình dung trong con đường thay thế (SN2) .
Do đó, cơ chế Phillips đi ngược lại với những phát hiện thực
nghiệm về các enzyme có liên quan chặt chẽ.
Một thử nghiệm hấp dẫn đã quyết định nghiêng về con đường
SN2 , theo báo cáo của Stephen
Withers và đồng nghiệp vào năm 2001. Sử dụng người đột biến
enzym (có dư lượng 35 chuyển từ Glam thành Gln) và
chất nền nhân tạo, kết hợp với nhau để làm chậm tốc độ
các bước quan trọng trong phản ứng, những công nhân này đã có thể
ổn định chất trung gian cộng hóa trị khó nắm bắt. Điều này lần lượt
cho phép họ quan sát trực tiếp chất trung gian, sử dụng cả phép
đo phổ khối và tinh thể học tia X
(Hình 6–25b).
Cơ chế lysozyme hiện đã được chứng minh chưa? Không. Một chiếc chìa khóa
đặc điểm của phương pháp khoa học, như Albert Einstein
đã từng tóm tắt nó là “Không có nhiều thử nghiệm
có thể chứng minh tôi đúng; một thí nghiệm duy nhất có thể chứng minh
tôi sai rồi.” Trong trường hợp cơ chế lysozyme,
Machine Translated by Google

6.4 Ví dụ về phản ứng enzym 223

(Một)

Ồ
ồ
GlcNAc

NAc
HOH 2C
ồ (Một)
MỘT
ồ
CH2OH
Mur2Ac CH2OH
(b)
ồ
ồ H
Liên kết hydro H
RO với các Mur2Ac GlcNAc
1 C ồ C 4
gốc ở vị H Ồ
B AcN Ồ
trí gắn enzyme H
ồ
GlcNAc
AcN H

NAc H2O lysozyme

HOH2C
ồ CH2OH
C ồ
ồ ôi H
CH2OH H
ồ Mur2Ac C + C
H Ồ
RO = CH3CHCOO– H HO
ồ
RO
Vị trí AcN H
NAc/AcN = NH CH C 3 phân cắt
D AcN
Ồ
ồ ồ

GlcNAc

NAc
HOH2C
ồ
E ồ
HÌNH 6–24 Lysozyme lòng trắng trứng gà và phản ứng mà nó xúc tác. ( a ) Sơ
CH2OH
đồ dải băng của enzyme có dư lượng vị trí hoạt động Glam35 và Asp52 được Mur2Ac
hiển thị dưới dạng cấu trúc thanh màu xanh và chất nền liên kết hiển thị
ồ
màu đỏ (PDB ID 1LZE). (b) Phản ứng được xúc tác bởi lysozyme lòng trắng trứng gà. RO
Một đoạn polyme peptidoglycan được hiển thị, với các vị trí liên kết
F AcN
lysozyme từ A đến F được tô màu. Liên kết COO glycosid giữa các gốc ồ
đường liên kết với vị trí D và E bị cắt, như được biểu thị bằng mũi
tên màu đỏ. Phản ứng thủy phân được thể hiện trong hình bên dưới,
với số phận của oxy trong H2O được đánh dấu bằng màu đỏ. Mur2Ac là
axit N-acetylmuramic; GlcNAc, N-acetylglucosamine. ROO đại diện cho
nhóm lactyl (axit lactic); ONAc và AcNO, một nhóm N-acetyl (xem khóa).
Machine Translated by Google

224 Chương 6 Enzyme

Peptidoglycan liên kết

với vị trí hoạt
động của lysozyme
Cơ Cơ
chế SN1 chế SN2

Glam35 Glam35

ôi ôi
CH2OH CH2OH
:

ồ H ồ H

Mur2Ac
H GlcNAc Mur2Ac
H GlcNAc
C ồ C C ồ C
H Ồ H Ồ
H H H H

AcN H AcN H
–O ồ –O ồ
Lysozyme
Asp52 CH2OH Asp52 CH2OH
ồ ồ
H H H H
C C
ôi H ôi H
1 H O 1 H O

H NAc H NAc
Sản phẩm đầu tiên Sản phẩm đầu tiên

Glam35 Glam35

–OO –OO
ồ ồ
+ CƠ CHẾ HÌNH 6–25 Phản ứng lysozyme.
Glycosyl cộng hóa
C C Trong phản ứng này (được mô tả ở trang
H carbocation H trị trung gian
222), nước được đưa vào sản phẩm ở C-1
H trung gian
của Mur2Ac có cùng cấu hình với liên kết
AcN AcN
–O ồ ồ ồ glycosid ban đầu. Do đó phản ứng là
phản ứng phân tử

Asp52 Asp52 thay thế bằng việc giữ lại cấu hình.
(a) Hai con đường được đề xuất có

2
H2O 2
H2O khả năng giải thích phản ứng tổng thể
và các tính chất của nó. Con đường
SN1 (trái) là cơ chế Phillips ban
Glam35 Glam35
đầu. Con đường SN2 (phải) là cơ chế

–OO –OO phù hợp nhất với dữ liệu hiện

ồ H ồ H tại. (b) Sơ đồ ruy băng của chất
+
Ồ Ồ trung gian cộng hóa trị enzyme với hoạt chất-
C C
H H dư lượng vị trí (màu xanh) và chất nền liên kết

(màu đỏ) được hiển thị dưới dạng cấu trúc dính

AcN AcN (PDB ID 1H6M).

–O ồ ồ ồ

Asp52 Asp52

Glam35

CH2OH ôi
ồ
H
H Ồ

C
H H
H

RO ACN –O ồ

Sản phẩm thứ hai

Asp52

(Một) (b)
Machine Translated by Google

6.5 Enzyme điều hòa 225

người ta có thể lập luận (và một số có) rằng nhân tạo phản ứng của chúng nhanh như cơ chất của chúng được tạo ra từ các phản

chất nền, có chất thay thế flo ở C-1 và C-2, ứng trước đó.
được sử dụng để ổn định chất trung gian cộng hóa trị Hoạt động của các enzyme điều hòa được điều chỉnh

có thể đã làm thay đổi con đường phản ứng. đánh giá cao theo nhiều cách khác nhau. Chức năng của enzyme dị lập thể

flo có độ âm điện có thể làm mất ổn định thông qua liên kết thuận nghịch, không cộng hóa trị của các chất điều hòa

Ion oxocarbenium thiếu electron trong glycosyl các hợp chất được gọi là chất điều biến dị lập thể hoặc dị lập thể

cation trung gian có thể xuất hiện trong con đường SN1 . Tuy nhiên, tác nhân, thường là các chất chuyển hóa nhỏ hoặc đồng yếu tố. Các

con đường SN2 bây giờ là cơ chế enzyme khác được điều hòa bằng cách biến đổi cộng hóa trị thuận nghịch.
phù hợp nhất với dữ liệu có sẵn. Cả hai loại enzyme điều hòa đều có xu hướng là các protein đa tiểu đơn

vị, và trong một số

trường hợp (các) trang web quản lý và trang web hoạt động được bật
TÓM TẮT 6.4 Ví dụ về phản ứng enzyme
tiểu đơn vị riêng biệt. Hệ thống trao đổi chất có ít nhất hai

cơ chế điều hòa enzyme khác. Một số enzyme

■ Chymotrypsin là một protease serine có cơ chế được hiểu rõ,
bị kích thích hoặc bị ức chế khi chúng được liên kết bởi các protein
có đặc tính xúc tác axit-bazơ nói chung, xúc tác cộng hóa
điều hòa riêng biệt. Những người khác được kích hoạt khi
trị và
ổn định trạng thái chuyển tiếp. các đoạn peptide được loại bỏ bằng cách phân cắt protein;

Không giống như sự điều hòa qua trung gian tác động, sự điều hòa bằng
■ Hexokinase cung cấp một ví dụ tuyệt vời về
cách phân cắt pro-teolytic là không thể đảo ngược. Ví dụ quan trọng của
sự phù hợp gây ra như một phương tiện sử dụng chất nền
cả hai cơ chế đều được tìm thấy trong các quá trình sinh lý
năng lượng liên kết.
chẳng hạn như tiêu hóa, đông máu, hoạt động của hormone và

■ Phản ứng enolase tiến hành thông qua ion kim loại tầm nhìn.

xúc tác. Sự phát triển và tồn tại của tế bào phụ thuộc vào việc sử dụng hiệu quả

nguồn lực, và hiệu quả này được thực hiện bằng cách
■ Lysozyme sử dụng xúc tác cộng hóa trị và
enzym điều hòa. Không có một quy tắc đơn lẻ nào chi phối sự xuất hiện
xúc tác axit nói chung vì nó thúc đẩy hai
của các loại quy định khác nhau trong các hệ thống khác nhau. Ở một
phản ứng dịch chuyển nucleophin liên tiếp.
mức độ nào đó, sự điều hòa dị lập thể (không cộng hóa trị)

có thể cho phép tinh chỉnh các con đường trao đổi chất

được yêu cầu liên tục nhưng ở các mức độ hoạt động khác nhau khi điều

6.5 Enzyme điều hòa kiện tế bào thay đổi. Sự điều chỉnh bằng cách sửa đổi cộng hóa trị có

thể là tất cả hoặc không có gì - thường là như vậy

Trong quá trình trao đổi chất của tế bào, các nhóm enzym phối hợp với nhau với sự phân cắt protein—hoặc nó có thể cho phép thực hiện một cách tinh vi

theo những con đường tuần tự để thực hiện một quá trình trao đổi chất nhất định những thay đổi trong hoạt động. Một số loại điều hòa có thể xảy ra

quá trình, chẳng hạn như sự phân hủy đa phản ứng của glucose trong một enzyme điều hòa duy nhất. Phần còn lại của

đến lactate hoặc sự tổng hợp đa phản ứng của một axit amin chương này được dành để thảo luận về các phương pháp điều hòa enzyme

từ những tiền chất đơn giản hơn. Trong các hệ thống enzyme như vậy, này.

