Seminari 2:

TÈCNIQUES: MICROSCÒPIA

Curs 2023-2024

Dra. Montse Jaumot

Dept. de Biomedicina. Unitat de Biologia Cel·lular
Universitat de Barcelona
 MICROSCÒPIA BIOQUÍMICA i BIOFÍSICA
Estructura ? Composició ?
Funcionament ? Funcionament ?
ÒPTICA: SUB-FRACCIONAMIENT:
CÈL·LULES I ORGÀNULS GRANS ORGÀNULS PURIFICATS
ELECTRÒNICA: PROTEÒMICA:
ORGÀNULS PETITS I ESTRUCTURES SUBCEL·LULARS PROTEÏNES
LIPIDÒMICA:
LÍPIDS
GENÒMICA:
DNA i RNA

https://www.pinterest.es/
https://es.vector.me/
COM S’OBTENEN LES CÈLUL·LES?

ÒRGAN

PURIFICACIÓ
TRIPSINIZACIÓ
DELS DIFERENTES
(ruptura de les unions
TIPUS CEL·LULARS
PERFUSIÓ cel-cel i entre cel-ECM)
(centrifugació diferencial)
(extracció
de la sang)
LÍNIA CEL·LULAR
PROCESSAT PLACA DE CULTIU

Per a
Microscòpia BIOREACTOR
Bioquímica
Biofísica… PROLIFERACIÓ
CEL·LULAR
 1 mm = 10-3 m
QUINA MIDA TENEN LES CÈL·LULES ? 1 μm = 10-3 mm = 10-6 m
1 nm = 10-3 μm = 10-9 m

7-150 mm

Virus Bacteris

O,010-0,100 mm
O,5-3 mm
M. Ginzberg et al. Science 348, 2015
LA CÈL·LULA EUCARIOTA ESTÀ COMPARTIMENTADA:
 CITOPLASMA: NUCLI:
CITOSOL CROMATINA
CITO=cèl·lula;

+ SOL=solució +
ORGÀNULS CITOPLASMÀTICS ORGÀNULS NUCLEARS
+
CITOESQUELET
Part soluble del citoplasma
(50% volumn cel·lular)
-70% aigüa;
-20% proteïnes;
-10%: RNA, sucres, nucleòtids,
aminoàcids, metabolits, i ions
 NÚCLEO:
RETÍCLE Información genética
ENDOPLASMÀTIC LLIS: Síntesis de ribosomas
Síntesi de lípids

LISOSOMA:
Digestió intracel·lular
RETÍCLE
ENDOPLASMÀTIC
RUGÓS:
Síntesi i processament
MITOCÒNDRIA: de proteïnes
Respiració cel·lular
RIBOSOMES:
Síntesi de proteïnes

PEROXISOMA:
Oxidació àcids grassos
APARELL DE GOLGI:
Modificació, classificació
i distribució de proteïnes
Modificado de:
¿QUIN VOLUM EN % OCUPEN ELS COMPARTIMENTS CEL·LULARS?

Adapted from MBOC, 5th ed. p. 697.Table 12-2.

http://book.bionumbers.org/
 QUINES MESURES TENEN ELS ORGÀNULS CEL·LULARS?

500 nm
0,2 – 0,5 mm
50 nm (vesículas)

0,2 – 0,5 mm 0,5 mm

nucleolus 0,5 - 5 mm
3 - 10 mm
25 nm
NUCLI: 3-10 μm 4 – 5 nm (grosor)
NUCLÈOL: 0,5-5 μm
MITOCONDRI: 0,5 μm
LISOSOMA/PEROXISOMA:0,2-0,5 μm
VESÍCULES GOLGI: 50 nm
MEMBRANA PLASMÀTICA: 4-5 nm gruix
 PERQUÈ NECESSITEM UN MICROSCOPI ?
1-la cèl·lula és petita
2-la cèl·lula és transparent

1-PODER DE RESOLUCIÓ (PR):

Capacitat que te un microscopi de donar imatges diferents de
dos punts situats molt a prop l’un de l’altre.

PR PR
 LÍMIT DE RESOLUCIÓ (LR):

Distància mínima que ha d’existir entre dos punts perquè puguin

ser discriminats com a tals.
Com més petit és el LR més gran és el PR.

