RESISTÈNCIA DE LA PATATA

ENFRONT D’UN PATÒGEN BACTERIÀ

Paula Estrada i Carlota Esquembri

TCI-3 grup: 2
03/03/2022
 INTRODUCCIÓ

Durant molt de temps, aproximadament des del segle XVIII la patata ha estat un
dels aliments principals en l’alimentació humana, sobretot les de pell i carn groga.
No obstant, en els últims anys l’interès ha augmentat en la patata blava ja que s’ha
observat que contenen grans quantitats d’antocians, pigments que donen aquesta
tonalitat vermellosa i/o blavosa. Es diu que aquests antocians posseeixen importants
propietats terapèutiques i farmacològiques beneficioses per als humans. A més a
més, aquests antocians poden estar relacionats amb la capacitat de cicatrització de
les patates, ja que es creu que intervenen en la síntesi de la polifenoloxidasa (PPO),
un enzim gairebé universal.

Aquest estudi es centra en dues varietats de patata. La varietat Àgata, que és la

més comuna, d’orígen holandès, de pell groguenca i carn ferma. Tot i ser una
varietat molt productiva, té una resistència mitjana a una gran varietat de patògens.
D’altra banda, la varietat Vitelotte és originària de Bolívia i el Perú, de pell fosca i
carn morada. Gràcies a aquesta coloració es pot deduir que té grans quantitats
d'antocians. Aquestes dues varietats tenen un patògen en comú, el bacteri Erwinia
carotovora ssp. atroseptica (Eca) que provoca la podridura del tubercle a través de
les ferides en la pell, especialment durant el seu emmagatzematge i transport, degut
a que durant aquests processos, la pell no ha adquirit encara les propietats
fisicoquimiques necessàries per fer-se resistent a l’abrasió. És per aquesta raó que
es pot formular la següent hipòtesi: la patata Vitelotte tindrà més resistència a la
infecció per Eca que la varietat Àgata perquè té una quantitat superior d’antocians.

Per poder demostrar o refutar aquesta hipòtesi, es portaran a terme diversos

experiments, concretament tres: quantificar el nombre d’antocians de cada tipus de
patata; identificar la infecció de la bacteria Eca; determinar l’activitat de la
polifenoloxidasa (PPO) en les patates. Per tant, el principal objectiu és veure quina
de les dues varietats de patata conté més antocians.

2
 MATERIAL I MÈTODES

1. Quantificació del nombre d’antocians.

Per a determinar la quantitat d’antocians,en el nostre cas de la varietat Àgata,

vam extreure un cilindre d’aquesta amb un cork borer (foradataps) i vam
dividir-lo en tres segments o discos de 2 mm que contenien un fragment de
pell, còrtex i parèquima. Això és degut a que no totes les parts de la patata
tenen la mateixa concentració d’antocians i, per tant, per a què el valor de la
concentració fos el més representatiu possible. Acte seguit vam mesurar la
massa d’aquests discos amb una balança analítica. Després vam procedir a
triturar-los amb un bisturí i vam afegir-los en un tub de vidre amb 2 mL de
solució d’extracció amb una micropipeta i les seves respectives puntes.
Aquest tub de vidre el vam posar en una caixa amb gel i el vam anar posant
al vòrtex per a vortejar-lo 4 vegades en 45 minuts en períodes de 15 min. Un
cop fet això vam agafar 1,2 mL del sobrenedant amb una micropipeta i els
vam afegir en un tub eppendorf. Vam calibrar la centrífuga a 13000 g i hi vam
posar el tub eppendorf per 5 minuts, seguidament vam tornar a agafar 1 mL
del sobrenedant restant en un altre eppendorf. Alhora vam agafar un altre
eppendorf que contenia únicament solució d’extracció que el vam fer servir de
blanc. Finalment vam posar els dos tubs eppendorfs en l'espectrofotòmetre i
vam calcular-hi la absorbància a 545 nm.

