Prezentáció címe

Prezentáció címe

FAJOK ÉS EGYEDEK
DNS-ALAPÚ AZONOSÍTÁSA,
GENETIKAILAG MÓDOSÍTOTT
NÖVÉNYEK KIMUTATÁSA

2009. január 21.

„Gimilab-gyakorlat”

Prezentáció címe
Név Prezentáció címe

1
 Az örökítőanyag mibenléte…

• A tulajdonságok öröklődésének jellege?

- Darwin (1859.), Mendel-kísérletek (1869.)
• Kromoszómák vizsgálata
(1842→)Boveri-Sutton kromoszóma-teória (1902.)
• Nukleinsavak vagy fehérjék a felelősek?
- Hershey és Chase (1952.) - baktérium
fágfertőzése (izotópos 35S, 32P jelöléssel)
• A genetikai kód megfejtése
- Watson és Crick (1953.) a DNS szerkezete
Prezentáció címe
Prezentáció címe

Az örökítőanyag vizsgálata
1. Mintavé
Mintavétel
szö
szövet kinyeré
kinyerése a vizsgá
vizsgálat alanyá
alanyától
2. Nukleinsav izolá
izolálás
a sejtek feltárása, megtisztítás egyéb anyagoktól (pl. fehérjék,
szénhidrátok, zsírok, membrántöredékek)
3. A keresett DNS szakasz felsokszorozá
felsokszorozása ‘in vitro’
vitro’ úton:
ton:
PCR (Polimeráz láncreakció)

4. A mé
méret és mennyisé
mennyiség becslé
becslése elektroforé
elektroforézissel
Agaró
Agaróz gél
5. A DNS megszekvená
megszekvenálása,
sa, „leolvasá
leolvasás”
Automata szekvená
szekvenátorok (Nobel-
(Nobel-díj is!)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

2
 2. A nukleinsav izolálás lépései
a) Sejtfeltá
Sejtfeltárás
Az izolálandó nukleinsavak a sejteken belül találhatók.
• fizikai módszerek: aprítás, darálás, turmixolás, fagyasztás,
feltárás homokkal, ultrahang, vákuum
• kémiai módszerek: detergensek alkalmazása
• egyéb módszerek: ozmózisos sejtfeltárás

b) DNS
DNS- és RNS
RNS-bontó
bontó enzimek (DNá
(DNázok,
zok, RNá
RNázok)
zok)
inaktivá
inaktiválása
• pl. hideg / hőhatás

c) nukleinsav elvá
elválasztá
lasztása a tö
többi sejtalkotó
sejtalkotótól
• Kicsapásos módszer
• Adszorpciós módszer

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Kicsapásos módszer / Feltárás, feloldás

1. lépés: Sejtfeltárás 2. lépés: A sejtek lízise és a
nukleinsavak oldása extrakciós
pufferben

Pl.: A leveleket folyékony nitrogén- Az extrakciós puffer feloldja a

ben célszerű homogenizálni. membránokat, gátolja a bontó
enzimek működését és
stabilizálja a nukleinsavakat.

Prezentáció címe
Prezentáció címe

3
 2. lépés: - a detergensek hatása -

Plazma membrán Detergens molekulák Kevert micella

+
Hidrofób farok Hidrofil fej

SDS

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Kicsapásos módszer - oldószeres extrakció

3. lépés: A minta oldott fehérjetartalmának eltávolítása eltérő
oldhatósági viszonyok alapján szerves oldószerrel:
Vizes fázis
+ szerves oldószer
pl. kloroform, fenol centrifugálás vizes fázis leszívása (ez kell!)
Interfázis

Feltárt minta Szerves fázis +

a kivonó pufferben sejttörmelék

Nyers szövetkivonat, A vizes fázis tartalmazza a vízben oldódó

amely a nukleinsav molekulákat, így a nukleinsavakat is. A
mellett tartalmazza a fehérje és lipid alkotók a szerves fázisban
sejt egyéb alkotóit is. oldódnak, ezért eltávolíthatók a kivonatból.

Prezentáció címe
Prezentáció címe

4
 Kicsapásos módszer
– oldószeres extrakció hatása -

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Kicsapásos módszer
- nukleinsavak alkoholos kicsapása -
4. lépés: A nukleinsav alkohol (etanol, i-propanol) és só (NaCl,
Na-acetát) hatására kicsapódik a vizes fázisból.

