Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

BÀI 1. NUÔI CẤY VI SINH VẬT THU CHẾ PHẨM ENZYM

Tế bào vi sinh vật (VSV) tuy nhỏ bé nhưng trao đổi chất không ngừng. Sự sống của vi
sinh vật được đặc trưng bởi hàng loạt các phản ứng chuyển hóa vật chất, trong đó có
những phản ứng thực tế không xảy ra trong các ống nghiệm ở điều kiện bình thường
nhưng trong tế bào vi sinh vật các phản ứng ấy xảy ra với tốc độ nhanh gấp hàng triệu
lần nhờ những chất xúc tác đặc biệt: chất xúc tác sinh học hay còn gọi là Enzym.
1. Những đặc trưng của Enzym từ vi sinh vật
- Hệ Enzym của vi sinh vật rất đa dạng, phong phú. Từ vi sinh vật có thể thu nhiều
Enzym khác nhau, trong đó có những Enzym chỉ có ở vi sinh vật như xenlulaza,
Razemaza…
- Enzym từ vi sinh vật có hoạt lực cao hơn các Enzym tương tự ở động vật và thực
vật.
- Vi sinh vật nhạy cảm với môi trường nên khi thay đổi điều kiện sống hoặc tác
động bằng các yếu tố khác nhau, có thể thay đổi hệ Enzym và hoạt lực Enzym
của chúng. Nhờ vậy có thể tạo được các Enzym theo yêu cầu với hoạt lực cao.
- So với các sinh vật khác, vi sinh vật phát triển nhanh hơn. Tuy kích thước nhỏ
nhưng tỷ lệ Enzym trong tế bào VSV tương đối lớn nên hiệu suất thu hồi Enzym
cao, quy trình sản xuất đơn giản.
- Nguyên liệu dùng nuôi cấy vi sinh vật thu chế phẩm Enzym rất rẻ tiền, dễ kiếm,
thường là các loại phụ phẩm, phế liệu. Do đó, giá thành Enzym từ vi sinh vật
thấp hơn nhiều Enzym nguồn gốc động, thực vật.
2. Vi sinh vật tổng hợp Enzym và một số Enzym điển hình
2.1. Các vi sinh vật tổng hợp Enzym
Các vi sinh vật được sử dụng để thu Enzym gồm nhiều loại nấm mốc, nấm men, vi
khuẩn, xạ khuẩn.
2.2. Phương pháp nuôi cấy thu chế phẩm Enzym
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường cám trấu
- Phương pháp nuôi cấy chìm trong môi trường lỏng
2.3. Một số Enzym ứng dụng rộng rãi
2.3.1 Enzym Amylaza
- Enzym Amylaza là Enzym có ứng dụng rộng rãi nhất. Amylaza là tên chung
chỉ một nhóm gồm các Enzym có khả năng xúc tác thủy phân tinh bột thành
dextrin, đường maltoza và glucoza như α-Amylaza, β-Amylaza, Glucoamylaza,
Dextrinaza…
- Amylaza có trong một số nấm mốc
Aspergillus: Asp. oryzae, Asp. usami, Asp. niger, Asp. awamori
Rhizopus: Rh. delemar, Rh. japonium