2. Infecció amb Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca)

En aquesta part de la pràctica es van utilitzar dos mètodes per determinar la

resistència de la patata vers la infecció de l’Eca.
- Inòcul puntual amb el fi d’avaluar la capacitat de la patata de frenar
l’extensió de la maceració del teixit.
- Assaig de supervivència cel·lular per avaluar la resistència de les
parets cel·lulars a ser degradades.
Cada un d’aquest assajos requereixen uns procediments previs comuns que
consten del rentat de les patates per evitar que els bacteris i fongs propis del
sòl participin en aquesta infeció. A més, cal preparar l’inòcul d’1,9 ml de cultiu
d’Eca. Mitjançant la centrifugació, es va preparar 800μL d’una dilució ¼ per
poder mesurar l’absorbància ( λ=530nm ). Utilitzant aquest valor es mesura la
concentració cel·lular de l’inòcul mare amb la finalitat de preparar els inòculs i
els blancs per introduir-los a les patates.
A partir d’aquest punt, es van infectar les patates amb 3 inòculs d’Eca (10μL) i
3 inòculs d’aigua de l’aixeta estèril (control). Es van deixar incubar durant 72h
a temperatura ambient i en la foscor. Passades aquestes hores, es va tallar la
patata pels punts d’inòcul i es va mesurar amb un peu de rei (marca Spurtar)
els diàmetre màxim de l’extensió de la podridura per a cada inòcul.
D'altra banda, en l’assaig de la supervivència cel·lular es va seguir el
procediment de la tinció amb un colorant vital (vermell neutre) basat en el
mètode descrit per Wegener (2002) amb algunes modificacions.
En una placa de Petri estèril prèviament retolada s’hi va posar dos papers de
filtre de 6x6 𝑐𝑚2 i 30 mL de l’inòcul control (aigua estèril). Aquest procediment
es torna a repetir però afegint 30 mL d’Eca. Seguidament, amb les pinces
estèrils s'agafen els papers submergits, es deixa que perdin l'excés de líquid i
es posen en una placa de Petri. Amb l’ajuda d’un foradataps d’1,2 cm de
diàmetre, s'extreu el cilindre medul·lar de cada una de la patata, amb el
3
 tallador ( format per doble fulla d’afaitar) es tallen 6 discos de patata (2mm
aprox.) evitant la pela. Dels 6 discos, es van col·locar 3 d’aquests en cada
placa i tapar-los amb 2 altres papers de filtres submergits prèviament amb
s’ha dit anteriorment. Al final s’obté que per a cada placa hi han 6 discos: 3
discos de la varietat Àgata i 3 de la Vitelotte.
És imprescindible que tots els processos s’hagin realitzat de manera estèril.

Passades les 16 hores es va procedir a la tinció vital amb el vermell neutre.

Els discos preparats anteriorment, es col·loquen en tubs de Falcon de 50 mL
diferents amb 20 mL d’aigua miliQ i deixar-ho 45 minuts en agitació
horitzontal suau. Seguidament es va abocar l’aigua i es va afegir 10 mL d’una
solució de vermell neutre. Es van tornar a posar en agitació horitzontal suau
durant 60 min. Es van fer 2 rentats amb aigua per treure l'excés de la solució i
s’hi va afegir 10 mL d’etanol 96% deixant-ho en agitació 15 minuts més.
Aquest últim procés es repeteix un segon cop quan després s’hi afegeix
0,02N d’àcid sulfúric. A partir d’aquí es va mesurar l’absorbància de cada una
de les mostres a 535 nm.

3. Activitat de la polifenoloxidasa (PPO)

Es tracta d’observar per mitjà d’una espectrofotometria, la quantitat de

benzoquinona formada en un període de 20 segons. Per a aquest assaig vam haver
de tornar a treure cilindres de la patata amb el cork borer (foradataps), a aquests els
hi vam extreure la pell y vam agafar discos de 2 mm subepidèrmics, Després vam
afegir nitrogen líquid en un recipient i hi vam triturar-hi els discos amb una mà de
morter. El resultant ho vam abocar en un tub eppendorf. El tub el vam posar
seguidament a la centrifugadora a 13000 g durant 5 minuts. Aquesta vegada vam
deixar el pèl·let i en vam extreure el sobrenedant que era extracte enzimàtic. A això
li vam afegir catecol (substrat) i oxigen per a formar la següent reacció catalitzada
pel ppo:
catecol + ½ O₂ → Benzoquinona + H₂O
Després vam observar amb l’espectrofotòmetre l’absorvància a 526 nm per tal de
determinar la concentració de benzoquinona de les dues varietats de patates i veure
quina de les dues n’havia produït més en aquests 20 segons, ja que a major
quantitat d'enzim més ràpida hauria de ser en teoría la síntesi de benzoquinona.

4
 RESULTATS
Després d'obtenir els resultats individuals es van posar en comú amb la finalitat de fer una
valoració global i afirmar si la nostra hipòtesi era veritable. Mitjançant l’equació de Lambert-
Beer s’han pogut obtenir els resultats finals expressats en les taules següents.

QUANTITAT D’ANTOCIANS

GRUP VARIETAT ANTOCIANS 𝑋 ± SD

(mg/kg de pes
fresc)

1 Vitelotte 555,36 599,34 ± 167.8145

2 823,30

3 419,36

4 Àgata 14,602 7,4827 ± 5.1583

5 5,301

6 2,545

Taula 1.1 Resultat de la quantitat d’antocians en cada varietat de patata.