DNS
Felülúszó
csapadék

Centrifugálás Centrifugálás

Nukleinsav csapadék mosása leülepítése visszaoldása

alkohollal steril vízben

Prezentáció címe
Prezentáció címe

5
 Az örökítőanyag vizsgálata
1. Mintavé
Mintavétel
szö
szövet kinyeré
kinyerése a vizsgá
vizsgálat alanyá
alanyától
2. Nukleinsav izolá
izolálás
a sejtek feltárása, megtisztítás egyéb anyagoktól (pl. fehérjék,
szénhidrátok, zsírok, membrántöredékek)
3. A keresett DNS szakasz felsokszorozá
felsokszorozása ‘in vitro’
vitro’ úton:
ton:
PCR (Polimeráz láncreakció)

4. A mé
méret és mennyisé
mennyiség becslé
becslése elektroforé
elektroforézissel
Agaró
Agaróz gél
5. A DNS megszekvená
megszekvenálása,
sa, „leolvasá
leolvasás”
Automata szekvená
szekvenátorok (Nobel-
(Nobel-díj is!)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

PCR (Polimeráz láncreakció)

• Akár 1 sejtbő
sejtből szá
származó
rmazó,
egyetlen nukleinsav-
nukleinsav-molekula megsokszorozá
megsokszorozására
és a kó
kópiá
piák lá
látható
thatóvá tétele enzimatikus úton,
ton, de
élő szervezet (pl. baktérium (E. coli)
coli) vagy élesztő
lesztő)
igé
igénybevé
nybevétele nélkü
lkül.
• Pl.: kó
kórokozó
rokozók, transzgé
transzgén kimutatá
kimutatása

A PCR általá
ltalánosan haszná
használt mó
módszer az
élettudomá
lettudományi kutatá
kutatásokban.

Prezentáció címe
Prezentáció címe

6
 PCR-elegy

Mi kell a reakciókeverékbe a DNS felsokszorozásához?

• Teljes, duplaszá DNS-kivonat, a minta..
duplaszálú DNS-
• 4 fé
féle nukleotid keveré ke, azaz a DNS "é
keveréke, "építőelemei" (dCTP
(dCTP,,
dATP,
dATP, dGTP és dTTP - egy tí típust mind a né
négy bá
bázis szá
számára)
egyenlő
egyenlő ará
arányú
nyú feleslegben
• hőálló polimeráz enzim (Taq:
lló DNS polimerá Taq a DNS-
DNS-szintetizá
szintetizáló enzim
egy hőforrá
forrásokban élő, ún. Thermus aquaticus
aquaticus bakté
baktériumbó
riumból
szá
származik).
• 2 primer, párban – rövid, ált. 15-
15-30 bá
bázisnyi DNS szakaszok,
az érdekes, mámásolandó
solandó DNS szakasz ellenté
ellentétes vé
végeihez
illeszkedhetnek (komplementer); az enzim „vakvezető
vakvezetői”.
Prezentáció címe
Prezentáció címe

PCR reakció
lépései:
1. Magas hőmérséklet
(95-98°C)

2. Hűtés (a primerek
olvadáspontja alá
1-2 °C-kal, így kitapadhatnak) (1+2+3.) lé
lépés
ISMÉ
ISMÉTLÉ
TLÉSE

melegítés 72˚C-ra
3. Enyhébb melegítés (72 °C)
a Taq DNS-polimeráznak
optimális
↓
új DNS-szálak szintézise a
már meglévők alapján.

Prezentáció címe
Prezentáció címe

7
 PCR V - hőmérsékleti diagram
Hőmérséklet (˚C)
100 d e n a tu r á c ió

90

80
p o lim e r iz á c ió
70

60

50
h ib r id iz á c ió
40

30
0 50 100 150 200 250 300

Idő (sec)
Prezentáció címe
Prezentáció címe

PCR készülékek
b) újabb,
kompakt
kivitel

már nem csak álom ☺:

a) Régi, külön számítógép vezérelt

Prezentáció címec) Terepi, „zseb-PCR”

