Textbook Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems Methods and Protocols Masaru Ishii Ebook All Chapter PDF

Intravital Imaging of Dynamic Bone and
Immune Systems Methods and

Protocols Masaru Ishii
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Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems

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Methods in
Molecular Biology 1763
Masaru Ishii Editor
Intravital Imaging
of Dynamic Bone
and Immune
Systems
Methods and Protocols
Methods in Molecular Biology
Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK
For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
Intravital Imaging of Dynamic
Bone and Immune Systems
Methods and Protocols
Edited by
Masaru Ishii
Department of Immunology and Cell Biology, Graduate School of Medicine,
Osaka University, Osaka, Osaka, Japan
Editor
Masaru Ishii
Department of Immunology and Cell Biology
Graduate School of Medicine, Osaka University
Osaka, Osaka, Japan
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-7761-1 ISBN 978-1-4939-7762-8 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7762-8
Library of Congress Control Number: 2018933038
© Springer Science+Business Media, LLC 2018

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Printed on acid-free paper
This Humana Press imprint is published by Springer Nature

The registered company is Springer Science+Business Media, LLC
The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A.
Preface
During the last decade, advanced intravital imaging technology by using multiphoton exci-
tation fluorescent microscopy has revolutionized the field of biological sciences. Based on
these techniques, we are now able to visualize in situ behavior of a diversity of living cells
“intravitally” within intact tissues and organs. This research trend would be quite meritori-
ous especially for analyzing bone and immune systems, where various kinds of cell types are
moving around and their spatiotemporal control is pivotal for proper functions in vivo. For
example, bone is a mysterious organ where various kinds of hematopoietic and immune
cells are produced and functioning although poorly analyzed by conventional methodology
such as histological analyses with decalcified bones. Intravital imaging of bones has identi-
fied the behavior of bone cells such as osteoclasts, specialized macrophages contributing to
bone destruction, revealing novel mechanisms controlling their migration and function in
situ. Furthermore, visualization of the dynamic movement of various cell types in lymph
nodes, skin, kidney, nervous systems, and cancer tissues has identified crucial mechanisms
and factors triggering their migration and infiltration in these areas.
Despite the increased importance of the methods in biological sciences and the avail-
ability of expensive imaging modalities such as multiphoton microscopy in many research
institutes, one of the big hurdles preventing popularization of this research trend has so far
been the complicated experimental protocol. Researchers need the procedures to be elabo-
rated for themselves in their respective laboratories.
In this book, leading researchers who are actually doing imaging studies in the field of
bone and immune systems contributed the chapters where they described respective actual
cutting-edge protocols, including some “secret recipes.” These detailed methods would surely
be useful for general readers in order to establish and perform these experiments on their own.
I express my sincere gratitude to all the authors for their willingness to share their secrets
and to Prof. John Walker at Humana Press for giving me the opportunity to publish this book
for the series. Both he and the authors have been patient during the editing of this volume.
Osaka, Japan Masaru Ishii
v
Contents
Preface�� v
Contributors �� ix
1 Bone Imaging: Osteoclast and Osteoblast Dynamics�� 1

Junichi Kikuta and Masaru Ishii
2 Intravital Imaging of Mouse Bone Marrow:
Hemodynamics and Vascular Permeability�� 11
Yookyung Jung, Joel A. Spencer, Anthony P. Raphael, Juwell W. Wu,
Clemens Alt, Judith R. Runnels, Briaira Geiger, and Charles P. Lin
3 Bone Imaging: Platelet Formation Dynamics�� 23
Asuka Sakata and Satoshi Nishimura
4 Live Imaging of Interstitial T Cell Migration
Using Lymph Node Slices�� 29
Tomoya Katakai
5 Two-Photon Imaging of T-Cell Motility in Lymph Nodes:
In Vivo and Ex Vivo Approaches�� 43
Akira Takeda, Masayuki Miyasaka, and Eiji Umemoto
6 Imaging the Lymph Node Stroma�� 53
Clément Ghigo, Rebecca Gentek, and Marc Bajénoff
7 Intravital Imaging of B Cell Responses in Lymph Nodes�� 63
Stefano Sammicheli, Mirela Kuka, and Matteo Iannacone
8 Live Imaging of the Skin Immune Responses:
Visualization of the Contact Hypersensitivity Response�� 75
Gyohei Egawa, Tetsuya Honda, and Kenji Kabashima
9 Imaging of Inflammatory Responses in the Mouse Ear Skin�� 87
Jackson LiangYao Li, Chi Ching Goh, and Lai Guan Ng
10 In Vivo Imaging of Immune Cells in Peyer’s Patches�� 109
Andrea Reboldi
11 Intravital Imaging of T Cells Within the Spinal Cord�� 119
Naoto Kawakami
12 Kidney Imaging: Intravital Microscopy�� 129
Takashi Hato, Seth Winfree, and Pierre C. Dagher
13 Intravital Imaging of Liver Cell Dynamics�� 137
Sayaka Matsumoto, Junichi Kikuta, and Masaru Ishii
14 Intravital Imaging of the Heart at the Cellular Level
Using Two-Photon Microscopy�� 145
Ryohei Matsuura, Shigeru Miyagawa, Junichi Kikuta, Masaru Ishii,
and Yoshiki Sawa
vii
viii Contents
15 Imaging Window Device for Subcutaneous Implantation Tumor�� 153

Wataru Ikeda, Ken Sasai, and Tsuyoshi Akagi
16 New Tools for Imaging of Immune Systems: Visualization
of Cell Cycle, Cell Death, and Cell Movement by Using
the Mice Lines Expressing Fucci, SCAT3.1, and Kaede and KikGR�� 165
Michio Tomura
Index�� 175
Contributors
Tsuyoshi Akagi • KAN Research Institute Inc., Kobe, Hyogo, Japan

Clemens Alt • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA, USA
Marc Bajénoff • Aix-Marseille University, Centre National de la Recherche Scientifique
(CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre
d’Immunologie de Marseille-Luminy (CIML), Marseille, France
Pierre C. Dagher • Division of Nephrology, Department of Medicine,
Indiana University, Indianapolis, IN, USA
Gyohei Egawa • Department of Dermatology, Kyoto University Graduate
School of Medicine, Kyoto, Japan
Briaira Geiger • Department of Chemistry, Richard Stockton College of New Jersey,
Galloway, NJ, USA
Rebecca Gentek • Aix-Marseille University, Centre National de la Recherche Scientifique
Clément Ghigo • Aix-Marseille University, Centre National de la Recherche Scientifique
Chi Ching Goh • Singapore Immunology Network (SIgN), A*STAR (Agency for Science,
Technology and Research), Singapore, Singapore; Department of Microbiology,
Immunology Programme, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of
Singapore, Singapore, Singapore
Takashi Hato • Department of Medicine, Indiana University, Indianapolis, IN, USA
Tetsuya Honda • Department of Dermatology, Kyoto University Graduate School of
Medicine, Kyoto, Japan
Matteo Iannacone • Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases,
IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy; Vita-Salute San Raffaele
University, Milan, Italy; Experimental Imaging Center, IRCCS San Raffaele Scientific
Institute, Milan, Italy
Wataru Ikeda • KAN Research Institute Inc., Kobe, Hyogo, Japan
Masaru Ishii • Department of Immunology and Cell Biology, Graduate School of
Medicine, Osaka University, Osaka, Japan
Yookyung Jung • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA, USA; Center
for Molecular Spectroscopy and Dynamics, Institute for Basic Science (IBS), Seoul,
Republic of Korea
Kenji Kabashima • Department of Dermatology, Kyoto University Graduate School of
Medicine, Kyoto, Japan
Tomoya Katakai • Department of Immunology, Graduate School of Medical and Dental
Sciences, Niigata University, Niigata, Japan
ix
x Contributors
Naoto Kawakami • Institute of Clinical Neuroimmunology, University Hospital and

Biomedical Center, Ludwig-Maximilians University Munich, Munich, Germany;
Max-Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, Germany
Junichi Kikuta • Department of Immunology and Cell Biology, Graduate School of
Mirela Kuka • Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS
San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy; Vita-Salute San Raffaele University,
Milan, Italy
Jackson LiangYao Li • Singapore Immunology Network (SIgN), A*STAR (Agency for
Science, Technology and Research), Singapore, Singapore; School of Biological Sciences,
Nanyang Technological University, Singapore, Singapore; CNIC (Fundación Centro
Nacional de Investigaciones Cardiovasculares), Madrid, Spain
Charles P. Lin • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Sayaka Matsumoto • Department of Immunology and Cell Biology, Graduate School of
Ryohei Matsuura • Department of Cardiovascular Surgery, Osaka University, Graduate
School of Medicine, Osaka, Japan
Shigeru Miyagawa • Department of Cardiovascular Surgery, Osaka University Graduate
School of Medicine, Osaka, Japan
Masayuki Miyasaka • MediCity Research Laboratory, University of Turku, Turku,
Finland; Interdisciplinary Program for Biomedical Sciences, Institute of Academic
Initiatives, Osaka University, Suita, Osaka, Japan
Lai Guan Ng • Singapore Immunology Network (SIgN), A*STAR (Agency for Science,
Technology and Research), Singapore, Singapore; School of Biological Sciences, Nanyang
Technological University, Singapore, Singapore; Department of Microbiology, Immunology
Programme, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
Singapore, Singapore
Satoshi Nishimura • Research Division of Cell and Molecular Medicine, Center for
Molecular Medicine, Jichi Medical University, Tochigi, Japan
Anthony P. Raphael • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA, USA;
Dermatology Research Centre, Translational Research Institute, School of Medicine, The
University of Queensland, St Lucia, QLD, Australia
Andrea Reboldi • Department of Pathology, University of Massachusetts Medical School,
Worcester, MA, USA
Judith R. Runnels • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Asuka Sakata • Research Division of Cell and Molecular Medicine, Center for Molecular
Medicine, Jichi Medical University, Tochigi, Japan
Stefano Sammicheli • Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases,
IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy; Vita-Salute San Raffaele
University, Milan, Italy
Ken Sasai • KAN Research Institute Inc., Kobe, Hyogo, Japan
Yoshiki Sawa • Department of Cardiovascular Surgery, Osaka University Graduate School
of Medicine, Osaka, Japan
Contributors xi
Joel A. Spencer • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical
School, Boston, MA, USA; School of Engineering, University of California Merced,
Merced, CA, USA
Akira Takeda • MediCity Research Laboratory, University of Turku, Turku, Finland
Michio Tomura • Laboratory of Immunology, Faculty of Pharmacy, Osaka Ohtani
University, Osaka, Japan
Eiji Umemoto • Laboratory of Immune Regulation, Department of Microbiology and
Immunology, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita, Osaka, Japan
Seth Winfree • Department of Medicine, Indiana University, Indianapolis, IN, USA
Juwell W. Wu • Center for Systems Biology and Wellman Center for Photomedicine,
Chapter 1
Bone Imaging: Osteoclast and Osteoblast Dynamics