INÒCUL PUNTUAL

CADA PATATA CADA VARIETAT

GRUP VARIETAT 𝑋 ± SD 𝑋 ± SD
1 1,86 ± 1,041
2 0,37 ± 1,50
3 ÀGATA 0,37 ± 0,1414 2,3016 ± 0,7662
4 0,55 ± 0,11605
5 2,663 ± 1,1547
1,997 ± 0,7638
1 5,16 ± 0,577
2 0,32 ± 0,51
3 VITELOTTE 0,37 ± 0,163 2,3072 ± 0,954
4 0,5 ± 0,26458
5 1,83 ± 1,1547
5,663 ± 3,055
Taula 1.2 Resultat del diàmetre de la podridura de cada varietat de patata.

5
SUPERVIVÈNCIA CEL·LULAR

VARIETAT GRUP TIPUS SUPERVIVÈNCIA 𝑋 ± SD

%
1
2
3 CONTROL 100% 100
4
5
ÀGATA 1 25,42%
2 59,81%
3 ECA 145,32% 63,24 ±
4 87,65% 23,35
5 72,52%
70,81%
1
2
3 CONTROL 100% 100
4
5
VITELOTTE 1 48,48%
2 60,09%
3 ECA 130,18% 70,66 ±
4 120,59% 20,11
5 93,114%
80,987%
Taula 1.3 Resultat de la supervivència cel·lular de cada varietat de patata.

En aquesta taula els valors en vermell representen un error ja que no tenen sentit en
aquest tipus d’experiment, per tant no es van tenir en compte a l’hora de fer els
càlculs. Aquests són degut a que no es va afegir l’etanol corresponent, és a dir no
es va utilitzar el de 96%, sinó el d’una concentració diferent.

ASSAIG PPO

CADA PATATA CADA VARIETAT

GRUP VARIETAT 𝑋 ± SD 𝑋 ± SD
1 0,5007 ± 0,5952 0,55183 ±
2 VITELOTTE 0,619 ± 0,769 0,05214
3 0,4658 ± 0,200
4 0,13143 ± 0,457 ± 0,2534
ÀGATA 0,08663
5 0,645 ± 0,3835
0,596 ± 0,2902
Taula 1.4 Resultat de l’activitat polifenoloxidasa (PPO) a cada varietat de patata.

6
 DISCUSSIÓ I CONCLUSIONS

Comparant i discutint els resultats a classe es va veure que la quantitat d’antocians

de la Vitelotte és de fins a 100 vegades superior a la de l’Àgata, el que dóna la
possibilitat de comprovar la hipòtesi que a més antocians més resistència. En la
següent prova que vam fer, la inòcul puntual, podem observar en la taula 1.2 que els
resultats van ser contraris a la nostre hipòtesi, l’extensió de la podridura de la
Vitelotte era més gran que la de l’Àgata. Com en aquest experiment no hi ha
ceguesa dels resultats (havia de haver estat al contrari) vam concloure que aquests
resultats podrien haver estat deguts a una incorrecte manipulació experimental. La
supervivència celular (taula 1.3) però, ens va donar que hi havien més cèl·lules que
sobrevivien de Vitelotte que de l’Àgata, el problema va estar que es va detectar un
error experimental de 2 grups que van fer servir material equivocat i es van haver de
descartar algunes dades tal i com ja s’ha mencionat anteriorment. A més a més ens
vam donar compte que la desviació estàndard era molt alta i els valors eren similars,
amb la qual cosa tampoc no es va poder assegurar que la supervivència fos major
en la patata blava. Finalment amb l’assaig de les PPO es van poder observar uns
resultats clars, l’activitat de les PPO és més abundant en la varietat Vitelotte, com
podem observar en la taula 1.4. Així que globalment no es va poder acceptar la
nostra hipòtesi, una quantitat superior d’antocians doncs no fa que la patata tingui
més resistència.

7
 BIBLIOGRAFIA

● Álvarez, C. (2021, 14 diciembre). Descubre las interesantes propiedades de

la patata morada. Lifestyle. Recuperado 3 de marzo de 2022, de
https://lifestyle.fit/alimentos/verduras-hortalizas/patata-morada
● Hella-Monika Kuhn a, Ursula Meier-Dieter b and Hubert Mayer b. (1988,
febrero). ECA, the enterobacterial common antigen (N.o 54). FEMS
MicrobiologyReviews54(1988)195–222. https://doi.org/10.1016/0378-
1097(88)90002-X
● Penelo, L. (2020, 9 septiembre). Patata: propiedades, beneficios y valor
nutricional. La Vanguardia. Recuperado 3 de marzo de 2022, de
https://www.lavanguardia.com/comer/tuberculos/20181030/452622496029/ali
mentos-patata-valor-nutricional-beneficios-propiedades.html
● colaboradores de Wikipedia. (2022, 1 marzo). Solanum tuberosum.
Wikipedia, la enciclopedia libre. Recuperado 3 de marzo de 2022, de
https://es.wikipedia.org/wiki/Solanum_tuberosum