b5. PPNCDL Full

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU
ThS. Ngô Văn Cường
1
Main aspects of herbal medicine research (Willow J.H.Liu, 2011)
1. Extraction, Isolation, and Identification of Compounds in Herbal
Medicines
2. Bioassay Screening of Herbal Medicines
3. Pharmacological and Toxicological Study of Herbal Medicines
4. Clinical Studies of Herbal Medicines
5. Chemical Standardization and Quality Control of Herbal
Medicines
………
antioxidant activity: hoạt tính chống oxy hóa
antibacterial activity : hoạt tính kháng khuẩn 2
extract: (n) dịch chiết, cao chiết, (v) chiết xuất
Nội dung bài học
Phần 1. Quy trình nghiên cứu dược liệu
Phần 2. Tài liệu tham khảo
Phần 3. Thu hái dược liệu chuẩn bị cho nghiên cứu
Phần 4. Sơ bộ thành phần hóa thực vật
Phần 5. Chiết xuất, phân lập hoạt chất từ dược liệu
3
Mục tiêu bài học
Sau khi học xong phần 1 bài “Phương pháp nghiên cứu dược
liệu”, sinh viên phải:
1. Kể tên được các giai đoạn của quy trình nghiên cứu dược
liệu
2. Biết được phương pháp tìm tài liệu tham khảo để viết tổng
quan về một dược liệu.
3. Biết cách chuẩn bị dược liệu cho nghiên cứu
4. Trình bày được phương pháp khảo sát sơ bộ thành phần
hóa học của dược liệu
5. Trình bày được phương pháp chiết xuất, phân lập và xác
định cấu trúc các chất từ dược liệu 4
PHẦN 1.
QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU
5
Quy trình nghiên cứu dược liệu
Tìm hiểu
Xác khái niệm, Xây
Tiến Phân
định lý thuyết dựng Viết
hành tích
vấn đề liên quan, đề báo
các nghiên thực kết
nghiên cương cáo
cứu có nghiệm quả
cứu chi tiết
sẵn
1 2 3 4 5 6
6
1. Xác định vấn đề (tên đề tài)
• Vấn đề phải có ý nghĩa thực tiễn và phải có đóng góp, hoặc
đem lại những hiểu biết.
• Vấn đề phải cụ thể, không quá rộng.
• Cần phải bảo đảm có thể thu thập được mẫu/nguyên liệu
để tiến hành đề tài.
• Bạn phải trình bày vấn đề một cách rõ ràng, chính xác và
ngắn gọn.
• Bạn cần phải thích thú với vấn đề.
Ví dụ: Chiết xuất và phân lập một số ﬂavonoid từ rau Ngót 7
Nhật (Asystasia gangetica)

Tìm hiểu
Tiến Phân
hành tích
cứu chi tiết
sẵn
1 2 3 4 5 6
8
2. Tìm hiểu các khái niệm, lý thuyết và các nghiên
cứu liên quan
• Tóm tắt lại tất cả những lý thuyết và nghiên cứu trước đây
có liên quan
• Đánh giá và rút bài học kinh nghiệm về phương pháp
nghiên cứu từ các nghiên cứu trước
• Cần biết ngoại ngữ để tăng khả năng tổng quan tài liệu.
Chiết xuất và phân lập một số ﬂavonoid từ rau Ngót Nhật

9
(Asystasia gangetica)
Tìm hiểu
Tiến Phân
hành tích
cứu chi tiết
sẵn
1 2 3 4 5 6
10
3. Xây dựng đề cương chi tiết
• Thực chất là một bản kế hoạch thực hiện nghiên cứu.
• Là cơ sở để xem xét, đánh giá và phê duyệt nghiên cứu.
11
Các nội dung của một cuốn Đề cương nghiên cứu
1. Mục lục
2. Danh sách thuật ngữ viết tắt
3. Danh sách bảng, biểu đồ và hình ảnh
4. Đặt vấn đề
5. Chương 1. Tổng quan tài liệu và cơ sở lý thuyết
6. Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
7. Kết quả dự kiến: các mốc công việc cụ thể và thời gian
cần thiết để hoàn thành.
8. Giới thiệu người tiến hành nghiên cứu (nếu cần)
9. Dự trù kinh phí (nếu cần) 12
10. Tài liệu tham khảo