Prezentáció címe

8
 - - - - - - Mozi-mozi-moziii ☺ ! - - - -

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Az örökítőanyag vizsgálata
1. Mintavé
Mintavétel
szö
szövet kinyeré
kinyerése a vizsgá
vizsgálat alanyá
alanyától
2. Nukleinsav izolá
izolálás
a sejtek feltárása, megtisztítás egyéb anyagoktól (pl. fehérjék,
szénhidrátok, zsírok, membrántöredékek)
3. A keresett DNS szakasz felsokszorozá
felsokszorozása ‘in vitro’
vitro’ úton:
ton:
PCR (Polimeráz láncreakció)

4. A mé
méret és mennyisé
mennyiség becslé
becslése elektroforé
elektroforézissel
Agaró
Agaróz gél
5. A DNS megszekvená
megszekvenálása,
sa, „leolvasá
leolvasás”
Automata szekvená
szekvenátorok (Nobel-
(Nobel-díj is!)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

9
 4. A PCR termék ellenőrzése
- DNS méret és mennyiség becslése -

Agaróz gélelektroforézis

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Az agaróz gélelektroforézis
elve:
Nukleinsavak (DNS, RNS) gyors elválasztására, méretbeli
azonosítására és tisztítására használható.
Az elektromos töltéssel rendelkező részecskék elektromos erőtér
hatására a töltésük által meghatározott irányba:
vagy az anód (+) vagy a katód (-) felé vándorolnak.

A nukleinsavak: erős negatív töltésük miatt (cukor-foszfát gerinc)

→ elektromos erőtérben: (+) anód felé vándorolnak a gélben.

Prezentáció címe
Prezentáció címe

10
 Agaróz gélelektroforézis
A DNS vá
vándorlá
ndorlási sebessé
sebességét meghatá
meghatározó
rozó tényező
nyezők:
• A molekula mérete
a (-) töltések száma arányos a hosszal…

• A DNS alakja
duplaszálú lineáris DNS ↔ egyszálú vagy cirkuláris nukleinsavak

• Az agaróz koncentrációja (közegellenállás)

agaróz koncentráció – pórusméret a gélben – elválasztható DNS
mérettartomány („tól-ig”)

• Elektromos erőtér nagysága (a vonzás mértéke)

az elektroforézis során alkalmazott feszültség, a puffer összetétel

Prezentáció címe
Prezentáció címe

moziii ☺…

Prezentáció címe
Prezentáció címe

11
 Hogyan tehető a NS láthatóvá?
• DNS/RNS: (akár 1-10 ng is!)

pl. etídium-bromiddal (EtBr)

UV-ben elnyelő,
vörös tartományban fluoreszkáló festék.

ha a molekula beékelődik
az örökítőanyag két szála közé,
a nagy árokba

EtBr festett DNS

gélképe kb. 20x-osára erősödik
fluoreszcenciája !!!
Prezentáció címe
Prezentáció címe

A PCR termék megfuttatása

- gélelektroforézis -
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Marker (bp)
a nukleinsavak futásának iránya

1000

900
800
700
600
500
300
80

• PCR-
PCR-termé
termék elektroforetikus gélen megfuttatva
Prezentáció címe
Prezentáció címe

12
 DE:

HOGYAN OLVASHATJUK LE
A SZÁMUNKRA ÉRDEKES
DNS régiót?

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Az örökítőanyag vizsgálata
1. Mintavé
Mintavétel
szö
szövet kinyeré
kinyerése a vizsgá
vizsgálat alanyá
alanyától
2. Nukleinsav izolá
izolálás
a sejtek feltárása, megtisztítás egyéb anyagoktól (pl. fehérjék,
szénhidrátok, zsírok, membrántöredékek)
3. A keresett DNS szakasz felsokszorozá
felsokszorozása ‘in vitro’
vitro’ úton:
ton:
PCR (Polimeráz láncreakció)

4. A mé
méret és mennyisé
mennyiség becslé
becslése elektroforé
elektroforézissel
Agaró
Agaróz gél
5. A DNS megszekvená
megszekvenálása,
sa, „leolvasá
leolvasás”
Automata szekvená
szekvenátorok (Nobel-
(Nobel-díj is!)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

13
 5. Szekvenálás
• Ezalatt a nukleinsav
bázissorrendjé
zissorrendjének
meghatá
meghatározá
rozását értjü
rtjük.