Sản phẩm phản ứng của một enzyme trở thành cơ chất
của tiếp theo.
Enzyme dị lập thể trải qua những thay đổi về hình dạng
Hầu hết các enzyme trong mỗi con đường trao đổi chất đều tuân
để đáp ứng với liên kết bộ điều biến
theo mô hình động học mà chúng tôi đã mô tả.

Tuy nhiên, mỗi con đường bao gồm một hoặc nhiều enzyme Như chúng ta đã thấy ở Chương 5, các protein dị lập thể là những protein

có ảnh hưởng lớn hơn đến tốc độ của chuỗi tổng thể. Các enzyme điều có “hình dạng khác” hoặc sự phù hợp do

hòa này thể hiện sự gia tăng ràng buộc của bộ điều biến. Khái niệm tương tự cũng áp dụng cho một số

hoặc giảm hoạt tính xúc tác để đáp ứng với các tín hiệu nhất định. Sự enzyme điều hòa nhất định, khi những thay đổi về hình dạng

điều chỉnh tốc độ phản ứng được xúc tác bởi gây ra bởi một hoặc nhiều bộ điều biến sẽ chuyển đổi các dạng enzyme

enzyme điều hòa, và do đó ở tỷ lệ toàn bộ hoạt động mạnh hơn và ít hoạt động hơn. Các chất điều biến các enzym

trình tự trao đổi chất, cho phép tế bào đáp ứng những thay đổi dị lập thể có thể có tác dụng ức chế hoặc

nhu cầu về năng lượng và các phân tử sinh học cần thiết trong kích thích. Thông thường bộ điều biến chính là chất nền;

tăng trưởng và sửa chữa. enzyme điều hòa mà cơ chất và chất điều biến

Trong hầu hết các hệ thống đa enzyme, enzyme đầu tiên của giống hệt nhau được gọi là đồng hướng. Hiệu quả tương tự

trình tự này là một enzyme điều hòa. Đây là một nơi tuyệt vời để điều liên kết với O2 với hemoglobin (Chương 5): liên kết của phối tử—hoặc

chỉnh một con đường, bởi vì chất xúc tác của cơ chất, trong trường hợp là enzym—

ngay cả một vài phản ứng đầu tiên của một chuỗi dẫn đến gây ra những thay đổi về hình dạng ảnh hưởng đến hoạt động tiếp theo

một sản phẩm không cần thiết sẽ chuyển hướng năng lượng và chất chuyển hóa của các vị trí khác trên protein. Khi mà

từ các quá trình quan trọng hơn. Các enzyme khác trong chất điều biến là một phân tử không phải là chất nền,

trình tự thường hiện diện ở mức độ cung cấp một gọi là enzim dị hướng. Lưu ý rằng allosteric

vượt quá hoạt động xúc tác; họ thường có thể quảng bá bộ điều biến không nên nhầm lẫn với không cạnh tranh
Machine Translated by Google

226 Chương 6 Enzyme

Trong nhiều con đường, một bước điều hòa được xúc
S Cơ chất
tác bởi enzyme dị lập thể
M Bộ điều biến tích cực

Trong một số hệ thống đa enzyme, enzyme điều hòa được

C R
bị ức chế đặc biệt bởi sản phẩm cuối cùng của con đường

Enzim kém hoạt động bất cứ khi nào nồng độ của sản phẩm cuối cùng vượt quá
yêu cầu của tế bào. Khi phản ứng của enzyme điều hòa bị chậm
MM lại, tất cả các enzyme tiếp theo sẽ hoạt động ở tốc độ
giảm tỷ lệ khi chất nền của chúng bị cạn kiệt. Tỷ lệ

S C R M

Enzyme hoạt động mạnh hơn

SC RM đang hoạt động

cơ chất enzyme
tổ hợp

HÌNH 6–26 Tương tác tiểu đơn vị trong enzyme dị lập thể và tương
tác với chất ức chế và chất kích hoạt. Trong nhiều enzym dị lập thể
vị trí liên kết cơ chất và (các) vị trí liên kết bộ điều biến đang bật

các tiểu đơn vị khác nhau, tiểu đơn vị xúc tác (C) và tiểu đơn vị điều hòa (R),

tương ứng. Liên kết bộ điều biến tích cực (kích thích) (M) với nó
vị trí cụ thể trên tiểu đơn vị điều hòa được truyền đến tiểu đơn
vị xúc tác thông qua sự thay đổi về hình dạng. Sự thay đổi này làm cho
tiểu đơn vị xúc tác có hoạt tính và có khả năng liên kết với cơ chất (S)

với ái lực cao hơn. Khi bộ điều biến tách khỏi tiểu đơn vị điều
hòa, enzyme sẽ trở lại dạng không hoạt động hoặc ít hoạt động hơn.

và các chất ức chế hỗn hợp. Mặc dù chất này liên kết ở vị trí
thứ hai trên enzyme nhưng chúng không nhất thiết phải là trung gian
thay đổi về hình dạng giữa hoạt động và không hoạt động
dạng và tác dụng động học là khác biệt.
Các đặc tính của enzyme dị lập thể khác biệt đáng kể so với
đặc tính của các enzyme không điều hòa đơn giản. Một số khác biệt
là về cấu trúc. Ngoài các vị trí hoạt động, các enzym dị lập
thể thường có
một hoặc nhiều vị trí quy định hoặc phân lập để ràng buộc
bộ điều biến (Hình 6–26). Giống như hoạt động của một enzym
vị trí cụ thể cho chất nền của nó, mỗi vị trí quy định là
cụ thể cho bộ điều biến của nó. Các enzyme có nhiều chất điều
biến thường có các vị trí liên kết cụ thể khác nhau
cho mỗi. Trong các enzym đồng hướng, vị trí hoạt động và
HÌNH 6–27 Hai quan điểm về enzyme điều hòa aspartate trans-
trang web quy định là như nhau.
carbamoylase. (Có nguồn gốc từ PDB ID 2AT2.) Quy định phân lập này
Enzim dị lập thể thường lớn hơn và nhiều hơn
enzyme có hai cụm xúc tác xếp chồng lên nhau, mỗi cụm có ba nhóm xúc tác
phức tạp hơn các enzym không dị lập thể. Hầu hết có hai hoặc
chuỗi polypeptide (có màu xanh lam và tím) và ba cụm điều
nhiều tiểu đơn vị hơn. Aspartate transcarbamoylase,
hòa, mỗi cụm có hai chuỗi polypeptide điều hòa (màu đỏ và
xúc tác cho phản ứng sớm trong quá trình sinh tổng hợp nucleotide
màu vàng). Các cụm điều hòa tạo thành các điểm của một tam giác bao quanh
pyrim-idine (xem Hình 22–36), có 12 polypeptide
các tiểu đơn vị xúc tác. Các trang web liên kết cho bộ điều biến allosteric là
chuỗi được tổ chức thành các tiểu đơn vị xúc tác và điều hòa. trên các tiểu đơn vị điều tiết. Liên kết bộ điều biến tạo ra những thay đổi lớn
Hình 6–27 cho thấy cấu trúc bậc bốn của en-zyme này, được suy ra trong cấu trúc và hoạt động của enzyme. Vai trò của enzyme này trong quá trình tổng

từ phân tích tia X. hợp nucleo-tide và chi tiết về sự điều hòa của nó sẽ được thảo luận trong Chương 22.
Machine Translated by Google

6.5 Enzyme điều hòa 227

Do đó, việc sản xuất sản phẩm cuối cùng của con đường được COO
cân bằng với nhu cầu của tế bào. Loại quy định này được gọi
H3N
MỘT

CH ồ

là ức chế phản hồi. Sự tích tụ sản phẩm cuối cùng cuối cùng MỘT
L-Threonine
sẽ làm chậm toàn bộ quá trình. H OH C
ồ ồ

Một trong những ví dụ đầu tiên được biết đến về sự ức

MỘT

CH3
chế phản hồi dị lập thể là hệ thống enzyme vi khuẩn xúc tác
threonine
quá trình chuyển đổi L-threonine thành L-isoleucine trong E1 dehydratase

năm bước (Hình 6–28). Trong hệ thống này, enzyme đầu tiên,
MỘT
threonine dehydratase, bị ức chế bởi isoleucine, sản phẩm
của phản ứng cuối cùng trong chuỗi. Đây là một ví dụ về sự
E2
ức chế dị lập thể dị hướng. Isoleucine khá đặc hiệu như một
chất ức chế. Không có chất trung gian nào khác trong trình B
tự này ức chế threonine dehydratase, cũng như không có enzyme
nào khác trong trình tự bị ức chế bởi isoleucine. Isoleucine E3
không liên kết với vị trí hoạt động mà với một vị trí cụ thể
C
khác trên phân tử enzyme, vị trí điều hòa. Sự ràng buộc này
là không cộng hóa trị và có thể đảo ngược dễ dàng; nếu nồng
E 4
độ isoleucine giảm thì tốc độ mất nước của threonine tăng
lên. Do đó, hoạt động của threonine dehydratase phản ứng D
nhanh chóng và thuận nghịch với sự dao động nồng độ
isoleucine trong tế bào. E5