Junichi Kikuta and Masaru Ishii
Abstract
Bone is continually remodeled by bone-resorbing osteoclasts and bone-forming osteoblasts. Although it
has long been believed that bone homeostasis is tightly regulated by communication between osteoclasts
and osteoblasts, the fundamental process and dynamics have remained elusive. To resolve this, we estab-
lished an intravital bone imaging system using multiphoton microscopy to visualize mature osteoclasts and
osteoblasts in living bone.
We herein describe the methodology for visualizing the in vivo behavior of bone-resorbing osteoclasts
and bone-forming osteoblasts in living bone tissues using intravital multiphoton microscopy. This approach
facilitates investigation of cellular dynamics in the pathogenesis of bone-destructive disorders, such as
osteoporosis and rheumatoid arthritis in vivo, and would thus be useful for evaluating the efficacy of novel
anti-bone-resorptive drugs.
Key words Intravital imaging, Multiphoton microscopy, Osteoclast, Osteoblast, pH-sensing probe
1 Introduction
Bone is a dynamic tissue that undergoes continuous remodeling by

bone-resorbing osteoclasts and bone-forming osteoblasts [1].
Tight control of bone remodeling is critical for maintaining bone
homeostasis in response to structural and metabolic demands.
Bone remodeling is strictly controlled through a complex commu-
nication network between osteoblast- and osteoclast-lineage cells
[2]. Therefore, it is essential to understand the spatial–temporal
relationship and interactions between osteoblasts and osteoclasts
in vivo. In particular, it remains controversial whether these cell
types physically interact with each other.
Bone is the hardest tissue in the body; for this reason, it is tech-
nically difficult to visualize cellular interactions in the bone marrow
cavities of living animals. The morphology and structure of bone
tissues can be analyzed using various conventional methods,
including micro-computed tomography, histomorphological anal-
yses, and flow cytometry. These methods yield information on cell
Masaru Ishii (ed.), Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 1763, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7762-8_1, © Springer Science+Business Media, LLC 2018
1
2 Junichi Kikuta and Masaru Ishii
shape and gene expression patterns, but not on dynamic cell move-
ments in living bone marrow. The recent introduction of fluores-
cence microscopy has enabled imaging of the cellular dynamics of
organs and tissues in vivo [3, 4]. Therefore, we established an
advanced imaging system to visualize living bone tissues using
intravital multiphoton microscopy [5–8]. For visualization of deep
bone tissue, we selected the parietal bone of mice, which is ~80–
120 μm thick (within the range of infrared lasers), as the observa-
tion site. In this region, living bone marrow can be accessed with
minimal invasion.
To visualize mature osteoclasts (mOCs), we generated trans-
genic reporter mice expressing tdTomato, a red fluorescent pro-
tein, in the cytosol of mOCs (TRAP-tdTomato mice) [8]. To
visualize mature osteoblasts (mOBs), we also generated fluores-
cent reporter mice expressing enhanced cyan fluorescent protein
(ECFP) in the cytosol of mOBs (Col2.3-ECFP mice). To visualize
communication between mOCs and mOBs, we crossed TRAP-
tdTomato mice with Col2.3-ECFP mice to generate TRAP-
tdTomato/Col2.3-ECFP double fluorescently labeled mice. Using
intravital multiphoton microscopy of calvaria bone tissues of
TRAP-tdTomato/Col2.3-ECFP mice, we successfully visualized
the in vivo behavior of living mOCs and mOBs on the bone sur-
face; the imaging results suggested direct interactions between
mOCs and mOBs in vivo. In wide views of skull bones under nor-
mal conditions, mOCs and mOBs appeared to be distributed sepa-
rately, although some direct, albeit spatiotemporally limited,
mOC–mOB interactions were evident. Analysis of time-lapse
images showed that mOCs and mOBs exhibited distinct spatial
distributions. However, several mOCs in contact with mOBs dis-
played dendritic shapes and projected synapse-like structures
toward mOBs. Additionally, these interactions between mOCs and
mOBs changed dynamically according to bone homeostatic
conditions.
We recently developed pH-sensing chemical fluorescent probes
to detect localized acidification by bone-resorbing osteoclasts on
the bone surface in vivo [9, 10]. These probes are based on the
boron-dipyrromethene (BODIPY) dye and a bisphosphonate
group. BODIPY dyes have a large number of applications because
of their environmental stability, large molar absorption coefficients,
and high fluorescence quantum yields [11]. The bisphosphonate
group replaces phosphate ions in hydroxyapatite, the main compo-
nent of bone tissue, and forms a tight bond with the bone matrix.
Therefore, the bisphosphonate group facilitates delivery and fixa-
tion of the probe on bone in living animals [12]. Our recently
developed pH-probes enabled visualization of bone resorption by
osteoclasts, which led to identification of two distinct functional
states of differentiated osteoclasts: bone-resorptive [R] and non-
resorptive [N].
Bone Imaging: Osteoclast and Osteoblast Dynamics 3
In this chapter, we describe a methodology for visualizing the

in vivo behavior of osteoclasts and osteoblasts simultaneously in
living bone tissue. In addition, we describe imaging of osteoclast
function using a pH-sensing fluorescent chemical probe.
2 Materials
2.1 Multiphoton 1. Upright multiphoton microscope (A1R-MP; Nikon) (see

Microscopy Note 1).
2.1.1 Standard Imaging 2. Water-immersion objective, 25× (APO: numerical aperture [NA],
1.1; working distance [WD], 2.0 mm; Nikon) (see Note 2).
3. Femtosecond-pulsed infrared laser (Chameleon Vision II Ti:
sapphire laser; coherent) (see Note 3).
4. External non-descanned detector (NDD) with four channels
(Nikon).
5. Dichroic and filter set: Three dichroic mirrors (458, 506, and
561 nm), and four band-pass filters (417/60 nm for the sec-
ond harmonic generation (SHG) signal, 480/40 nm for ECFP,
534/30 nm for autofluorescence, and 612/69 nm for tdTo-
mato) (Nikon) (see Note 4).
6. NIS Elements integrated software (Nikon).
2.1.2 Spectral Imaging 1. Upright multiphoton microscope (LSM 780 NLO; Carl
(See Note 5) Zeiss).
2. Water-immersion objective, 20× (W Plan-Apochromat: NA,
1.0; WD, 2.4 mm; Carl Zeiss).
3. Femtosecond-pulsed infrared laser (Chameleon Vision II Ti:
sapphire laser; coherent).
4. Internal 32-channel GaAsP spectral detectors (Carl Zeiss).
5. ZEN software (Carl Zeiss).
2.2 Mice 1. TRAP-tdTomato [8] and Col2.3-ECFP mice.

and Anesthesia 2. Isoflurane (Escain).
3. Vaporizer (inhalation device).
4. O2 bomb.
5. Anesthesia box and mask.
2.3 Intravital 1. Custom-made stereotactic stage (Fig. 1) (see Note 6).

Imaging 2. Head holder with a hexagonal window (see Note 7).
3. Shaver and hair-removal lotion.
4. Iris scissors and tweezers for mouse surgery.
5. N-Butyl cyanoacrylate glue.
Fig. 1 Schematic illustration of calvaria bone imaging. The mouse is anesthetized

with isoflurane, the frontoparietal region of the skull bone is surgically exposed,
and its head is immobilized using the custom-made stereotactic holder. The
head holder is kept fully loaded with PBS by an infusion syringe pump
6. Ethyl-cyanoacrylate glue.
7. Infusion line.
8. Infusion syringe pump.
9. Phosphate-buffered saline (PBS) buffer, pH 7.4.
10. Electrocardiogram monitoring device.
11. Environmental dark box in which an anesthetized mouse is
warmed to 37 °C by an air heater.
2.4 Preparation 1. pH-sensing chemical fluorescent probe (Fig. 2) [10].

of the pH-Sensing 2. PBS immersion buffer, pH 7.4.
Probe
3. One 26-gauge needle.
2.5 Staining of Blood 1. Angiographic agent: Qtracker 655.

Vessels 2. One 29-gauge insulin syringes for intravenous injection.
2.6 Image 1. Image processing and analysis software: Imaris (Bitplane), NIS
Processing Elements (Nikon), and ZEN (Carl Zeiss).
and Analysis 2. After Effects software (Adobe).
Fig. 2 Chemical structure of the pH-sensing fluorescent chemical probe. The pH-sensing probe is based on the
boron-dipyrromethene (BODIPY) dye for visualization in low-pH environments in bone created by active osteo-
clasts; the bisphosphonate group facilitates delivery of the probe to bone tissue. Fluorescence of the probe can
be detectable under acidic condition
3 Methods
3.1 Administration 1. Dissolve 5 mg/kg of pH-sensing chemical probe (pHocas-3)

of the pH-Sensing in PBS.
Probe 2. All procedures in mice are performed under anesthesia.
3. Inject the pH-probe subcutaneously into mice daily beginning
3 days prior to imaging.
4. Perform intravital bone imaging experiments (see Subheading
3.2).
3.2 Intravital 1. Start up the multiphoton microscope and turn on the heater in
Multiphoton Imaging the environmental dark box (see Note 8).
of Calvaria Bone 2. All surgical procedures are performed under isoflurane inhala-
tion anesthesia.
3. Shave the hair and apply hair-removal lotion to the top of the
head of the mouse (see Note 9).
4. Disinfect the skin of the head using 70% ethanol.
5. Cut the skin minimally using iris scissors and then expose the
frontoparietal region of the skull.
6. Resect marginal muscles and the periosteum.
7. Apply n-butyl cyanoacrylate glue to the back of the head
holder.
8. Apply ethyl-cyanoacrylate glue to the marginal area of the
exposed bone, but not to the skull bone within the hexagonal
window.
9. Place the head holder on the skull bone using the skull bone
suture as an anatomical landmark.
10. Wait a few minutes to allow the glue to firmly secure the skull
bone to the head holder (see Note 10).
11. Fix the head holder to the custom-made stereotactic stage
using two screws, and immobilize the mouse as tightly as pos-
sible to avoid drift secondary to respiration and pulsation
(Fig. 1) (see Note 11).
12. Set the infusion line in the groove of the head holder, and fill
the hexagonal window with PBS (see Note 12).
13. Place the mouse in the environmental dark box.
14. If necessary, intravenously inject Qtracker 655 dissolved in PBS.
15. Focus on the bone marrow cavity at an appropriate depth and
look through the ocular lenses using a mercury lamp as the
light source.
16. Change the light source from the mercury lamp to the Ti: sap-
phire laser.
17. Set the excitation wavelength, zoom ratio, z-positions, interval
time, and duration time using the microscope software (see
Note 13).
18. Observe the bone tissue by multiphoton excitation microscopy.
19. Monitor the heart rate of the mouse using an electrocardio-
gram throughout imaging (see Note 14).
3.3 Image 1. Obtain the SHG, autofluorescence, pHocas-3, ECFP, and

Processing tdTomato fluorescence spectra from the raw images using
and Analysis ZEN software by manually selecting appropriate pixels.
3.3.1 Spectral Unmixing 2. Utilize these spectral libraries for spectral unmixing
for Images Acquired algorithms.
by 32-Channel 3. Discriminate each fluorescence signal, exclude autofluores-
GaAsP Spectral Detectors cence, and create unmixed images (Fig. 3).
3.3.2 Analysis 1. Correct images for XY drift using NIS Elements or Imaris
of Intravital software.
Multiphoton Images 2. Analyze images by measuring the frequency and duration of
cell-to-cell contact using Imaris software (Fig. 4).
3. Create the movie using After Effects software.
4 Notes
1. There are two types of microscope: upright and inverted. Bone

marrow can be observed using an inverted microscope.
Multiphoton microscopes are also available from other manu-
facturers (e.g., Leica Microsystems and Olympus).
Fig. 3 Visualization of the bone-resorptive function of mature osteoclasts using a

pH-sensing fluorescent probe. Representative images of the calvaria of TRAP-
tdTomato mice treated with a pH-probe, showing sites of local bone resorption.
Red, mature osteoclasts expressing TRAP-tdTomato; green, fluorescence signals
from areas of high H+ concentration; blue, bone tissue. Arrowheads and asterisks
represent bone-resorptive and non-resorptive osteoclasts, respectively. Scale
bar, 40 μm
Fig. 4 Visualization of living mature osteoclasts and osteoblasts on bone surface

by intravital multiphoton microscopy. Representative image of the calvaria of
TRAP-tdTomato/Col2.3-enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) mice under
control conditions. Red, mature osteoclasts (mOCs) expressing TRAP-tdTomato;
cyan, mature osteoblasts (mOBs) expressing Col2.3-ECFP. Arrowheads represent
mOB–mOC interactions. Scale bar, 40 μm
2. Objective lenses with a higher NA and longer WD are