3.1. Mục lục: số thứ tự và tên mục, số trang
13
3.2. Danh sách thuật ngữ viết tắt

• Danh sách các chữ viết tắt tiếng Việt (theo thứ tự ABC)
• Danh sách các chữ viết tắt tiếng Anh (theo thứ tự ABC)
14
3.3. Danh sách bảng, biểu đồ và hình ảnh
Danh sách bảng: số thứ tự, tên bảng, số trang
Danh sách biểu đồ: số thứ tự, tên biểu đồ, số trang
Danh sách hình ảnh: số thứ tự, tên hình ảnh, số trang
15
Việc đánh số ảnh, biểu đồ và bảng biểu phải gắn với số chương
3.4. Đặt vấn đề (tại sao chọn đề tài này?)
1. Tầm quan trọng của vấn đề nghiên cứu
2. Tên đề tài là gì? Mục tiêu, đối tượng, phạm vi
3. Đề tài này có lợi ích gì? (học thuật, thực tiễn)
4. Mục tiêu/nội dung nghiên cứu (là gì)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây rau Ngót Nhật ……. ..được sử dụng ở nhiều nước. Ở Ấn Độ, người ta dùng
dịch lá làm thuốc trừ giun và dùng xoa trị sưng viêm và đau thấp khớp [1]. Ngoài
ra lá của Asystasia gangetica được sử dụng nhiều nơi ở Nigeria để điều trị hen
[14]. ……. Tuy nhiên, ở Việt Nam và trên thế giới cho tới thời điểm này chưa có
nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau Ngót Nhật.
Nhằm mục đích góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học có tác dụng sinh học
của cây Ngót Nhật đề tài “Chiết xuất và phân lập một số flavonoid từ rau ngót
nhật (Asystasia gangetica)" được thực hiện với các nội dung sau:
- Thu hái, khảo sát đặc điểm thực vật, định danh cây Ngót Nhật 16
- Chiết xuất, phân lập các flavonoid trong Ngót Nhật bằng phương pháp sắc ký
- ………
3.5. Tổng quan tài liệu và cơ sở lý thuyết
Khái niệm: Là một chương miêu tả chi tiết để chỉ ra rằng
những lý thuyết nào sẽ được nói đến và sử dụng trong đề tài
nghiên cứu của mình.
Mục đích:
• Trình bày kiến thức và sự hiểu biết về vấn đề đang hoặc sẽ
nghiên cứu.
• Đánh giá ưu - khuyết điểm của các lý thuyết sẽ áp dụng
• Mở rộng tầm hiểu biết trong lĩnh vực ta đang nghiên cứu.
17
Giảm thiểu các sai lầm.
1. Các lý thuyết nào liên quan đề tài này?
• Các khái niệm, các lý thuyết liên quan;
• Các mô hình nghiên cứu mang tính lý thuyết.
2. Vấn đề này đã được nghiên cứu như thế nào?
• Ai nghiên cứu?
• Dùng phương pháp nghiên cứu nào?
• Dùng các mô hình nghiên cứu nào?
• Kết luận như thế nào?
• Bài học kinh nghiệm về phương pháp là gì?
18
Tripetch Kanchanapoom và Somsak Ruchirawat (2007) bằng phương

pháp sắc ký cột diaion HP-20 đã phân lập được từ cao methanol phần
trên mặt đất Asystasia gangetica các chất 5,11-epoxymegastigman
(asysgangosid), salidrosid, ………
19
3.6. Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu
• Dược liệu sẽ tiến hành nghiên cứu: thời gian, địa điểm thu
hái, cách sơ chế…
• Động vật thử nghiệm: loài, giới tính, tuổi, cân nặng…
• Các dung môi, hóa chất, thiết bị sử dụng trong thử nghiệm…
2.1.1. Nguyên vật liệu
Mẫu cây rau Ngót Nhật thu hái vào tháng 10 năm 2017 tại huyện Gò
Công Đông, tỉnh Tiền Giang…..
2.1.2. Hóa chất sử dụng
Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập: nước cất, cồn….
2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ
20
- Kính hiển vi Olympus (Merck).
- Bình ngấm kiệt (20 lít) vật liệu nhựa cứng.
3.6. Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu (tiến hành như thế nào)
• Trình bày thật đầy đủ các nội dụng sẽ làm thực nghiệm
• Trình bày thật chi tiết các bước tiến hành các thực nghiệm đó
• Trình bày phương pháp phân tích, xử lý số liệu dự kiến.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Soi bột dược liệu
Dược liệu được xay mịn, rây qua rây 32, quan sát dưới kính hiển vi, vật kính 40X
2.2.2. Phân tích vi phẫu thực vật
Thực hiện theo giáo trình Thực hành Thực vật dược của bộ môn Thực vật dược
Đại
học Lạc Hồng [4].
2.2.3. Xác định độ tinh khiết 21
2.2.3.1. Xác định độ ẩm
Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182 [6].
3.7. Kết quả dự kiến: các mốc công việc cụ thể và thời
gian cần thiết để hoàn thành.
22
3.8. Giới thiệu người tiến hành nghiên cứu (nếu cần)
Tóm tắt lý lịch khoa học của từng thành viên trong nhóm
nghiên cứu
9. Dự trù kinh phí (nếu cần)
23
3.10. Tài liệu tham khảo/references
• Danh sách tài liệu tiếng Việt (theo thứ tự ABC của họ và tên)
• Danh sách tài liệu tiếng Anh (theo thứ tự ABC của họ)
24
3.10. Tài liệu tham khảo/references
Hoặc sắp xếp theo thứ tự trích dẫn (trước – sau)
25
Sau khi đã viết xong đề cương:
• Báo cáo đề cương
• Sửa chữa đề cương
• Đề cương nghiên cứu được chấp thuận
26
Tìm hiểu
Tiến Phân
hành tích
cứu chi tiết
sẵn
1 2 3 4 5 6
27
6. Báo cáo kết quả
Báo cáo hoàn chỉnh Đề cương
1. Lời cảm tạ 1. Mục lục
2. Tóm tắt/Abstract (1 trang) 2. Danh sách thuật ngữ viết tắt
3. Mục lục 3. Danh sách bảng, biểu đồ và hình
4. Danh sách thuật ngữ viết tắt ảnh
5. Danh sách bảng, biểu đồ và hình 4. Đặt vấn đề
ảnh 5. Chương 1. Tổng quan tài liệu và
6. Đặt vấn đề cơ sở lý thuyết
7. Chương 1. Tổng quan tài liệu và 6. Chương 2. Đối tượng và phương
cơ sở lý thuyết. pháp nghiên cứu
8. Chương 2. Đối tượng và Phương 7. Kết quả dự kiến: các mốc công
pháp nghiên cứu việc cụ thể và thời gian cần thiết để
hoàn thành.
9. Chương 3. Kết quả và thảo luận
8. Dự trù kinh phí
10. Chương 4. Kết luận và đề nghị
9. Giới thiệu người tiến hành 28
nghiên cứu (nếu cần)
12. Phụ lục (nếu có)
Lời cảm tạ
• Cảm ơn cơ quan, tổ chức đã tạo điều kiện cho nghiên cứu;
• Cảm ơn các cá nhân đã hỗ trợ cho công tác nghiên cứu
(người hướng dẫn, đồng nghiệp, bạn bè, người cung cấp
dữ liệu);
• Cảm ơn cơ quan tài trợ cho nghiên cứu.
29
Tóm tắt/Abstract (1 trang): trình bày ngắn gọn
• Lý do chọn đề tài
• Đối tượng, phương pháp nghiên cứu
• Kết quả chính và bàn luận
30
Kết quả và bàn luận
- Trình bày một cách logic kết quả hình ảnh, số liệu thu từ
phương pháp nghiên cứu đã đặt ra trước đó
- Đúc rút ra các phát hiện chủ yếu (trả lời các câu hỏi nghiên
cứu).
- Lý giải cho các phát hiện này, và so sánh với các kết quả
nghiên cứu trước đây, so với lý thuyết (bàn luận).
Từ 5 kg dược liệu khô tiến hành chiết xuất và phân lập đã xác định được
trong cao ethyl acetat có hai flavonoid là AG1 (luteolin – 15 mg) và AG2
(apigenin – 10 mg). Luteolin và apigenin đã được phân lập trong nhiều
loại thực vật khác nhau nhưng chưa thấy có báo cáo phân lập được từ
cây Asystasia gangetica. Luteolin và apigenin là những flavonoid tự
nhiên, có tác dụng chống oxy hóa và chống thoái hóa [16], hạ cholesterol31
máu [26], ngăn ngừa sự phát triển ung thư biểu mô phổi [25].
Kết luận và đề nghị