COO
Đặc tính động học của enzyme dị lập thể khác với
H3N
MỘT

hành vi của Michaelis-Menten

ồ

CH ồ

MỘT

H CH C 3
ồ ồ

L-Isoleucine
Enzim dị lập thể cho thấy mối quan hệ giữa V0 và [S] khác MỘT

với động học của Michaelis-Menten. Chúng thể hiện độ bão hòa CH2

với cơ chất khi [S] đủ cao, nhưng đối với một số enzyme dị
MỘT

lập thể, đồ thị V0 so với [S] (Hình 6–29) tạo ra đường cong
bão hòa sigmoid, thay vì đường cong hyperbol điển hình của
enzyme không điều hòa. Trên đường cong bão hòa sigmoid,
CH3
HÌNH 6–28 Sự ức chế phản hồi. Sự chuyển đổi L-threonine thành
L-isoleucine được xúc tác bởi một chuỗi gồm năm enzyme (E1 đến E5).

chúng ta có thể tìm thấy giá trị [S] tại đó V0 đạt cực đại Threonine dehydratase (E1) bị ức chế đặc biệt bởi L-isoleucine, sản

một nửa, nhưng chúng ta không thể gọi nó bằng ký hiệu Km, vì phẩm cuối cùng của chuỗi, nhưng không bị ức chế bởi bất kỳ chất nào

trong bốn chất trung gian (A đến D). Sự ức chế phản hồi được biểu thị
enzyme không tuân theo mối quan hệ Michaelis-Menten hyperbol.
bằng đường phản hồi nét đứt và ký hiệu ở mũi tên phản ứng threonine
Thay vào đó, ký hiệu [S]0,5 hoặc K0,5 thường được sử dụng
dehydratase, một thiết bị được sử dụng xuyên suốt cuốn sách này.
để biểu thị nồng độ cơ chất mang lại vận tốc tối đa một nửa
của phản ứng được xúc tác bởi enzyme dị lập thể (Hình 6–29).

Hành vi động học sigmoid thường phản ánh sự tương tác
hợp tác giữa các tiểu đơn vị protein. Nói cách khác, những
thay đổi trong cấu trúc của một tiểu đơn vị được chuyển
thành những thay đổi cấu trúc trong các tiểu đơn vị lân cận,
một hiệu ứng được trung gian bởi các tương tác không cộng
của cơ chất với một vị trí liên kết làm thay đổi cấu trúc
của enzyme và tăng cường sự liên kết của các phân tử cơ
chất tiếp theo. Điều này giải thích cho sự thay đổi sigmoid
chứ không phải hyperbol trong V0 khi tăng [S]. Một đặc điểm
của động học sigmoid là những thay đổi nhỏ về nồng độ của
chất điều biến có thể dẫn đến những thay đổi lớn trong hoạt

hóa trị tại bề mặt tiếp xúc giữa các tiểu đơn vị. Các nguyên
tắc này được minh họa cụ thể bằng một nonenzym: O2 liên kết
với hemoglobin. Hành vi động học Sigmoid được giải thích
bằng các mô hình phối hợp và tuần tự cho các tương tác giữa
các tiểu đơn vị (xem Hình 5–15).
động. Như được thấy rõ trong Hình 6–29a, sự gia tăng tương
đối nhỏ của [S] ở phần dốc của đường cong gây ra sự gia tăng
tương đối lớn trong V0.
Đối với các enzyme dị lập thể dị hướng, những enzyme có
chất điều biến là chất chuyển hóa khác với cơ chất thông

Các enzyme dị lập thể đồng hình thường là các protein thường, rất khó để khái quát hóa về hình dạng của đường cong
đa tiểu đơn vị và, như đã lưu ý trước đó, cùng một vị trí bão hòa cơ chất. Chất kích hoạt có thể làm cho đường cong
liên kết trên mỗi tiểu đơn vị có chức năng vừa là vị trí trở nên gần hyperbol hơn, với K0,5 giảm nhưng Vmax không
hoạt động vừa là vị trí điều hòa. Thông thường nhất, chất thay đổi , dẫn đến tốc độ phản ứng tăng lên ở nồng độ cơ
nền hoạt động như một bộ điều biến tích cực (chất kích hoạt), chất cố định (V0 cao hơn đối với bất kỳ giá trị nào của [S];
bởi vì các tiểu đơn vị hoạt động hợp tác: sự liên kết của một phân Hình
tử 2). 6–29b, đường cong trên).
Machine Translated by Google

228 Chương 6 Enzyme

Các enzym dị lập thể dị hướng khác phản ứng với chất kích
hoạt bằng cách tăng Vmax với ít thay đổi về K0.5 (Hình 6–
29c). Một bộ điều biến âm (chất ức chế) có thể tạo ra đường
cong bão hòa cơ chất sigmoid hơn ,
với mức tăng K0,5 (Hình 6–29b, đường cong phía dưới). Do
đó, các enzyme dị lập thể het-erotropic thể hiện các loại
phản ứng khác nhau trên đường cong hoạt động cơ chất của
chúng, bởi vì một số có bộ điều biến ức chế, một số có bộ
điều biến kích hoạt và một số có cả hai.

(Một)
Một số enzyme điều hòa có thể đảo ngược
Vmax
Sửa đổi cộng hóa trị

Trong một loại enzyme điều hòa quan trọng khác, hoạt tính
được điều chỉnh bằng cách biến đổi cộng hóa trị của phân tử
en-zyme. Các nhóm biến đổi bao gồm các nhóm ribosyl
/h
)tú 0p
M V
(

1
2Vmax phosphoryl, adenylyl, uridylyl, methyl và adenosine
diphosphate (Hình 6–30). Các nhóm này thường được liên kết
và loại bỏ khỏi enzyme điều hòa bằng các enzyme riêng biệt.

Một ví dụ về enzyme được điều hòa bằng quá trình methyl

K0.5
hóa là protein hóa hướng tiếp nhận methyl của vi khuẩn.
[S] (mM)
Protein này là một phần của hệ thống cho phép vi khuẩn bơi
về phía chất hấp dẫn (chẳng hạn như đường) trong dung dịch
(b)
Vmax và tránh xa các hóa chất xua đuổi. Tác nhân methylat là S-
adenosylmethionine (adoMet) (xem Hình 18–18b). ADP-ribosyl
hóa là một phản ứng đặc biệt thú vị, chỉ được quan sát thấy
ở một số ít protein; ADP-ribose có nguồn gốc từ nicotinamide
adenine dinucleotide (NAD) (xem Hình 8–41). Loại biến đổi
/h
)tú 0p
M V
(

1 này xảy ra đối với enzyme dinitrogenase reductase của vi

2 Vmax
khuẩn, dẫn đến sự điều hòa quá trình cố định đạm sinh học
quan trọng. Độc tố bạch hầu và độc tố dịch tả là các enzyme
xúc tác quá trình ribosyl hóa ADP (và bất hoạt) của các
enzyme hoặc protein quan trọng của tế bào. Độc tố bạch hầu
K0.5 K0.5 K0,5 tác động và ức chế yếu tố kéo dài 2, một loại protein liên
[S] (mM) quan đến sinh tổng hợp protein. Độc tố dịch tả tác động lên
(b)
protein G, một phần của con đường truyền tín hiệu (xem Hình
(c)
12–39), dẫn đến một số phản ứng sinh lý bao gồm mất lượng
Vmax
lớn dịch cơ thể và đôi khi gây tử vong.

Phosphoryl hóa là loại sửa đổi điều hòa phổ biến nhất;
một phần ba đến một nửa tổng số protein trong tế bào nhân
Vmax
/h
)tú 0p
M V
(

chuẩn bị phosphoryl hóa. Một số protein chỉ có một gốc được

phosphoryl hóa, một số khác có nhiều gốc và một số ít có
Vmax hàng chục vị trí để phosphoryl hóa.
Chế độ biến đổi cộng hóa trị này là trung tâm của một số
1
2Vmax lượng lớn các con đường điều tiết và do đó chúng tôi thảo
luận về nó rất chi tiết.
K0.5
[S] (mM)
( ) Nhóm Phosphoryl ảnh hưởng đến cấu trúc và
HÌNH 6–29 Đường cong hoạt tính cơ chất của các enzym dị lập thể đại Hoạt tính xúc tác của protein
diện. Ba ví dụ về phản ứng phức tạp của các enzyme dị lập thể đối với
Sự gắn kết của các nhóm phosphoryl với các gốc axit amin cụ
các bộ điều biến của chúng. (a) Đường cong sigmoid của enzyme đồng

hình, trong đó cơ chất cũng đóng vai trò là chất điều biến (kích
thể của protein được xúc tác bởi các kinase protein; Việc

thích) tích cực hoặc chất kích hoạt. Lưu ý sự giống nhau với đường loại bỏ các nhóm phosphoryl được xúc tác bởi protein

cong bão hòa oxy của hemoglobin (xem Hình 5–12). (b) Tác động của bộ phosphatase. Việc bổ sung một nhóm phosphoryl vào gốc Ser,

điều biến dương (+) và bộ điều biến âm () lên enzyme dị lập thể trong Thr hoặc Tyr đưa một nhóm tích điện cồng kềnh vào một vùng
đó K0.5 bị thay đổi mà không thay đổi Vmax. Đường cong trung tâm cho chỉ có độ phân cực vừa phải. Các nguyên tử oxy của nhóm
thấy mối quan hệ hoạt động cơ chất mà không cần bộ điều biến. (c) Một phosphoryl có thể liên kết hydro với một hoặc một số nhóm
trong
loại điều chế ít phổ biến hơn, trong đó Vmax bị thay đổi và K0,5 gần như không đổi. protein, thường là
Machine Translated by Google