1
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Mucor: M. rouxii
- Nấm men có khả năng tổng hợp Amylaza
Endomycopsis: E. fibuliger, E. species
Endomyces sp.
- Vi khuẩn có khả năng tổng hợp Amylaza
Bacillus subtilis, Bac. Macerans
Vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt lực amylaza mạnh: Bac.diastilicus, Bac.cirulans
Enzym Amylaza còn có trong thực vật (hạt nảy mầm, thóc mầm, hạt malt…, khoai
lang), trong động vật (nước bọt).
2.3.2 Enzym proteaza
Proteaza có nhiều ở động vật, thực vật, và vi sinh vật. Proteaza ở vi sinh vật tồn tại
dưới dạng nội bào và ngoại bào, phân hủy các liên kết peptit.
Proteaza có ở vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc
- Vi khuẩn tổng hợp Proteaza:
+ Bacillus: Bac. subtilis, Bac. thermophilus
+ Clostridium: Clost. perfringen, Clost. histolyticum,…
- Nấm mốc:
+ Aspergillus: Asp.oryzae, Asp.fumigatus, Asp.flavus,…
+ Penicillium: Pen. janthinellum
Proteaza có trong thực vật (promelin ở quả dứa, papain ở quả đu đủ xanh…), trong
động vật (tụy tạng, dạ dày…).
2.3.3 Enzym Pectinaza
Pectin là thành phần chính của lớp gian bào có chức năng kết dính các tế bào tạo thành
mô thực vật. Pectin khá bền được phân hủy nhờ enzym Pectinaza.
Pectinaza có nhiều ở nấm mốc Aspergillus niger.
2.3.4 Enzym Xenlulaza
Hệ Enzym Xenlulaza gồm 3 enzym chủ yếu:
- Exo.β 1,4-glucanaza
- Endoglucanaza
- Xelobiaza
Thủy phân xeluloza thành đường glucoza
Xelulaza có trong xạ khuẩn, nấm mốc và vi khuẩn.
- Nấm mốc: Trichoderma reesei, Tri.lignoran, Fusarium lini, Fus.solani
- Xạ khuẩn: Streptomyces flagrogrisens

2
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

- Vi khuẩn: Clost.thermicillum, Cellulomonas sp, Bacillus thermospoza sp.

Các enzym nói trên có vai trò rất lớn trong công nghệ xử lý nước thải và chất thải rắn
giàu các chất hữu cơ.
Nhờ có hệ enzym rất phong phú của vi sinh vật, các chất hữu cơ dưới dạng protein,
gluxit, pectin và cả xenlulo được chuyển hóa, góp phần ổn định chu trình tuần hoàn
vật chất trong tự nhiên.
Các enzym nói trên có vai trò rất lớn trong xử lý yếm – hiếu khí các chất thải rắn, nước
thải giàu chất hữu cơ.
3. Phần thực hành
3.1. Nuôi cấy VSV thu chế phẩm Enzym
3.1.1. Nuôi cấy nấm mốc thu chế phẩm Enzym Amylaza và Proteaza bằng phương
pháp nuôi cấy bề mặt
a). Chuẩn bị môi trường
- Cân:
Thành phần Chế phẩm enzym Amylaza Chế phẩm enzym Proteaza
Cám gạo 8g 8g
Trấu 10g 10g
Bột ngô 2g -
Gelatin - 2g

- Trộn đều, chuyển hỗn hợp vào bình tam giác 250mL, bổ sung nước cất đến độ
ẩm 60-65%. Nút bông.
- Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110oC trong 30 phút.
- Để nguội đến nhiệt độ phòng.
b). Cấy vi sinh vật
Sử dụng pipet đã được thanh trùng cấy 1mL dịch chứa bào tử của nấm mốc:
- Asp. usami: thu enzym Amylaza
- Asp. oryzae: thu enzym Proteaza
c). Nuôi cấy vi sinh vật thu enzym ở nhiệt độ 28-30oC trong thời gian 36 giờ.
3.1.2. Nuôi cấy thu chế phẩm Glucomaylaza bằng phương pháp nuôi cấy chìm
a). Chuẩn bị môi trường
- Lấy 50 mL môi trường lỏng (Rhutloff) vào bình tam giác 250mL để nuôi cấy
Endomycopsis. Nút bông.
- Thanh trùng ở nhiệt độ 110oC trong 30 phút.
- Lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng.
b). Cấy nấm men

3
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

- Cấy 5 mL canh trường nấm men Endomycopsis vào môi trường đã chuẩn bị.
c). Nuôi trên máy lắc ở nhiệt độ 28 – 30oC trong thời gian 48h và thu chế phẩm enzym.
3.2. Định tính hoạt lực của Enzym vi sinh vật
3.2.1. Chuẩn bị môi trường cho định tính
- Enzym Amylaza: Môi trường Shapec tinh bột
- Enzym Xenlulaza: Môi trường Hutchinson
3.2.2. Gieo cấy và nuôi vi sinh vật tổng hợp enzym
- Cấy vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp Amylaza và Xenlulaza: cấy chấm
điểm
- Nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 48 giờ
4. Báo cáo kết quả, nhận xét đánh giá
- Đánh giá chất lượng canh trường thu được bằng cảm quan
- Đo vòng thủy phân và đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzym của các vi sinh
vật
+ Vòng thủy phân tinh bột
+ Vòng thủy phân CMC