• Nêu lại các kết quả, các phát hiện chủ yếu (trả lời các câu
hỏi nghiên cứu)
• Từ các phát hiện này, rút ra các ý tưởng, đề xuất Các nội
dung cần thực hiệp để tiếp tục hoàn thiện đề tài, đưa ra
giải pháp sản xuất kinh doanh, quản lý, chính sách vi mô,
vĩ mô …
Đề nghị
Nếu đề tài được tiếp, chúng tôi có một số đề nghị như sau:
- Khảo sát thành phần hóa học của cây rau Ngót Nhật ở các phân đoạn khác:
n-hexan, cloroform, n-butanol, nước.
- Đánh giá tác dụng dược lý (hạ đường huyết, kháng viêm, chống oxy hóa,
32
điều hòa rối loạn mỡ máu) của Rau Ngót Nhật để phát triển chế phẩm chăm
sóc sức khỏe ..
Phụ lục (nếu có)

• Phiếu điều tra, khảo sát
• Bảng số liệu, kết quả thống kê
• Các bản đồ, hình ảnh khác (phổ đồ NMR…)
…
 Nhằm chứng minh độ tin cậy của nghiên cứu
33
PHẦN 2.
TÌM TÀI LIỆU THAM KHẢO
34
2.1. Các nguồn tìm kiếm tài liệu
 Các ấn bản sách, tạp chí khoa học trong thư viện
 Internet (từ các tạp chí khoa học có phát hành online)
https://www.google.com
Bài báo trong nước:

- https://yhoctphcm.ump.edu.vn/ (tạp chí y học)
- http://www.vjol.info/index.php/tcdh (tạp chí dược học)
- …
Bài báo quốc tế
https://scholar.google.com **
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Hỗ trợ download các bài báo quốc tế có phí: https://sci-hub.tw/
Hỗ trợ tìm kiếm và download các bài báo
https://libgen.is/ ** https://z-lib.org ** (có thể tải được cả sách và báo)
37
Hỗ trợ download các bài báo quốc tế
Sci-Hub was founded by Alexandra Elbakyan in
2011 in Kazakhstan, as a reaction to the high
cost of research papers behind paywalls,
typically US$30 each when bought on a per-
paper basis. The site is widely used in
both developed and developing countries.[2][3]
Sci-Hub and Elbakyan were sued twice for
copyright infringement, first in 2015
by Elsevier and then by the American Chemical
Society in 2017, and judgements were declared
against it both times, leading to loss of its
Internet domain names.[8] The site has cycled
through different domain names since then.[2]
https://en.wikipedia.org/wiki/Sci-Hub
Hỗ trợ download các bài báo quốc tế và sách
Hỗ trợ download các bài báo quốc tế và sách
46
2.2. Cách trích dẫn tài liệu trong bài
48
2.3. Danh sách tài liệu tham khảo
(theo thông lệ quốc tế)
Đối với sách
Họ tên tác giả (năm xuất bản), tên sách, nhà xuất bản, nơi
xuất bản, trang tham khảo.
• Tên sách viết nghiêng, chữ cái đầu tiên viết hoa
• Kết thúc là dấu chấm (.) 49
• Trang trích dẫn: Tài liệu tiếng Việt: tr.
Tài liệu tiếng Anh: pp.
Đối với bài báo khoa học
Họ tên tác giả (năm xuất bản), “tên bài báo”, tên tạp chí, số
phát hành, khoảng trang chứa nội dung bài báo trên tạp chí.
Tên bài viết đặt trong dấu ngoặc kép, chữ đầu tiên viết hoa
Tên tạp chí in nghiêng, chữ đầu tiên viết hoa 50
Kết thúc bằng dấu chấm.