6.5 Enzyme điều hòa 229

các nhóm amide của khung peptide ở đầu chuỗi xoắn hoặc nhóm
Biến đổi cộng hóa trị
guanidinium tích điện của gốc Arg. Hai điện tích âm trên
(dư lượng mục tiêu)
chuỗi bên được phosphoryl hóa cũng có thể đẩy lùi các gốc
tích điện âm (Asp hoặc Glam) lân cận. Khi chuỗi bên biến
Phosphoryl hóa
đổi nằm ở vùng protein quan trọng đối với cấu trúc ba chiều
(Tyr, Ser, Thr, của anh ấy)
của nó, quá trình phosphoryl hóa có thể có tác động mạnh
ATP ADP ồ mẽ đến cấu trúc protein và do đó đến khả năng liên kết và
B
Enz Enz OPOO
xúc tác cơ chất.
MỘT

ồ
Một ví dụ quan trọng về sự điều hòa bằng quá trình
phosphoryl hóa được thấy ở glycogen phosphorylase (Mr
Adenyl hóa
94.500) của cơ và gan (Chương 15), chất này xúc tác cho
(Tyr)
phản ứng
ATP PPi ồ
B (Glucose)n Pi 88n (glucose)n1 glucose 1-phosphate
Enz Enz OPO CH2
ồ ồ

adenin glycogen Chuỗi

ồ
glycogen
MỘT

ồ
rút ngắn
H H
H H
Glucose 1-phosphate được tạo thành có thể được sử dụng để
Ồ ồ H tổng hợp ATP ở cơ hoặc chuyển hóa thành glucose tự do ở
gan. Glycogen phosphorylase xảy ra ở hai dạng: phosphorylase
Uridyl hóa
a hoạt động mạnh hơn và phosphorylase b kém hoạt động hơn
(Tyr)
(Hình 6–31). Phosphorylase a có hai tiểu đơn vị, mỗi tiểu
UTP PPi ồ đơn vị có gốc Ser cụ thể được photphoryl hóa ở nhóm
B hydroxyl của nó. Những dư lượng serine phosphate này cần
Enz Enz OPO ồ ồ

CH2 Uridin
MỘT
ồ thiết cho hoạt động tối đa của enzyme.
ồ
H H
H H
Chuỗi Ồ Ồ Chuỗi
Ồ ồ H bên bên
Ser14 CH2 CH2 Ser14

ADP-ribosyl hóa
(Arg, Gln, Cys, diphthamide—một bản sửa đổi của His) Phosphorylase b (ít
hoạt động hơn)
NAD
nicotinamit
Enz Enz
ồ ôi ôi

CH2 ồ
MỘT
2Pi 2ATP
ồ bạn
PO ồ

HH photphatase phosphorylase
MỘT
H H phosphorylase kinase
ồ
MỘT
Ồ ồ H 2H2O 2ADP
ồ bạn
P ồ

ồ
MỘT

ồ OCH2 adenin
ồ P P
ồ ồ
HH
H H CH2 CH2

Ồ Ồ
Phosphorylase a
(hoạt động mạnh hơn)
Sự methyl hóa
(Glu)
HÌNH 6–31 Điều chỉnh hoạt động của glycogen phosphorylase bằng cách
S-adenosyl- S-adenosyl- biến đổi cộng hóa trị. Ở dạng hoạt động mạnh hơn của enzyme, photphory-
methionine homocysteine
lase a, các gốc Ser cụ thể, trên mỗi tiểu đơn vị, được phosphoryl hóa.

Enz Phosphorylase a được chuyển thành phosphorylase b kém hoạt động hơn do
EnzOCH3
mất enzyme của các nhóm phosphoryl này, được thúc đẩy bởi phosphorylase

phosphatase. Phosphorylase b có thể được chuyển đổi lại (tái hoạt động)

HÌNH 6–30 Một số phản ứng biến đổi enzyme. thành phos-phorylase a nhờ tác dụng của phosphorylase kinase.
Machine Translated by Google

230 Chương 6 Enzyme

Các nhóm phosphoryl có thể được loại bỏ bằng phương pháp thủy
phân bằng một loại enzyme riêng biệt gọi là phosphorylase phosphatase:
Phosphorylase a 2H2O 88n phosphorylase b 2Pi (ít hoạt
(tích cực hơn) động hơn)
Tuy nhiên, trình tự bậc một không phải là yếu tố quan trọng duy
nhất trong việc xác định liệu một dư lượng nhất định có bị
phosphoryl hóa hay không. Việc gấp protein tập hợp các phần tử ở
xa trong trình tự sơ cấp; cấu trúc ba chiều thu được có thể xác
định liệu protein kinase có tiếp cận được một gốc nhất định hay

Trong phản ứng này, phosphorylase a được chuyển đổi thành phos-
phorylase b bằng cách phân cắt hai liên kết cộng hóa trị serine
phosphate, một liên kết trên mỗi tiểu đơn vị của glycogen
phosphorylase.
Phosphorylase b lần lượt có thể được kích hoạt lại—chuyển
hóa cộng hóa trị trở lại thành phosphorylase a có hoạt tính— bởi
một enzyme khác, phosphorylase kinase, enzyme này xúc tác quá
trình chuyển các nhóm phosphoryl từ ATP sang nhóm hydroxyl của
hai gốc Ser cụ thể trong phosphorylase b :
2ATP phosphorylase b 88n 2ADP phosphorylase a (ít hoạt
động hơn) (hoạt động mạnh hơn)
Sự phân hủy glycogen trong cơ xương và gan được điều hòa bởi sự
thay đổi tỷ lệ của hai dạng glycogen phosphorylase. Các dạng a và
b khác nhau ở cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn; vị trí hoạt
không và có thể nhận biết lại nó như một chất nền hay không. Một
yếu tố khác ảnh hưởng đến tính đặc hiệu cơ chất của một số protein
kinase nhất định là sự gần gũi của các gốc phosphoryl hóa khác.
Sự điều hòa bằng quá trình phosphoryl hóa thường phức tạp.
Một số protein có trình tự liên ứng được thừa nhận bởi một số
kinase protein khác nhau, mỗi loại có thể phosphoryl hóa protein
và làm thay đổi hoạt tính enzyme của nó. Trong một số trường hợp,
quá trình phosphoryl hóa có tính phân cấp: một dư lượng nhất định
chỉ có thể được phosphoryl hóa nếu dư lượng lân cận đã được
phosphoryl hóa. Ví dụ, glycogen synthase, enzyme xúc tác quá
trình ngưng tụ các monome glucose để tạo thành glycogen (Chương
15), bị bất hoạt bởi quá trình phosphoryl hóa các gốc Ser đặc
biệt và cũng được điều biến bởi ít nhất bốn protein kinase khác
mà phosphoryl hóa bốn gốc khác. các vị trí trong protein (Hình 6–
32). Ví dụ, protein không phải là cơ chất cho glycogen synthase

động trải qua những thay đổi về cấu trúc và do đó, những thay kinase 3, cho đến khi một vị trí được phosphoryl hóa bởi casein
đổi về hoạt động xúc tác khi hai dạng này được chuyển hóa lẫn nhau. kinase II. Một số quá trình phosphoryl hóa ức chế glycogen
synthase nhiều hơn

Sự điều hòa glycogen phosphorylase bằng quá trình photphoryl

hóa minh họa tác động lên cả cấu trúc và hoạt động xúc tác của
việc thêm nhóm phosphoryl. Ở trạng thái không được phosphoryl 2 3 1
Các vị trí
hóa, mỗi tiểu đơn vị của protein này được gấp lại để đưa 20 gốc ở
ABAB C 4 5 AB
đầu amino của nó, bao gồm một số gốc bazơ, vào vùng chứa một số phosphoryl

axit amin có tính axit; điều này tạo ra một tương tác tĩnh điện H3N
hóa trên glycogen synthase COO
giúp ổn định hình dạng.

Mức độ
Quá trình phosphoryl hóa Ser14 cản trở sự tương tác này, buộc Các vị trí bất hoạt
miền đầu amino ra khỏi môi trường axit và trở thành một cấu trúc
Kinase phosphoryl hóa synthase

cho phép tương tác giữa P –Ser và một số chuỗi bên Arg. Ở dạng
Protein kinase A 1A, 1B, 2, 4
này, enzyme hoạt động mạnh hơn nhiều.
Protein kinase G 1A, 1B, 2

Protein kinase C 1A
Quá trình phosphoryl hóa một enzyme có thể ảnh hưởng đến quá trình

xúc tác theo một cách khác: bằng cách thay đổi ái lực liên kết với cơ chất. Ca2 /calmodulin 1B, 2
kinase
Ví dụ, khi isocitrate dehydrogenase (một enzyme của chu trình
axit citric; Chương 16) bị phospho-rylat hóa, lực đẩy tĩnh điện Phosphorylase b 2
kinase
của nhóm phosphoryl sẽ ức chế sự liên kết của citrate (một loại
axit tricarboxylic) tại vị trí hoạt động. Casein kinase I Ít nhất chín