ULL HUMÀ: 0,2 mm

MICROSCOPI ÒPTIC (MO): 0,2 μm
MICROSCOPI ELECTRÒNIC (ME): 0,1 nm

LR

0,2 mm 0,2 μm 0,1 nm

0,1 nm 0,2 mm 0,2 mm

https://www.utsouthwestern.edu/labs/nicastro/ https://es.clipartlogo.com/
 PERQUÈ NECESSITEM UN MICROSCOPI ?
1-la cèl·lula és petita
2-la cèl·lula és transparent
(incolora i translúcida)

és necessari ressaltar les estructures cel·lulars

CONTRASTAR COLORANTS
MICROSCOPIS SELECTIUS
AMB
SISTEMES ÒPTICS
METALLS PESATS
DE CONTRAST SELECTIUS
CAL PREPARAR LES MOSTRES PER A LA SEVA OBSERVACIÓ ?

cèl·lules Navicula
pigments (diatomea): alga
MO unicel·lular
CONVENCIONAL acolorits fotosintetitzadora
del fitoplancton

EXAMEN TINCIÓ amb

VITAL MO colorants
Schizosaccharomyces pombe
DE CONTRAST vitals
(llevat): fong unicel·lular.
DE FASES Tinció: blau de metilè

Línia cel·lular NIH-3T3 en

cultiu (fibroblasts de ratolí)
CAL PREPARAR LES MOSTRES PER A LA SEVA OBSERVACIÓ ?

MO
CONVENCIONAL
1-FIXACIÓ
2-INCLUSIÓ
teixit 3-TALLAT
EXAMEN 4-TINCIÓ o CONTRASTAT
POST-VITAL 5-MUNTATGE DE LA PREPARACIÓ
1-FIXACIÓ
cultiu cel·lular 2-TINCIÓ o CONTRASTAT
ME 3-MUNTATGE DE LA PREPARACIÓ
 1-FIXACIÓ:
Mata les cel·lules,
però preserva les
seves qualitats
físico-químiques
FÍSICA
PER CONGELACIÓ: QUÍMICA:
-Nitrògen líquid -Formol (MO)
(MO i ME) -Gluteraldehid (ME)

Conserva a més,
L’activitat enzimàtica i
els lípids
 -Parafina (MO)
-Plàstic líquid (ME)

2-INCLUSIÓ:
Endureix per poder fer talls
molt fins i incrementar la
superficie de tall.
 3-TALL:
MICRÒTOM (MO) 0,5-50 μm
ULTRA MICRÒTOM (ME) 50-100 nm
CRIOSTAT

Modificat de: Freeman and Company. Molecular Cell Biology. Sixth edition. 2008
 DESPARAFINAT

PORTAOBJECTES REIXETA
(MO) (ME)

Modificat de: Freeman and Company. Molecular Cell Biology. Sixth edition. 2008
4-TINCIÓ (MO) (o CONTRASTAT (ME):
Contrasta les estructures, específicament.

HEMATOXILINA-EOSINA
TINCIÓ (MO): Afinitat per a àcides bàsiques
estructures: nucli citoplasma
Colorants o molècules fluorescents
afins a determinades
estructures cel·lulars (en molts
casos es desconeix la base
química d’aquest comportament).

Fetge de rata.
Tinció H-E
 MICROSCÒPIA
ÒPTICA

MICROSCÒPI ÒPTIC CONVENCIONAL

MICROSCOPI ÒPTIC DE CONTRAST DE FASES

MICROSCOPI ÒPTIC DE FLUORESCÈNCIA

CONVENCIONAL O CONFOCAL
 MICROSCOPI ÒPTIC
retina
CONVENCIONAL:

lent ocular A
(augments)

lents objectius B
(augments i resolució)
platina E
mostra C

lent condensadora D
(concentra la llum)

Font de llum F

Figure 9-3. Molecular Biology of the Cell . Fifth Edition (© Garland Science) (Adaptada)
 MICROSCOPI ÒPTIC DE CONTRAST DE FASES:
Porta una peça que retarda uns rajos de llum respecte a uns altres, així es crea un
efecte òptic de contrast sense necessitat de tenyir les mostres.
Les imatges sempre es veuen en tonalitats de grisos.

Línia cel·lular NIH-3T3 en

cultiu (fibroblast de ratolí)
MICROSCOPI ÒPTIC DE FLUORESCÈNCIA:
SUBSTÀNCIES FLUORESCENTS:
Al ser il·luminades amb llum d’una longitud
d’ona determinada (λ d’excitació) emeten λ
llum de λ superior (λ d’emissió) que brilla inferior
sobre un fons negre:

• naturals o AUTOFLUORESCÈNCIA
• artificials o FLUOROCROMS

λ
superior

Albert Leal i Anna Bosch SCiT-UB

 Premi Nobel Química 2008
Pel descobriment i desenvolupament de la proteïna verda fluorescent

