Sejtbiológia gyakorlat

A sejtmag
A sejtmag felfedezése
Anton van Leeuwenhoek
lazac vörösvérsejtjeiben
figyelt meg belső „űrt” 1719

Csak az eukariótáknak
van sejtmagjuk
A sejtmag mérete a
legtöbb sejt
esetében 5-10 (akár 20)
µm-es méretű.
Magfestés
1) szafranin
• más néven Safranin-O vagy bázikus vörös-2
• a sejtmagokat vörösre színezi
• Nem magspecifikus festék, ugyanis porc és
hízósejt kimutatására is alkalmas
• lipofil tulajdonságú
Magfestés

2) metil-zöld
• 19. század óta alkalmazzák
• DNS-t festi meg, nem interkalálódik, vagyis nem
épül be a DNS bázispárjai közé
• Agaróz gélben, áramlási citometriában is
alkalmazzák
• Metil-zöld—pyronin festés: DNS, RNS
elkülönítése

Patkány vékonybélhám
Sejtmagok kékkel festődnek
Magfestés (fluoreszcens)
3) DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole):
• A DNS nagy árkába, a A-T gazdag régiókba kötődik,
az emissziós intenzitása a bekötődéskor a
legnagyobb
• A Dapi festék képes átjutni az intakt membránon,
így élő sejtek festésére is alkalmas
• Excitációs maximuma: 358 nm UV spektrumban
gerjesztve
• Az emissziós spektruma széles, maximuma: 461
nm.
• Ha RNS-hez kötődik, akkor az emissziós maximum
500 nm-re tolódik
Patkány szomatoszenzoros kéreg
Kék: sejtmag
Zöld: GFAP (gliális fibrilláris savas protein;
asztrocita marker)
Magfestés (fluoreszcens)

4) PI (propidium iodide):
• DNS-hez és RNS-hez is kötődik
• nincs specifikusan preferált kötődési helye
• interkalálódó festék
• Csak az elpusztult sejtekbe képes bejutni
• Erősen rákkeltő
• Excitációs maximuma 538 nm HeLa* sejtvonal
zöld: α-Tubulin
piros: sejtmag

