INDUSTRIJSKI ENZIMSKI

PROCESI (3+3)

Predmetni nastavnik dr Zorica Kneevi
Asistent: mr Dejan Bezbradica

Literatura:
1. T. Godfrey& S.West, Industrial Enzimology,
Macmillan Press LTD, 1996.
2. Z. Kneevi, interni materijal

Preiavanje i izolovanje enzima
Za industrijske i laboratorijske svrhe, kao i u sluaju primene
enzima u analitici, dijagnostici i medicini neophodno je enzime
izdvojiti od ostalih sastojaka i dobiti ih u to je mogue vie istom
stanju.
Postoji jako veliki broj metoda preiavanja i u nekim sluajevima
uspeno preiavanje zahteva primenu nekoliko metoda istovremeno
Pre nego to se pristupi preiavanju enzima, treba razmotriti
mnogo pitanja. Krajni cilj preiavanja ima odluujuu ulogu u
razvoju eme preiavanja.
Nepotrebno preiavanje se izbegava jer svaki novi korak
preiavanja zahteva sloenu opremu, dodatne trokove, radnu snagu i
prouzrokuje novi rizik gubitka enzimske aktivnosti.
Uopteno, prinos se smanjuje za 25% sa svakim kritinim korakom
preiavanja

Preiavanje i izolovanje enzima
Tana ema preiavanja zavisi od velikog broja faktora kao to su:
Taan izvor i lokacija enzima
Koncentracija produkovanog enzima
Fiziko-hemijska svojstva enzima
Cilj preiavanja
Od porekla izvora enzima zavisi koncentracija i tip kontaminanata u
polaznom materijalu
U zavisnosti da li je proizvedeni enzim ekstracelularan ili
intracelularan, razlikovae se poetni postupci preiavanja. Isto tako,
ukoliko je proizvedeni enzim intracelularan, nain razaranja elije
zavisie od njenog porekla.
U sluaju male produktivnosti, koncentracija enzima je toliko mala da
je potrebno ekstrahovati veliku koliinu izvora, to kasnije zahteva
znaajno koncentrisanje pre hromatografskog preiavanja.
Fiziko-hemijska svojstva enzima znaajno utiu na proces
preiavanja i u velikoj meri ga odreuju.
Dobijanje i preiavanje enzima
Uticaj broja koraka preiavanja na prinos i cenu enzima. Realna
pretpostavka je da pri svakom koraku stepen preiavanja je tri puta,
prinos enzima je 75% i da se cena poveava za 10%.

Veoma je vano da enzim zadri poetnu aktivnost u toku postupka
preiavanja
Inaktivacija enzima moe biti prouzrokovana:
Toplotom
Oksidacijom
Ekstremnim pH vrednostima
Denaturantima i inhibitorima
Dejstvom proteaza
Gubitkom kofaktora
Izolacija enzima iz tene ili vrste
podloge
Prvi stadijum izolacije enzima razlikuje se u zavisnosti od tehnike
kultivacije proizvodnog mikroorganizma i proizvodnje enzima
Ako se enzim proizvodi na vrstim podlogama, kultura se moe
usitniti i osuiti na 10-12% vlage. Takva kultura se moe lake
transportovati i uvati due vremena bez znatnijeg gubitka aktivnosti
Suenje do oko 38-55% ve u ureajima za biosintezu enzima
Usitnjavanje kulture u cilju njenog breg daljeg suenja i bolje
ekstrakcije enzima u raznim DROBILICAMA,
GRANULATORIMA i DEZINTEGRATORIMA
Suenje u specijalnim sunicama pomou zagrejanog vazduha
do oko 10-12% vlage
Ekstrakcija enzima iz vlane ili suve kulture ime se uklanja 70-
75% balastnih supstanci
ema preiavanja enzima
Ekstracelularni ili intracelularni enzimi
Ukoliko je enzim ekstracelularan to ima niz prednosti:
Nije potrebno da se razara elija
Termostabilniji su i esto se produkuju u veim koliinama
Poreba za preiavanjem je jako mala
Nedostatak u sluaju produkcije ekstracelularnih enzima: procesi
koncentrisanja su esto potrebni u sluaju produkcije ekstracelularnih
enzima.
Nedostaci kod dobijanja intracelularnih enzima su:
Neminovnost naruavanja elijske strukture
Kontaminacija sa drugim intracelularnim enzimima
Gubitak proteina
Prednost kod dobijanja intracelularnih enzima: radi se sa mnogo
manjim poetnim zapreminama
Veoma je vano znati lokaciju enzima unutar elije.
Opta ema izolovanja i preiavanja intra-, ekstra-
celularnih, i periplazmatinih enzima
Postupci preiavanja intracelularnih
enzima
DEZINTEGRACIJA MIKROBNIH
ELIJA
NEMEHANIKI
MEHANIKI
Smicanje u
vrstom stanju
Smicanje u
tenosti
Liza elije Desikacija
Enzimska
Hemijska
Fizika (osmotski ok, uzastopno
zamrzavanje i odmrzavanje i drugi)
Presa
Kuglini
mlinovi
Ultrazvuk
Visoko-pritisni
homoge-
nziator
Postupci preiavanja intracelularnih
enzima
Da bi se izdvojili intracelularni proteini, struktura elije mora biti
naruena. Postoji nekoliko metoda za naruavanje elija i to mogu biti:
Koliina energije koja je potrebna za razaranje elije i oslobaanje
unutarelijskog sadraja zavisi od tipa organizma i u izvesnoj meri od
fiziologije organizma, lokacije enzima unutar elije, uslova kultivacije
MO itd. Neki tipovi elija se razaraju ve pod dejstvom povienog
osmotskog pritiska, dok su neke veoma otporne na razaranje.
Brzina oslobaanja proteina u sluaju mehanikog razaranja elijske
membrane proporcionalna je koliini rastvornih proteina. Napisati
formule i objasniti znaenje.
Metod razaranja elije treba da bude takav da ne dovede do
inaktivacije enzima.