GFP
(green fluorescent protein)

Osamu Shimomura Roger Y Tsien Martin Chalfie

Químic orgànic i Biòleg marí Bioquímic Químic i Neurobiòleg
Boston University University of San Diego Columbia University
USA USA USA
seqüenciació / clonatge en vectors d’expressió

Nous fluorocroms a partir del

coneixement del GFP
“How glow-in-the-dark jellyfish inspired a scientific revolution”
https://www.youtube.com/watch?v=Z4vJ8rQCNgg

"GFP, Lighting up Life" Dr. Martin Chalfie, Nobel Laureate

https://www.youtube.com/watch?v=NDVqUxF5LbQ
 FILTRE (3)
permet el pas de
la λ d’emissió
(ex. pel GFP llum
verda)
FONT DE LLUM
Proporciona lum
d’un espectre
ampli de λ: MIRALL
mercuri o làser DICROIC
(2)
FILTRE (1)
Permet el pas
de la λ
d’excitació
(ex. pel GFP llum mostra
blava)

Figure 9-13. Molecular Biology of the Cell . Fifth Edition (© Garland Science)
Alguns fluorocroms, com els colorants, tenen afinitat per algunes molècules:

DNA:
DAPI

Cèl·lules epitelials humanes (HeLa) marcades amb DAPI

Montse Jaumot, UB
Microtúbuls:
marcats amb
fluoresceïna Filaments d’actina:
DNA: Marcats amb rodamina
Fibroblasts humans
DAPI
Maria Calvo, CCiTUB
MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA CONFOCAL:
Què passa si les mostres que emeten fluorescència tenen un cert gruix ?

Freeman et al. Molecular Cell Biology (Adapted)

Molecular Biology of the Cell (© Garland Science) (Adapted)
El confocal permet obtenir imatges nítides !

Freeman et al. Molecular Cell Biology (Adapted)

Molecular Biology of the Cell (© Garland Science) (Adapted)
Cóm ?
• Va escanejant la mostra (seccions òptiques)
• Les imatges són captades seqüencialment i processades per un
ordinador per generar una imatge tridimensional

http://www.ianhopkinson.org.uk/
seccions òptiques seccions òptiques
eix xy eix xz
 stack of xy-slices

seccions òptiques
eix xy

GFP-actina
anti GFAP-A555
DAPI

Miguel Morales i Maria Calvo, CCiTUB

 secció òptica stack of xz-slice
xz-slices
eix xz

GFP-actina
anti GFAP-A555
DAPI

Miguel Morales i Maria Calvo, CCiTUB

Projecció:

Miguel Morales i Maria Calvo, CCiTUB

Reconstrucció tridimensional:

Miguel Morales i Maria Calvo, CCiTUB

 MICROSCÒPIA
ELECTRÒNICA

MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE TRANSMISSIÓ

MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE RASTREIG o

D’ESCOMBRATGE (SCANNING)
MICROSCÒPIA ELECTRÒNICA DE TRANSMISSIÓ
(MET o TEM)
 MO TEM

llum visible font d’electrons

Lents òptiques lents

electromagnètiques
portaobjectes
mostra
reixeta
mostra

tub
amb el buit

pantalla o
film fotogràfic
Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
CAL PREPARAR LES MOSTRES PER A LA SEVA OBSERVACIÓ ?

MO
CONVENCIONAL
1-FIXACIÓ
2-INCLUSIÓ
teixit 3-TALLAT
EXAMEN 4-TINCIÓ o CONTRASTAT
POST-VITAL 5-MUNTATGE DE LA PREPARACIÓ
1-FIXACIÓ
cultiu cel·lular 2-TINCIÓ o CONTRASTAT
ME 3-MUNTATGE DE LA PREPARACIÓ
1-FIXACIÓ: per CONGELACIÓ (FÍSICA) o amb GLUTARALDEHID (QUÍMICA)
2-INCLUSIÓ: amb un PLÀSTIC LÍQUID
3-TALL: amb un CRIOSTAT o un ULTRA-MICRÒTOM. Talls 50-100 nm gruix
mostra

REIXETA DE COURE

4-CONTRASTAT (no es pot tenyir !!!): amb METALLS PESATS (plom, tetròxid
d’osmi, urani, etc)
• Són afins a determinades estructures cel·lulars i no a d’altres (com els colorants)
• Són electrodensos (no permeten el pas dels electrons)
• Es produeix una difracció dels electrons els quals no poden ser recollits per les
lents i no contribueixen a la formació de la imatge.