Casein kinase II 5 0

Glycogen tổng hợp 3A, 3B, 3C

Cho phép nhiều Phosphoryl hóa
Kiểm soát quy định tinh tế
Các gốc Ser, Thr hoặc Tyr được phosphoryl hóa trong các protein
điều hòa xuất hiện trong các mô típ cấu trúc chung, được gọi là
các trình tự đồng thuận, được nhận biết bởi các protein kinase cụ
thể (Bảng 6–10). Một số kinase có tính bazơ, thích phosphoryl hóa
các gốc có lân cận cơ bản hơn; những người khác có các ưu tiên cơ
chất khác nhau, chẳng hạn như đối với dư lượng gần dư lượng Pro.
kinase 3
Glycogen tổng hợp 2
kinase 4
HÌNH 6–32 Nhiều quá trình phosphoryl hóa điều hòa. Enzyme glycogen
synthase có ít nhất chín vị trí riêng biệt ở năm vùng được chỉ định
dễ bị phosphoryl hóa bởi một trong các kinase protein của tế bào. Do
đó, sự điều hòa của enzyme này không phải là vấn đề chuyển đổi nhị
phân (bật/tắt) mà là sự điều biến hoạt động được tinh chỉnh trên một
phạm vi rộng để đáp ứng với nhiều tín hiệu khác nhau.
Machine Translated by Google

6.5 Enzyme điều hòa 231

BẢNG 6–10 Trình tự đồng thuận của các protein Kinase

Protein kinase Trình tự đồng thuận và dư lượng phosphoryl hóa *

Protein kinase A –X–R–(R/K)–X–(S/T)–B–

Protein kinase G –X–R–(R/K)–X–(S/T)–X–
Protein kinase C –(R/K)–(R/K)–X–(S/T)–B–(R/K)–(R/K)–
Protein kinase B –X–R–X–(S/T)–X–K–

Ca2/calmodulin kinase I –B–X–R–X–X–(S/T)–X–X–X–B–

Ca2/calmodulin kinase II –B–X–(R/K)–X–X–(S/T)–X–X–

Myosin chuỗi nhẹ kinase (cơ trơn) –K–K–R–X–X–S–X–B–B–

Phosphorylase b kinase –K–R–K–Q–I–S–V–R–

Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK) –P–X–(S/T)–P–P–

Protein kinase phụ thuộc cyclin (cdc2) –X–(S/T)–P–X–(K/R)–

Casein kinase I –(Sp/Tp)–X–X–(X)–(S/T)–B
Casein kinase II –X–(S/T)–X–X–(E/D/Sp/Yp)–X–

-Kase thụ thể adrenergic –(D/E)n–(S/T)–X–X–X–

Rhodopsin kinase –X–X–(S/T)–(E)n–

thụ thể insulin kinase –X–E–E–E–Y–M–M–M–M–K–K–S–R–G–D–Y–M–T–M–Q–I–G–K–K–K –

L–P–A–T–G–D–Y–M–N–M–S–P–V–G–D–

Kinase thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) –E–E–E–E–Y–F–E–L–V–

Nguồn: Pinna, LA & Ruzzene, MH (1996) Làm thế nào để protein kinase nhận biết cơ chất của chúng? Biochim. Sinh lý. Đạo luật 1314,

191–225; Kemp, BE & Pearson, RB (1990) Mô típ trình tự nhận biết protein kinase. Xu hướng sinh hóa. Khoa học. 15, 342–346;

Kennelly, PJ & Krebs, EG (1991) Trình tự đồng thuận là yếu tố quyết định tính đặc hiệu cơ chất của protein kinase và protein

phosphatase. J. Biol. Chem. 266, 15.555–15.558.

*Hiển thị ở đây là các trình tự đồng thuận được suy ra (theo kiểu La Mã) và các trình tự thực tế từ các chất nền đã biết (in nghiêng). Người Ser

Dư lượng (S), Thr (T) hoặc Tyr (Y) trải qua quá trình phosphoryl hóa có màu đỏ; tất cả các gốc axit amin được hiển thị dưới dạng chữ viết tắt

một chữ cái của chúng (xem Bảng 3–1). X đại diện cho bất kỳ axit amin nào; B, bất kỳ axit amin kỵ nước nào; Sp, Tp và Yp, dư lượng Ser, Thr

và Tyr đã được phosphoryl hóa.

những cái khác, và một số sự kết hợp của quá trình phosphoryl hóa là cần có cơ chế để vô hiệu hóa các enzym này.

tích lũy. Nhiều quá trình phosphoryl hóa điều hòa này Protease bị bất hoạt bởi các protein ức chế liên kết

cung cấp tiềm năng điều chế cực kỳ tinh tế rất chặt chẽ với vị trí hoạt động của enzyme. Ví dụ, chất ức chế

của hoạt động của enzyme. trypsin pan-creatic (Mr 6.000) liên kết và ức chế

Để phục vụ như một cơ chế quản lý hiệu quả, trypsin; 1-antiproteinase (Mr 53.000) chủ yếu ức chế

quá trình phosphoryl hóa phải thuận nghịch. Nói chung, các nhóm phos- elastase bạch cầu trung tính (bạch cầu trung tính là một loại bạch cầu,

phoryl được thêm vào và loại bỏ bởi các enzyme khác nhau và do đó hoặc bạch cầu; elastase là một protease hoạt động trên

các quá trình có thể được thực hiện riêng biệt. Elastin, một thành phần của một số mô liên kết). MỘT

được quy định. Tế bào chứa một họ phosphoprotein sự thiếu hụt 1-antiproteinase, có thể gây ra

phosphatase thủy phân P –Ser, P –Thr, do tiếp xúc với khói thuốc lá, có liên quan

và P –Tyr este, giải phóng Pi . Phosphoprotein với tổn thương phổi, bao gồm cả khí thũng.

phosphatase mà chúng ta biết cho đến nay chỉ tác động lên một tập hợp con Protease không phải là protein duy nhất được kích hoạt bởi quá

của phosphoprotein, nhưng chúng có tính đặc hiệu cơ chất kém hơn so trình phân giải protein. Tuy nhiên, trong những trường hợp khác, tiền chất là

với protein kinase. không được gọi là zymogen mà nói chung hơn là proprotein

hoặc proenzym, nếu thích hợp. Ví dụ, collagen protein mô liên kết

ban đầu được tổng hợp dưới dạng

Một số enzyme và protein khác được điều hòa bởi
tiền chất hòa tan procollagen. Sự đông máu
Sự phân cắt protein của tiền chất enzyme
hệ thống cung cấp nhiều ví dụ về hoạt hóa phân giải protein của

Đối với một số enzyme, tiền chất không hoạt động được gọi là zymogen protein. Fibrin, protein của cục máu đông, là

được phân cắt để tạo thành enzyme hoạt động. Nhiều được tạo ra bởi sự phân giải protein của fibrinogen, pro-protein

enzyme phân giải protein (protease) của dạ dày và không hoạt động của nó. Protease chịu trách nhiệm cho sự kích hoạt này là

tuyến tụy được điều hòa theo cách này. Chymotrypsin và trombin (tương tự như chymotrypsin ở nhiều khía cạnh),

trypsin ban đầu được tổng hợp dưới dạng chymotrypsinogen bản thân nó được tạo ra bởi sự phân giải protein của một proprotein

và trypsinogen (Hình 6–33). Nguyên nhân phân cắt cụ thể (trong trường hợp này là zymogen), protrombin. Máu đông

những thay đổi về hình dạng làm bộc lộ hoạt động của enzyme được trung gian bởi một chuỗi phức tạp của quá trình phân giải protein

địa điểm. Bởi vì loại kích hoạt này là không thể đảo ngược, nên các loại kích hoạt khác kích hoạt.
Machine Translated by Google

232 Chương 6 Enzyme

Chymotrypsinogen Trypsinogen
(không hoạt động) (không hoạt động)

1 245 1 6 7 245

Val– (Asp)4 –Lys–Ile–

enteropeptidase
trypsin

Val–(Asp)4 –Lys

P -Chymotrypsin Trypsin
(tích cực) (tích cực)

1 15 16 245 7 245

Arg Ile Ile

P -chymotrypsin
(tự phân) HÌNH 6–33 Kích hoạt zymogen bằng cách phân cắt protein.
Dưới đây là sự hình thành chymotrypsin và trypsin từ
Ser14–Arg15
Thr147–Asn148 zymogen. Các thanh đại diện cho trình tự chính của chuỗi polypeptide.
Dư lượng axit amin ở đầu cuối của polypeptide
Một
-Chymotrypsin
các mảnh được tạo ra bởi sự phân tách được chỉ định bên dưới các thanh. Các
(tích cực)
Việc đánh số các gốc axit amin thể hiện vị trí của chúng trong
1 13 16 146 149 245
trình tự sơ cấp của zymogen, chymotrypsinogen hoặc trypsino-gen (dư
Lêu Ile Tyr Ala lượng đầu tận cùng amino là số 1). Như vậy, trong hoạt động
MỘT B C
dạng, một số dư lượng được đánh số bị thiếu. Hãy nhớ lại rằng ba
chuỗi polypeptide (A, B và C) của chymotrypsin được liên kết bằng liên

kết disul-fide (xem Hình 6–18).

Một số enzyme điều hòa sử dụng một số các hình thức ical. Thay vào đó, tế bào chỉ xúc tác cho các phản ứng mà chúng

Cơ chế điều tiết cần tại một thời điểm nhất định. Khi nguồn tài nguyên hóa học bị

dồi dào, tế bào tổng hợp và dự trữ glucose và các chất khác
Glycogen phosphorylase xúc tác phản ứng đầu tiên trong con đường đưa
chất chuyển hóa. Khi nguồn tài nguyên hóa học khan hiếm, tế bào
glucose dự trữ vào quá trình chuyển hóa carbohydrate tạo ra năng lượng sử dụng những kho dự trữ này để cung cấp nhiên liệu cho quá trình trao đổi chất của tế bào. Hóa chất

(Chương 14 và
năng lượng được sử dụng một cách tiết kiệm, được phân bổ cho nhiều mục đích khác nhau
15). Đây là một bước trao đổi chất quan trọng và sự điều hòa của nó
con đường trao đổi chất theo nhu cầu của tế bào. Khả năng sẵn có của các
tương ứng cũng phức tạp. Mặc dù quy định cơ bản của nó là thông qua sửa
chất xúc tác mạnh, mỗi chất đặc hiệu cho một phản ứng nhất định, làm cho
đổi cộng hóa trị, như
việc điều chỉnh các phản ứng này trở nên khả thi.
được nêu trong Hình 6–31, glycogen phosphorylase cũng
Điều này lại tạo ra sự phức tạp, được quản lý chặt chẽ
được điều chế đồng không gian bởi AMP, đây là một bộ kích hoạt
bản giao hưởng mà chúng ta gọi là cuộc sống.

của phosphorylase b và một số phân tử khác

đó là những chất ức chế.