desirable.
3. A femtosecond-pulsed infrared laser is also available from
Spectra-Physics (MaiTai).
4. The dichroic and filter set required depends on the fluorescent
proteins and dyes used.
5. We utilize a Carl Zeiss upright multiphoton microscope with
internal 32-channel GaAsP spectral detectors when using
simultaneous multiple fluorescent labels. This enables acquisi-
tion of the entire spectrum of each label in one scan, which is
then used to create unmixed images.
6. The custom-made stereotactic stage is composed of a 10-mm-
thick metal plate, on which two cylinders with screw holes are
placed. The head holder can be fixed to this stage with two
stainless screws.
7. The head holder has one recess, the curvature radius of which
is 28 mm. The center of the recess has a hexagonal window.
The head holder is 3 mm in thickness and 15 g in weight.
8. Some time is required for the laser and temperature to
stabilize.
9. Remove as much hair as possible to prevent hair (which is
autofluorescent) entering the visual field.
10. Prevent glue from contaminating the visual field because some
glues are autofluorescent.
11. Do not fasten too tightly to avoid injuring the mouse.
12. The head holder is kept fully loaded with PBS by an infusion
syringe pump.
13. The excitation wavelength of 940 nm is used to simultaneously
excite ECFP, tdTomato, and pHocas-3. For an example of
intravital time-lapse bone imaging, image stacks were collected
at 3 μm vertical steps at a depth of 50–150 μm below the skull
bone surface with 2.0× zoom, 512 × 512 X–Y resolution, and
a time resolution of 5 min.
14. The heart rate is used as a guide to adjust the anesthetic gas
concentration.
References
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Suggested sequential mode of control of lular unit. Bonekey Rep 3:481
changes in cell behavior in adult bone remodel- 3. Cahalan MD, Parker I, Wei SH, Miller MJ
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5. Ishii M et al (2009) Sphingosine-1-phosphate imaging of bone-resorbing osteoclasts. J Am
mobilizes osteoclast precursors and regulates Chem Soc 33:17772–17776
bone homeostasis. Nature 458:524–528 10. Maeda H et al (2016) Real-time intravital
6. Ishii M, Kikuta J, Shimazu Y, Meier- imaging of pH variation associated with osteo-
Schellersheim M, Germain RN (2010) clast activity. Nat Chem Biol 12:579–585
Chemorepulsion by blood S1P regulates osteo- 11. Loudet A, Burgess K (2007) BODIPY dyes
clast precursor mobilization and bone remodel- and their derivatives: syntheses and spectro-
ing in vivo. J Exp Med 207:2793–2798 scopic properties. Chem Rev 107:4891–4932
7. Kikuta J et al (2013) Sphingosine-1-phosphate- 12. Kozloff KM, Volakis LI, Marini JC, Caird MS
mediated osteoclast precursor monocyte migra- (2010) Near-infrared fluorescent probe traces
tion is a critical point of control in the bisphosphonate delivery and retention in vivo.
anti-bone-resorptive action of active vitamin J Bone Miner Res 25:1748–1758
D. Proc Natl Acad Sci U S A 110:7009–7013
Chapter 2
Intravital Imaging of Mouse Bone Marrow: Hemodynamics

and Vascular Permeability
Yookyung Jung, Joel A. Spencer, Anthony P. Raphael, Juwell W. Wu,
Clemens Alt, Judith R. Runnels, Briaira Geiger, and Charles P. Lin
Abstract
The bone marrow is a unique microenvironment where blood cells are produced and released into the
circulation. At the top of the blood cell lineage are the hematopoietic stem cells (HSC), which are thought
to reside in close association with the bone marrow vascular endothelial cells (Morrison and Scadden,
Nature 505:327–334, 2014). Recent efforts at characterizing the HSC niche have prompted us to make
close examinations of two distinct types of blood vessel in the bone marrow, the arteriolar vessels originat-
ing from arteries and sinusoidal vessels connected to veins. We found the two vessel types to exhibit differ-
ent vascular permeabilites, hemodynamics, cell trafficking behaviors, and oxygen content (Itkin et al.,
Nature 532:323–328, 2016; Spencer et al., Nature 508:269–273, 2014). Here, we describe a method to
quantitatively measure the permeability and hemodynamics of arterioles and sinusoids in murine calvarial
bone marrow using intravital microscopy.
Key words Bone marrow blood vessel, Arterioles, Sinusoids, Permeability, Hemodynamics, Flow
speed, Blood vessel diameter, Mouse restraint, Intravital imaging
1 Introduction
The microanatomic landscape of the bone marrow is dominated by

the presence of a dense vascular network. The vasculature makes
up approximately 25–30% of the marrow space by volume [1, 2],
with sinusoidal blood vessels being the most prominent vessel type.
However, the bone marrow vasculature is heterogeneous [3, 4],
and the heterogeneity is particularly notable when imaging the
local hemodynamics in real time [1, 5]. Compared to arteriolar
vessels, the flow speed and sheer rate in sinusoidal vessels are much
lower [1, 5], and vascular permeability is significantly higher [5].
Increased vascular permeability has been shown to increase the
level of reactive oxygen species (ROS) in the surrounding cells and
Yookyung Jung and Joel A. Spencer contributed equally to this work.
Masaru Ishii (ed.), Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 1763, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7762-8_2, © Springer Science+Business Media, LLC 2018
11
12 Yookyung Jung et al.
to impact the migration and differentiation of hematopoietic stem

and progenitor cells (HSPCs) [5]. Here, we present a protocol
for measuring hemodynamics and permeability of arterioles and
sinusoids in mouse bone marrow using video rate laser scanning
confocal/two-photon microscopy [6–8]. Video rate laser scanning
is achieved by a polygon-based fast scanning mechanism that allows
full-frame (500 × 500 pixels) image acquisition at 30 frames per
second. Higher frame rates can be acquired at a reduced frame size
(120 frames per second at 500 × 125 pixels). The rapid scanning
enables individual hemodynamic and vessel permeability measure-
ments based on fluorescently labeled circulating blood cells and
vascular dye leakage, respectively. Using this protocol, we could
measure flow speeds up to 10 mm/s in individual blood vessels
and simultaneously record vascular permeability in the same vessels
within the first minute after dye injection. We also present concur-
rent methods for stabilizing the mouse for imaging and injection
of cells and dyes on stage using a custom-built catheter.
2 Materials
2.1 Mouse Any strain of mice can be used. Care should be taken to minimize
signal overlap with the vascular dyes for permeability studies if co-
injecting fluorescently labeled cells or using transgenic fluorescent
mouse models. We typically use C57BL/6, which is the most com-
mon background strain for our studies. Animals were maintained
in the animal facilities of Massachusetts General Hospital in com-
pliance with institutional guidelines, and all animal studies were
approved by the Subcommittee on Research Animal Care of the
institution.
The high resolution imaging demands minimal mouse move-
ment during imaging caused by breathing and other movement
artifacts (see Note 1). Adequate mouse restraint can be achieved by
modifying a 50 mL conical tube as described in [4]. However, with
improved access to rapid-prototyping and related CAD software,
more precise restraints can be fabricated. Our custom-built, 3D
printed mouse restraint was designed using Autodesk® Inventor
Professional 3D CAD software (Autodesk®, USA) and printed on a
Fortus 380mc (Stratasys, USA) using ASA filament (see Note 2).
2.2 Fluorescence Fluorescently labeled RBCs are used for flow speed measurement.
Labeling of Red Blood Here we assumed that the local blood flow speed is equal to the
Cells (RBCs) average speed of RBCs in the vasculature.
Solutions and heparin-coated microcentrifuge tubes should be
prepared immediately before RBC labeling.
1. Fluorescent cell label CFDA-SE: thaw one vial of 500 μg
CFDA-SE (V12883, Invitrogen) and solubilize in 90 μL
DMSO.
Hemodynamics and Permeability of Bone Marrow Blood Vessels 13
2. Labeling solution A (“Soln A”): 90 mL of PBS (without

calcium and magnesium) supplemented with 1 g/L glucose
and 0.1% bovine serum albumin (BSA). Keep 60 mL at room
temperature, warm 30 mL to 37 °C.
3. Labeling solution B (“Soln B”): 48 mL PBS (without calcium
and magnesium), warm to 37 °C.
4. Wash solution (“Soln W”): 30 mL PBS (without calcium and
magnesium) supplemented with 1 g/L glucose. Keep at room
temperature.
5. Donor mouse: we label 1.2 × 109 RBCs for a final yield of
>0.75 × 109 cells. In our experience, a single facebleed from an
adult unanesthetized C57BL/6 mouse provides sufficient
RBCs.
6. Microcentrifuge tube for blood collection: add 200 μL
100 unit/mL heparin into tube and vortex briefly to coat.
7. Any BSA stock solution (concentration varies by
manufacturer).
2.3 Fluorescence Vascular dyes are used for flow speed measurement, vessel diameter
Labeling of the measurement, and vascular permeability measurement.
Vasculature
1. Large molecular weight fluorescent dye-dextran conjugates:
10 mg/mL 70 kDa Rhodamine B-dextran, 10 mg/mL
70 kDa Texas red-dextran, 10 mg/mL 70 kDa
FITC-dextran.
2.4 Custom-Built 1. 30½ gauge needle.

Catheter
2. Tygon microbore tubing, 0.010 (ID) × 0.030 (OD) in.
3. ½ cc insulin syringe with 29 G × ½ in. needle.
3 Methods
3.1 Preparing RBCs are fluorescently labeled ex vivo and injected into recipient
Fluorescently Labeled mouse 2–3 days before imaging to allow time for the bone marrow
RBCs to re-establish its equilibrium hemodynamic state.
1. Perform facial vein blood collection on donor mouse and col-
lect the blood in heparin-coated microcentrifuge tube. Animal
anesthesia (if used) should be non-intravenous, such as isoflu-
rane. Avoid ketamine and xylazine.
2. Transfer the heparinized blood suspension into 12 mL of Soln
A at room temperature. Centrifuge at 500 × g for 6 min.
Discard the suspension, which should be opaque with a faint
red shade. The cell pellet should be bright red.
3. Wash the RBCs two more times with 1.5 mL Soln A at room
temperature.
4. Perform cell count. Resuspend 1.2 × 109 RBCs in 12 mL Soln
A (37 °C) at 1 × 108 cells/mL. Keep the cells at 37 °C.
5. Add the 90 μL CFDA-SE DMSO stock into Soln B. Vortex to
mix and split the solution evenly into two 50 mL centrifuge
tubes (24 mL each).
6. Mix 6 mL of the RBC suspension from step 4 into each of the
two 50 mL centrifuge tubes prepared in step 5. Label at 37 °C
for 12 min.
7. When labeling is complete, introduce bovine serum albumin
stock solution such that BSA concentration is 0.1% in each of
the two 50 mL centrifuge tubes. Centrifuge.
8. Wash each cell pellet in 30 mL Soln A at room temperature.
Centrifuge.
9. Resuspend each cell pellet in 15 mL Soln W at room tempera-
ture and combine the two suspensions into one centrifuge
tube. Perform cell count and centrifuge.
10. Resuspend the labeled RBCs in 180 μL saline for retro-orbital
or tail vein injection. The RBC suspension should retain the
same bright red hue as in blood; do not inject cells that look
“rusty” as they will be cleared by circulation.
3.2 Mouse Restraint 1. Anesthesia is induced using 4% isoflurane in oxygen with a

and Preparation maintenance rate of 1–3%. Induction is achieved in a separate
chamber prior to mounting the mouse in the restraint.
2. For minimal motion, the mouse is first restrained by the bite-
bar, followed by the nose cone and lastly the side skull
restraints. The contact points on the side of the skull should be
between the eye socket and ears, typically in the region of the
squamosal bones (see Fig. 1).
3. Following appropriate restraint, the skull is prepared after
scalp incision [7].
3.3 Intravital The protocol for performing intravital optical imaging of the bone
Imaging of Calvarial marrow has been well described [6–8]. It is summarized as follows.
Bone Marrow Figure 2a shows the cross-sectional view of the calvarial bone of a
mouse. As the bone overlying the marrow cavity is typically
50–70 μm thick, the bone marrow can be accessed optically after a
simple skin flap surgery to expose the underlying bone surface.
The thickness of the marrow cavity can vary from tens of microm-
eters to a couple of hundred micrometers (Fig. 2a and b), where
the low intensity region in between the bone layers is the bone
marrow. Using the intrinsic second harmonic signal to visualize
Fig. 1 3D printed mouse holder for intravital optical imaging. (a) Mouse holder.
Red arrows indicate the nose cone and bite-bar which are anchor points for
securing the mouse head. Red dots are prongs that fix squamosal bones of the
mouse. (b) Side view of mouse skull. Red arrows and dots of (a) are shown at the
corresponding sites [6]
the bone, we image the bone marrow cavities located in the central
region of the skull around the sagittal and coronal sutures, which
encompass an area approximately 3–6 by 6–8 mm (see Fig. 2c and
Note 3). An example image of a bone marrow cavity of a nestin-
GFP mouse is shown in Fig. 2d, with the bone signal in blue, GFP
in green, hematopoietic stem and progenitor cell in red, and blood
vessels in grey. The cell is overlaid on the pre-acquired nestin-GFP,
blood vessels, and bone images.
3.4 Imaging Labeled The blood flow speed is measured by tracking the frame-to-frame
RBC and Calculating displacement of individual RBCs using high frame rate imaging.
Flow Speed 750–800 million fluorescently labeled RBCs are injected into a
recipient mouse 2–3 days before imaging. Immediately prior to
imaging, a fluorescent vascular dye (e.g., Rhodamine-B-dextran) is
injected allowing the visualization of the blood vessels that map
the “paths” of RBC displacement. For accurate flow speed mea-
surement, the average velocity of a minimum of five RBCs is used.
The detailed protocol for determining RBC and blood flow
speed in vivo is as follows:
Fig. 2 Intravital optical imaging of the bone marrow through the calvarial bone. (a) Cross-sectional view of a
mouse skull (from Henkelman M, Micro-CT images of mouse skull. http://www.stlfinder.com/model/mouse-
skull-(from-micro-ct)) and optical access into the bone marrow between calvarial bone layers. (b) Intensity
profile of the dotted yellow line in (a) shows two layers of calvarial bone and bone marrow between them. (c)
Top view of a mouse skull. Optical imaging area is shown as a dotted red rectangle that contains coronal and
sagittal sutures [6]. (d) Example of in vivo optical imaging of the bone marrow [9]. Nestin-GFP (green), hema-
topoietic stem and progenitor cell (red), blood vessels (grey), and bone (blue) are displayed. The cell is overlaid
on the pre-acquired nestin-GFP, blood vessels, and bone images. Scale bar is 50 μm
1. Deliver 40 μL of 10 mg/mL 70 kDa Rhodamine B-dextran