*HeLa sejtek: Henrietta Lacks

méhnyakrák, 1951
 Mag + citoplazma festése
5) hematoxilin-eozin:
• a sejt acidofil komponensei: pozitív
töltés, bazofil komponensek: negatív
töltés
• acidofil komponenseket a savas
festékek, a bazofil anyagokat a bázikus
festékek festik
• a sejtmagban lévő nukleinsavak negatív
töltésűek: bázikusan festődnek
• hematoxilin megfesti a nukleáris
komponenseket
• eozin megfesti a citoplazmatikus
komponenseket
Hepatociták Osteoclast
Hematoxilin-eozin festés 1) Metszetekről paraffin eltávolítása
(65 celsius fok, 30 perc)
2) 2x xylol inkubáció (30 perc)
3) 2x 100% etanol inkubáció (10 perc)
4) Leszálló alkohol sor:
1) 90% etanol: 5 perc
2) 70 % etanol: 1 perc
3) 50% etanol: 1 perc
4) 30% etanol: 1 perc
5) Öblítés foszfát pufferben (PBS, 5
perc)
6) 200 μl hematoxilin oldat,
szobahőmérsékleten, 5 percig
7) Csapvizes öblítés
8) PBS öblítés (5 perc)
9) 400 μl eosin festék: 30 s inkubáció
10) Csapvizes öblítés
11) PBS öblítés (5 perc)
12) 2x öblítés absz. alkoholban (2 perc)
13) 2x xylol inkubáció (10 perc)
14) Minta fedése
videó: https://www.youtube.com/watch?v=2D0rj0m6dVs
DNS kimutatása: Southern blot
• adott DNS mintából specifikus DNS szakaszok kimutatása válik lehetővé
1) DNS hasítása: restrikciós endonukleázok segítségével
2) DNS denaturálása: NaOH segítségével, melynek következtében a DNS két szála
elválik egymástól
3) Nitrocellulóz vagy nylon membránt helyeznek a gél tetejére, ezekre papírtörölköző Sir Edwin Mellor Southern
kerül. A kapillárishatás miatt a minták felfelé mozdulnak el, kikötődnek a membránra,
megőrizve a gélbeli egymáshoz viszonyított helyzetüket.
4) Nitrocellulóz membrán esetében száraz hőkezelés (60-100 °C), nylonmembrán
esetében UV kezelés következik, ekkor történik meg a DNS-membrán kovalens
keresztkötése
5) a membránt hibridizációs próbával kezelik – ami egy olyan specifikus szekvenciával
rendelkező DNS molekula, mely a vizsgálni kívánt szakasszal komplementer. A próba
jelölve van, vagy radioaktívan, vagy fluoreszcensen, így a próba bekötési helye
láthatóvá válik
6) A nem hibridizált próbákat lemossák a felületről, és a hibridizációs mintázatot
Röntgen-filmen autoradiográfiával vagy fluorescens jelölés esetén fluorométerrel
teszik láthatóvá.
DNS amplifikációja: polimeráz-láncreakció (PCR, polymerase chain reaction)
• a DNS egy kis darabjának megsokszorozása analízis céljából
• örökletes betegségek kimutatása, fertőző betegségek diagnosztikája, gének
klónozása és apasági vizsgálatok elvégzésére
• A PCR-eljárás húsz-harminc ciklus egymásutánjából áll. Mindegyik ciklus
három lépést tartalmaz
• (1) A kettős szálú DNS-t 94-96 °C-ra hevítik, hogy a szálak szétváljanak,
hidrogénkötések felbomlanak. Az első ciklus előtt a DNS-t gyakran hosszabb
ideig denaturálják, hogy a templát DNS kettős szálai teljesen szeparálódjanak.
• (2) A hőmérsékletet csökkentik, a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-
szálakhoz. Ezt a lépést annealing vagy kapcsolódási lépésnek nevezik. A
hőmérséklet ebben a fázisban függ a primerektől, és általában 5 °C-kal van a
primerek olvadási hőmérséklete alatt (45-60 °C). Ha a kapcsolódási lépésben
a hőmérséklet nem megfelelő, a primerek vagy egyáltalán nem kötődnek a
templáthoz, vagy véletlenszerűen kötődnek.
• (3) A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat, a primernél kezdi és
végigmegy a DNS-szálon. Ez a lépés a meghosszabbítás. A meghosszabbítás
hőmérséklete a DNS-polimeráztól függ. A lépés időigénye egyrészt függ
magától a DNS-polimeráztól, másrészt az amplifikálandó DNS-szakasz
hosszától.
• Az első ciklus végén az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus
templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.
Jelenség: ha a sejteket enyhe detergenssel kezeljük könnyen eltávolítható a sejtmembrán, a citoplazma
és a magmembrán külső lemeze. Ezt követően a DNS-állományt nukleáz enzimmel megemésztve, majd a
hisztonokat és egyéb nukleáris fehérjéket kivonva, előtűnik egy
hálózatos rostrendszer a sejtmagon belül. Ezt a struktúrát nevezik magmátrixnak vagy
nukleoszkeletonnak.