Toplota
U toku skoro svih mehanikih tretmana oslobaa se
toplota koja se mora uklanjati. Prisustvo supstrata ili
poliola moe stabilizovati enzim
Sile smicanja Mogu inaktivirati enzim naroito u prisustvu jona
tekih metala i granine povrine

Proteaze
Dejstvo se smanjuje ako se povea brzina procesa
preiavanja sa to je vie mogue hlaenja. Isti
efekat se postie dodatkom analognih supstrata
(jeftinih proteina) ili inhibitora u ekstrakcioni medijum
pH Potrebno je koristiti puferisane rastvore. Isto, dodatak
analognih supstrata, poliola...

Hemikalije
tetno dejstvo deterdenata ili rastvaraa. Isto,
polifenoli iz biljnih materijala inhibiraju enzim. Problem
se prevazilazi dodatkom adsorbenasa-
polivinilpirolidona i upotrebom askorbinske kiseline da
smanji dejstvo polifenoloksidaze.
Joni tekih
metala
Enzim se moe zatititi od ireverzibilne inhibicije
upotrebom helatnih agenasa, EDTA
Mogui uzroci inaktivacije enzima
Ultrazvuni dezintegrator
Usitnjavanje biolokog materijala i dobijanje suspenzije delova elije
u vodi ili puferu moe da se vri pod dejstvom ultrazvuka u
ULTRAZVUNOM DEZINTEGRATORU. Naime, ukoliko se elije
mikroorganizama izloe dejstvu ultrazvuka pri frekfenci veoj od 18
kHz, doi e do njenog razaranja i oslobaanja unutarelijskog
sadraja.
Ovaj postupak se puno koristi u svetu naroito u sluaju razaranja
biomase MO. Koliina enzima koja se oslobaa sonikacijom moe se
odrediti na osnovu jednaine (1). Konstanta k ne zavisi od
koncentracije elija i priblino je proporcionalna jaini ultrazvuka u
dosta irokom intervalu.
Ovim postupkom se moe razoriti 1-500 g elija i postupak nije
ekonomian za razaranje vee koliine elija od 500 g. elije treba
suspendovati u 2-3 ml pufera/g teine za sonifikaciju i ne treba da se
sonificira vie od 300 ml istovremeno.
Nekada treba hladiti homogenizat.
Nekada se uvodi vazduh to poveava mogunost inaktivacije enzima
Za E. Coli potrebno je 3-15 min za potpuno razaranje elije 300 ml
homogenata sonifikacijom
Metoda jo uvek nije nala veliku primenu za proizvodnju enzima u
velikim razmerama. Osnovni razlozi su inaktivacija velikog broja
enzima usled uticaja ultrazvuka, kao i slobodnih radikala koji mogu da
nastanu. Bez obzira, sonikacija ostaje popularna, korisna i veoma
podesna metoda za razaranje elija u malim razmerama.
Tehnika razaranja elije primenom
visokog pritiska
Struktura elije se moe razoriti i pritiskom
Osnovni faktori koji deluju su primenjeni pritisak i kao posledica pad
pritiska kroz ventil.
Brzina oslobaanja proteina moe se opisati jednainom (1) pri emu
se promenljiva vreme moe zameniti brojem prolaza kroz ureaj pod
visokim pritiskom (N)