• Mié
Miért cé
célszerű
lszerű?
ha ismerjü
ismerjük: össze tudjuk
hasonlí
hasonlítani a má
már ismert
szekvenciá
szekvenciákkal

Egy DNS-t akkor ismerünk igazán, ha megszekvenáltuk!

Prezentáció címe
Prezentáció címe

A szekvenálás lehetőségei
• Egyetlen egy (pont)mutációt is ki lehet
mutatni a kiválasztott régióban

• Felhasználás pl.:
– Humá
Humán diagnosztika
– Növényi mutá
mutáció
ciók
– Kórokozó
rokozók elkü
elkülönítése

Prezentáció címe
Prezentáció címe

14
 Gyakorlat I.:
DNS kimutatása „házi módszerrel”:
1. A növényi minta (pl. gyümölcs) gyors szétnyomkodása
erős műanyagzacskóban
2. 3 evőkanál kivonópuffer hozzáadása és elkeverése,
3. A kémcsőbe áttöltött kivonatra jéghideg izo-propanol
(alkohol) óvatos rárétegzése
4. A határfelületen megjelenő, „fehéres-ködös” DNS
megfigyelése (ép-e, feltekerhető-e pl. hurkapálcára ☺?)

Recept a kivonópufferhez:
– 3 evőkanál mosogatószer
– + ½ kávéskanál konyhasó
– 0,7 dl víz

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Gyakorlat II.:
PCR könnyen és gyorsan
- 4 µl • Minta: idegen eredetű (megtisztított DNS-oldat): 1. / 2.
ill. negatív kontroll (DNS nélküli, „üres”)
• PCR reakcióelegy:: 3 féle (A, B, C)
- 1+1 µl – a felszaporításra alkalmasnak vélt primerpár
már – dezoxi-nukleotidok (4 féle)
- 1 µl
bemért – steril víz
- 12 µl – hőstabil Taq DNS polimeráz enzim (frissen, utoljára!)
- 1 µl
20 µl • PCR program (~1,5 óra!):
– Előmelegítés: 95˚C (3 min)
– Ciklus:
• 95˚C (20 sec)
• 51˚C (20 sec)
• 72˚C (20 sec)
30x ismétléssel!
– Befejezés: 72 ˚C (30 sec)
– Leállítás: 4˚C

Prezentáció címe
Prezentáció címe

15
Mikropipetták használata – pár megszívlelendő
jótanács:

mért térfogat
állítása
1. ütközés:
és kijelzése
bemérés
2. ütközés:
kifújás

hegy ledobása

Prezentáció címe
Prezentáció címe

2. fejezet
konzervált és erősen
változékony DNS-régiók
előfordulása,

felhasználásuk
faji és egyed
szintű azonosításra.
Prezentáció
Prezentációcíme:
címeFAJOK ÉS EGYEDEK DNS-
Név: Pós Veronika Prezentáció
ALAPÚ AZONOSÍTÁSA,címe
GM NÖVÉNYEK KIMUTATÁSA

16
 Evolúció és a fajfogalom problémája
• Morfológiai fajfogalom
• Biológiai/reproduktív fajfogalom
• Pár-felismerési fajfogalom
• Felismerési (és kohéziós) fajfogalom
• Ökológiai fajfogalom
• Biológiai/izolációs fajfogalom
• Evolúciós fajfogalom
• Fenetikai vs. Genetikai fajfogalom

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Van-e egyáltalán alapja a

rendszerezésnek?
→ Sokféle faji definíció – mindegyik
egy kissé sántít…

• „ Azokat az élőlényeket, amelyeknek

genetikai programjuk hasonló, és
lényeges külső és belső
tulajdonságaik megegyeznek,
valamint képesek termékeny utódok
létrehozására egy fajba soroljuk. ”
Prezentáció címe
Prezentáció címe

17
 Faji elkülönülés és a kromoszómák
- pl. kromoszómaszám alapján?
• 46 db - ember (Homo sapiens) ↔ • 48 db – gorilla (Gorilla gorilla)

- mezei nyúl - őzegér

(Lepus europaeus) (Peromyscus maniculatus)

• 62 db – szamár (Equus asinus) ↔ • 64 db – ló (Equus caballus)

Fejlettség és
kromoszómaszám?
2 / 1 db - vörös
buldoghangya ~1200 db - kígyónyelv páfrány
(Myrmecia pilulosa) (Ophioglossum reticulatum)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Homológ kromoszómák és régiók:

FŐEMLŐSÖK KARIOTíPUSÁNAK ÖSSZEVETÉSE

Balról jobbra: ember - csimpánz - gorilla - orángután

Prezentáció címe
Prezentáció címe

18
 Fejlettség és DNS méret?
A „C-érték paradoxon”
• A genom mérete: a haploid sejt DNS tartalma = „C érték”

megjósolható:
a fejlettebb szervezeteknek több génre van szükségük,
mint az alacsonyabbrendűeknek

• ez általában igaz, pl.:

– gének száma ~ 30.000 gén (ember) ↔ 1/10-e (élesztő)
DE (1):
– genom mérete ~ 3,3 x109 bp (ember) ↔ 4,7x106 bp (élesztő)
DE (2):
– ember: x ↔ békák: 7x ↔pl. liliom: 100x DNS tartalom

• nem csak géntöbblet, hanem nem kódoló, extra DNS!

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Fejlettség és DNS méret?

A genom-szerveződés eltérései
• Prokarióták • Eukarióták

– Kódoló szekvenciák nagy – Kódoló (1-10% !!!): RNS és fehérje

sűrűségben • egyedi / kis számban előforduló, pl.
ún. házőrző gének
• Multigén-családok (több kópiában, rokon
– szabályzásuk: gének)

A TÖBBI SZEMÉT VOLNA?

operon-rendszerben
(a hasonló körülmények közt szükséges
gének egy csoportba rendeződnek a
genomban, ezek közös szabályzás
alatt állnak)
– Nem-kódoló régiók
• Átíródó
– Intronok (a génekből lévő, de az
mRNS-ből utólag kivágódó régiók)
– szomszédos rRNS-gének közti, rövid
határoló régiók

• nem átíródó
– génműködést szabályzó elemek
– pszeudo-gének (anno…)
– ismétlődő szekvenciák
»egymáshoz közel
Prezentáció címe
»szétszórtan
Prezentáció címe

19
 Az ismétlődések forrása?
• Egymást követő:
– Nem megfelelő rekombinálódás (meiózis)
• Szétszórt:
– Mobilis genetikai elemek (McClintock, 1950.)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

A genetikai azonosság / eltérés

igazolásának lehetőségei
• A) a genom bázissorrendjének konkrét/
teljes ismerete nélkül:
– DNS-DNS hibridizáció
(DNS-chipek)

– „genetikai ujjlenyomat”:
1.
2.

3.

Prezentáció címe
4.
Prezentáció címe

20
 A, B, C, D: elté
eltérő szekvenciá
szekvenciájú DNS-
DNS-ek
Lépések:
a DNS kivonása
↓
vélhetően változékony
egy adott
DNS régiók restrikció
restrikciós
felsokszorozása enzimmel
↓ hasí
hasítva
a minták hasítása
kizárólag adott
szekvenciát felismerő, ún.
restrikciós enzimmel
(szekvencia-függő
vágási hely) méret
↓
létrejött töredékek
méretének összevetése
más-más (sajá
Prezentáció(saját, kiindulá
címe kiindulási szekvenciá
szekvenciára
Prezentáció
jellemző
jellemz hasítcíme
ő) hasí ási mintá
mintázatot mutatnak

A genetikai azonosság / eltérés

igazolásának lehetőségei
• B) A genetikai állomány megismerése:
– teljes genomi szekvenálás (genom-projektek,
pl. élesztőgomba, ecetmuslica, rizs, kukorica,
szőlő, ember - 2001; 2003) – DE!!! (Craigh
Venter, a Celera főnökének példáján)

– csak egyes gének/génszakaszok, egy adott

csoportra jellemző DNS régiók feltárásának
esélye?

Prezentáció címe
Prezentáció címe

21
 • MI A MEGFELELŐ GÉN?

attól függ:
MILYEN CÉLRA KERESSÜK…

Prezentáció címe
Prezentáció címe

MI A CÉL? → a MEGFELELŐ
DNS szekvencia kiválasztása
• Egyedek azonosítása • Változékonyság
– (pl. apasági tesztek, kriminalisztika)

• Populációk és fajták
bizonyítása
– (pl. gazdasági licence-védelem, gyógyítási
hatékonyság rassz függése)

• Fajok elkülönítése
– (pl. ökológiai vonatkozások)

• Nagyobb rendszertani
egységek szétválasztása
– (pl. emberi evolúció, mélytengeri • Konzervativitás
kutatások, ismeretlen kór kezelése stb.)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

22
 Az evolúció mozgatórugói I.
MUTÁCIÓ
• A nukleotid változás hatása a kódolt aminosavra
1. példa:
1-1 pozíció változása
9 kodon lehetőségét
hordozza → 6 eltérő,
új aminosav az eredeti
Ile mellett

…és egy átlagos,

300 aminosav hosszú
fehérje változatainak
száma és térigénye?
☺ (házi feladat)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Az evolúció mozgatórugói II.