(ThermoFisher Scientific) to a labeled RBC recipient mouse
by retro-orbital or tail vein intravenous (i.v.) injection for
vascular labeling.
2. Perform simultaneous in vivo imaging of bone, blood vessels,
and labeled RBC. Imaging conditions are as follows:
●● Image size: 500 × 125 pixels.
●● Imaging speed: 120 frames/s.
●● Bone: 840 nm femtosecond laser excitation, ~40 mW of
power at the sample, 80 MHz repetition rate, MaiTai,
Fig. 3 Flow of labeled RBCs in the bone marrow blood vessels. Blue: second harmonic generation signal from
bone collagen. Red: blood vessels. Green: labeled RBCs. Scale bars are 50 μm. (a) Example image showing
overlay of labeled RBCs at several consecutive frames. (b) Flow of a single RBC in an arteriole. (c) Flow of a
single RBC in a sinusoid
Spectra Physics, Collection of the second harmonic genera-

tion from collagen in bone.
●● CFSE-labeled RBC: 491 nm continuous wave (CW) laser
excitation, ~1 mW of power at the sample, Dual Calypso,
Cobolt, Collection of confocal fluorescence at the spectral
range of 509–547 nm.
●● Blood vessel: 561 nm CW laser excitation, Jive, Cobolt,
~1 mW of power at the sample, Collection of confocal
fluorescence at the spectral range of 573–613 nm.
3. Calculate the speed of the blood flow using the following
equation (see Note 4):
Total distance traveled by RBC/Time (= number of
frames × 1/120 s).
The flow of labeled RBCs in the bone marrow blood vessels is
shown (Fig. 3). The labeled RBCs at several consecutive frames are
overlaid on the vascular image. Dotted and solid arrows show the
direction of flow and the positions of RBCs at each frame,
respectively.
Arterioles with small diameters (5–10 μm) show fast flow
(>1.5 mm/s) (Fig. 3b), and sinusoids with large diameter (>20 μm)
show slow flow (<1 mm/s) (Fig. 3c).
3.5 Blood Vessel Based on the flow speed and vessel diameter (Fig. 4), the majority
Diameter of bone marrow blood vessels can be categorized into two distinct
Measurement groups (Fig. 4f), those with high flow speed and small diameter
Fig. 4 Flow speed and diameter of arterioles and sinusoids. (a) Two-photon image of the blood vessels in the
calvarial bone marrow. Numbers in red and blue indicate the blood vessel identification (ID). Scale bar is
50 μm. (b, c) Individual blood vessel flow speeds from arterioles and sinusoids, respectively. (d, e) Individual
blood vessel diameters from arterioles and sinusoids, respectively. (f) Scatterplot of flow speed as a function
of diameter. Two distinct groups of “high flow speed and small diameter” vs “low flow speed and large diam-
eter” can be found (data from 70 blood vessels, n = 6 mice). Specific site of the individual blood vessels with
ID numbers in (b–e) can be found in (a)
(arterioles) vs those with low flow speed and large diameter

(sinusoids). These results are consistent with published values [1].
The protocol for blood vessel diameter measurement is as
follows:
1. Deliver 40 μL of 10 mg/mL 70 kDa Rhodamine B-dextran
(ThermoFisher Scientific) by retro-orbital or tail vein intrave-
nous (i.v.) injection for vascular labeling.
2. Acquire two-photon excitation fluorescence (at the spectral
range of 550–680 nm) image of the vessels in the calvarial bone
marrow immediately after injecting the vascular dye with femto-
second laser source (~40 mW of power at the sample, 80 MHz

repetition rate, 840 nm, MaiTai, Spectra Physics). Example
image shown in Fig. 4a.
3. Measure the diameter of the blood vessels using image analysis
software, for example ImageJ or Fiji software [10]. Repeated
measurements are taken and the averaged value of the measured
diameters is acquired.
3.6 Preparation Because of the high permeability of the bone marrow vasculature,
of Custom-Built it is necessary to perform dye injection while the mouse is on stage,
Catheter for Vascular so that the early dynamics of dye leakage immediately after injection
Imaging can be recorded and analyzed.
and Permeability
Measurement
3.6.1 Catheter 1. Cut 30½ gauge needle by using forceps (Fig. 5(1)).
Preparation 2. Insert the cut needle into 0.030 in. flexible plastic tube
(Fig. 5(2)).
3. Insert a needle of an insulin syringe into the other end of the
plastic tube (Fig. 5(3)).
Fig. 5 Preparation of home-built catheter for repeated vascular imaging and per-
meability measurement
4. Repeated bone marrow vascular imaging and permeability