Các enzyme điều hòa phức tạp khác được tìm thấy ở vị trí then chốt TÓM TẮT 6.5 Enzyme điều hòa
ngã tư trao đổi chất. Glutamine tổng hợp vi khuẩn,

xúc tác cho phản ứng đưa ni-trogen khử vào quá trình chuyển hóa tế bào
■ Hoạt động của các quá trình trao đổi chất trong tế bào
(Chương 22), là một trong những phản ứng
được điều chỉnh bằng việc kiểm soát các hoạt động của
enzyme điều hòa phức tạp nhất được biết đến. Nó được điều chỉnh theo
một số enzym nhất định.
phương pháp phân lập (với ít nhất tám bộ điều biến khác nhau); bằng cách
■ Trong ức chế phản hồi, sản phẩm cuối cùng của một
biến đổi cộng hóa trị thuận nghịch; và bởi
con đường ức chế enzyme đầu tiên của nó
sự liên kết của các protein điều hòa khác, một cơ chế
con đường.
được xem xét chi tiết khi chúng ta xem xét quy định của

con đường trao đổi chất cụ thể. ■ Hoạt động của các enzym dị lập thể được điều chỉnh
Ưu điểm của sự phức tạp như vậy trong bằng cách liên kết thuận nghịch của một bộ điều biến cụ thể

điều hòa hoạt động của enzim? Chúng tôi đã bắt đầu chương này với một vị trí điều tiết. Bộ điều biến có thể là

bằng cách nhấn mạnh tầm quan trọng trung tâm của chất xúc tác đối với chính chất nền hoặc một số chất chuyển hóa khác, và

rất sự tồn tại của sự sống. Việc kiểm soát xúc tác cũng tác dụng của bộ điều biến có thể bị ức chế

quan trọng đối với cuộc sống. Nếu tất cả các phản ứng có thể xảy ra hoặc kích thích. Hành vi động học của

trong tế bào đều được xúc tác đồng thời thì các đại phân tử và chất chuyển hóa enzyme allosteric phản ánh sự hợp tác

sẽ nhanh chóng được chia thành các hóa chất đơn giản hơn nhiều tương tác giữa các tiểu đơn vị enzyme.
Machine Translated by Google

Chương 6 Đọc thêm 233

■ Các enzyme điều hòa khác được điều biến bằng cách được kích hoạt bằng cách phân cắt các đoạn
biến đổi cộng hóa trị của một nhóm chức năng cụ peptide nhỏ.
thể cần thiết cho hoạt động. Sự phosphoryl hóa các gốc
■ Enzyme tại các điểm giao thoa trao đổi chất quan trọng
axit amin cụ thể là một cách đặc biệt phổ biến để
có thể được điều chỉnh bởi sự kết hợp phức tạp của các
điều chỉnh hoạt động của enzyme.
tác nhân, cho phép phối hợp các hoạt động của các con
■ Nhiều enzyme phân giải protein được tổng hợp dưới dạng đường liên kết với nhau.
tiền chất không hoạt động được gọi là zymogens, đó là

Điều khoản quan trọng

Các thuật ngữ in đậm được định nghĩa trong bảng

thuật ngữ. enzym 191 hằng số tốc độ 195 cofactor 191 năng lượng liên kcat 206
kết (GB) 196 coenzym 191 độ đặc hiệu 199 nhóm giả 192 cảm ứng phù hợp 200 số doanh thu 207 ức chế

holoenzym 192 xúc tác axit-bazơ đặc hiệu 200 apoenzym 192 xúc tác thuận nghịch 209 ức chế cạnh

axit-bazơ tổng quát 200 apoprotein 192 xúc tác cộng hóa trị 200 vị tranh 209 ức chế không cạnh tranh
trí hoạt động 193 động học enzyme 202 chất nền 193 tốc độ ban đầu (vận tốc ban đầu), 211 ức chế hỗn hợp 211 ức chế không
V0 202 trạng thái cơ bản 193 Vmax 203 thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn trước trạng cạnh tranh 211 chất ức chế

thái ổn định 203 (G) 194 trạng thái ổn định 203 trạng thái chuyển tiếp không hồi phục 211 chất bất hoạt
194 động học trạng thái ổn định 203 năng lượng kích hoạt (G‡ ) 194 tự sát 211 chất tương tự trạng
Hằng số Michaelis (Km) 204 chất trung gian phản ứng 195 Phương trình Michaelis-Menten thái chuyển tiếp 220 enzyme

204 Bước giới hạn tốc độ 195 Hằng số phân ly (Kd) 205 điều hòa 225 enzyme dị lập thể
Hằng số cân bằng (Keq) 195 Phương trình Lineweaver-Burk 206 225 chất điều biến dị lập thể
225 ức chế phản hồi 227
protein kinase 228 zymogen
231

Đọc thêm

Sự phát Nguyên lý xúc tác Amyes, TL,

triển chung của chức năng xúc tác. (1987) Bến Xuân Lạnh. Triệu chứng. O'Donoghue, AC, & Richard, JP (2001) Đóng góp năng lượng liên kết nội tại

Số lượng. Biol. 52. của photphat vào việc tăng tốc độ enzyme đối với triosephosphate

Một bộ sưu tập các bài viết xuất sắc về nguyên tắc cơ bản; tiếp tục isomerase. Mứt. Chem. Sóc. 123, 11.325–11.326.

rất hữu ích.

Fersht, A. (1999) Cấu trúc và cơ chế trong khoa học protein: Hansen, DE & Raines, RT (1990) Năng lượng liên kết và xúc tác

Hướng dẫn xúc tác enzyme và gấp protein, WH Freeman và Company, New enzyme. J. Chem. Giáo dục. 67, 483–489.

York. Một nơi tốt để sinh viên mới bắt đầu hiểu rõ hơn về các nguyên

Lời giới thiệu ngắn gọn, rõ ràng. Cao cấp hơn. tắc.

Friedmann, H. (ed.) (1981) Benchmark Papers in Biochem-istry, Vol. 1: Harris, TK & Turner, GJ (2002) Cơ sở cấu trúc của các giá trị pKa bị nhiễu

Enzyme, Công ty xuất bản Hutchinson Ross, Stroudsburg, PA. loạn của các nhóm xúc tác trong các vị trí hoạt động của enzyme. IUBMB Cuộc

sống 53, 85–98.

Một bộ sưu tập các bài báo kinh điển về hóa học enzyme, có
Kraut, J. (1988) Enzim hoạt động như thế nào? Khoa học 242, 533–540.
bình luận lịch sử của người biên tập. Vô cùng thú vị.
Landry, DW, Zhao, K., Yang, GX-Q., Glickman, M., & Georgiadis, TM
Jencks, WP (1987) Xúc tác trong hóa học và enzyme, Dover Publications,
(1993) Sự phân hủy kháng thể của cocaine.
Inc., New York.
Khoa học 259, 1899–1901.
Một cuốn sách nổi bật về chủ đề này. Cao cấp hơn.
Một ứng dụng thú vị của kháng thể xúc tác.

Kornberg, A. (1989) Vì tình yêu với enzyme: Cuộc phiêu lưu của một nhà
Lerner, RA, Benkovic, SJ, & Schulz, PG (1991) Ở ngã tư của hóa học
hóa sinh, Nhà xuất bản Đại học Harvard, Cambridge.
và miễn dịch học: kháng thể xúc tác.

Khoa học 252, 659–667.