REKOMBINÁCIÓ
• Kereszteződés és rekombináció a számfelező osztódás
(meiózis) alatt

• A homológ kromoszómák
véletlenszerű
rendeződése
az utódsejtek valamelyikébe

Prezentáció címe
Prezentáció címe

23
 Az evolúció mozgatórugói III.
SZELEKCIÓ

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Evolúciós ráta eltérő fehérjéken –

a „MOLEKULÁRIS ÓRA” fogalma
• 1. citokróm-c (mitokondrium)
– sejtlégzés, légzési e- transzportlánc része
(elektront szállító fehérje)
• 2. hemoglobin (Hb) (vörösvérsejt)
– oxigént szállító, tetramer fehérje
(eltérő globinok kombinálódásával)
• 3. fibrinopeptidek (vérplazma)
– a sikeres véralvadás
közreműködői (inaktív véralvadási
faktorról lehasadó, kisebb peptidek
→ aktív, térhálósodó fibrin, vérrög O.K.)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

24
 Kérdés:
1. citokróm-c
2. hemoglobin (Hb)
3. fibrinopeptidek
A három gén közül:
• Melyik lehet a legősibb/legfiatalabb?
• Melyik gén szekvenciája mutálódik/-hat(!)
a leggyorsabban?
• Melyik gén szelektálódása lehet a
legerősebb (konzervatív szekvencia)?
Prezentáció címe
Prezentáció címe

A konzervativitás
mértéke:
emlősök / hüllők
hüllők / csontoshalak
madarak / hüllők állkapcsosak / állkapocs nélküliek
emlősök szétválása gerincesek, rovarok
aminosav változások száma /100 as.ra vetítve

Millió év a közös őstől való elkülönüléstől számítva

Prezentáció címe
Prezentáció címe

25
 Citokróm-C
nukleinsav alapú törzsfája

az értékek:
Az evolúciós leágazás óta a
génben vélhetően megjelent
nukleotid-eltérések
becsült minimális számát jelölik
• Nukleinsav-szinten:

• Aminosav-szinten:
– ember = csimpánz vs. Rhesus-majom (1)
– csirke = pulyka vs. kacsa (1),
– tehén = birka = sertés
Prezentáció címe
Prezentáció címe

Mi befolyásolhatja egy gén szekvenciájában

az evolúciós változás mértékét?
• A gén megjelenése óta eltelt idő – mutáció!

• A gén mérete – mutáció!

• A funkció jellege (pl. enzimakivitás vs. szerkezet – szelekció!

biztosítása, működő / nem működő / nem kódoló)

• A gén funkciója és a szervezet közvetlen, – szelekció!

egyedi élő/élettelen környezetétől való
függése közti viszony (pl. gazdaszervezet)

• A gén elhelyezkedése a kromoszómán – mutáció és

rekombináció!

• A gén kópiaszáma – rekombináció/

transzpozíció és
szelekció!
Prezentáció címe
Prezentáció címe

26
 Azonosításra alkalmas DNS szakaszok

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Egyén-szintű azonosítás
- a genetikai sokféleség keresése -
Megfigyelések:
– pl. vérátömlesztés (különféle vércsoport-antigének),
terhesség esetében és szervátültetés (HLA antigének),;
„immunológiai ujjlenyomat”
→ a szervezet számára is nélkülözhetetlen (emlősök*)!
Alapja: Testi sejtjeink felületén olyan fehérjék, amelyek a
sejt „saját, testazonos” voltát bizonyítják a járőröző
fehérvérsejtek számára, ezek a szövetegyezési
antigének (HLA).
Így válik lehetővé, hogy az immunrendszer a saját és
idegen struktúrákat megkülönböztesse.
Prezentáció címe
Prezentáció címe

27
 Egyén-szintű azonosítás
- a genetikai sokféleség keresése -
• 2. példa:
– SNP (single = egypontos nukleotid polimorfizmus)
egy DNS szekvencia-variáció, mely akkor jön létre,
ha egy nukleotid a genomban megváltozik.