Presek ureaja (Manton-Gaulin APV tip
homogenizatora)

Presek Manton-Gaulin homogenizatora pri emu se vidi protok
materijala. Suspenzija elija se pumpa kroz ventil u cilindar pumpe
(150 MPa) i elije pod pritiskom pucaju pri prolazu kroz sitne otvore.
Ventil
Suspenzija elija
Razorene elije
Leite ventila
Udarni prsten
Presek ureaja (Manton-Gaulin APV tip
homogenizatora)

U sluaju primene najveeg broja ureaja koji rade pri pritiscima
manjim od 75 MPa, konstanta k je eksponencijalna funkcija primenjenog
pritiska pri emu eksponent zavisi od tipa MO, npr. u sluaju
Saccharomyces cerevisiae
Druga konstanta k

zavisi od temperature i razaranje je vee na viim

temperaturama. U toku ovog postupka temperatura homogenizata moe
da se povea i do 18-20
0
C.
Uslovi zavise od tipa mikroorganizama, lokacije enzima. G
-
organizmi
su osetljiviji na dejstvo pritiska od G
+
. E. Coli se brzo razori u toku
jednog prolaza dok vrste Bacillus zahtevaju 3-4 prolaza. Kvasci se tee
razaraju. Isto tako, vana je lokacija enzima unutar elije.
Vie prolaza treba izbegavati jer se smanjuje produktivnost, s jedne
strane, i dolazi do stvaranja finih estica elijskih ostataka, sa druge, to
oteava kasniju separaciju proizvoda.
Ova metoda je podesna za razaranje jednoelijkih organizama i kada
enzimi nisu termolabilni. Neki autori su objavili da ovaj proces nije
podesan za filamentozne organizme.
Usitnjavanje elijskog materijala uz dodatak
stakla ili kvarcnog peska
Usitnjavanje elijskog materijala i dezintegracija elije moe da se
vri meanjem u prisustvu malih estica stakla ili kvarcnog peska (0,2-
1,0 mm) u specijalnim ureajima-mlinovima.
Postupak se sastoji u tome da se dobro isprana biomasa bakterija,
micelija, plesnih gljivica ili biljna i ivotinjska tkiva suspenduju u
puferu i tretiraju mlevenju sa esticama koje su izgraene od razliitih
materijala uz intezivno meanje.
Brzina i efikasnost oslobaanja proteina zavise od BRZINE
MEANJA, VELIINE I KOLIINE ESTICA, DIMENZIJA
UREAJA, TIPA I KONCENTRACIJE ELIJE i od
TEMPERATURE
estice prenika 1mm su dovoljne da se oslobode enzimi rastvorni u
citoplazmi kvasca, dok je potrebno tretiranje esticama manjim od 0.25
mm u toku dueg vremena da bi se oslobodili neki enzimi koji su
vezani za membrane kod bakterija
Usitnjavanje elijskog materijala uz
dodatak stakla ili kvarcnog peska
Ukoliko se koristi ista zapremina estica, vei efekat se postie
primenom veeg broja manjih estica nego obrnuto zbog vee
frekfence sudara estica i elija
Primena vee koliine estica poveava efikasnost dezintegracije ali
ujedno se poveava koliina osloboene toplote i vea je potronja
energije za meanje.
Poveanje brzine meanja ima pozitivan uticaj sve dok se ne
oslobode znaajne koliine toplote koja moe inaktivirati enzim
Kinetika oslobaanja enzima data je sledeom jednainom:
| |
i
ik
P P
P
r m
m
t +
=
|
|
.
|