51
Một số tài liệu trích dẫn khác: xem tài liệu đính kèm
52
https://vnexpress.net/khoa-hoc/nhung-cu-lua-chan-dong-gioi-khoa-hoc-2251436.html
53
BÀI TẬP NHÓM
Số lượng thành viên nhóm: tối đa 5 sinh viên/nhóm
Nội dung: viết bài tổng quan về một dược liệu (tự chọn)
55
Nội dung và các quy định của báo cáo
Xem rubric đính kèm
56
Kiểm tra nguyên liệu:
- Định danh
Dược liệu - Độ tinh khiết: độ ẩm, độ tro, kim loại
nặng, dư lượng thuốc BVTV
- Thành phần hóa học
- Chiết xuất - Định lượng hoạt chất…
- Cô dung môi
Kiểm tra bán thành phẩm:

Cao - Độ tinh khiết
- Định lượng hoạt chất
- Hoạt tính sinh học….
- Bào chế
Chế phẩm Kiểm tra thành phẩm 57

PHẦN 3.
CHUẨN BỊ DƯỢC LIỆU CHO NGHIÊN CỨU
58
Tiên quyết
Kiểm tra dược liệu: đúng và đạt chất lượng
59
3.1. Xác định tên khoa học
❖ Xác định tên khoa học của cây (được viết bằng tiếng Latin)
❖ Tránh nhầm lẫn trong quá trình thu hái/mua do
• Một cây có nhiều tên tiếng Việt khác nhau
• Một tên tiếng Việt gắn với nhiều cây khác nhau
60
Mentha arvensis Colocasia gigantea

- Tên khoa học của cây gồm tên chi và loài bằng tiếng Latin, có
thể thêm tên tác giả và họ thực vật.
Mentha arvensis L., họ Hoa môi (Lamiaceae)
(a) (b) (c) (d)
(a) tên chi, chữ đầu viết hoa, chữ nghiêng
(b) tên loài, chữ đầu viết thường, chữ nghiêng.
(c) từ viết tắt tên của nhà thực vật đã phát hiện và đặt tên cho cây.
(d) Họ: họ bằng tiếng Việt ở trước và họ bằng tiếng Latin trong
dấu ngoặc đơn. Tên Latin của họ chữ đầu viết hoa, chữ thẳng.
- Tên tiếng Việt của cây thuốc: Bạc hà, Thiên môn đông
61
Tên dược liệu được viết bằng tiếng Latin
Herba Menthae arvensis
• Tên bộ phận dùng làm thuốc đứng trước, tên khoa học của cây
đứng sau, không có tên tác giả.
• Tên khoa học của cây được viết ở cách 2 phù hợp với tên bộ
phận dùng về giống và số.
• Tên khoa học của dược liệu được viết nghiêng (với chữ đầu của
từ chỉ tên bộ phận dùng và từ chỉ tên chi được viết hoa)
- Một số dược liệu kinh điển tên khoa học của dược liệu chỉ gồm
chữ chỉ bộ phận dùng của dược liệu và tên chi. Ví dụ:
Radix Polysciasis: Rễ của cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.)
Harms.
62
Một số từ Latin dùng để chỉ bộ phận dùng của dược liệu:
Flos: hoa (flower)
Folium: lá (leaf, leaves)
Fructus: quả (fruit)
Herba: toàn cây (aerial part)
Radix: rễ (root)
Rhizoma: thân rễ (rhizome)
Cũng có thể ghi dược liệu là:
Aerial part of Mentha arvensis
Thay vì Herba Menthae arvensis
63
Tham khảo giáo trình “Thực hành dược khoa 2” của
Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Lạc Hồng
Các phương pháp định danh cây:

❖ Phân tích đặc điểm thực vật: quan sát thân cành, lá, hoa (quan
trọng), ngửi mùi... để tra khóa phân loại thực vật.
❖ So sánh với mô tả trong tài liệu tham khảo về
• Mô tả vẻ ngoài của cây thuốc
• Vi học: vi phẫu, soi bột dược liệu khô
• Lý học: độ tro
• Hóa học: sắc ký lớp mỏng (TLC), HPLC, GC, so sánh với dược
liệu chuẩn (được lưu mẫu tại các trung tâm kiểm nghiệm).
❖ Phân tích ADN.
Các thuật ngữ định danh: Identified, verified, authenticated 64
65
Dược điển Việt
Nam V, chuyên
luận dược liệu
Thổ phục linh
66
Dược điển Việt Nam V, chuyên luận dược liệu Thổ phục linh
67
Ngô Văn Cường (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác
dụng chống oxy hóa trong thân rễ Thổ phục linh (Rhizoma Smilacis)
Cùng quy trình chiết, chấm cùng bản mỏng:
- dịch chiết của dược liệu thử (T)
- dịch chiết của dược liệu chuẩn (C)
So sánh các vết trên cùng một bản mỏng
(số vết, Rf, hình dạng, màu, tỷ lệ tương đối...)
của mẫu T // C.
68
69
70
71
3.2. Kiểm tra chất lượng dược liệu
72
3.3. Thu hái, chế biến
• Cần nêu rõ thời gian và địa điểm thu hái