4
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

BÀI 2. XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC HdG CỦA CHẾ PHẨM ENZYM
Glucoamylaza là enzym ngoại phân (exoenzym), có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh
bột, glucogen, amilopectin, dextrin,… từ đầu không khử để tạo ra glucoza.
Glucoamylaza từ vi sinh vật thuộc các loài khác nhau thì có khả năng phân giải tinh
bột khác nhau.
1. Nguyên tắc
Dựa trên khả năng thủy phân tinh bột tạo thành đường glucoza của enzym
Glucoamylaza. Lượng glucoza tạo thành được xác định bằng phương pháp đường khử
Luf-School cải tiến.
Định nghĩa hoạt độ Enzym Glucoamylaza
1 đơn vị hoạt độ Glucoamylaza là lượng Enzym cần thiết xúc tác thủy phân tinh bột
tạo thành 1mg glucoza trong thời gian 1h ở điều kiện tiêu chuẩn (pH = 4,7, nhiệt độ
30oC)
2. Hóa chất
- Dung dịch đệm acetate pH = 4,7
- Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch Fehling I: CuSO4
- Dung dịch Fehling II: NaOOC-CHOH-CHOH-COOK, NaOH
(Natri, kali tartrat trong môi trường kiềm)
- Dung dịch tinh bột tan 1%
- Dung dịch KI 30%
- Dung dịch H2SO4 25%
- Dung dịch Na2S2O3 0,1N
3. Cách tiến hành
3.1. Thu Enzym từ canh trường nuôi cấy bề mặt
- Nghiền nhỏ chế phẩm enzym
- Cân 5 g chế phẩm đã nghiền nhỏ rồi chuyển vào bình/ống định mức 50 mL
- Thêm 5 mL dung địch đệm acetate, định mức bằng nước cất đến vạch
- Lắc đều, giữ hỗn hợp ở 30oC trong 30 phút
- Lọc lấy dịch chiết bằng giấy lọc băng vàng thu chế phẩm enzym tinh khiết
3.2. Xác định hoạt lực của enzym
- Cho vào bình tam giác 50 mL (100 mL):
+ 1 mL (hoặc 2 mL,…) dịch chiết enzym
+ 2 mL dung dịch đệm acetate
+ 10 mL dung dịch tinh bột 1%

5
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Đặt bình tam giác chứa hỗn hợp vào máy lắc ổn nhiệt, thực hiện quá trình
-
xúc tác thủy phân tinh bột ở 30oC trong thời gian 1h.
- Định tính hoạt lực Amylaza: thử phản ứng với Iốt sau các khoảng thời gian
3, 5, 10, 15 phút…..và quan sát sự thay đổi màu sắc của sản phẩm thủy
phân.
- Lấy mẫu sau 1h và định lượng đường khử.
- Song song tiến hành thí nghiệm với mẫu kiểm chứng ở cùng điều kiện (đun
dịch chiết để vô hoạt enzym).
3.3. Định lượng đường khử theo phương pháp Luf-School cải tiến
3.3.1 Nguyên tắc:
Phản ứng oxy hóa khử giữa dung dịch Fehling I và đường khử (glucoza, fructoza)
tạo thành kết tủa đỏ gạch. Lượng Fehling I dư được định lượng gián tiếp bằng KI
trong môi trường a xít mạnh.
3.3.2 Các bước tiến hành:
- Lấy vào bình tam giác 50 mL (100 mL):
+ 1 mL dung dịch Fehling I
+ 1 mL dung dịch Fehling II
+ 2 mL nước cất
+ 1 mL dung dịch mẫu cần phân tích
- Đậy bình tam giác bằng phễu thủy tinh. Đặt bình lên bếp đun sôi nhẹ trong 2
phút kể từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên.
- Làm nguội đến nhiệt độ phòng.
- Thêm vào hỗn hợp 1 mL dung dịch H2SO4 25%, 1 mL dung dịch KI 30%;
lắc đều và giữ trong 2 phút, hỗn hợp sẽ có màu vàng rơm.
- Chuẩn iốt dư bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N với chỉ thị là hồ tinh bột 1% sao
cho hỗn hợp dung dịch chuyển từ màu nâu đen sang màu trắng sữa.
Chú ý: Khi tiến hành thực hiện xác định lượng đường khử, cần dự đoán có những
khả năng nào xảy ra, hướng giải quyết như thế nào?)
4. Tính hoạt lực của Enzym
Từ lượng Na2S2O3 tiêu tốn trong phân tích, tính được hoạt độ Glucoamylaza theo công
thức:
(𝑎−𝑏).𝑓.3,3
𝐻𝑑𝑔 = , đv Hdg/g
𝑚.𝑡