\
|

1 ln
ln
Problem adsorpcija enzima na staklu to se moe minimizirati
primenom rastvora vee jonske jaine za ekstrakciju.
Usitnjavanje elijskog materijala uz
dodatak stakla ili kvarcnog peska
Ovi ureaji su dostupni u razliitim veliinama i konfiguracijama od
Mickle-ovog ejkera ija je maksimalna zapremina 40 ml, pa do
opreme za kontinualne procese u kojima se moe dezintegrisati 200 kg
vlane mase kvasca ili 20 kg vlane mase bakterija. Ureaji koji su
najvie korieni su Dyno-Mill i Netsch-Molinex agitator.
Dobijena kaa naziva se HOMOGENAT. U ovoj masi nalaze se i
jedra elija, hloroplasti biljaka i druge protoplazmatine strukture
(mitohondrije, mikrosomi, lizosomi i dr.), pigmenti, razliite
rastvorljive belanevine itd.
Metode smicanja u vrstom stanju
Hugove (Hughes) i X prese. Ovi postupci se zasnivaju na ekstruziji
smrznute paste elija pod visokim pritiskom (150-230 MPa) kroz uske
otvore. Do razaranja elije dolazi usled promene faza i zapremine, kao
i smicanja pod dejstvom kristala.
Hugove prese rade diskontinualno i koriste se samo u malim
razmerama. Takozvane X prese mogu da se korste semikontinualno i u
veim razmerama, meutim, iako su podesne za razaranje elija veeg
broja mikroorganizama i termolabilnih enzima, ova metoda se jo
uvek ne koristi u veim razmerama.
Dezintegracija elije primenom nemehanikih metoda moe da ima
odreenih prednosti jer su uslovi dezintegracije blagi (enzimi nisu
izloeni silama smicanja i zagrevanju) i ove metode mogu da budu
veoma jeftine
Primena ostalih metoda
U ove nemehanike metode spadaju:
Osmotski ok Naizmenino smrzavanje i odmrzavanje
Enzimska liza Hemijska liza (deterdenti, antibiotici,
rastvarai, alkalije, haotropni agensi)
Desikacija
Dezintegracija elija pod uticajem povienog osmotskog pritiska je
jeftina, blaga i konvencionalna metoda za dobijanje velikog broja
intracelularnih enzima.
Autoliza elije je spor proces u odnosu na mehanike metode, tako
da moe da doe do mikrobioloke kontaminacije u toku procesa, ali to
nije prepreka da se ona koristi i u industrijskim razmerama. Kvaeva
INVERTAZA se industrijski proizvodi na ovaj nain. Problem: spor
proces, rizik od kontaminacija
Hemijska liza Primena samih deterdenata, ili uz dodatak haotropnih
agenasa, moe da bude veoma efikasan postupak za rastvaranje
elijske membrane. Pri tome, jonski deterdenti kao to je
natrijumlaurilsulfat su efikasniji od nejonskih. Njihova primena kao i
primena ostalih hemikalija kao to su organski rastvarai ili alkalije je
ograniena zbog inaktivacije enzima i njhovo prisustvo je nepoeljno u
finalnom proizvodu jer oteava kasnije postupke preiavanja enzima.
U postupku izolacije holesteroloksidaza koristi se Triton X-100 za
razaranje elija Nocardia u industrijskim razmerama (enzim vezan za
membranu) .
Desikacija (suenje smrzavanjem) moe takoe da se koristi za
dobijanje nekih enzima u industrijskim razmerama. U tom sluaju,
brzina suenja je jedan od najvanijih faktora procesa. Sporo suenje
ima prednost u odnosu na brza suenja, kao to je liofilizacija.
ENZIMSKA LIZA se puno koristi na laboratorijskom nivou i retko
na industrijskom. LIZOZIM je jedini litiki enzim koji se komercijalno
proizvodi i slui za lizu G
+
bakterija. Problem: cena i nepostojanje
komercijalnih litikih enzima na svetskom tritu.
Uklanjanje nukleinskih kiselina
Visok sadraj nukleinskih kiselina moe znatno poveati viskoznost
rastvora, to moe da predstavlja problem pri centrifugiranju, filtraciji,
ultrafiltraciji i drugim separacionim procesima, naroito ako se oni
izvode u industrijskim uslovima.
Uklanjanje nukleinskih kiselina nije obavezan postupak
preiavanja, ve se primenjuje samo kada je viskoznost
homogenizata znaajno poveana i kad dobijeni proizvod ne sme da
sadri nukleinske kiseline ni u tragovima.
Nukleinske kiseline se efikasno uklanjaju taloenjem pri emu se
koriste sledea talona sredstva:
(NH
4
)
2
SO
4
(moe da taloi i enzime)