measurements can be performed by using the home-built
catheter.
5. In case multiple measurements of permeability are necessary,
vasculature dyes with distinct two-photon emission spectrum
should be used to prevent the signal leaking between the
detection channels (see Note 5).
3.6.2 Quantitative 1. Perform video rate two-photon imaging of bone marrow vas-
Measurement culature immediately after injection of vascular dye.
of Permeability 2. Frame-to-frame misalignment of the images can exist because
of residual movement artifacts from breathing (Fig. 6a).
3. Series of raw images in Fig. 6a are registered and aligned by
either using Template Matching plugin of ImageJ or Matlab
code utilizing the command, normxcorr2, which performs
normalized two-dimensional cross-correlation [11, 12]. Ten
a b
c d 1 (Sinusoid)
40
2 (Arteriole)
30
Intensity (a.u.)
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (second)
Fig. 6 Process to measure the rate of vascular dye leakage. (a) Series of two-photon raw vascular images with
1/30 s of time interval. Misalignment of the images exists because of residual movement artifacts. (b) Raw
images are registered and aligned. Ten consecutive frames are frame-averaged to reduce the background noise
signal. (c) Regions to measure the dye leakage are displayed as yellow rectangles labeled with 1 (next to sinu-
soid) and 2 (next to arteriole). (d) Average intensity in the region 1 and 2 of (c) is plotted as a function of time.
The linear fits are shown as red lines. The slope of this linear fit is the rate of vascular dye leakage, dI/dt
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etwa bei Turnieren und Schützenfesten zusammenströmten,
keineswegs nur dem niederen Volk Unterhaltung.
Trotz aller verbitternden sozialen Gegensätze herrscht damals
doch noch ein außerordentlich starkes volkstümliches Gesamtgefühl.
Der oben erwähnte Massengeist ist nicht nur der Geist der niedrigen,
sondern der der Gesamtmasse, dem freilich eben wegen der großen
Rolle des niederen Volkes keine feinen Züge eignen können. Die Art
der niederen Volkskreise zieht vielmehr die der höheren zu sich
herab. Nicht nur, daß die Bildungsunterschiede in der Laienwelt
damals noch immer stark zurücktreten und hoch und niedrig sich in
einer durchaus volkstümlichen Ausdrucksweise (die natürlich nichts
Neues ist, sich jetzt nur in den Quellen stärker kundgibt) ergeht: es
ist auch an Stelle der höfischen Art in den aristokratischen Kreisen
eine freilich ebenfalls immer vorhanden gewesene und nur durch
jene modische Verbildung überfirnißte Neigung zur Derbheit und zu
grober Redeweise getreten. Schon der Minnedichtung sahen wir
(S. 93) in der höfischen Dorflyrik ein volkstümliches Gegenbild
erstehen. Herr Steinmar hat jene dann geradezu verspottet und zog
vor, »in daz luoder« zu »treten« und sehr materielle Genüsse zu
preisen. Ein plebejischer Geschmack bringt die Literatur dann immer
mehr herunter. Alles feinere Schönheitsgefühl schwindet, der Ton
wird immer niedriger, der Stoff immer realistischer, die
Ausdrucksweise immer derber. Die Schwänke, oft zotig und gemein,
werden zur Lieblingskost. Vor allem in jenen Fastnachtsspielen, und
zwar den Nürnbergern besonders, machen sich Derbheit und Roheit
mit vollstem Behagen breit. Es war im Grunde lächerlich, wenn in
ihnen der Bauer als komische und mißachtete Figur wegen seiner
Freßgier, seines Saufens, seines Schmutzes und seiner Roheit
herhalten mußte. Der Inhalt der Spiele zeigt die gleiche Freude
gerade des Städters am Rohen, z. B. an Prügelszenen, und in seiner
materiellen, groben, oft gemeinen Genußsucht unterschied er sich
vom Bauer nur durch die ihm zu Gebote stehende größere
Mannigfaltigkeit und gewisse äußerliche Feinheiten. Seine Neigung
zur Unflätigkeit beweisen wiederum die Spiele. Um diese Zeit wurde
ein zotiger, unanständiger Ton aber überhaupt allgemein Mode. Die
ganze Art nennt man nach dem von Sebastian Brant als
Modeheiligen hingestellten St. Grobian Grobianismus. Der Zug
nahm im 16. Jahrhundert noch sehr zu. Mit ihm sind eine
geflissentliche Mißachtung des überhaupt (s. S. 122) schon arg
heruntergekommenen gesellschaftlichen Anstandes und eine
teilweise fast zynische Behandlung des weiblichen Geschlechts
verbunden.
Die Maßlosigkeit und Ungebundenheit der Zeit, die sich in dem
genußsüchtigen Sichausleben, in der Sinnlichkeit wie noch immer in
Raub, Mord und Grausamkeit, überhaupt im Hang zu
Gewalttätigkeiten und in der allgemeinen Habgier äußert, zeigt sich
auch in diesem Gebaren. Strotzende Kraft, jugendlich-naive
Unkultiviertheit toben sich mit allem Behagen in ihrer Art aus: eben
dies ist immer die Weise des niederen Volkes. Aber diese griff
damals hoch hinauf. Wenn uns nun weiter aus jenen Spielen und
Schwänken, aus der Redeweise, der Spruchweisheit, den
Inschriften, den Namen und so vielem anderen, auch aus den
Briefen derjenigen, die über die Steifheit des üblichen förmlichen
Stils hinaus gelernt haben, zu schreiben, wie sie reden (wie vor
allem Luther und Albrecht Achilles), nicht nur Derbheit, sondern
immer auch lustige, launige Derbheit entgegenblitzt, so kommen wir
auf das Erhebende in dieser ganzen Erscheinung, auf das
befreiende Lachen, das uns aus alledem entgegendröhnt und
zeitweise auch die sozialen Bitternisse übertönt, auf den Humor der
Zeit. Keine andere war je so lachlustig, so launig selbst in Not und
Tod. Und auch das Heilige, das Ernste mußten sich das Eindringen
des Komisch-Possenhaften gefallen lassen. Wie sich am Osterfest
mancher Prediger dazu hergab, durch allerlei Scherze die Lachlust
zu erregen, so schoben sich in die geistlichen Schauspiele, die sich
ja vom Lateinischen nun zu einem volkstümlichen Deutsch gewandt
hatten, komische Zwischenspiele ein. Bei den Kirchenbauten
benutzte man die Wasserspeier zu humorvollen, oft satirischen,
selbst gegen Mönch und Nonne gerichteten Darstellungen, und
drinnen an Holzgestühl und Steinsäulen wurden allerlei lustige
Bildwerke angebracht. So erscheinen auch Recht und vor allem
Moral gern in humoristischem Gewande. Rechtssprache und
Rechtssätze zeugen davon, ferner gewisse Strafen. Dem
gefürchteten Galgen gibt der Volkshumor eine Fülle launiger
Bezeichnungen. So oft ferner Sünden und Schwächen mit ernsten
Worten gegeißelt werden, so häufig ist doch im 15. Jahrhundert ihre
humoristische Auffassung. Ihre Träger werden als »Narren«
hingestellt, wie zum Teil in den Spielen, wie vor allem in dem
Narrenschiff Brants. Das Laster verfällt der Lachlust, dem Spott. Die
Figur des »Narren« in besonderer Tracht übernimmt auch im
wirklichen Leben diese spöttische Geißelung der Schwächen, und
charakteristisch ist, daß diese volkstümliche Figur zu einer ständigen
Einrichtung an den Höfen und oft auch beim Adel wird. Ebenso gab
es natürlich Volksnarren bei Festen und Umzügen. Andererseits tat
man sich in Narrengesellschaften zusammen, um zu Zeiten mit
vollem Behagen »närrisch« zu sein. Wenn irgendein Zug für die
volkstümliche Grundstimmung der Zeit spricht, so ist es der Humor.
Das Volk lacht gern, gemessene Bildung und Moral haben ihm die
Laune nicht verdorben. Noch heute ist der Hauptzug aller
Dialektdichtungen der Humor; noch heute wählt der volkstümliche
Scherz weniger die Schriftsprache als eben den Dialekt. Gewiß hat
der Humor ebenso wie die anderen erwähnten volkstümlichen Züge
auch im früheren Mittelalter das ganze Volk durchdrungen, und die
erst später zahlreicher werdenden Zeugnisse für ihn dürfen nicht
dazu verleiten, ihn als Merkmal nur dieser späteren Zeit hinzustellen.
Es ist eben nunmehr die Möglichkeit, ihn zum Ausdruck zu bringen
und auch schriftlich kund zu tun, für weite Laienkreise
außerordentlich gewachsen. Aber dennoch liegt viel an dem jetzt
eingetretenen Übergewicht der Art der breiten Masse, durch das die
noch immer starke und nur durch die Stammesunterschiede
beschränkte Einheitlichkeit des Innenlebens aller der sonst so
zerrissenen und einander feindlichen Kreise außerordentlich
befördert wird.
Ein letztes Zeugnis für den volkstümlichen Gesamtgeist der Zeit ist
das Volkslied, das damals seine Blütezeit erlebte. Freilich wurde es,
besonders von den Spielleuten entwickelt und getragen, vor allem
von den niederen Schichten gepflegt und gesungen, aber
keineswegs nur von diesen. Es ist sicherlich Gemeingut des ganzen
Volkes gewesen und zeugt von dem innigen poetischen
Gefühlsleben der ganzen Zeit. Zugleich ist es in seinem Preisen
eines naiven Glückseligkeitsideals materieller Färbung (Liebe,
Gesang, Naturfreude, Schlemmerei, kurz »gutes Leben«) wieder für
die Genußsucht der Zeit charakteristisch. Aber es steckt in dieser
volkstümlichen Weltfreude doch auch ein poetischer Schwung, der
der bürgerlichen Nüchternheit gar nicht entspricht. Das Volkslied
zeugt weiter dafür, daß der demokratische, der Massencharakter
nun auch die Literatur nicht nur, wie (S. 139) geschildert, in Ton und
Geschmack beherrscht, sondern sich auch in der Bevorzugung
bestimmter Gattungen äußert. Diese Volkslieder wurden auch nicht
mehr von einzelnen Volkssängern, sondern mehrstimmig gesungen.
Eine solche Gattung, in der fast niemals einzelne Verfassernamen
glänzen, stellen ferner die Volksbücher dar, die die alten ritterlichen
Stoffe nun in breiter Prosa, oft in Anlehnung an französische Muster,
darboten und zunächst in den höheren Schichten verbreitet waren,
dann aber mehr und mehr zur Unterhaltung der Volkskreise dienten
und von diesen lange bewahrt wurden. Auch die reiche Entwicklung
und volkstümliche Gestaltung der jetzt deutschen geistlichen
Schauspiele wie die Ausbildung der weltlichen Fastnachtsspiele sind
hier anzuführen, zumal auch an jenen die Laien sowohl bezüglich
der Texte wie vor allem bei der Aufführung immer stärker beteiligt
sind. In diesem Zusammenhang ist auch wieder die deutsche
Volkspredigt zu erwähnen.
Holzschnitt und Kupferstich sodann, vor allem der erstere, tragen
gegen Ausgang des Mittelalters der Verbreitung der Kunst unter der
Masse Rechnung. Zugleich geben sie durchaus volkstümliche
Darstellungen und entnehmen ihren Stoff dem gesamten Volksleben,
wie es ja auch die bürgerliche Dichtung tat. Mit dieser Richtung auf
das wirkliche eben entwickeln sich dann auch Malerei und Plastik in
ganz anderer Weise als früher – der wichtigste Zug des
Aufschwungs dieser Künste ist das Streben nach Naturwahrheit –
und machen sich von der Beherrschung durch die Architektur frei.
Zweifellos beweist das alles ein Eindringen der höheren, jetzt freilich
volkstümlich gefärbten Kunst in die Masse, ein Bedürfnis nach
Kunst, wie es sich nun auch in der Gestaltung des Hausrats im
Bürgerhause, in der Anfüllung der Kirchen mit geschnitzten Altären,
mit Grabmälern an den Wänden und Pfeilern zeigt. Jene
mechanische Vervielfältigung durch Holzschnitt und Kupferstich ist
überhaupt von vornherein demokratisch gerichtet, und ganz
dasselbe gilt auf dem Gebiet des Bildungswesens von der neuen
Erfindung der Buchdruckerkunst. Nicht zwar gerade für die
niedersten Schichten, aber doch für die breitere Masse war diese
technische Errungenschaft des Bürgertums, die übrigens das sehr
entwickelte Abschreibegewerbe nur folgerichtig ablöste, das
willkommene Verbreitungsmittel der jetzt allgemeiner geschätzten
Bildung, die zunächst freilich durchaus mittelalterlichen Charakter
bewahrte. Die neue Kunst war zugleich ein Hauptmittel religiöser
Erbauung und Belehrung und kam, ebenso wie zum guten Teil der
Holzschnitt und Kupferstich, jenem tiefen religiösen Bedürfnis der
Masse entgegen. Sie war endlich ein Sprachrohr der Stimmungen
und Strebungen dieser Masse, wie sie auch der volkstümlichen
Unterhaltung diente.
So hat denn gerade zu Ausgang des Mittelalters, bis ins 16.
Jahrhundert hinein, volkstümlicher Geist das ganze Leben
beherrscht wie niemals wieder. Aber eben damals machten sich
schon Strömungen bemerkbar, die dem Volkstum innerlich feindlich
waren, zum Teil freilich zunächst wegen der damals allgemeinen
volkstümlichen Ausdrucksweise diese Richtung noch nicht deutlich
zeigten. Es sind naturgemäß Strömungen höherer Kultur, die letzten
Endes wiederum in der Antike wurzeln, der Humanismus, das
Römische Recht, die künstlerische Renaissance. Sie sind zum Teil
verbunden mit einer später ebenso volkstumsfeindlichen sozialen
Entwicklung, der ständigen Steigerung der landesherrlichen Gewalt,
die schließlich im Absolutismus mündete. Die antike Kultur ist
seinerzeit eine volkstümliche Kultur gewesen, die griechische vor
allem, aber das gewöhnliche Volk hat doch meist eine gewisse
Mißachtung erfahren. Namentlich seit dem Ausgang der Republik
hat der gebildete Römer sich über alles Plebejische weit erhaben
gefühlt, keinerlei Interesse für Strömungen im niederen Volk gehabt.
Diesen Geist der feineren Kulturmenschen haben dann auch die
Menschen der italienischen Renaissance gezeigt, er wurde gerade
durch den Zug zur antiken Literatur genährt. Von dieser wurden in
solcher Richtung dann auch die deutschen Juristen und Humanisten
mehr und mehr beeinflußt. Nun gaben aber gerade die niederen
Klassen zu jener Zeit vielfach den Ton in Deutschland an, und je
mehr man sich von ihnen und ihrer Art, die ja auch immer
grobianischer wurde, abwandte, um so mehr wandte man sich vom
Volkstümlichen überhaupt ab. Im 16. Jahrhundert überwog freilich
dieser volkstümliche Geist noch lange, die Verrohung ergriff sogar
bekanntlich immer höhere Schichten, so daß eine Gegenströmung
heilsam war, aber das schließliche Ergebnis war eine tiefe Kluft
zwischen den »Gebildeten«, also den Kulturmenschen, und dem
niederen Volk.
Anfangs, als sich in den letzten Jahrhunderten des Mittelalters
überhaupt eine allgemeinere Laienbildung zu verbreiten begann, war
die vermehrte geistige Schulung durchaus nicht unvolkstümlich, der
Drang nach besserem Wissen allgemein gewesen. Zunächst
keineswegs aus einem höheren und feineren Streben heraus. Es
handelte sich lange nur um jene elementare Bildung, deren aus
geistlicher Hand früher schon mancher Edle, mancher reiche Bürger
und noch mehr die Frauen dieser Stände teilhaftig geworden waren,
nach der nun auch die praktisch-nüchterne Masse des Bürgertums
aus wirtschaftlichen Gründen verlangte. Der Kaufmann und auch der
verkaufende Handwerker konnten das Schreiben und Rechnen nicht
mehr entbehren. Anfangs lateinisch und selten, dann deutsch und
immer allgemeiner wurden Notizen in Geschäftsbücher und kurze
Geschäftsbriefe geschrieben; in den Genossenschaften, den Zünften
und Gilden, wollte man allmählich bei der Führung der Listen und
Bücher nicht mehr auf den hilfreichen Geistlichen angewiesen sein;
für die städtische Gesamtheit wurde die selbständige Führung der
Verwaltung auch in bezug auf das Schriftwesen notwendig, und
ebenso wie aus den Kanzleien der Fürsten wurden die zum Teil noch
lange unentbehrlichen Geistlichen aus den städtischen
Schreibstuben durch schrift- und immer häufiger auch rechtskundige
weltliche Beamte verdrängt. Und natürlich mußten auch die Leiter
der Verwaltung, die Mitglieder des Rats, eine bessere Bildung
haben.
Diese allgemeinere Laienbildung konnte zunächst nur aus den
(äußeren) Schulen der Klöster und Stifter stammen, aber das
wachsende Bedürfnis ließ sehr bald von der Stadt selbst ins Leben
gerufene Schulen entstehen, so eine ganze Anzahl schon im 13.
Jahrhundert, noch mehr im 14. Über ihre Verwaltung erhoben sich
an diesem oder jenem Ort scharfe Streitigkeiten mit der Geistlichkeit,
wobei aber natürlich nicht an innere Gegensätze zur Kirche zu
denken ist. Jedenfalls ging die Aufsicht immer mehr auf die
städtische Obrigkeit über. Allmählich entwickelten sich aus ziemlich
niedrig stehenden Schulen die städtischen Lateinschulen, die im 15.
Jahrhundert schon recht zahlreich waren. Mit dem steigenden
Bildungsbedürfnis besuchten diese auch immer mehr Schüler aus
niedrigen Kreisen, die dann in ihrer Armut oft von Almosen leben, ihr
Brot ersingen mußten und als fahrende Schüler von Schule zu
Schule wanderten, häufig von berühmten Lehrern angezogen. Diese