• Dược liệu được rửa sạch (đất cát, thuốc trừ sâu), phơi
sấy khô (60 – 80 oC, tránh phơi dưới ánh nắng gay gắt),
xay nhỏ, rây để chuẩn bị cho chiết xuất.
73
PHẦN 4. KHẢO SÁT
SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
74
4.1. Cấu trúc một số nhóm chất trong cây
75
76
77
78
79
80
4.2. Định tính một số nhóm chất trong cây
Nhóm chất Thuốc thử/ Cách thực hiện (+) nếu
Chất béo Nhỏ dd lên giấy, hơ nóng Có vết mờ

Tinh dầu Bốc hơi trong chén sứ Có mùi thơm
Triterpen tự do Liebermann– Burchard vòng nhẫn tím, đỏ, nâu
Alkaloid TT chung alkaloid có tủa
Coumarin cắn + NaOH, soi UV 365 tăng huỳnh quang
Anthraquinon phản ứng Borntrager (+ kiềm) dịch kiềm → đỏ
Flavonoid Mg/HCl đđ (Cyanidin) có màu đỏ
dd FeCl3 5 % → xanh rêu / xanh đen
Tanin
dd gelatin muối 1 % → có tủa bông
Saponin Lắc mạnh dd nước bọt bền > 15 phút81
4.3. Khảo sát thành phần hóa học
Phương pháp Ciulei cải tiến
Ether ethylic = diethyl ether = C2H5-O-C2H5
Cồn = C2H5OH
82
Độ phân cực của một vài dung môi
Nhóm chức có tính phân cực tăng dần
Chất Aldehyd Ester Hydroxy,

alkan alken alkin ether Acid
thơm ceton amid amin
-OH
C-C C=C CC -O- C=O -NH2
83
(–) không có
 nghi ngờ
+ có ít
++ có
+++ có nhiều
Có tìm 84
Không tìm, dù có thể +
Không cần tìm
• Nếu gắn thêm nhóm chức thì độ phân cực sẽ thay đổi
Cùng là flavonoid: kém phân cực (aglycol bị methyl hóa), phân
cực trung bình (aglycol), phân cực (flavonoid glycosid 1 đường),
rất phân cực (flavonoid glycosid nhiều đường)
B
A
D
85
Ghi chú về bảng kết luận
86
Tránh nhầm lẫn
87
Tránh nhầm lẫn
88
Phản ứng Dragendorff dương tính giả
89
Phản ứng Dragendorff dương tính giả
90
PHẦN 5. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP
VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
91
Giới thiệu
Một số thuật ngữ
• Chiết xuất (extract, verb): dùng dung môi để lấy các chất ra
khỏi tế bào. Phân biệt với chiết suất: chỉ số khúc xạ.
• Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là dịch chiết (chất
tan và dung môi) (extract, noun)
• Dịch chiết cô loại bỏ dung môi trở thành cao chiết (lỏng, đặc)
(extract, noun)
• Phân lập (isolate): từ hỗn hợp nhiều chất phân thành từng chất
(compound)
• Đơn chất: chỉ cấu tạo bởi 1 nguyên tố: H2, N2, O2
• Hợp chất: cấu tạo từ nhiều nguyên tố: NaCl, HCl 92
• Tinh chế (purify): làm cho các chất tinh khiết hơn
93
Lắc phân bố

Yêu cầu: 2 dung môi không đồng tan
Dung môi, quy trình, dụng cụ chiết
Chiết xuất thích hợp
Phân lập Các kỹ thuật sắc ký cột
Tinh chế Lọc rửa tinh thể, kết tinh lại
Kiểm tra độ tinh khiết Sắc ký lớp mỏng, HPLC
94
Xác định cấu trúc Phổ IR, UV, MS, NMR
5.1. CHIẾT XUẤT
95
 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT
• Chiết các alkaloid
• Chiết lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần
• Chiết với cồn/ cồn nước rồi phân bố với dung môi có
độ phân cực tăng dần
 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ CHIẾT THƯỜNG DÙNG
96
QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT
Chiết xuất alkaloid
B td c li u C n khô alk. base Σ
MeOH.H2O cô quay thu DCM*
ch MeOH.H2O Alk. base Σ / DCM*
cô quay thu h i MeOH Ki m , chi t = DCM*
+ HCl 2%
C n MeOH Alk. mu i / ch c
c a
97
Dược liệu Chiết lần lượt với các dung môi
Chiết với DC n- Cô dung môi Cao n- Phân lập

n-hexan hexan hexan
Bã dược liệu 1
- Chất A
Chiết với DC Cô dung môi Cao Phân lập
cloroform CF CF
- Chất B
- Chất C
Ethyl acetat EA EA
- Chất X
- Chất Y
Chiết với DC Cô dung môi Cao Phân lập ….
n-butanol n-bu n-bu

Bã nước Nước Nước
Chiết (cồn-nước) Dược liệu
Dịch chiết
Cô dung môi, hòa với nước
Cao lỏng
Phân bố n-hexan DC n- Cô dung môi Cao n- Phân lập
hexan hexan - Chất A
Cao lỏng
- Chất B
Phân bố cloroform DC Cô dung môi Cao Phân lập
CF CF
- Chất C
Cao lỏng
Phân bố ethyl acetat DC Cô dung môi Cao Phân lập - Chất X
EA EA
Cao lỏng - Chất Y
Phân bố n-butanol DC Cô dung môi Cao Phân lập ….
n-bu n-bu
Cô dung môi Cao Phân lập