Variánsok száma?
Előfordulásuk aránya? ☺

Prezentáció címe
Prezentáció címe

„Hivatalos SNP”:
Csak azok a variánsok, amik a populáció min. 1%-ában
megjelennek – ezek adják a humán variációk 90%-át,
minden 100-300 bp-onként megjelennek az emberi
genomban (jelenleg 1,4 millió SNP ismert)!!!

Tkp. Olyan, evolúciósan sikeres* pontmutációk, melyek

fontos részévé váltak a populációknak.
– egy extrém példa: sarlósejtes vérszegénység

*mivel (+/-) hatással lehetnek arra, hogy hogyan reagál az

emberi szervezet pl. egyes betegségekre, ld. tumor,
vírusok stb.:
→ gyógyszerkutatás, személyre szabott
orvosi kezelések
→ a HapMap–projekt és adatbázisa

Prezentáció címe
Prezentáció címe

28
 Fajták azonosítása
- a korlátozottabb genetikai sokféleség keresése -
Mikroszatellit-markerezés ACCG (…) GCCA(…) GCCA
• Rövid (1-2-3-4 bázispárnyi), ismétlődő,
nagy sokféleséget mutató szakaszok,
mint fajtára jellemző változatok
keresése a genomban
• ún. „tandem” módon ismétlődnek →
• a mendeli törvények szerint (kodominánsan) öröklődnek
→ pl. leszármazási vonalak azonosítására is alkalmasak
• Ökológiai szempontok:
– kertészeti fajtagyűjtemények, génbankok fenntartása –eredetvizsgálat,
ősi fajták származásának bizonyítása
• Gazdasági szempont:
– Fajtavédelem (pl. borok, olívaolaj eredete, hamisítványok kizárása)
• emberi oldal:
– pl. „vérvonal”-kutatás, uralkodóházak leszármazottainak vizsgálata
Prezentáció címe(az „Anasztázia-ügy”)
Prezentáció címe

Fajok azonosítása
• Olyan gén keresése, amely minél több faj
elkülönítésére is alkalmas (potenciálisan hasonló
evolúciós ráta a közel rokon fajok közt)
DE: van-e egy üdvözítő / létezhet-e egyáltalán?

• 2003: „barcode”, mint frappáns fogalom →

→ „Vonalkódoló- projekt” megindulása
– Állatoknál: COI = citokróm-oxidáz I. alegysége
(mitokondriális e-trp lánc tagja)
– Növény, gombák: ITS szekvenciák
(internal transcribed sequence = rRNS géneket határoló,
átíródó, majd kivágódó régiók)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

29
 Prezentáció címe
Prezentáció címe

„Barcoding gap”
– a káposztalepke példáján ☺ -
A mért nukleotid-eltérés gyakorisága (%)

A nukleotid-eltérés mértéke (%)

Prezentáció címe
Prezentáció címe

30
Összefüggés:
Rendszertani rokonság - nukleotid eltérés?

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Nagyobb rendszertani csoportok

azonosítása

• Riboszómális RNS-ek génjei szerint

(kis és nagy alegység alapján)

16 18 18
23 25 28

pl. baktériumok növények állatok

Prezentáció címe
Prezentáció címe

31
 3. fejezet
A génmódosított
szervezetek, azaz
„(GMO)-k”
kimutatásának módjai.
Prezentáció címe
Név Prezentáció címe

GMO: „Génmódosított” élőlény = ?

• GM: Az élőlény génállományának mesterséges
megváltozatása, legtöbbször örökíthető módon.
pl.:
– az eredeti gén funkciójának
elrontása vagy megváltoztatása, erősítése/gyengítése
– idegen, nem a fajból származó DNS (gén) beépítése
→ transzgénikus élőlény !!! (rokonsági fok?)

akkor valamiféle „molekuláris nemesítés” zajlik

napjainkban?

