Pràctica 8: Immunodifusió doble o tècnica

d’Ouchterlony
La Prova de Coombs és una tècnica basada en una rea cció d’hemaglutinació.
Permet la detecció d’anticossos lliures en sèrum que poden reaccionar “in
vitro” amb eritròcits.

Instruments i equips:
Material - Microones
- Micropipetes automàtiques i puntes
Mostres: - Espàtula o escuradents
• A antisèrum - Aigua destil·lada
Reactius: - Pipetes (5 o 10 ml)
• B Sèrum total (Antigen) - Retolador
• C Albúmina (Antigen) - Placa calefactora o Microones
• D IgG (Antigen) - Paper
• E Solució tampó - Parafilm
• AgarosaTM UltraSpec - Safata de plàstic (cambra d’incubació)
- Vas de precipitats
- Proveta

Quin tipus de tècnica es?

Es una tècnica de precipitació.

Per a que serveix?

Estudis de puresa antigènica, estudis d’identitat d’antígens.

Proce1diment

A PREPARACIÓ DE L’AGAROSA
1. En un vas de precipitats de 500 ml, afegir tot el contingut del paquet de tampó en pols (component E) a 225 ml
d'aigua destil·lada. Agitar el vas de precipitats per dissoldre totalment la pols.

2. Afegir tot el contingut del paquet d'AgarosaTM UltraSpec al vas de precipitats (3 g). Agitar la suspensió per
dispersar els grumolls. Amb un retolador, indicar el nivell de volum de la solució a l'exterior del vas de precipitats.

3. Cal escalfar (fins a punt d'ebullició) la solució per dissoldre l'agarosa. Això es pot aconseguir amb una placa
calefactora. Cobrir el got amb Parafilm. Escalfeu la barreja fins que arribi a punt d'ebullició sobre una placa amb
agitació ocasional. Mantenir la barreja amb calor fins que tota la agarosa es dissolgui. Durant l'escalfament, retireu
ocasionalment el vas de precipitats de la calor i verifiqueu que no hi hagi partícules petites i clares d'agarosa.

Continuar escalfant amb agitació ocasional. La solució final ha de ser clara i transparent.
Preferiblement utilitzar un microones per fondre l'agarosa a temperatura alta en 30
segons. També es poden fer polsos d'escalfaments durant 2 minuts agitant el vas de
precipitats entre polsos. Verifiqueu que no hi hagi petites partícules clares d'agarosa.
La solució final ha de ser clara i transparent.
4. Si s'ha produït una evaporació detectable, afegir aigua destil·lada per emportar la solució al volum original
marcat al vas de precipitats al pas 2. El volum total ha de ser
d’un mínim de 230 ml.
5. Refredeu la solució d'agarosa a 55 °C en un bany d'aigua. Agitar el vas de precipitats al bany per facilitar la
dissipació de calor.
6. Preparar 3 alíquotes de 20 ml de la solució d'agarosa (55 °C) per a cada un de els
deu grups.

B. PREPARACIÓ DE PLAQUES D'OUCHTERLONY

1. Cada grup necessita 3 plaques: 3 plaques experimentals. Usar una pipeta de 5 ml o 10 ml, pipetejar
acuradament 5 ml de l'agarosa líquida (refredada a 55 °C) a cada placa, girant la placa per cobrir el fons amb
agarosa. Repetiu-ho amb les plaques restants.
2. Si l'agarosa líquida conté bombolles, agitar suaument la placa per eliminar-les.
3. Permetre que l'agarosa se solidifiqui. Això trigarà aproximadament 10-15 minuts, en el moment del qual el gel
apareixerà una mica opac.
4. Si les plaques no es faran servir aquest dia, poden embolicar-se amb plàstic i emmagatzemar invertides a la
nevera fins a dues setmanes.

C. PREPARACIÓ DELS POUETS

Col·locar la plantilla sota una de les plaques perquè el patró estigui al
centre de la placa.
Les distàncies entre els vasets són importants. Intentar seguir la plantilla
amb la màxima
precisió possible.
Tallar els cinc pouets amb el tallador de pouets (proporcionat al kit) amb
un suau
moviment de perforació.
Retireu els taps d'agarosa amb un escuradents.
 E. CÀRREGA DE LES MOSTRES EN ELS POUET
1. Anotar la identificació de cada grup en la part superior de la placa abans de carregar les mostres.
2. Usant la mateixa pipeta, omplir els pouets centrals de les tres plaques amb 30 microlitres (2 gotes
amb una pipeta de transferència) d'antisèrum (anticòs) del tub A. Els pouets han d'aparèixer plens,
però anar amb compte de no omplir massa els pocillos i causar vessament en la superfície de
agarosa. Això pot afectar els seus resultats.
3. Omplir els pocillos externs amb 30 microlitres d'antigen usant una punta de pipeta neta per a cada
antigen de la manera següent:

F. INCUBACIÓ
Col·locar les tapes en les plaques. Col·locar amb cura les plaques cobertes en la cambra d'incubació sobre
una capa de tovalloles de paper humides. No s'han d'invertir les plaques. Cobrir la cambra amb un embolcall de
plàstic i deixar incubar a temperatura ambient entre 24 i 48 hores per a permetre que es formin línies de
precipitació o la cambra es pot col·locar en un forn d'incubació a 37 °C.

5. Son els resultats esperats? Per què?

Sí, ja que, les mostres provenen del banc de sang i no sabem l’historial clínic de la persona.

6. Resultats

Placa 1: reacció d’identitat Placa 2: reacció d’identitat parcial Placa 3: reacció de no identitat

Podem concloure que els resultats són els espertats

7. Limitacions de la tècnica
• Sensibilitat Limitada:
La tècnica de Ouchterlony pot tenir una sensibilitat limitada, especialment quan es compara amb tècniques més
modernes com ELISA o Western blotting. Pot ser menys sensible per a la detecció de baixes concentracions
d'antigen.
• Detecció Qualitativa:
La tècnica de Ouchterlony és principalment qualitativa, cosa que significa que s'utilitza per a determinar si hi ha
interaccions antigèniques sense proporcionar una mesura quantitativa precisa de la concentració d'antigen.
• Interpretació Subjectiva:
La interpretació dels resultats pot ser subjectiva i dependre en gran manera de l'experiència de l'observador. Pot ser
difícil discernir amb precisió els límits de les línies de precipitació.
• Requereix Coneixement Preliminar:
Es necessita informació prèvia sobre els possibles antígens presents en la mostra, ja que s'han de preparar pocillos
específics per a cada antigen d'interès.
• Durada del Procés:
La tècnica de Ouchterlony pot portar més temps en comparació amb algunes tècniques més modernes. La difusió en
gel pot requerir un temps considerable perquè les interaccions antigen-anticòs es manifestin clarament.
• Requeriments Tècnics:
La tècnica requereix uns certs equips i habilitats tècniques, com la preparació de gels i la interpretació de patrons de
precipitació, la qual cosa pot ser limitatiu en entorns que no compten amb els recursos necessaris.
• Dificultats amb Antígens multicomponents:
Pot haver-hi dificultats en la interpretació quan es tracta amb antígens que tenen múltiples components, ja que les
línies de precipitació poden no ser tan clares.