Cao lỏng
nước
PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT
Thường dùng
• Ngấm kiệt (percolation)
• Ngâm (maceration)
• Hồi lưu (reflux)
• Một số phương pháp khác
100
NGẤM KIỆT (PERCOLATION)
• Quá trình chiết diễn ra liên tục, dung môi luôn được
thay mới, hiệu quả cao. 101
• Ít tốn công
NGÂM (MACERATION)
Dược liệu + dung môi trong bình chứa
Kết hợp với siêu âm, gia nhiệt, khuấy trộn, rung lắc để làm tăng
hiệu quả chiết xuất
102
HỒI LƯU (REFLUX)
• Gồm
• Hệ thống sinh hàn
• Bình cầu chứa dược liệu và dung môi
• Bếp đun
• Ưu điểm: tiết kiệm dung môi

• Nhược điểm: không thích hợp cho
các chất kém bền với nhiệt
103
CHƯNG CẤT
104
105
Máy cô quay chân không
Máy cô quay chân không có các bộ

phận chính:
- Bể gia nhiệt
- Bình cầu chứa mẫu dung dịch
- Hệ thống sinh hàn
- Bình cầu thu dung môi
- Bơm hút chân không
106
Máy cô quay chân không
Nguyên tắc hoạt động: giảm áp suất

thì nhiệt độ sôi chất lỏng sẽ giảm.
Bình chứa mẫu dung dịch được quay

tròn liên tục nhằm tăng diện tích tiếp
xúc giữa dung dịch và nguồn nhiệt,
nhiệt phân bố đều trong dung dịch,
tránh hiện tượng quá nhiệt cục bộ.
Hơi dung môi bay ra khỏi bình cầu sẽ được

làm lạnh trong hệ thống sinh hàn và thu lại ở
bình thu dung môi.
107
5.2. PHÂN LẬP
108
Sắc ký cột cổ điển
Sắc ký cột rây phân tử (sephadex)
SPE
109
GIỚI THIỆU
Thuật ngữ
 Mẫu (sample): hỗn hợp chất cần phân tách (thường là cao
dược liệu)
 Pha tĩnh: đứng yên, nằm trong cột hay trên bản mỏng
 Pha động: dung môi di chuyển qua cột/ bản mỏng
Pha tĩnh <> các chất của mẫu <> pha động
110
5.2.1. SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN
111
A. PHA TĨNH – CƠ CHẾ TÁCH
Thường là silica gel (pha thuận):
 Là 1 chất phân cực với các nhóm –OH silanol hoạt động
 Cơ chế sắc ký chính: hấp phụ (mẫu bị giữ lại trên bề mặt
pha rắn)
SiO2
112
 Các cực hấp phụ (-RC=O, -OH, -RNH...) của mẫu thử gắn với
trung tâm hấp phụ ở bề mặt pha tĩnh rắn (-OH của silica gel) bằng
tương tác lưỡng cực, tương tác tĩnh điện hoặc liên kết hydro.
 Mẫu thử càng phân cực, lực hấp phụ càng lớn
113
 Ngược lại với quá trình hấp phụ là quá trình giải hấp phụ: dung
môi khi chảy qua hệ thống cũng sẽ tương tác với mẫu. Nếu dung
môi có lực giải hấp phụ > lực hấp phụ của “pha tĩnh + cấu tử” thì
dung môi sẽ đẩy cấu tử ra khỏi hệ thống
 Do lực hấp phụ của pha tĩnh đối với từng cấu tử này khác nhau
dẫn tới vận tốc di chuyển của từng cấu tử khác nhau.
114
B. CHUẨN BỊ CỘT
• Silica gel có thể được hòa với dung môi

rồi rót vào cột hay nạp dưới dạng bột khô.
• Mẫu có thể được nạp vào cột dưới dạng
ướt (hòa tan trong một lượng tối thiểu
dung môi nền rồi rót vào cột) hoặc dạng
khô (nghiền trộn cao với silica gel thật
mịn, sau đó đổ đều vào cột).
115
C. DUNG MÔI QUA CỘT
Trình tự dung môi sử dụng sẽ có độ phân cực tăng dần, các chất
tách ra khỏi hỗn hợp cũng sẽ có độ phân cực tăng dần.
 Dung môi kém phân cực được sử dụng trước, dung môi
phân cực được sử dụng sau
 Chất kém phân cực sẽ di chuyển ra khỏi cột trước, chất
phân cực hơn sẽ di chuyển ra khỏi cột sau.
116
C. DUNG MÔI QUA CỘT
• Có thể là một dung môi, nhưng thường là hỗn hợp của 2 dung
môi.
Dung môi chảy tự nhiên qua cột hoặc được hút/đẩy qua cột (sắc
ký cột nhanh) 117
D. PHÁT HIỆN CHẤT RA KHỎI CỘT
Chất theo dung môi pha động chảy ra khỏi cột được hứng vào các
ống nghiệm hoặc các lọ thủy tinh.
Một ít dịch từ các ống/lọ hứng sẽ được sử dụng thực hiện SKLM.
Các ống/lọ cho các vết giống nhau trên SKLM được gom lại để
làm giàu các chất.
118
119
Phát hiện chất trên SKLM:
 Mắt thường
 Thuốc thử
 Phát hiện bằng đèn UV 254 và UV 365 (bản

mỏng F254 Merch): bản mỏng phát quang chất
tắt quang trong 254 và ngược lại, bản mỏng tắt
quang trong UV 365 còn chất phát quang
120
UV 365 UV 254 FeCl3 VS
nBU 1 2 3 4 5 nBU 1 2 3 4 5 nBU 1 2 3 4 5 nBU 1 2 3 4 5
121
Một số thuốc thử phát hiện trên SKLM:
Hợp chất Thuốc thử