Magyarázat: a sejtmag közel 200 éve ismert sejtalkotó, mégis a legkevésbé feltárt szerkezetű sejtszerv
maradt a mai napig. A szerkezetéről alkotott egyik felfogás azokat a megfigyeléseket hangsúlyozza,
melyek szerint a magnak saját váza van (nukleoszkeleton, magmátrix) és szuborganellumokkal
rendelkezik, mások a magasabb rendű rendezettség, a szupramolekuláris szerveződés példáit átmeneti,
funkcionális jelenségként értelmezik.
Nukleáris lamina
• 30-100 nm
• Szerkezet és stabilitás biztosítása, perinukleáris heterokromatin kihorgonyzása;
• Lamin: intermedier filamentum (V. alosztály), típusai: lamin A, B és C: -helix dimerek laterálisan
kapcsolódnak; lamin B-membrán kapcsolat
• Lamin foszforilációja (sejtosztódáskor) → a nukleáris lamina felbomlása (defoszforiláció →
újraépülés)
Laminopátiák
• ritka genetikai betegségek, melyeknek hátterében valamelyik lamint kódoló gén
mutációja áll
Emery–Dreifuss izomdisztrófia: (lamin A, lamin
C mutáció)
Tünetei: gyerekkorban: elsősorban a vázizmok
disztrófiája, ízületi deformitások
Felnőtt korra: szívizom is érinetté válik,
szívritmuszavar
Előfordulási gyakorisága: 100 000/1
Hutchinson-Gilford progeria szindróma: (lamin A mutáció)
Születéskor egészségesnek tűnik, első évben már
jelentkeznek a tünetek:
Lassabb növekedés, kisebb alsó állkapocs, szemöldök,
szempillák hiánya, szívproblémák
Ép motoros funkciók, nincs szellemi visszamaradás
Átlagos élettartam: 13 év
Jelenség:
A citoplazmába mikroinjekcióval bejuttatott különböző
méretű mesterséges polimer molekulák egy bizonyos mérethatárig (ez
kb. 40 -60 kDa) a membránnal határolt sejtmagban
is megjelennek.

Magyarázat:
A maghártyán elektronmikroszkóppal pórusokat kialakító komplex struktúrák
észlelhetők. Az említett anyagfelvétel mérethatára és kinetikája összhangban
van a pórusok méretével és számával.
Nukleáris transzport
Import:
• kis poláris molekulák, ionok, makromolekulák (RNS,
fehérjék) bejutása a magba
• Fehérjék, RNS transzportja energiaigényes
• Csak nukleáris (magi) lokalizációs szignállal (NLS)
ellátott molekulák juthatnak be
• Rövid speciális aminosav sor
• Importin ismeri fel a citoplazmában
• Nukleáris pórus komplex fehérjéivel kölcsönhatva a
cargot a magba viszi, ahol a Ran/GTP kötődik az
importinhoz, így az elengedi szállítmányát
• Ran/GTP/importin komplex visszajut a citoplazmába,
itt Ran-GAP hatására a Ran/GTP-je hidrolizálódik
Ran/GDP-re és elengedi az importint
• A Ran/GDP-t az NTF2 visszajuttatja a magba
• Ahol a Ran-GEF foszforilálja a GDP-t, így a Ran újra
GTP köt
Export:
• Nukleáris export szignállal (NES) „jelölt” molekulák jutnak ki
• Őket az exportin és a Ran/GTP köti
• A citoplazmában a GTP hidrolizálódik a szállított molekula
https://www.youtube.com/watch?v=ZGPpKk-6-K0&t=140s felszabadul, az exportin és a Ran/GDP visszajut a magba
GAP: GTPáz aktiváló protein
GEF: guanin nukleotid kicserélő faktor
NTF2: nukleáris transzport faktor 2
DNS becsomagolása a sejtmagba Miért kell a DNS-t becsomagolni?
1) 3 milliárd bp, kb. 2 m hosszú
DNSnek kell „elférni” a
sejtmagban
2) A szabad DNS instabil, ezzel
szemben a kromoszómális DNS
viszonylag stabil
3) A sejt osztódásakor csak a
kromoszóma formában
jelenlévő DNS örökítődhet az
utódsejtekbe
Becsomagolás:
• H3,H4,H2A,H2B hisztonok
oktamert alkotnak, köréjük 150-
170 bp DNS tekeredik:
nukleoszóma
• 2 nukleoszóma közötti szakasz:
linker DNS
• H1 hiszton segíti a további
feltekeredést
• Kialakul a szolenoid fonal
• Majd a kromoszóma
https://www.youtube.com/watch?v=R0I0Fhy_2dA
A kromoszómák helye a sejtmagban/ kromoszóma territórium
• kromoszómáknak van "kedvenc" helyük a sejtmagban
• az emberi fehérvérsejtekben például a 18-as kromoszóma általában a sejtmag szélének közelében
helyezkedik el, míg a 19-es kromoszóma inkább középen marad
• a kromoszómáknak általában vannak kedvelt szomszédjaik is
• egér fehérvérsejtjében a 12-es kromoszóma gyakran található egy csoportban a 14-es és a 15-ös
kromoszómával
• kromoszómák elhelyezkedése sejttípusfüggő
• helyzetük függ a gének aktivitásától is
Bolzer és munkatársai speciális
eljárásokkal festett sejtmagfotók alapján
készítették el a kromoszómák
elhelyezkedésének számítógépes képét. A
számok az emberi fibroblaszt
kromoszómáinak sorszámát jelölik
Kromoszóma rendellenességek

