ALAPVETŐ LABORATÓRIUMI TECHNIKÁK ÉS

MŰSZEREK I.
SZÖVETTENYÉSZTÉS

Dr. Minárovits János és Dr. Rakonczay Zoltán

Szegedi Tudományegyetem, Fogorvostudományi Kar

Orálbiológiai és Kísérletes Fogorvostudományi Tanszék
Sejt, szövet, szerv, szervrendszer

• Sejt: az élőlények szerkezeti és működési

egysége
• Szövet: azonos módon differenciálódott,
azonos funkciójú sejtek együttese
• Szerv: többféle szövet együtteséből álló
funkcionális egység (pl. gyomor:
hámszövet, kötöszövet, símaizom)
• Szervrendszer: több mint egy szerv
együttese által alkotott működési egység
(pl. emésztőszervrendszer)
Szövettenyésztés
HeLa cervix carcinoma sejtek in vitro
 Adherens sejtek passzálása
A tápfolyadék leszívása ► inkubálás tripszin-EDTA oldatban
► a tripszin-EDTA oldat leszívása ► szuszpendálás friss
tápoldatban ► a levált sejtek átvitele új tenyészedénybe
 Nonadherens sejtek tenyésztése
A sejteket tartalmazó tápfolyadék egy részét eltávolítjuk és friss
tápfolyadékkal helyettesítjük, vagy a sejtszuszpenzió egy részét
friss tápoldatot tartalmazó új edénybe visszük át
Sejtcsomók (clumps)
kialakulása
szuszpenziós
kultúrában

Szuszpenziós
tenyészet, egymáshoz
nem tapadó sejtek
 Tápoldat
• MEM (Minimal Essential Medium)
• RPMI-1640 médium
- Vitaminok, aminosavak, sók, glukóz,
glutation, pH indikátor
-----------------------------------------------------------
Borjúsavó (FCS, fetal calf serum)
Szérummentes médiumok
Speciális növekedési faktorok, merkaptoetanol,
extracelluláris mátrix
Tápoldat
Tenyésztőedény
Normális sejt, daganatsejt
Tenyésztőedény
Tenyésztőedény
Pipetta Pipetták Pipettor
hegy Automata Műanyag
PIPETTOR, STERIL PIPETTA
Steril fülke
 Centrifugálás
- felülúszó (supernatant)
-üledék (pellet)
 Centrifuga
kilendülő fejes rotor
Centrifuga
szögrotor
 Centrifugálás
mikrocentrifuga
CO2 termosztát
Inverz mikroszkóp
Kondenzor (diafragma + lencsék): kellő erősségű, homogén
megvilágítást biztosít
Diafragma Lencsék
Inverz mikroszkóp
Inverz mikroszkóp, fluoreszcens
feltéttel
FACS
FACS
ÁRAMLÁSI CITOMETRIA
(FLOW CYTOMETRY)
FACS
 3D (három dimenziós) sejtkultúra
a) Explantátum: szervekből készített szeleteket
porózus felszínre helyeznek, és tenyésztő médiumban
inkubálnak
b) Szferoidok: sejtaggregátumok több száz mikron
átmérőjű gömböket (szferoid) képezhetnek és
differenciálódhatnak in vitro (Pampaloni et al., 2007)
 3D (három dimenziós) sejtkultúra
c) Polarizált hámsejt tenyészet: 1) porózus felszínen a levegő
és a médium határán növesztett hámsejtek polarizálódnak
(apikális és bazális felszín) és egy sejtsorból álló réteget
(monolayer) hoznak létre 2) kollagén gélben cisztát képeznek
d) Mesterséges bőr: 1) -primér fibroblaszttenyészet
biodegradábilis szitán 2) + keratinociták
e) Mikrokarrier tenyészet: polimer (pl. dextrán) gyöngyök segítik
letapadó sejtek 3 dimenziós növekedését (Pampaloni et al., 2007)
 Szferoidok
a) Light sheet fluoreszcens mikroszkópia (LSFM), több nézetből készített
felvétel rekonstrukciója (a minta egy szeletét világítja meg lézersugárral,
multiview reconstruction, deconvolution) – látható a kromatin
szerveződése
b) Pásztázó (szkenning, scanning) elektron mikroszkópia (SEM) HepG2
humán hepatóma sejtvonal
c) Elektronmikroszkópia (EM) V-79 kínai hörcsög tüdősejt vonal
d) Multifoton mikroszkópia, autofluoreszcens sejtek (alacsony energiájú
lézer pulzusokkal gerjesztett fluoreszcens festékek lehetővé teszik
élő sejtek közvetlen vizsgálatát) (Pampaloni et al., 2007)
 Extracellular matrix, ECM
Agaróz tartályka (a1,2) és plasztik tartály (a3) ECM-be kevert sejtek
vizsgálatára SPIM (Selective/Single Plane Illumination Microscopy)
módszerrel (b). Folyékony agarózba kevert, kapillárisba felszippantott sejtek
is vizsgálhatók (c1,2,3).
d) Kollagén gélben tenyésztett MDCK (kutya vese) sejtek által képzett ciszta
(GFP-vel jelölt aktin: zöld,Draq5-tel jelölt magok, piros) (Pampaloni F, Reynaud EG,
Stelzer EH (2007). The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature
Reviews Molecular Cell Biology 8, 839-845)
 Figure 1. (a) Representative pictures of extracted human-impacted third molar tooth to obtain
(b) dental pulp tissue.