Schulen waren, so mäßig ihr Unterricht war, für die niederen Klassen
in der Allgemeinheit natürlich zu hoch. Diese bedurften seit dem
Eindringen der Volkssprache in den Schriftverkehr nur eines
deutschen Elementarunterrichts: ihn vermittelten notdürftig private
»deutsche« Schulen, die von Schreibern und Rechenmeistern
gehalten wurden. Aber diese »deutschen« Schulen wurden von der
städtischen Obrigkeit wie von der Geistlichkeit durchaus nicht
begünstigt, und darin zeigt sich bereits ein unvolkstümlicher, mit
einem Bildungshochmut zusammenhängender Zug.
Dieser Zug steigerte sich mit der immer größeren Zahl
Höhergebildeter, die aber ihre Bildung nun nicht nur den mehr
vorbereitenden Lateinschulen, sondern den Universitäten
verdankten. Diese Universitäten waren ganz aus der geistlichen
Bildungsluft hervorgegangen; sie bedeuteten eine Erweiterung des
stiftischen Schulwesens, das den Fortschritten des von arabischen
Einflüssen neu angeregten Geisteslebens seit der Ausbildung der
scholastischen Theologie und Philosophie, einer höherstrebenden
Jurisprudenz und einer erneuerten Medizin nicht mehr zu folgen
vermochte. Aber Lehrer und Schüler blieben geistlich. Natürlich
konnten solche Hochschulen zunächst nur in den höher entwickelten
romanischen Ländern entstehen. Deren Kultur bedurfte in
praktischer Hinsicht immer mehr der Juristen, Ärzte und Lehrer, und
in geistiger Hinsicht war mit der Scholastik ein tieferes
philosophisch-systematisches Wissensbedürfnis entstanden. Die
Deutschen blieben auf die romanischen Universitäten, die
berühmten Rechts- und Ärzteschulen wie die großen theologisch-
philosophischen Lehrstätten, angewiesen. Aber vor allem das
praktische Bedürfnis infolge der Entwicklung der landesherrlichen
Macht wie der städtischen Kultur ließ dann auch in Deutschland
Universitäten erstehen, zuerst 1348 diejenige zu Prag, der dann seit
Ausgang des 14. Jahrhunderts noch vierzehn, zum Teil aus höher
entwickelten Stiftsschulen heraus und durchaus in Anlehnung an das
fremde Vorbild, folgten.
Jener geistliche Charakter der Universität blieb noch lange
gewahrt, wie ihn ja auch noch die ganze höhere Bildung trug. Die
großen Gelehrten des ausgehenden Mittelalters waren Geistliche,
Ordensgeistliche vor allem. Hauptträger der Wissenschaft waren die
Dominikaner, die aber auch Kunst und Dichtung pflegten. Die
Juristen und Ärzte waren zunächst Geistliche, bis allmählich das
Laienelement unter ihnen stärker wurde. Die Zucht in den Kollegien
der Lehrer und den Bursen der Studenten entsprach der der Klöster,
wenn auch das Leben der Bursenbewohner in Wahrheit äußerst wild
war und immer weltlicher wurde. In dem geistig-wissenschaftlichen
Leben selbst war zwar eine größere Spezialisierung eingetreten, und
von gewissen Ansätzen freierer Entwicklung werden wir sogleich
hören. Aber im übrigen herrschte auch jetzt die kirchlich bedingte
Universalität des Mittelalters. Noch war trotz der erwähnten
Erweiterung die Summe des abendländischen Wissens so gering,
daß es der einzelne durch alle Fakultäten hindurch bewältigen
konnte, eben mit Hilfe des formal-logischen Betriebes, der lehrhaften
Zustutzung in maßgebenden Kompendien, der philologischen
Bearbeitung der Stoffe. Dem entsprach ein unkritisches,
dogmatisches Aufnehmen. Letzten Endes war aber alles theologisch
zugespitzt, in der Theologie gipfelte alles. Nur in Gott hat das
irdische Wissen Wert, die Philosophie soll die göttlichen Wahrheiten
beweisen, die Natur ist nur als Niederschlag der großen Taten
Gottes und seiner Weisheit aufzufassen. Höchst bezeichnend ist die
Natursymbolik, zugleich ein Beweis für das Spielerisch-Äußerliche
des mittelalterlichen Denkens. Alle Dinge auf Erden haben ihre
symbolische, zunächst an die Bibel geknüpfte, christlich-moralische
Bedeutung, Tiere, Pflanzen, Steine. Die entsprechenden
Eigenschaften, die man wesentlich mit ihnen verbunden glaubte,
spielten dann in der praktischen Anwendung des Wissens eine
Rolle. Noch immer ist eben mit dem Geistesleben ein übersinnlich
gerichteter Zug innig verknüpft.
Auf der anderen Seite darf man das Geistesleben des
ausgehenden Mittelalters auch nicht unterschätzen. Die
Universitäten sind wie das ganze höhere Geistesleben von der
Scholastik (s. S. 103 f.) beherrscht. Aber diese Philosophie des
Mittelalters trug immerhin schon wissenschaftlichen Charakter,
bedeutete Ausbildung systematischen Denkens und lehrte
Abstraktes fassen. Und wenn schon die Kirche überhaupt der
Wissenschaft in ihrer damaligen Form keineswegs feindlich war,
vielmehr gerade durch ihre Pfründen, obwohl unabsichtlich,
manchem die äußere Möglichkeit gab, ganz den Studien zu leben,
so waren auch die von der Kirche ausgegangenen und behüteten
Universitäten, die ja selbständige privilegierte Körperschaften waren,
schon geordnete Vertretungen der Wissenschaft. Es waren geistige
Gemeinschaften und Verkörperungen geistiger Bestrebungen auch
über das theologische und das weltlich-praktische Bedürfnis hinaus.
In der Scholastik selbst, die überhaupt nichts Starres und
Gleichförmiges ist, entwickelte sich ferner im späteren Mittelalter
eine freiere Richtung, die zu großen Spaltungen führte. In dem
entschiedenen Nominalismus, der in den allgemeinen Begriffen
»Namen« und nur in den Einzeldingen Wirklichkeit sah, der die
Glaubensgeheimnisse nicht mehr für beweisbar hielt, kam man
wenigstens theoretisch zur Unvereinbarkeit von Glauben und
Wissen, also zum Gegenteil des eigentlichen Zieles der Scholastik.
Man arbeitete zum Teil mit einer damals übrigens nicht zuerst
auftauchenden Annahme, die andererseits erst in
nachscholastischer Zeit schärfer formuliert wurde, mit der
»zwiefachen Wahrheit«, der theologischen und der philosophischen.
Aber damit wäre die Theologie nicht mehr, was man doch erstrebte,
philosophisch beweisbar und die Scholastik in ihrem Kern vernichtet
gewesen. In Wirklichkeit blieb überhaupt trotz mancher kritischer
Keckheiten und ernsterer Reibungen das Dogma unangetastet. Man
begnügte sich mit der äußerlichen, dialektischen Betätigung der
Vernunft, mit der formalen Logik, und jenen Gefahren suchte die
spätere Scholastik mit einem um so schrofferen kirchlichen Eifer zu
begegnen.
Gewiß mußte die scholastische Methode schon der Theologie und
Jurisprudenz, noch mehr der Philosophie auf die Dauer wirkliche
Fortschritte unmöglich machen, gewiß war sie, der Gegensatz zu
exakter, empirischer Forschung, vor allem ein Hemmschuh für die
Naturwissenschaften und die Medizin. Aber man muß doch
feststellen, daß es in diesen Jahrhunderten weder an
wissenschaftlicher Beobachtung noch an praktischen Fortschritten
gefehlt hat, worauf ja auch schon die arabischen, die Antike neu
belebenden naturwissenschaftlich-medizinischen und
philosophischen Einflüsse hingeleitet hatten. Mit dem Namen des
Albertus Magnus verbinden sich doch nicht nur Phantasterei und
Aberglaube, vielmehr deutliche Anfänge eigener Beobachtung und
kritischen Unterscheidungsvermögens, mit dem des Roger Bacon
immerhin schon Andeutungen der induktiven Methode. Es hat
sodann, wie Dietrich Schäfer hervorhebt, das Mittelalter die
Erweiterung der Erdkenntnis, »den gewaltigen Aufschwung, mit dem
es abschloß, aus sich herausgenommen, die Alten weit überflügelnd
und ohne nennenswerte antike Beeinflussung«. Ganz zweifellos
erhob sich auch die Heilkunde auf eine höhere Stufe. Von dem aus
der antiken Überlieferung seine medizinische Weisheit schöpfenden
Klostergeistlichen unterschied sich der studierte Arzt, zunächst noch
meist aus geistlichem Stande, freilich insofern wenig, als auch er
sich vor allem auf Buchgelehrsamkeit stützte. Eben deswegen fühlte
er sich über den alten, teils empirischen, teils abergläubischen
volkstümlichen Heilbetrieb, namentlich von Frauen, hoch erhaben,
ebenso über die umherziehenden Quacksalber, aber auch über die
ungelehrten niederen Wundärzte, die gerade in den Städten bald
zahlreich wurden und vor allem dem damals so wichtigen Aderlaß
oblagen: er suchte deren Betrieb auch bald zu beschränken. Aber
andererseits bedeutete der neue Ärztestand doch einen wirklichen
Fortschritt. Zuerst hatten die Höfe fremde studierte Ärzte, häufig und
lange noch Juden, herangezogen, dann förderten allmählich die
Städte die Ausbildung dieses Standes, zumal seit der Entwicklung
von Universitäten in Deutschland. Stadtärzte begegnen schon im 14.
Jahrhundert, damals auch schon Ordnungen und Taxen für sie.
Immer stärker wurde auch das Laienelement unter ihnen.
Das war nun weiter ebenso bei den Juristen der Fall, deren Zahl
immer größer wurde. Fürsten und Städte brauchten sie vor allem für
die Kanzlei, den Mittelpunkt der weltlichen Verwaltung, einst die
Domäne der Geistlichen. Die Stadtschreiber, gewissermaßen die
Kanzler der Städte und im Gegensatz zu den Inhabern der
städtischen Ehrenämter besoldet, die eigentlichen Träger der
Verwaltungsgeschäfte, ergänzten sich andererseits auch bald aus
den »Artisten«, der anfangs mehr propädeutischen Fakultät der
freien Künste, aus der auch die Lehrer der Lateinschulen
hervorgingen. Durch die Beherrschung der Kanzlei hat sich nun früh
eine Verbindung der Juristen mit der Verwaltung, aber auch mit der
Politik ergeben, und dies Moment erklärt auch den immer stärkeren
Zudrang des Adels zum juristischen Studium. Die Wichtigkeit der
Juristen führt auf die neue Bedeutung des Römischen Rechts, das ja
freilich für das kanonische Recht immer die Grundlage gewesen war.
Die Gründe seiner Übernahme, sicherlich vor allem durch die jetzt
starken Kultureinflüsse Italiens (s. S. 149) bewirkt, seien hier nicht
erörtert. Die Begünstigung der Juristen durch die Fürsten schrieb
sich zum Teil wenigstens aus der von ihnen erwarteten
Unterstützung des fürstlichen Machtstrebens, vor allem aber aus
ihrer Brauchbarkeit im neuen Beamtenstaat her. Im übrigen war die
Zeit für ein Berufsrichtertum auch in Deutschland gekommen, und
eine heimische Rechtswissenschaft gab es nicht. Man zog die
Juristen langsam aus dem Rat in das kaiserliche und die fürstlichen
Hofgerichte. Damit nahm die Anwendung des römischen Rechts in
schwierigen Fällen gegenüber dem zersplitterten deutschen Recht
zu. Die Juristen eroberten schließlich die Gerichte überhaupt, und
man »reformierte« die Land- und Stadtrechte im römischen Sinne.
Diese Wandlungen vollzogen sich langsam seit der zweiten Hälfte
des 15. Jahrhunderts. 1495 nahm das Reichskammergericht das
römische Recht an. Aber wenn die Juristen in ihrem
Kulturbewußtsein auf das »rohe, bäurische« Recht der Laien
herabsahen, so hing das Volk an diesem letzten Rest seiner
öffentlichen Betätigung, an dieser Schöpfung seines Geistes und
Wesens noch zäh genug, um nicht über den Wandel in eine tief
erregte Stimmung zu geraten. Der übrigens nicht zu übertreibende
Volkshaß richtet sich freilich weniger gegen die römischen als die
Juristen, die Berufsrichter an sich. Die beklagte Rechtsunsicherheit
wurde zunächst nur noch größer. Die früheren, für die niederen
Schichten besonders empfindlichen Mißbräuche, vor allem die
Käuflichkeit der Richter, schwanden auch jetzt nicht; gerade der des
neuen Rechtes Kundige konnte sein Schäfchen ins Trockene
bringen, ebenso, wer rechtskundig tat, wie der Gerichtsschreiber
oder der Fürsprech, der Advokat.
Aber die Juristen haben für jene Zeit noch eine andere Bedeutung
gehabt, wieder im Sinne der Einbürgerung einer im Grunde
volkstumsfeindlichen höheren Kultur: sie waren die ersten Vermittler
und in Verbindung mit ihrer Kanzleiherrschaft die ersten Förderer der
geistigen Bewegung des Humanismus. Sie, die um ihrer besseren
Ausbildung willen und bei ihrer starken Begehrtheit in immer
größerer Zahl nach Italien zogen, selbst als es schon deutsche
Universitäten gab, wurden hier von der humanistischen Strömung
ergriffen, die besonders auch die oberitalienischen Universitäten
erobert hatte. Es handelt sich zunächst nur um eine mehr äußerliche
literarische Beeinflussung in Richtung des Stils, der formalen Kultur,
nicht um Annäherung an das Wesen der eigentlichen Renaissance.
Diese faßt man neuerdings zutreffend überhaupt nicht einfach als
Neubelebung antiken Geistes auf – wie ja auch schon Burckhardt
neben der Antike als zweiten Faktor den italienischen Volksgeist
hinstellte –, sondern als reifste Frucht der mittelalterlichen Kultur
selbst, als Leistung der christlichen wie der volkstümlichen Kräfte
des Mittelalters. Die stärkere Wendung zur Antike, die ja (vgl. S. 64)
immer ein belebendes Element des Mittelalters gewesen ist, trug die
Keime zu einer neuen, unmittelalterlichen Entwicklung in sich, aber
sie ist doch ein Fortschritt, den das Mittelalter selbst machte. Man
hat z. B. von französischer Seite Frankreich, das alte Land des
»studium«, als eigentlichen Ausgangspunkt der Renaissance
hingestellt, und sicherlich sind auch gewisse Elemente derselben
zuerst dort entwickelt worden. Die stärkere Hinneigung zur Antike
war aber in letzter Linie die Folge der arabischen Befruchtung, und
dieser Zug mußte dann in Italien um so mehr hervortreten, als
überhaupt das Bildungsübergewicht Frankreichs auf das mächtig
seine Kräfte entwickelnde Italien überging, vor allem im 15.
Jahrhundert, und dieses Land überdies durch die Denkmäler der
Antike auf seinem Boden, durch seine Sprache und das niemals
erstorbene römische Recht noch mit der Antike wirklich
zusammenhing. Dieser Zusammenhänge wurde man sich bei dem
vermehrten Studium der Antike stärker bewußt, für deren Geist aber
um so empfänglicher, als die hohe geldwirtschaftliche Entwicklung
Italiens nicht nur die äußeren Lebensverhältnisse, sondern auch
Weltanschauung und Lebensauffassung auf einen Stand brachte,
der sich dem der Antike wenigstens näherte. In der entsprechenden
Gestaltung wirkte das Studium der Antike von Italien aus auf die
übrigen Länder dann wie eine neue Offenbarung, auf Deutschland
freilich, wie gesagt, zunächst nur nach der formalen Seite. Hatte
Italien auf Deutschland schon durch die Folgen der Kaiserpolitik und
die Römerzüge vielfältige Wirkung geübt, machte dann der immer
regere Handelsverkehr nicht nur den deutschen Kaufmann zum
Schüler des italienischen, sondern beeinflußte auch wie der sonstige
Verkehr, z. B. infolge der ausgedehnten Söldnerdienste deutscher
Ritter, die äußere Kultur mehr und mehr, so wurde auf geistigem
Gebiet Italiens Einfluß an Stelle des französischen immer
maßgebender. Der Zug der Studenten ging, wie gesagt, immer
stärker nach Italien, ohne daß aber derjenige nach Frankreich
aufhörte.
So war die Übertragung der humanistischen Strömung, mit deren
italienischen Trägern man zum Teil auch durch den Aufenthalt
einiger derselben in Deutschland selbst bekannt wurde, etwas
durchaus Natürliches. Sie knüpft indes eben vor allem an die in
Italien gebildeten Juristen. Es wurde insbesondere die zum Teil mit
Juristen besetzte Kanzlei zur Pflege- und Vermittlungsstätte der
neuen, wesentlich formalen Richtung. Auch in Italien pflegten ja
gerade in ihr die Humanisten die Eloquenz, den neuen klassischen
Stil. Ein italienischer Humanist, der bekannte Aeneas Sylvius, war
dann auch in Deutschland selbst in der kaiserlichen Kanzlei tätig und
von großem Einfluß auf manchen Deutschen. Die formale Seite hat
aber auch auf jenes geistlich-gelehrte Studium, das in der Theologie
gipfelte, gewirkt. Vielleicht im Zusammenhang mit einer stärkeren
Berücksichtigung der antiken Autoren schon seitens der älteren
Schulwissenschaft ist vor allem in den Niederlanden eine durchaus
religiös gerichtete, aber den klassischen Autoren zugewandte
Bildung erblüht, die auch den deutschen Nordwesten und Westen
beeinflußte und zugleich stark pädagogisch gerichtet war.
Niederländischer und langer italienischer Aufenthalt haben auf den
trefflichen Rudolf Agricola gewirkt, der neben gewissen
abenteuerlichen Wanderaposteln der Mitte des 15. Jahrhunderts,
wie Petrus Luder, zuerst den Humanismus um seiner selbst willen
vertrat und ihm in Heidelberg außerhalb der Universität eine Stätte