• Számbeli eltérés
• Poliploidia: a haploid kromoszómaszám egész számú többszöröse
• triploidia (3n) és a tetraploidia (4n): korai vetélés
• Aneuploidia: nem többszöröse a haploid kromoszómaszámnak
• triszómia: egy vagy több kromoszóma többlete ( Down-, Edwards- és Patau-
szindróma
• monoszómia: egy vagy több kromoszóma hiánya
Kromoszóma
rendellenességek
Down-szindróma
Kromoszóma rendellenességek
Kromoszóma rendellenességek
Kromoszóma rendellenességek

Turner szindróma

• nők: egy X kromoszóma van jelen

• az embriók zöme a korai magzati életben meghal
• monoszómiás kromoszóma rendellenességek közül a
az egyetlen, amelynél az élveszületés lehetséges
• az összes megszülető lánygyermekek nagyjából 0,33
ezreléke (3000-ből 1) Turner-szindrómás, azaz a
betegség esélye nem elhanyagolható
• az egyik leggyakoribb genetikai betegség
Epigenetikai öröklődés
• A genomot érintő olyan jelenségek,
melyek nem a DNS
nukleotidsorrendjét érintik, de
mitotikusan (vagy akár meiotikusan)
átörökíthetőek (növényekben,
gombákban, állatokban)
• génexpressziót befolyásolják
• Leggyakrabban a DNS metilációs
mintázata változik meg
• Példa:
• az egerek aguti lokusz-nak nevezett, a
szőrszín kialakulásért felelős génje
• genetikailag azonos alléleket hordozó
szülőknek különböző szőrszínű utódaik
születhetnek, ha az aguti gének metiláltsági
állapota különbözik a szülőkben
 Epigenetikai öröklődés
• Hiszton kód: hisztonok módosításainak összessége
• Ez is öröklődik az utódsejtekbe
• Nukleoszómát alkotó hisztonok módosításai
• Hisztonkódot „író” és „törlő” enzimek: HAT, HMT, HDAC, HDM
• Leggyakrabb módosítások:
• Acetiláció-lizin
• Metiláció-lizin, arginin
• Foszforiláció-szerin, tirozin, threonin

a hisztonacetiláció elősegíti a transzkripciót:

1) lazítja a hiszton–DNS kapcsolatot
2) befolyásolja a szabályozó fehérjék kötődését
A hiszton-acetiltranszferázok (HAT) fokozzák, a
hiszton-deacetilázok (HDAC) pedig mérséklik a
transzkripciót
Magvacska • Sejtmagon belül
sötétebb foltként látható
• Membrán nem határolja
• Sejtmag 25%-át teszi ki
• RNS-ből és fehérjékből
áll
• A riboszómális RNS-ek
szintézise (transzkripció,
érési folyamatok)
• A riboszómák részleges
összeszerelése
• Riboszómák:
• kis és nagy alegység
• Fehérje „gyárak”

https://www.youtube.com/watch?v=prCFM7Hz0MY
Magvacska, mint betegség biomarker
Rák

Egészséges Tumor sejtek: nagyobb számú, méretű magvacska; stressz

egészséges öregedés hatására a magvacska fragmentálódik
Öregedés: szeneszcens sejtek, illetve progeria szindrómában
szenvedőknél megnagyobbodik
Neurodegeneráció: betegségfüggő a magvacska morfológiai
elváltozása
AD:Alzheimer kór; ALS: amiotrófiás laterálszklerózis, PD,
Neurodegeneratív betegségek Parkinson kór
Köszönöm a figyelmet!