Alkaloid Dragendorff
Anthranoid KOH 10%/cồn
Các polyphenol (tanin, flavonoid) FeCl3 5%/cồn
Các chất hữu cơ nói chung Vanilin-sulfuric (VS)
122
5.2.2. SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ
123
PHA TĨNH – CƠ CHẾ TÁCH
Thường là các hạt sephadex (1 thương hiệu của hãng Pharmacia
để chỉ các hạt xốp tổng hợp từ dextran - có bản chất
polysacharid).
124
125
CƠ CHẾ TÁCH
Các cấu tử có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau:
 Các cấu tử lớn hơn kích thước xoang chỉ nằm ở ngoài các hạt,
không xâm nhập vào các xoang, theo pha động ra ngoài trước.
 Các cấu tử nhỏ hơn kích thước các xoang có thể xâm nhập các
xoang của hạt, bị lưu giữ tạm thời trong các xoang xốp này, sau
đó mới di chuyển dần theo pha động và thoát ra sau.
126
PHÁT HIỆN CHẤT RA KHỎI CỘT
Tương tự SKC cổ điển
127
5.2.3. SPE
128
5.3. TINH CHẾ
129
TINH CHẾ
- Tiếp tục sắc ký cột (với kích thước cột nhỏ hơn)
- Kết tinh:
• Hòa tan hoàn toàn trong dung môi, để bay hơi thật chậm ở
nhiệt độ thấp. Khi dung môi bay hơi, chất cần tinh chế sẽ kết
tinh thành tinh thể.
• Các tạp chất với hàm lượng nhỏ vẫn còn tan trong dung
dịch. Lọc lấy lớp tinh thể.
• Lặp lại vài lần cho đến khi tinh khiết
130
TINH CHẾ
- Lọc rửa tinh thể:
• Cho tinh thể còn lẫn tạp chất vào phễu lọc thủy tinh xốp
• Dùng dung môi hòa tan tốt tạp chất và ít hòa tan chất cần tinh
chế rót từ từ lên phễu.
• Dung môi hòa tan tạp chất và chảy xuống bình hứng, chất kết
tinh đã được làm sạch nằm lại trên phễu xốp.
(Hoặc dùng dung môi hòa tan tốt chất cần tinh chế nhưng ít hòa
tan tạp chất để rửa. Kết quả chất cần tinh chế ở phễu hứng bên
dưới, tạp chất nằm lại trên phễu)
131
5.4. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
132
5.4.1. SẮC KÝ LỚP MỎNG
Xác định độ tinh khiết của chất phân lập được: chất được chấm
lên 3 bản mỏng riêng biệt, khai triển với 3 hệ dung môi khác
nhau sao cho:
Bản 1: chất di chuyển gần vạch xuất phát (Rf = 1/3)
Bản 2: chất di chuyển khoảng nửa bản mỏng (Rf = ½)
Bản 3, chất di chuyển hơn nửa bản mỏng (Rf = 2/3)
133
134
5.4.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
135
PHA TĨNH – CƠ CHẾ
Pha tĩnh (silica gel pha đảo RP-8 hay RP-18): là silica gel mà
nhiều nhóm Si-OH silanol được biến đổi thành nhóm SiOR, trong
đó R là mạch hydrocarbon kém phân cực (phổ biến là 8C và
18C).
136
Cơ chế chủ yếu: phân bố. Các mạch nhánh (C-8, C-18) đóng vai
trò như một giá của pha tĩnh, lưu giữ một lớp dung môi tạo thành
pha tĩnh lỏng. Khi một pha động lỏng chứa mẫu đi qua hệ thống
pha tĩnh lỏng này, một sự phân bố mẫu vào 2 pha sẽ được hình
thành.
137
[𝑎] 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎 𝑡ĩ𝑛ℎ
 Ka =
[𝑎] 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎 độ𝑛𝑔
 Hệ số K càng lớn thì mẫu càng tập trung trong pha tĩnh, di
chuyển càng chậm, và ngược lại.
138
PHÁT HIỆN
Các chất ra khỏi cột được phát hiện bằng các đầu dò (detector,)
kết quả phát hiện được hiển thị trên màn hình máy vi tính.
Một số đầu dò thường dùng: PDA, MS...
139
140
5.5. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
141
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)  Phổ hồng ngoại (IR)
 Phổ UV  Phổ khối lượng (MS)
Xử lý tín hiệu

Mẫu Detector
Nguồn năng lượng
Nguyên tắc chung: chiếu các “chùm tia năng lượng” đi qua vật
chất (mẫu), vật chất sẽ “tương tác” với các chùm tia năng lượng
này. Phần “tia năng lượng” thoát ra khỏi mẫu sau quá trình tương
tác biến đổi phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của mẫu. Sự thay đổi
142
này được detector ghi nhận lại, các “bộ phận xử lý” biến đổi dữ
liệu thành cấu trúc tương ứng
Bức xạ điện từ
143
PHỔ IR
Cho thông tin về các loại liên kết và các nhóm chức khác nhau
hiện diện trong phân tử như -OH, -COR, -COOR, -CN,... nhưng
không cho thông tin về vị trí của các nhóm chức này
Symmetric Stretching Asymmetric Stretching Wagging
Twisting Scissoring Rocking