Machine Translated by Google
234 Chương 6 Enzyme
Miller, BG & Wolfenden, R. (2002) Trình độ xúc tác:
trường hợp bất thường của OMP decarboxylase. Annu. Mục sư Hóa sinh. 71,
847–885.
Orotidine monophosphate decarboxylase dường như đang thống trị
nhà vô địch về tăng cường tốc độ xúc tác bằng enzyme.
Schramm, VL (1998) Trạng thái chuyển tiếp và chuyển tiếp enzyme
thiết kế tương tự trạng thái. Annu. Mục sư Hóa sinh. 67, 693–720.
Nhiều minh họa hay về các nguyên tắc được giới thiệu trong cuốn sách này
chương.
Động học
Cleland, WW (1977) Xác định cơ chế hóa học của
phản ứng xúc tác enzyme bằng các nghiên cứu động học. Khuyến cáo. Enzim. 45,
273–387.
Cleland, WW (2002) Động học enzyme: trạng thái ổn định. Trong tự nhiên
Bách khoa toàn thư về khoa học đời sống, Tập. 6, trang 421–425, Nhóm Xuất
bản Tự nhiên, Luân Đôn. Bài báo được xuất bản lần đầu vào năm 1998. Ency-
clopedia có sẵn trực tuyến (2001), theo hình thức đăng ký, tại www.els.net.
Trình bày rõ ràng và ngắn gọn về những điều cơ bản.
Raines, RT & Hansen, DE (1988) Cách tiếp cận trực quan để
động học trạng thái ổn định. J. Chem. Giáo dục. 65, 757–759.
Segel, IH (1975) Động học enzyme: Hành vi và phân tích của
Hệ thống cân bằng nhanh và trạng thái ổn định, John Wi-ley & Sons, Inc., New
York.
Một phương pháp điều trị tiên tiến hơn.
Ví dụ về enzyme
Babbitt, PC & Gerlt, JA (1997) Tìm hiểu về các siêu họ enzyme: hóa học là yếu
tố quyết định cơ bản trong sự phát triển của các hoạt động xúc tác mới. J.
Biol. Chem. 27, 30.591–30.594.
Một mô tả thú vị về sự phát triển của các enzyme có đặc tính xúc tác
khác nhau và việc sử dụng một số ít mô típ cấu trúc protein.
Các vấn đề
1. Giữ vị ngọt của ngô Vị ngọt
ngô mới hái (ngô) là do hàm lượng đường cao
trong hạt nhân. Ngô mua ở cửa hàng (vài ngày sau khi hái)
không ngọt bằng vì khoảng 50% lượng đường tự do được chuyển hóa
thành tinh bột trong vòng một ngày sau khi hái. Để bảo tồn
vị ngọt của ngô tươi, tai trấu có thể đắm chìm trong đó.
nước sôi trong vài phút (“chần”) rồi để nguội trong
nước lạnh. Ngô được chế biến theo cách này và bảo quản trong tủ đông
vẫn giữ được vị ngọt của nó. Cơ sở sinh hóa của việc này là gì?
thủ tục?
2. Nồng độ enzyme nội bào Để ước tính gần đúng nồng độ thực tế
của enzyme trong tế bào vi khuẩn,
giả sử rằng tế bào chứa nồng độ bằng nhau là 1.000
các enzym khác nhau trong dung dịch trong bào tương và mỗi pro-
tein có trọng lượng phân tử là 100.000. Cũng giả sử rằng
Tế bào vi khuẩn có dạng hình trụ (đường kính 1,0 m, cao 2,0 m),
rằng cytosol (trọng lượng riêng 1,20) là 20% protein hòa tan
tính theo trọng lượng và protein hòa tan bao gồm toàn bộ
enzyme. Tính nồng độ mol trung bình của mỗi
enzyme trong tế bào giả định này.
Babbitt, PC, Hasson, MS, Wedekind, JE, Palmer, DRJ,
Barrett, WC, Reed, GH, Rayment, I., Ringe, D., Kenyon,
GL, & Gerlt, JA (1996) Siêu họ enolase: chung
chiến lược tách proton của -proton bằng xúc tác enzyme
axit cacboxylic. Hóa sinh 35, 16,489–16,501.
Kirby, AJ(2001) Cơ chế lysozyme được sắp xếp sau 50
năm. Nat. Cấu trúc. Biol. 8, 737–739.
Một cuộc thảo luận thú vị về khả năng xúc tác của enzyme và
nguyên tắc làm nền tảng cho nó.
Warshel, A., Naray-Szabo, G., Sussman, F., & Hwang, J.-K.
(1989) Serine protease thực sự hoạt động như thế nào? Hóa sinh 28,
3629–3637.
Enzyme điều hòa
Barford, D., Das, AK, & Egloff, M.-P. (1998). Cấu trúc
và cơ chế của protein phosphatase: hiểu biết sâu sắc về xúc tác và
quy định. Annu. Mục sư Sinh lý học. Sinh khối. Cấu trúc. 27, 133–164.
Dische, Z. (1976) Việc phát hiện ra sự ức chế phản hồi. Xu hướng
Hóa sinh. Khoa học. 1, 269–270.
Hunter, T. & Plowman, GD (1997) Protein kinase của nấm men đang chớm nở: sáu
điểm trở lên. Xu hướng sinh hóa. Khoa học. 22, 18–22.
Chi tiết về sự đa dạng của các enzyme quan trọng này trong một mô hình
sinh vật nhân chuẩn.
Johnson, LN & Barford, D. (1993) Ảnh hưởng của quá trình phosphoryl hóa lên
cấu trúc và chức năng của protein. Annu. Rev.
Sinh lý. Sinh khối. Cấu trúc. 22, 199–232.
Koshland, DE, Jr. & Neet, KE (1968) Các đặc tính xúc tác và điều hòa của
enzym. Annu. Mục sư Hóa sinh. 37, 359–410.
Monod, J., Changeux, J.-P., & Jacob, F. (1963) Protein dị lập thể và hệ
thống kiểm soát tế bào. J. Mol. Biol. 6, 306–329.
Một bài viết cổ điển giới thiệu khái niệm về quy định phân bổ.
3. Tăng cường tỷ lệ bằng Urease Enzym urease
nâng cao tốc độ thủy phân urê ở pH 8,0 và 20 C bằng cách
hệ số 1014. Nếu một lượng urease nhất định có thể hoàn toàn
thủy phân một lượng urê nhất định trong 5,0 phút ở 20 C và pH
8.0, lượng urê này sẽ bị thủy phân trong bao lâu trong điều kiện
tương tự và không có ure-ase? Giả sử cả hai phản ứng đều diễn ra
trong hệ thống vô trùng
để vi khuẩn không thể tấn công urê.
4. Bảo vệ enzyme chống lại sự biến tính bằng cách
Nhiệt Khi đun nóng dung dịch enzyme, hoạt tính xúc tác sẽ giảm
dần theo thời gian do sự biến tính của enzyme. Dung dịch enzyme
hexokinase
ủ ở 45 C mất 50% hoạt tính trong 12 phút, nhưng khi
được ủ ở 45 C với nồng độ rất lớn của một trong các cơ chất của
nó, nó chỉ mất 3% hoạt tính
trong 12 phút nữa. Giải thích tại sao sự biến tính nhiệt của hexokinase
đã bị chậm lại khi có sự hiện diện của một trong các chất nền của nó.
5. Yêu cầu của các vị trí hoạt động trong enzyme Carboxy-
peptidase, loại bỏ tuần tự đầu carboxyl
Machine Translated by Google

Chương 6 Vấn đề 235

dư lượng axit amin từ cơ chất peptide của nó, là một đơn
polypeptide gồm 307 axit amin. Hai chất xúc tác thiết yếu
các nhóm trong trang hoạt động được cung cấp bởi Arg145 và Glam270.
(a) Nếu chuỗi carboxypeptidase là một chuỗi xoắn hoàn hảo,
Arg145 và Glam270 sẽ cách nhau bao xa (tính bằng Å) ? (Gợi ý: Xem
Hình 4–4b.)
(b) Giải thích làm thế nào hai gốc axit amin có thể xúc tác
cho một phản ứng xảy ra trong không gian vài angstrom.
6. Xét nghiệm định lượng Lactate Dehydrogenase
enzyme cơ lactate dehydrogenase xúc tác phản ứng
ồ
mô của động vật có xương sống. Chúng chịu trách nhiệm gây sốt
và tình trạng viêm và cơn đau liên quan của nó. Prostaglandin
có nguồn gốc từ axit béo 20 cacbon axit arachidonic
trong một phản ứng được xúc tác bởi enzyme prostaglandin en-
doperoxide synthase. Enzym này là cyclooxygenase, sử dụng
oxy để chuyển axit arachidonic thành PGG2, tiền chất trực tiếp của
nhiều loại prostaglandin khác nhau (sự tổng hợp tuyến tiền liệt
được mô tả trong Chương 21).
(a) Dữ liệu động học đưa ra dưới đây dành cho phản ứng được
xúc tác bởi prostaglandin endoperoxide synthase. Lấy nét
ở đây trên hai cột đầu tiên, xác định Vmax và Km của
enzym.

C NADH
CH3 COO H Tỷ lệ hình thành

Pyruvat [Axit Tỷ lệ hình thành của PGG2 với 10

của PGG2 mg/mL ibuprofen
Ồ Arachidonic] (mM) (mM/phút) (mM/phút)

C NAD
CH3 COO 0,5 23,5 16,67
1.0 32,2 25,25
H
1,5 36,9 30,49
lactat
2,5 41,8 37.04
3,5 44,0 38,91
NADH và NAD là các dạng khử và oxy hóa của coenzym NAD. Dung dịch
NADH nhưng
không phải NAD, hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 340 nm. Thuộc tính này được dùng để
(b) Ibuprofen là chất ức chế men tổng hợp prostaglandin
xác định nồng độ NADH trong dung dịch bằng cách đo quang phổ lượng
endoper-oxide. Bằng cách ức chế sự tổng hợp prostaglandin,
ánh sáng được hấp thụ ở
ibuprofen làm giảm viêm và đau. Sử dụng dữ liệu trong
340 nm bằng dung dịch. Giải thích các tính chất này của
cột đầu tiên và thứ ba của bảng, xác định loại
NADH có thể được sử dụng để thiết kế xét nghiệm định lượng lactate
sự ức chế mà ibuprofen tác động lên prostaglandin en-doperoxide
dehydrogenase.
synthase.
7. Mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng và cơ chất
10. Phân tích đồ họa của Vmax và Km Dữ liệu thực nghiệm sau đây
Nồng độ: Phương trình Michaelis-Menten (a) Tại
được thu thập trong quá trình nghiên cứu về
nồng độ cơ chất của enzyme với kcat là bao nhiêu
Hoạt tính xúc tác của peptidase đường ruột với cơ chất
30,0 s1 và Km 0,0050 M hoạt động ở 1/4
glycylglyxin:
tỷ lệ tối đa của nó? (b) Xác định phân số Vmax
sẽ thu được ở nồng độ cơ chất sau: [S]
1 Glycylglycine H2O Trên 2 glycine
Km, 2Km và 10Km.
2
Sản phẩm hình thành
8. Ước tính Vmax và Km bằng cách kiểm tra
[S] (mM) (mol/phút)
phương pháp đồ họa có sẵn để xác định chính xác
Vmax và Km của phản ứng được xúc tác bởi enzyme (xem Hộp 1,5 0,21
6–1), đôi khi những đại lượng này có thể được ước tính nhanh chóng bằng 2.0 0,24
kiểm tra giá trị của V0 khi tăng [S]. Ước tính Vmax 3.0 0,28
và Km của phản ứng được xúc tác bằng enzyme đã thu được dữ liệu sau. 4.0 0,33
8,0 0,40
16.0 0,45
[S] (M) V0 (M/phút)