trong đó:
a: thể tích Na2S2O3 0,1N chuẩn mẫu trắng, mL
b: thể tích Na2S2O3 0,1N chuẩn mẫu thí nghiệm, mL

6
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3,3 đương lượng đường khử tính theo Na2S2O3 (1 mL Na2S2O3 0,1N ~ 3,3mg
glucoza)
f: hệ số pha loãng
m: lượng enzym xúc tác phản ứng (tính tương ứng với mẫu khi chuẩn đường
khử), gam
t: thời gian phản ứng, giờ
5. Báo cáo thí nghiệm
- Nhận xét chế phẩm đã nuôi cấy bằng cảm quan.
- Đánh giá hoạt lực Glucoamylaza từ chế phẩm nuôi cấy Asp.usami.

7
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

BÀI 3. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ HdP PHƯƠNG PHÁP ANSON

Enzym Proteaza là nhóm Enzym xúc tác cho quá trình phân cắt liên kết peptit trong
các chuỗi peptit hoặc protein (polypeptit) nhờ phản ứng thủy phân theo cơ chế:

Proteaza thường được dùng trong sản xuất nước chấm, trong quá trình chế biến các sản
phẩm từ sữa, trong thuộc da, y học,… Trong công nghệ môi trường, các vi sinh vật
tổng hợp Proteaza được sử dụng trong xử lý hoặc hỗ trợ xử lý phân giải các chất thải,
nước thải giàu protein như: chất thải từ thuộc da, chế biến thủy sản, phế liệu hoặc phụ
phẩm nông nghiệp giàu protein (khô lạc, khô đậu tương, khô bông….).
Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp Proteaza
- Các vi khuẩn:
Bacillus subtilis, Bac. thermophilus, Bac. mesentericus…
Clotridium perfriugens, Clos. histolitium
Pseudomonas aeruginoza
- Các nấm mốc:
Asp. oryzae, Asp. fumicatus, Asp. flavus
Pen. ganthinellum, Pen. chrysogenum
Proteaza từ vi sinh vật tồn tại dưới dạng: Proteaza axit tính, trung tính, kiềm tính.
Hoạt độ Proteaza (HdP) đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải protein tới peptit và
axit amin của các Enzym.
HdP được biểu thị bằng số đơn vị Proteaza trong 1 g (hoặc 1 mL) chế phẩm.
Hoạt độ riêng của chế phẩm biểu thị bằng số đơn vị Proteaza trên 1 mg protein của chế
phẩm.
1. Nguyên tắc xác định hoạt độ Proteaza theo Anson
Enzym Proteaza có khả năng thủy phân Protein (gelatin, casein, hemoglobin,..) tạo
thành axit amin. Lượng axit amin tạo thành trong phản ứng thủy phân được xác định
bằng phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào thang chuẩn tyrozin để tính lượng axit amin thu được nhờ phản ứng thủy
phân.