Prezentáció címe
Prezentáció címe

32
 GMO növények osztályozása és felhasználása
1. Generációs transzgénikus növények
(növénytermesztési technológiák fejlesztése)
- biotikus rezisztencia növelése (vírus, baktérium, gomba, rovar, stb.)
- abiotikus rezisztencia növelése (herbicid, hideg, szárazság, só, stb.)

2. Generációs transzgénikus növények

(a termék minőségének javítása)
- anyagcsere módosítása: fehérje, zsírsav, szénhidrátok, színanyagok,
alkaloidtartalom minősége és mennyisége
- fejlődés módosítása: virágzás (hímsterilitás), érés, tárolhatóság

3. Generációs transzgénikus növények

(ipari alapanyagok előállítása)
- bioreaktor növények: gyógyszerek (humán fehérjék, antitestek,
vakcinák), műanyagok, élelmiszeripar enzimjei
Prezentáció címe
Prezentáció címe

GMO növények termesztési területei

millió hektár (1996 - 2006)

120 Összes 22 GMO ország

Fejlett
100 Fejlődő

80

60

40

20

0
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
13% növekedés (12 millió hektár) 2005 és 2006 között
Forrás: Clive James, 2006.

Prezentáció címe
Prezentáció címe

33
 GMO
• Kockázatai?
• Előnyei?
Gazdasági / egészségügyi:
• fontos élelmiszerek
• gyógyszerek előállítása
genetikai alapú betegségek
gyógyítása (akár ehető
vakcinák formájában)
– „génszökés”, multirezisztens
gyomok kialakulása
– a faji sokféleség csökkenésének
esélye (mesterséges evolúció?)
– termesztők gazdasági függése a
jó hozamú, de pl. steril magvú
növényeket előállító cégektől

Tudományos: • Az eljárás nehézségei:

• A speciális genomi régiók Nem a célnak megfelelő kifejeződés
szerepének megismerése – nem működőképes
(pl. „K.O.” mutánsok) – nem jó időben/térben
– pár generáció után „elhalkul”
(„géncsendesítés”)

→ SOKLÉPCSŐS TESZTELÉS
(zárt, majd szabadföldi)
ÉS SZIGORÚ
Prezentáció címeSZŰRÉS!!!
Prezentáció címe

A géntechnológiai eredet megállapítására

jogosult laboratóriumok:
(magyar törvényi szabályozás)

• állami fenntartású
1. Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont (MBK, Gödöllő)
2. Országos Élelmiszervizsgáló Intézet (OÉI)
3. Országos Mezőgazdasági Minősítő Intézet (OMMI)
4. Országos Élelmezés és Táplálkozástudományi Intézet (OÉTI)

• kereskedelmi laboratóriumok

Prezentáció címe
Prezentáció címe

34
Jelölési kötelezettség EU-ban, így Magyarországon
is 0,9% transzgénikus tartalom felett
(kereskedelem, feldolgozóipar)

Transzgén tartalom megállapítása laboratóriumi úton

történik:
1. DNS alapú - PCR technikával
2. Fehérje alapú - ELISA módszerrel

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Élelmiszer, takarmány, alapanyag, kiegészítők

Laboratóriumi minta

DNS izolálás Fehérje izolálás

Kvalitatív PCR ELISA test

GMO kimutatás
Azonosítás Fehérje kimutatás
Mennyiségi
Real-time PCR meghatározás

Mennyiségi
meghatározás

Prezentáció címe
Prezentáció címe

35
 DNS izolálás PCR

Cél:
DNS fragment
felsokszorozása
specifikus primerek
használatával

Értékelés

Prezentáció címe
Prezentáció címe

Izolált primerek Előny:

100-120 bp feldolgozott
genomi hosszú
PCR élelmiszerek
DNS felsokszorozott esetén is
fragment alkalmazható

Kimutatási határ 0,01%-0,1%

Prezentáció címe
Prezentáció címe

36
 GMO tartalom kimutatásának stratégiája

promóter marker gén / transzgén terminátor

növényi genom

Ált. szűrés alacsony

gén
Konstrukció specificitás

Vonal

magas
Prezentáció címe
Prezentáció címe

A transzgén kimutatás lehetősége:

Primer- Transzgén-gyanús Negatív
kombináció minták kontroll
1. 2.
A.
egy gyakori
transzgénre
B.
egy másik
transzgénre
C.
egy gyakori
promoterre
Prezentáció címe
Prezentáció címe

37