144
Mỗi loại dao động trong phân tử hấp thu ở một tần số xác định
145
PHỔ IR
146
147
PHỔ IR
148
PHỔ IR
149
PHỔ IR
150
PHỔ UV
Các photon của ánh sáng tới làm chuyển dịch các điện tử từ trạng
thái cơ bản sang trạng thái kích thích
Ảnh hưởng của dung môi

Ảnh hưởng của sự liên hợp 151
Ảnh hưởng của pH

152
KHỐI PHỔ
Cung cấp thông tin về khối lượng phân tử của chất.
Quá trình ion hóa là quá trình bắn phá các phân tử hợp chất
hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương
bằng các phần tử mang năng lượng cao:
X + e → X•+ + 2e
153
PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN NMR
Hạt nhân nguyên tử nằm trong từ trường được chiếu một bức
xạ điện từ có tần số thích hợp, sự hấp thu năng lượng sẽ xảy ra
và lúc đó spin trạng thái năng lượng thấp sẽ nhảy chuyển lên
spin trạng thái năng lượng cao hơn. Khi có hiện tượng nhảy
chuyển spin như thế, người ta nói là hạt nhân đã cộng hưởng
với bức xạ chiếu vào, gọi là cộng hưởng từ hạt nhân.
Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng
để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt
nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thụ (hay giải
phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của phân tử
chất đó.
154
1H-NMR
155
13C-CPD
156
Tên phổ Thông tin thu nhận
Một số liên kết, nhóm chức trong công
Phổ hồng ngoại (IR)
thức
Khối lượng của phân tử, qua đó có

Khối phổ (MS) thể dự đoán công thức phân tử
CxHyOzNt
Số lượng nguyên tử C, H trong công

Phổ cộng hưởng từ
thức phân tử, và cách thức liên kết
hạt nhân (NMR)
của chúng trong phân tử
157
TÀI LIỆU THAM KHẢO
158
159

b5. PPNCDL Full

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

b5. PPNCDL Full

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU

ThS. Ngô Văn Cường

Phần 1. Quy trình nghiên cứu dược liệu

Phần 2. Tài liệu tham khảo

Phần 4. Sơ bộ thành phần hóa thực vật

3. Biết cách chuẩn bị dược liệu cho nghiên cứu

Ví dụ: Chiết xuất và phân lập một số ﬂavonoid từ rau Ngót 7

Nhật (Asystasia gangetica)

Chiết xuất và phân lập một số ﬂavonoid từ rau Ngót Nhật

10. Tài liệu tham khảo

3.2. Danh sách thuật ngữ viết tắt

Tripetch Kanchanapoom và Somsak Ruchirawat (2007) bằng phương

3.6. Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

3.6. Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

Kết luận và đề nghị

Phụ lục (nếu có)

Bài báo trong nước:

Kết thúc bằng dấu chấm.

Kiểm tra bán thành phẩm:

Chế phẩm Kiểm tra thành phẩm 57

Mentha arvensis Colocasia gigantea

Các phương pháp định danh cây:

• Cần nêu rõ thời gian và địa điểm thu hái

Nhóm chất Thuốc thử/ Cách thực hiện (+) nếu

Chất béo Nhỏ dd lên giấy, hơ nóng Có vết mờ

Ether ethylic = diethyl ether = C2H5-O-C2H5

Nhóm chức có tính phân cực tăng dần

Chất Aldehyd Ester Hydroxy,

Lắc phân bố

Phân lập Các kỹ thuật sắc ký cột

Tinh chế Lọc rửa tinh thể, kết tinh lại

Kiểm tra độ tinh khiết Sắc ký lớp mỏng, HPLC

• Chiết các alkaloid

 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ CHIẾT THƯỜNG DÙNG

B td c li u C n khô alk. base Σ

MeOH.H2O cô quay thu DCM*

ch MeOH.H2O Alk. base Σ / DCM*

cô quay thu h i MeOH Ki m , chi t = DCM*

Chiết với DC n- Cô dung môi Cao n- Phân lập

Chiết với DC Cô dung môi Cao Phân lập

Cô dung môi, hòa với nước

Cô dung môi Cao Phân lập

Dược liệu + dung môi trong bình chứa

• Ưu điểm: tiết kiệm dung môi

Máy cô quay chân không có các bộ

Nguyên tắc hoạt động: giảm áp suất

Bình chứa mẫu dung dịch được quay

Hơi dung môi bay ra khỏi bình cầu sẽ được

Sắc ký cột rây phân tử (sephadex)

 Pha động: dung môi di chuyển qua cột/ bản mỏng

• Silica gel có thể được hòa với dung môi

Phát hiện chất trên SKLM:

 Phát hiện bằng đèn UV 254 và UV 365 (bản

UV 365 UV 254 FeCl3 VS

nBU 1 2 3 4 5 nBU 1 2 3 4 5 nBU 1 2 3 4 5 nBU 1 2 3 4 5

Một số thuốc thử phát hiện trên SKLM:

Hợp chất Thuốc thử

Tương tự SKC cổ điển

Bản 1: chất di chuyển gần vạch xuất phát (Rf = 1/3)

Bản 2: chất di chuyển khoảng nửa bản mỏng (Rf = ½)

Bản 3, chất di chuyển hơn nửa bản mỏng (Rf = 2/3)

Xử lý tín hiệu

Symmetric Stretching Asymmetric Stretching Wagging