8
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2. Định nghĩa hoạt độ Proteaza (HdP)

Đơn vị hoạt độ Proteaza là lượng Enzym trong 1 phút ở điều kiện xác định phân
giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng tạo màu
tương đương với 1 µmol tyrozin.
3. Hóa chất và dụng cụ
- Dung dịch Na2CO3 0,5 M
- Dung dịch đệm vạn năng pH = 5,5 (đệm đa năng Britton và Robinson)
- Dung dịch gelatin 2%
- Thuốc thử folin
- Dung dịch tyrozin chuẩn 10-3 (1µmol/mL)
- Dung dịch TCA 0,3 M
4. Các bước tiến hành
4.1. Thu dịch chiết Enzym
- Nghiền chế phẩm
- Cân 2g chế phẩm thu được đã nghiền nhỏ rồi chuyển vào bình/ống định mức
50 mL
- Định mức bằng dung địch đệm vạn năng 0,1M, pH 5,5 đến vạch
- Lắc đều, giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC trong 30 phút
- Lọc thu dịch chiết Enzym bằng giấy lọc
4.2. Thực hiện phản ứng xúc tác thủy phân
- Cho vào bình tam giác 50 mL (100 mL):
+ 2 mL dịch chiết Enzym
+ 2 mL dung dịch gelatin
- Lắc đều và thực hiện phản ứng xúc tác thủy phân ở nhiệt độ 30oC trong thời
gian 10 phút
- Đình chỉ phản ứng bằng cách thêm 4 mL TCA 0,3 M để kết tủa protein dư
và các sản phẩm thủy phân có phân tử lượng lớn
- Tiếp tục giữ hỗn hợp ở 30oC trong 20 phút
- Lọc thu dịch thủy phân
- Song song tiến hành thí nghiệm kiểm chứng ở cùng điều kiện, cho vào bình
tam giác 50 mL (100 mL):
+ 2 mL dịch chiết enzym
+ 4 mL TCA 0,3 M, khuấy đều trong 10 phút
Thêm 2 mL dung dịch gelatin, khuấy đều trong 20 phút
4.3. Dựng đường chuẩn tyrozin
- Từ dung dịch gốc tyrozin chuẩn, pha thành dãy nồng độ dung dịch sau:

9
 Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Nồng độ tyrozin (µmol/mL) 0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,3

1mL H2O 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5

Thể tích tyrozin 1µmol/mL (mL)
4 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,5
Thể tích HCl 0,2N (mL)

- Lắc đều
- Mỗi dung dịch trên lấy 1 mL cho vào ống nghiệm
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 5 mL dung dịch Na2CO3 0,5M, lắc đều
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL thuốc thử Folin, lắc đều
- Giữ hỗn hợp trong 20 phút
- Đo cường độ màu của hỗn hợp bằng máy so màu ở bước sóng λ = 670nm với
cuvet dày 1cm
- Dựng đường chuẩn từ kết quả đo được với trục hoành là hàm lượng tyrozin và
trục tung là mật độ quang.
4.4. Xác định lượng axit amin có trong mẫu thủy phân
- Lấy 1 mL sản phẩm thủy phân, mẫu đối chứng cho vào ống nghiệm
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 5 mL dung dịch Na2CO3 0,5M
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL thuốc thử folin, lắc đều
- Giữ hỗn hợp trong 20 phút, lọc nếu thấy có kết tủa
- Đo độ chiết quang bằng máy so màu quang điện ở bước sóng λ = 670 nm
Hoạt độ Proteaza (HdP) đv/g của chế phẩm được tính bằng biểu thức:
𝐷. 4. 𝑓
𝐻𝑑𝑃 =
𝑡. 𝑚
trong đó:
HdP: hoạt độ Proteaza của chế phẩm Enzym, đv/g
D: số µmol tyrozin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí
nghiệm và mẫu đối chứng
t: thời gian phản ứng, phút
m: lượng chế phẩm dùng cho quá trình xúc tác, g
4: tỷ lệ thể tích giữa hỗn hợp phản ứng với dung dịch Enzym sau khi thêm TCA
f: hệ số pha loãng
5. Báo cáo thí nghiệm
- Nhận xét chế phẩm đã nuôi cấy bằng cảm quan.
- Từ kết quả thí nghiệm, đánh giá hoạt lực của chế phẩm Enzym.

10
Khoa: Khoa học và Công nghệ môi trường - Thí nghiệm Hóa sinh môi trường
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

11