gründete. Die Seele des neuen Lebens, das sich dort entfaltete –
daneben wären noch andere südwestliche kleinere weltliche und
geistliche Höfe zu nennen –, war der Kanzler Johannes v. Dalberg,
der spätere Freund Celtes’ und Reuchlins. Wichtig wurde dann vor
allem die seit etwa 1470 beginnende Eroberung einzelner
Universitäten durch die Humanisten, was zunächst nichts weiter
besagte als Fürsorge für den Unterricht in der neuen Eloquenz,
besonders auch im Interesse der Kanzleien. Die Pflege reinen
Lateins erstreckte sich zugleich immer auf die Dichtung – diese war
noch wie früher ein Betätigungsfeld der gelehrten Bildung –,
bedeutete also überhaupt eine neue literarische Richtung.
Aber es handelte sich doch mehr und mehr nicht nur um eine
neue Form, sondern um einen neuen, an der Antike genährten
Geist, der auch das Leben der jüngeren Humanisten »modern«
gestaltete. Mit dem jugendlichen Hochmut einer neuen,
zukunftsfreudigen Richtung, mit stolzer Verachtung des Alten, mit
radikaler Kritik und großen Tiraden ging diese jüngere Schule vor. Es
kam etwa seit 1500 an den Universitäten naturgemäß zu scharfen
Kämpfen, zur Abwehr der Eindringlinge, die im übrigen auch ihre
ernsten Ziele hatten. Es ging doch schon um die Beseitigung des
bisherigen scholastischen Bildungsideals. Insbesondere handelte es
sich jetzt um die Neugestaltung der Artistenfakultäten (s. S. 147).
Um 1520 hatte die neue Strömung, gefördert von Fürsten und
Städten und von der Jugend begrüßt, in der Hauptsache über den
verzopften Scholastizismus gesiegt. Ein beachtenswertes Moment
ist übrigens die Einfügung des Griechischen in den Studienkreis.
Früher als die Universitäten wurden zum Teil die Lateinschulen
humanistisch gefärbt. Im ganzen war es in Deutschland eine
wesentlich gelehrte, dabei stark formale und äußerliche Bewegung,
keine allgemeinere geistige Umwandlung, wenigstens nicht
zunächst. Der freiere naturwissenschaftliche Geist schon des 16.,
dann namentlich des 17. Jahrhunderts, die verstandesmäßige
Aufklärung, die Ideale der Freiheit und Humanität, der schönen
Bildung im 18. Jahrhundert und die politischen Ideale dieses und des
19. Jahrhunderts sind jedoch teilweise Folgeerscheinungen der
Neubelebung der antiken Kultur. Was aber die notwendige
Herbeiführung einer Verweltlichung betrifft, so hat der Humanismus
die in ihm steckenden Keime dazu vorerst nicht entwickeln können.
Er sah wohl das moderne, in der Antike ruhende Ideal des freien
Menschentums, aber es lag ihm zu fern. Er ist im 16. Jahrhundert
zum Diener der Theologie geworden, wie ihn ja auch die Kirche in
seinen Anfängen nicht bekämpft hat. Die Antike hat ferner einen
neuen patriotischen, nationalen Geist in manchem Humanisten
erweckt, wozu auch der Gegensatz zu den hochmütigen
italienischen Leuchten beitrug, aber im Grunde bewahrte der
Humanismus die Internationalität mittelalterlichen Geisteslebens, die
auf das gemeinsame Band der Kirche zurückgeht. Er hat den
Verstand von der äußerlichen Übung seitens der Scholastik auf die
Betrachtung der Menschen und des Lebens gelenkt, und ein Mann
wie Erasmus zeigt auch den höheren Dingen gegenüber
rationalistische Haltung (s. S. 155 f.). Der Humanismus hat auch
einen neuen kritischen Geist entwickelt, der aber zunächst auf die
gelehrte Kritik und die Weckung geschichtlichen Sinnes sich
beschränkte, im übrigen ebenso von anderen Strömungen der Zeit
geweckt war. Er hat die Bildung durch tieferes Eindringen in die
Schätze der Antike stofflich erweitert und die Lebensauffassung und
die Moral, ohne sie auf neue Grundlagen zu stellen, gewandelt und
vertieft. Er hat endlich auch eine individuellere Geisteshaltung
gefördert, aber zum Teil nur infolge seiner bewußten Weltlichkeit und
der Wertschätzung eigener geistiger Kräfte. Wir haben ferner bereits
(S. 74) festgestellt, daß das Mittelalter schon lange vorher solcher
Haltung keineswegs bar ist. Gerade zu Ausgang desselben wirkten
überdies auch andere Strömungen und die Zeitverhältnisse in der
bezeichneten Richtung[11]. Zu einem schrankenlosen Individualismus
nach italienischem Muster sind im übrigen unter den Humanisten
selbst nur wenige radikale Köpfe gekommen. Aber unterschätzen
darf man die Wirkungen des Humanismus auch nicht. Die
Persönlichkeit zum Ausdruck zu bringen, ist sein Bestreben, sei es
auch nur durch die äußeren Mittel der Eloquenz. Der Stolz auf die
feine Bildung hat zugleich etwas Aristokratisches. Er wird aber
später zu jenem volkstumsfeindlichen Bildungshochmut. Durch
Latinisierung und Gräzisierung der Namen fällt man ganz aus dem
Volkstum heraus. Es erfolgt eine Neubelebung der lateinischen
Schriftsprache, ein neues Zeitalter des lateinischen Briefes setzt ein,
der den deutschen freilich nicht mehr verdrängen konnte.
Das feinere Schönheitsideal, das die Humanisten literarisch-
stilistisch pflegten, drang gegen den volkstümlichen Geist, der auch
diese neuen Kulturmenschen zum Teil noch unter die derbe Volksart
beugte, erst langsam durch: noch langsamer erobert dieses antik-
südliche Formempfinden die noch durchaus volkstümliche Kunst, der
dann freilich schließlich das Rückgrat gebrochen wurde. Das gehört
nicht mehr in die Geschichte des Mittelalters. Niemals aber wurde
diese künstlerische Renaissance von unserem Volk wirklich innerlich
erfaßt. Sie entsprach dem äußerlichen Prunk, den die reichen
Kaufherren und dann die wiederum zu kulturellen Mittelpunkten sich
aufschwingenden Höfe entfalteten. Auch dieser neue Fürstenstaat,
den das ausgehende Mittelalter entstehen sah, gehört in seiner
ausgebildeten, unvolkstümlichen Art nicht mehr in das Mittelalter und
ebensowenig die völlige Herabdrückung des Standes, der der älteste
Born des Volkstums war, des Bauern, der ja allerdings in der
höfischen Zeit schon der Gegenstand des ritterlichen Spottes
gewesen und zu Ausgang des Mittelalters ein solcher für den auf
seine Zivilisation stolzen Städter geworden war. Aber zu Ende des
Mittelalters war er trotz allen Druckes noch kraftvoll genug wie das
niedere Volk überhaupt. Aus solchen Kreisen stammte Luther.
Die bestimmende Macht des Mittelalters war die abendländische
Kirche. Mit der Erschütterung dieser überragenden Macht geht das
Mittelalter zu Ende. Hat die Reformation diese entscheidende
Bedeutung gehabt? Insofern sie die Universalität dieser Kirche, ein
wesentliches Moment ihrer Herrschaft, zerstörte, gewiß. Diese
Universalität war schon durch die nationalstaatliche
Machtentwicklung im Westen und Norden Europas gefährdet, und
die aufsteigende Entwicklung der deutschen Landesherren hatte
auch bereits gewisse Selbständigkeitsbestrebungen in kirchlicher
Hinsicht gezeitigt. Es war kein Zufall, daß die Reformation mit den
Landesherren paktierte. Deren Macht verlieh der großen Spaltung
Dauer und Festigkeit. Der kräftigere Staat hat dann auch in der
Richtung das eigentlich mittelalterliche, d. h. kirchliche Zeitalter zu
Grabe zu tragen geholfen, als er, wie schon die Städte, die Macht,
die die Kirche über das gesamte Leben ausübte, ihre weltlich-
politisch-kulturelle Wirksamkeit mehr und mehr beschränkte. Das
ausgehende Mittelalter war überhaupt auf dem Wege zu einer
Säkularisation des Lebens. Aber die Reformation ist in Wahrheit
doch der Hemmschuh der weiteren Säkularisation gewesen, und das
Mittelalter ist mit ihr im Grunde nicht zu Ende gegangen. Trotz der
kirchlichen Herrschaft hatte es ja ein volkstümliches weltliches
Leben immer gegeben. Aber die bäuerlich-kriegerische Laienkultur
des frühen Mittelalters zunächst war doch in allen höheren
Beziehungen von der Kirche geleitet. Ein erstes Freimachen
bedeutete dann die ästhetisch-gesellschaftliche Kultur des
Rittertums. Wichtiger wurde die breitere Laienkultur des auf
wirtschaftliche Interessen gegründeten Bürgertums mit der
Durchsetzung des modernen Elements der Geldwirtschaft und der
Zerstörung des Lehnswesens, der bisherigen sozialen
Hauptgrundlage. Besonders durch den Handel und Verkehr war
auch das Gebiet der weltlichen Interessen immer vielseitiger
geworden. Zu dem Krieger und dem Bauern hatten sich der
Handwerker und vor allem der Kaufmann mit seinem durchaus
weltlichen Gesichtskreis gesellt. Mehr noch als die Städte, die neuen
Mittelpunkte einer allseitigen Kulturpflege, war dann der territoriale
Staat infolge der durchgreifenderen Zusammenfassung äußerer
Kräfte im Gegensatz zu dem längst verfallenen feudalen
Gesamtstaat fähig, Träger höheren weltlichen Kulturlebens zu sein.
Bereits hatten sich auch die Anfänge eines neuen weltlichen
Beamtenstandes entwickelt, der höhere Kräfte aus Adel und
Bürgertum zu nicht von der Kirche bestimmten Aufgaben heranzog.
Stadt- und Staatsverwaltung weckten ein Gefühl der
Verantwortlichkeit ohne kirchlichen Hintergrund; ein neuer
Gesichtspunkt war das allgemeine Wohl um seiner selbst willen. In
der Lebensauffassung hatte sich in der ritterlichen wie in der
bürgerlichen Kultur ein von der letzteren vergröbertes Ideal des
Weltgenusses dem kirchlich-asketischen Ideal nachdrücklich
entgegengestellt.
Auch die Kunst löste sich aus ihrer kirchlichen Bindung. Schon im
aristokratischen Kulturzeitalter war sie mehr und mehr in den Dienst
des Luxus der Herren getreten, und derjenige der reichen Städter
erweiterte noch diese weltlichen Aufgaben. Es wurde überhaupt die
städtische Entwicklung der Geldwirtschaft und der immer
ausgebildeteren technischen und gewerblichen Arbeit folgenreich,
insbesondere für die führende Baukunst. Schon in der romanischen
Zeit war die Bedeutung der Laien stärker geworden, je mehr die
technischen Ansprüche stiegen. Noch entscheidender war der
Laienanteil bei der Gotik. Die reiche Ausarbeitung der Bauten zeigt
die stärkere Rolle der Technik. Dehio weist treffend darauf hin, daß
dieser Stil dreimal weniger Material, aber zehnmal mehr Arbeit
verlangt als der romanische. Die meist namenlosen Meister der
gotischen Bauten sind auf dem Boden internationaler technischer
Überlieferung erwachsen, auf dem Boden vor allem des
fortgeschrittenen städtischen Handwerks. Auf diesem Boden
erwuchsen auch die großen Maler und Bildhauer des ausgehenden
Mittelalters. Die Künstler waren durchaus Handwerker, daher die
Volkstümlichkeit ihrer Kunstübung, daher freilich auch eine gewisse
Bürgerlichkeit und Schulmäßigkeit, über die hinaus nur einzelne zu
höherer Freiheit, zu idealerem Schwung gelangten. Das bürgerliche
Leben selbst erweitert im übrigen die Aufgaben der Kunst,
insbesondere der Malerei (Porträtmalerei u. a.). – Noch wichtiger
wurde die geistige Entwicklung. Seit dem 12. und 13. Jahrhundert
war die Laienbildung in immer weitere Kreise gedrungen. Es war
freilich nur die geistlich bestimmte Bildung, aber das
Bildungsmonopol der Geistlichen war gefallen, die Schranken
zwischen Geistlichen und Laien waren niedergebrochen. Mehr und
mehr kamen in diese Bildung dann rein weltliche Bestandteile,
denen sich der Klerus selbst nicht versagte; vor allem beobachteten
wir die neue Bedeutung des Römischen Rechts. Die für das ganze
Mittelalter so wichtige Antike gewinnt überhaupt über die kirchliche
Zurechtstutzung hinaus Geltung, und an ihre Weltlichkeit knüpfen
sich zunächst durch den Humanismus trotz seines formalistischen
Charakters wenigstens die Ansätze zu einem neuen, freien, zum Teil
kaum noch an das Christentum gebundenen geistigen Lebensinhalt
(s. S. 151). Der geistige Aufschwung der Laien im Zusammenhang
mit den fortgeschritteneren Erfordernissen des Lebens äußert sich
weiter in den Anfängen eines weltlichen Gelehrtenstandes mit
besonderen Berufszielen.
Und endlich hatte das Laientum auch auf das religiöse Gebiet
selbst hinübergegriffen. Daß die religiöse Wahrheit nur in den Lehren
der Kirche beschlossen sei, war die charakteristische Auffassung
des Mittelalters. Dagegen hatten sich immer neue Sektenbildungen
und Ketzerbewegungen ständig erhoben: aber die Kirche blieb
siegreich, zumal sie seit der stärkeren Zunahme solcher
Bewegungen (s. S. 129) zu den scharfen Abwehrmaßregeln der
Inquisition und der Ketzergerichte gegriffen hatte. Die allgemeine
Opposition des ausgehenden Mittelalters gegen die Mißstände
innerhalb der Kirche, vor allem gegen das geldliche
Aussaugungssystem der Kurie hatte mit einer Abwendung von der
Kirche selbst, die ja viel zu sehr mit dem ganzen Leben verknüpft
war, nichts zu tun. Der gewaltige Haß gegen die Pfaffen und ihre
Sittenlosigkeit namentlich ist eine rein soziale Erscheinung und hat
seinen Grund in der seit langem beklagten und von den kirchlichen
Reformern selbst immer wieder bekämpften Verweltlichung der
Kirche, die wieder mit dem neuen weltlich-politisch-juristischen
System der Papstkirche und dem gewaltigen Besitz der Kirche
zusammenhängt. Die Streitigkeiten der Städte mit den kirchlichen
Behörden sind nur die Folge des Ernstes der städtischen
Verwaltung, des Aufsichts- und Regelungsrechts der Städte wie des
Grundsatzes der gleichen bürgerlichen Rechte und Pflichten:
deshalb suchten die Städte das Schulwesen, die Armen- und
Krankenfürsorge in die Hand zu bekommen, deshalb bekämpften sie
den gerichtlichen Sonderstand der Geistlichen und ihre Ansprüche
auf Freiheit von Abgaben und Ungeld. Sonst aber herrschte gerade
in den Städten eine übertriebene äußere Kirchlichkeit (s. S. 129 f.).
Selbst bei den Vertretern der neuen geistigen Bewegung, den
Humanisten, ist von wirklicher Kirchenfeindlichkeit trotz allen Spottes
über den faulen und dummen Klerus nicht die Rede, höchstens bei
den späteren von einem religiösen Indifferentismus. Ansätze zu
einem gewissen Heidentum sind freilich, wie gesagt, ebenso wie die
Anfänge verstandesmäßiger Aufklärung bei ihnen vorhanden. Aber
Ketzer wollten sie nicht sein und ja nicht mit der religiös aufgeregten
Masse gehen. Mit Luthers erstem Auftreten gegen den Papst waren
sie einverstanden wie alle Welt, vor allem auch mit seiner Wendung
gegen die Klöster und die Askese. Bald aber wurden sie in der
Mehrheit Gegner der Bewegung: Luther dachte ja vielfach unfreier,
kirchlicher als die damaligen Päpste. Auf Befreiung von einem
geistigen Bann zielte er durchaus nicht hin, sie selbst freilich auch
kaum.
Luther wieder knüpfte an den Humanismus nur in Verwertung der
neuen philologischen Kritik und Sprachkenntnis wie in dem
Zurückgehen auf die Quellen an. Sein Ziel war neben der allgemein
geforderten Beseitigung der Verdorbenheit und der äußeren
Mißstände der Kirche ihre innere Besserung, weil er ein Herz für die
Kirche hatte. War er in jener Beziehung der gewaltige Stimmführer
des allgemeinen Hasses gegen die römische Kurie, sah die gärende
sozial-religiöse Massenbewegung der Zeit in ihm den ersehnten
Führer, so war er auch als Reformer nur der Vollender längst
vorhandener Strömungen. Abgesehen von dem allgemeinen
geistigen Unbehagen und der beginnenden Skepsis der Gebildeten,
herrschte doch auch im Gegensatz zu den abergläubischen
Aufregungen und Stimmungen der Masse, aber in einem gewissen
Zusammenhang mit dem beobachteten tieferen religiösen Bedürfnis
derselben besonders in Deutschland ein verständiger systematisch-
reformerischer Geist auch innerhalb der geistlichen Kreise, vor allem
bei den Gelehrten der Universitäten. Er richtete sich, nicht ohne den
Einfluß nationaler Abneigung, namentlich auch gegen die Kurie und
bekundete sich in einer starken reformerischen Literatur ebenso wie
in den großen Reformkonzilien des 15. Jahrhunderts. Selbst in der
Kritik der Lehre gefielen sich später einzelne Gelehrte, vor allem
manche der Kurie deshalb verdächtige Humanisten. In dieser
Beziehung hatten radikalere Geister aber längst tiefer gegriffen,
Wicliff und vor allem Hus, der völlig mit der römischen Kirche brach.
Und eben an die Wurzeln des Systems griff nun auch Luther: er
mußte zum Abfall kommen. Aber weiter war Luther außer von jenem
allgemeinen religiösen Drang von der echt deutschen, innerlichen
religiösen Stimmung ergriffen, die bereits die Mystiker im Gegensatz
zur äußeren Kirche gepflegt hatten. Die innerliche Versenkung in
Gott unmittelbar, das unmittelbare Verhältnis des Individuums zu