Modificat de: Freeman and Company. Molecular Cell Biology. Sixth edition. 2008
 2 3
1

CONTRASTAT AMB UN METALL PESAT

1-molta afinitat
orgànul / estructura 2-una mica afí
3-gens afí
 e- e-

e-

e-

La imatge sempre es veu en escala de grisos !

 MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE RASTREIG
(MER o SEM)

IMATGES TRIDIMENSIONALS DE LA SUPERFÍCIE DE LA MOSTRA !!!

UPC
Polen vist amb el SEM
TEM SEM

▪ espirals que mouen

feixos d’electrons
per generar el
movimient de rastreig

▪ els electrons incideixen

sobre la SUPERFÍCIE de la
mostra la qual EMET
ELECTRONS SECUNDARIS*
que són detectats

▪ els electrons MAI

TRAVESSEN la mostra

IMATGE TRIDIMENSIONAL DE LA SUPERFÍCIE!!!

 COMPAREM: TEM SEM

ELECTRONS Travessen la mostra i formen la Incideixen sobre la superficie

imatge rastrejant-la
No travessen la mostra
S’emeten electrons secundaris que
són els que formen la imatge

IMATGE 2D de dins de la cèl·lula 3D de la superfície de la cèl·lula

PREPARACIÓ Complexa i llarga: fixació, inclusió, Simple i curta: fixació, peu

tall, reixeta de coure, contrastat d’alumini, contrastat

GRUIX DE LA Inferior a 150 nm Qualsevol

MOSTRA
Modificat de: https://microbiologynote.com/

MÀXIMA Més de 50 milions Màxim de 2 milons

MAGNIFICACIÓ
FORMACIÓ DE LA Directa en una pantalla fluorescent Els electrons són captats i
IMATGE del propi microscopi o en la processats amb un detector. La
pantalla de l’ordinador. imatge es crea en un ordinador.
INFORMACIÓ No Si
DIGITALITZADA
https://www.indiamart.com/ https://www.emgrid.com.au/
 feix d’electrons feix d’electrons

e- e-
e-

e-
 TEM SEM
Estudi de la ultraestructura i
Estudi de la morfologia de la
composició interna de les
superfície de les cèl·lules
cèl·lules
Brittanica.com

Macròfag

Ratnayake et al. Microsc. Microanal. 23 (Suppl 1), 2017

© Microscopy Society of America 2017 https://www.sciencesource.com/
 TEM
Espermatozoide
tall SEM
longitudinal
Espermatozoide i òvul

tall
transversal

Molecular Biology of the Cell, 4th ed.

Stevens i Lowe, 1992

 MICROSCÒPIA ÒPTICA DE SÚPER-RESOLUCIÓ
(SRM)
Premi Nobel de Química 2014
Pel desenvolupament de la
microscòpia de fluorescència de súper-resolució

Erik Betzig William E. Moerner Stephan Hell

Físic Químic i Físic Físic
University of California University of Standford Max Planck Institute
USA USA Alemania
 “Bridging the resolution gap”

LR

0,2 mm 0,2 μm 0,1 nm

Philip Patenall/Springer Nature Limited. IM Dobbie. Nature Reviews Microbiology 17, 2019
 UL HUMÀ: 0,2 mm
MICROSCOPIO ÒPTICO (MO): 0,2 μm (200 nm)
MICROSCOPIO ÒPTICO DE SÚPER-RESOLUCIÓ: 20 nm
MICROSCOPIO ELECTRÒNIC (ME): 0,1 nm

LR

200000 nm 200 nm 20 nm 0,1 nm

 MICROSCOPI
MICROSCOPI
FLUORESCÈNCIA
FLUORESCÉNCIA
SÚPER-RESOLUCIÓ

5 mm

Poros nucleares:
anti-NPC
Envoltura nuclear:
anti-lámina 1 mm
DNA:
DAPI Schermelleh et al. Science 320 .
DOI:10.1126/science.1156947. PMID 18535242.
“Super-resolution microscopy: a brief history and new avenues”
https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rsta.2021.0110
 Premi Nobel de Medicina 1906
En reconeixement al seu estudi sobre l’estructura del sistema nerviós

Santiago Ramón y Cajal

Metge
Universitats de València, Barcelona i Madrid
 Dado el carácter y la finalidad exclusivamente docente y eminentemente ilustrativa de las
explicaciones en clase de esta presentación, el autor se acoge al artículo 32 de la Ley de propiedad
intelectual vigente respecto del uso parcial de obras ajenas como imágenes, gráficos u otro
material contenidos en las diferentes diapositivas.

Todas las imágenes presentadas se incluyen como citas necesarias

para ilustrar las explicaciones de esta clase.