2,5 106 4,0 28

106 1 105 2 40
Sử dụng phân tích đồ họa (xem Hộp 6–1 và các cuộc sống liên quan của nó
105 4 105 70
Đồ thị) để xác định Km và Vmax cho quá trình chuẩn bị enzyme và cơ
1 104 2 95 chất này.
103 1 102 112
128 11. Phương trình Eadie-Hofstee Một phép biến đổi của

139 phương trình Michaelis-Menten là Lineweaver-Burk, hoặc

140 nghịch đảo kép, phương trình. Nhân cả hai vế của

Phương trình Lineweaver-Burk bằng Vmax và sắp xếp lại sẽ cho kết quả
Phương trình Eadie-Hofstee:
9. Tính chất enzyme tổng hợp Prostaglandin Prostaglandin là một
nhóm eicosanoid, axit béo V.0
V0 (Km) Vmax
dẫn xuất với nhiều tác dụng cực kỳ mạnh mẽ trên [S]
Machine Translated by Google

236 Chương 6 Enzyme

Đồ thị V0 so với V0 /[S] của phản ứng được xúc tác bởi enzyme là Tính khối lượng phân tử nhỏ nhất của enzyme. Tại sao
hiển thị dưới đây. Đường cong màu xanh thu được khi không có giá trị thu được theo cách này chỉ mang lại giá trị tối thiểu

chất ức chế. Đường cong nào trong số các đường cong còn lại (A, B hoặc C) biểu thị trọng lượng phân tử?

hoạt tính của enzyme khi thêm chất ức chế cạnh tranh vào
15. Ứng dụng lâm sàng của enzyme vi phân
Hỗn hợp phản ứng? Gợi ý: Xem Công thức 6–30.
Sự ức chế Huyết thanh người có chứa một nhóm

Vmax enzyme được gọi là axit phosphatase, thủy phân este photphat sinh học trong

điều kiện hơi axit

(pH 5,0):

ồ ồ

RP ồ ồ H2O R OH HO P ồ
C
ồ ồ
0V

Độ dốc Km
Phosphatase axit được sản xuất bởi hồng cầu, gan,

thận, lá lách và tuyến tiền liệt. Enzim của

tuyến tiền liệt rất quan trọng về mặt lâm sàng vì nó tăng
B
hoạt động trong máu có thể là dấu hiệu của bệnh ung thư tuyến tiền liệt.
Vmax Phosphatase từ tuyến tiền liệt bị ức chế mạnh bởi ion tartrate, nhưng axit

MỘT
km phosphatase từ các mô khác

không. Làm thế nào thông tin này có thể được sử dụng để phát triển một quy

V0 trình cụ thể để đo hoạt động của axit phos-phatase của tuyến tiền liệt trong
[S] huyết thanh người?

12. Số vòng quay của Carbonic Anhydrase 16. Aceta-zolamide Carbonic anhydrase bị ức chế mạnh

Carbonic anhydrase của hồng cầu (Mr 30.000) có một trong

con số doanh thu cao nhất mà chúng tôi biết. Nó xúc tác quá trình bởi thuốc acetazolamide, được sử dụng làm thuốc lợi tiểu (tức là,

hydrat hóa thuận nghịch của CO2: để tăng sản xuất nước tiểu) và giảm quá mức

áp lực cao trong mắt (do tích tụ dịch nội nhãn

yz
H2O CO2 H2CO3 dịch) trong bệnh tăng nhãn áp. Carbonic anhydrase đóng vai trò quan trọng

đóng vai trò quan trọng trong các quá trình này và các quá trình bài
Đây là một quá trình quan trọng trong việc vận chuyển CO2 từ
tiết khác, vì nó tham gia vào việc điều chỉnh độ pH và hàm lượng
các mô đến phổi. Nếu cho 10,0 g anhydrase cacbonic tinh khiết
bicarbonate trong một số chất dịch cơ thể. Đường cong thử nghiệm của
xúc tác quá trình hydrat hóa 0,30 g CO2 trong 1 phút ở 37 C ở
tốc độ phản ứng ban đầu (tính theo phần trăm của Vmax) so với [S] đối với cacbonic
Vmax, số vòng quay (kcat) của anhy-drase cacbonic (tính theo đơn vị min1 )
Phản ứng anhydrase được minh họa dưới đây (đường cong trên). Khi
là bao nhiêu?
thí nghiệm được lặp lại với sự có mặt của acetazolamid,

13. Xây dựng phương trình tốc độ ức chế cạnh tranh Phương trình tốc độ của thu được đường cong thấp hơn. Từ việc kiểm tra các đường cong

một enzyme bị ức chế cạnh tranh là và kiến thức của bạn về các đặc tính động học của cạnh tranh

và các chất ức chế enzym hỗn hợp, xác định bản chất ức chế của acetazolamid.

Giải thích lý do của bạn.

V.tôi cây rìu [S]
V0
K tôi [S] 100

Bắt đầu với một định nghĩa mới về enzyme tổng số là

Không có chất ức chế

[E]t [E] [EI] [ES]

và các định nghĩa và KI được cung cấp trong văn bản, rút ra
50
phương trình tỷ lệ ở trên. Sử dụng đạo hàm của phương trình Michaelis-Menten
%V
)xam
ủ (
c

làm hướng dẫn. Acetazolamid

14. Sự ức chế không thể đảo ngược của một enzyme Nhiều enzyme bị ức chế

không thể đảo ngược bởi các ion kim loại nặng như

Hg2, Cu2 hoặc Ag, có thể phản ứng với sulfhydryl thiết yếu
0,2 0,4 0,6 0,8 1
nhóm để tạo thành mercaptide:
[S] (mM)
Enz–SH Ag Trên Enz–S–Ag H

Ái lực của Ag đối với nhóm sulfhydryl lớn đến mức Ag 17. Tác dụng của các chất ức chế có thể đảo ngược

có thể được sử dụng để chuẩn độ các nhóm OSH một cách định lượng. Đến 10,0 mL sự ức chế về tác dụng của chất ức chế có thể đảo ngược đối với quan sát được

dung dịch chứa 1,0 mg/mL enzyme tinh khiết, người nghiên cứu thêm vừa đủ Km (biểu kiến Km Km/). Bắt đầu với phương trình 6–30 và

AgNO3 để bất hoạt hoàn toàn phát biểu rằng Km biểu kiến tương đương với [S] tại

enzym. Tổng cộng cần có 0,342 mol AgNO3 . V0 Vmax / 2.

Machine Translated by Google

Chương 6 Vấn đề 237

18. Độ pH tối ưu của Lysozyme Vị trí hoạt động của lysozyme
chứa hai dư lượng axit amin cần thiết cho xúc tác: Glam35
và Asp52. Giá trị pKa của chuỗi bên carboxyl của chúng
dư lượng lần lượt là 5,9 và 4,5. Sự ion hóa là gì
trạng thái (được proton hóa hoặc khử proton) của từng cặn ở pH 5,2,
pH tối ưu của lysozyme? Làm thế nào các trạng thái ion hóa có thể
trong số các dư lượng này giải thích đặc tính pH hoạt động của lysozyme
hiển thị dưới đây?
100
19. Làm việc với Kinetics Đi tới đồ thị sống
cho Chương 6.
(a) Sử dụng Đồ thị sống cho phương trình 6–9, tạo chữ V
1
so với âm mưu [S]. Sử dụng Vmax 100 M giây , và Km 10 M. Như thế nào
V0 tăng bao nhiêu khi [S] tăng gấp đôi, từ 0,2 lên
0,4 triệu? V0 là bao nhiêu khi [S] 10 M? bao nhiêu
V0 tăng khi [S] tăng từ 100 lên 200 M? Quan sát
đồ thị thay đổi như thế nào khi các giá trị của Vmax hoặc Km là
giảm đi một nửa hoặc gấp đôi.
(b) Sử dụng Đồ thị Sống cho Phương trình 6–30 và
các tham số động học trong (a), tạo ra một đồ thị trong đó cả hai và
là 1.0. Bây giờ hãy quan sát xem cốt truyện thay đổi như thế nào khi 2.0;

khi 3.0; và khi 2.0 và (c) Sử dụng 3.0.

Đồ thị Sống cho Phương trình 6–30 và

50 Phương trình Lineweaver-Burk trong Hộp 6–1, tạo các đồ thị Lineweaver-
t)
g ạa
n
i ođ
ộ
%
ố H
(
t

Burk (nghịch đảo kép) cho tất cả các trường hợp trong (a) và (b).
Khi là 2.0, điểm chặn x di chuyển sang phải hay tới
Bên trái? Nếu là 2.0 và 3.0 thì điểm chặn x có di chuyển không

bên phải hay bên trái?

0
2 4 6 số 8 10

pH