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RNA Imaging Methods and Protocols 1st Edition Zdravka

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Cancer Systems Biology Methods and Protocols 1st

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Methods and Protocols

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Library of Congress Control Number: 2018933038

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Osaka, Japan Masaru Ishii

1 Bone Imaging: Osteoclast and Osteoblast Dynamics������������������������������������������� 1

15 Imaging Window Device for Subcutaneous Implantation Tumor������������������������ 153

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Naoto Kawakami • Institute of Clinical Neuroimmunology, University Hospital and

Bone Imaging: Osteoclast and Osteoblast Dynamics

Bone is a dynamic tissue that undergoes continuous remodeling by

In this chapter, we describe a methodology for visualizing the

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2.3 Intravital 1. Custom-made stereotactic stage (Fig. 1) (see Note 6).

Fig. 1 Schematic illustration of calvaria bone imaging. The mouse is anesthetized

2.4 Preparation 1. pH-sensing chemical fluorescent probe (Fig. 2) [10].

2.5 Staining of Blood 1. Angiographic agent: Qtracker 655.

3.1 Administration 1. Dissolve 5 mg/kg of pH-sensing chemical probe (pHocas-3)

3.3 Image 1. Obtain the SHG, autofluorescence, pHocas-3, ECFP, and

1. There are two types of microscope: upright and inverted. Bone

Fig. 3 Visualization of the bone-resorptive function of mature osteoclasts using a

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Yookyung Jung and Joel A. Spencer contributed equally to this work.

to impact the migration and differentiation of hematopoietic stem

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