Eltávolított Pulpa Pulpasejtek

3. moláris fogak tenyészete
Khanna-Jain R et al. J Tissue Eng 2012;2041731412467998

Copyright © by a Creative Commons Attribution License, unless otherwise noted.

 Figure 2. (a) Representative pictures of the β-TCP/P(LLA/CL) (ChronOS) biomaterial strip and
the biomaterial pieces cut into 1 cm × 0.8 cm dimension for in vitro analysis.

Bioanyag csík

Khanna-Jain R et al. J Tissue Eng 2012;2041731412467998

Copyright © by a Creative Commons Attribution License, unless otherwise noted.

 Figure 3. Surface marker expression of dental pulp stem cells cultured in human serum
medium as analyzed by flow cytometry.

Khanna-Jain R et al. J Tissue Eng 2012;2041731412467998

Felszíni markerek vizsgálata, áramlási citometria

Copyright © by a Creative Commons Attribution License, unless otherwise noted.
 Figure 4. Representative images of viable and dead DPSCs seeded on β-TCP/P(LLA/CL) 3D
scaffolds at (a) day 1, (b) day 7, and (c) day 14 (scale bar = 500 µm).

1. nap 7. nap 14. nap

Fogpulpa őssejtek bioanyag vázon
Khanna-Jain R et al. J Tissue Eng 2012;2041731412467998

Copyright © by a Creative Commons Attribution License, unless otherwise noted.

 Figure 5. Cell growth characteristics of DPSCs seeded on β-TCP/P(LLA/CL) 3D scaffolds at
days 1, 7, and 14 assessed by measuring the DNA content.DPSCs: dental pulp stem cells; β-
TCP/P(LLA/CL): β-tricalcium phosphate/poly(l-lactic acid/caprolactone); 3D: three-
dimensional; SD: standard deviation; DEX: dexamethasone; VD: vitamin D3.The bars
represent the mean ± SD and data are presented as relative cell numbers (n = 3; *p < 0.05, **p
< 0.01, ***p < 0.001).
Sejtszám
Kontroll
+ dexametazon
+ D3 vitamin

Khanna-Jain R et al. J Tissue Eng 2012;2041731412467998

Copyright © by a Creative Commons Attribution License, unless otherwise noted.

 Figure 6. ALP staining and relative mRNA expression of ALP in DPSCs seeded on β-
TCP/P(LLA/CL) 3D scaffolds cultured in (a) HS-M, (b) OM-DEX, and (c) OM-VD.

Alkalikus foszfatáz
kifejeződése biopolimeren
tenyésztett kontroll, illetve
dexametazonnal vagy D3
vitaminnal kezelt sejtekben

Khanna-Jain R et al. J Tissue Eng 2012;2041731412467998

Copyright © by a Creative Commons Attribution License, unless otherwise noted.

 Emlős sejtek lefagyasztása, tárolása
• Adherens sejtek:
1. tripszin-EDTA kezelés;
a tripszin fehérjeemésztő enzim, az EDTA
(etiléndiamin tetraacetát) megköti az adhézióban
közreműködő Ca++ ionokat (kelát képzés)
2. Reszuszpendálás tápoldatban
3. Centrifugálás
4. Reszuszpendálás fagyasztó oldatban (tápoldat +
5% DMSO vagy 10% glicerin) (DMSO:
dimetilszulfoxid, gátolja a jégkristályok kialakulását)
5. Elhelyezés folyékony nitrogénben
(-196oC) vagy hűtőben (-80oC, -150oC)
• Nonadherens (szuszpenziós) sejtek: 3-5. lépések
Folyékony nitrogénes tárló -150oC hűtő
Köszönöm a figyelmet