Katjonski polimeri polietilenimin (ne moe se koristiti za
proizvodnju terapeutskih enzima)
cetiltrimetilamonijum-bromid (CMAB), streptomicin-sulfat, i
protamin-sulfat. Njihova primena je ograniena jer su dosta skupi,
toksini, a u nekim sluajevima mogu da grade komplekse sa samim
enzimima
Nukleaze. Ovaj postupak nije skup, efikasan je i, za razliku od
hemijskih taloga, prisustvo nukleaza u talogu nije tetno i ne oteava
dalju proizvodnju enzima.
(CH
2
-CH
2
-NH)
Separacija mikrobne biomase i elijskih
ostataka
Mirobna biomasa kao i ostaci elije se izdvajaju iz fermentacionog
medijuma iili iz homogenizata elije filtracijom, centrifugovanjem ili
primenom dvofaznih sistema. Izbor separacione metode zavisi od
vrste MO (veliine njegovih elija), sastava hranljive podloge i
prisustva suspendovanih estica.
U sluaju malih elija (bakterija) i male relativne gustine (oko 1.03),
fermentaciona tenost se prethodno priprema zagrevanjem ili
dodavanjem sredstva za flokulaciju. Ovaj problem je manje izraen u
sluaju kvaeve i fungalne biomase.
Fizike osobine fermentacione tenosti oteavaju filtraciju zbog pH,
morfoloki oblik i veliina MO, viskozitet, nenjutnovsko ponaanje itd.
Filtracija kroz filtracionu pogau i unakrsna filtracija
Unakrsna filtracija je efikasnija i postiu se brzine filtracije 100 do
1000 puta vee nego pri klasinoj filtraciji kroz filtracionu pogau
Separacija mikrobne biomase i elijskih
ostataka
Specijalni sluajevi unakrsne filtracije su mikrofiltracija i
ultrafiltracija. Postrojenja rade na istom principu, razlika je samo u
veliini pora membrane. Mikrofiltracijom se izdvajaju estice > 50 nm
(bakterije, kvasci, plesni, elije tkiva), dok membrane ultrafiltera imaju
fine pore (20 nm) pa se na njima zadravaju enzimi, proteini i drugi
makromolekuli.
Membrane se proizvode u nekoliko razliitih oblika:
Ravne membrane
Membrana u obliku vlakana
Cilindrina membrana
Separacija mikrobne biomase i elijskih
ostataka
Mikrobna biomasa izdaja se iz fermentacione tenosti
centrifugovanjem kad je filtracija spora i kad ne obezbeuje
zadovoljavajuu separaciju, a pomono sredstvo se ne moe koristiti.
Mana: visoka cena.
Brzina taloenja elija zavisi od prenika estica, razlike u gustini
biomase i fermentacione tenosti, ugaone brzine doboa centrifuge
itd.
Lizat elije se moe podvrgnuti frakcionom centrifugovanju,
odnosno centrifugovanju pri razliitim brzinama koje se postepeno
poveavaju. Tako centrifugovanje moe da pone sa brzinom koja
odgovara radijalnom ubrzanju od 1500 G odnosno 1500 x vee od
ubrzanja zemljine tee (u talog padaju hloroplasti). Posle izdvajanja
struktura, akumuliranih na dnu kivete, centrifugovanje se vri na
15000 G (u talog padaju mitohondrije u kojima su locirani oksido-
redukcioni enzimi), a zatim sa 30000 x G (subcelularne strukture
nukleusa, elijske membrane, endoplazmatini retikulum) itd.

Raspodela u dvofaznim sistemima
Ova tehnika moe da poslui za razdvajanje celih elija ili elijskih
ostataka od rastvornog enzima. Prouavana je na laboratorijskom i
poluindustrijskom nivou, ali jo uvek nije zaivela u industriji. Razlog je
to jo uvek nije objanjen mehanizam razdvajanja.
Princip metode: veliki broj polimera su meusobno nekompatibilni ili
sa rastvorima soli kada se pomeaju, formiraju se
dvofazni sistemi
Donja faza-polarnija, vea gustina, tu se izdvajaju elije
Gornja faza-manje polarna, laka, enzim
Najee se koristi polietilenglikol i dekstran.
Najpoznatiji sistem: PEG-rastvor fosfatnih soli ili PEG-dekstran
(gornja faza sa enzimom). Separacija se moe ubrzati primenom
centrifugalne sile.
Enzim se moe zadrati u jednoj od faza afinitativnom raspodelom
Prednosti primene dvofaznih sistema su:
- blagi uslovi, ouvanje enzimske aktivnosti
- veliki broj polimera ak stabilizuje enzime
- prinos preienih enzima je visok
- relativno jednostavan scale-up
Osnovni nedostatak:
-nerazumevanje mehanizma procesa
-uglavnom empirijska iskustva
- tehniki ist dekstran je skup (mogu se koristiti PVA, PVP i drugi)
Koncentrisanje proizvoda
Koncentrisanjem tenosti smanjuju se trokovi hemikalija zbog
obrade manjih zapremina kao i operativni trokovi zbog manjih
kapaciteta. Da bi se postupak proizvodnje enzima uinio jo
ekonominijim nastoji se da faza koncentrisanja bude ujedno i prva
faza u preiavanju enzima.
Metode koncentrisanja su:
- taloenje (solima, rastvaraima, polimerima, promenom pH)
- ultrafiltracija
- vakuum uparavanje
- suenje zamrzavanjem
- jonoizmenjivaka hromatografija
- dodatak Sephadex-a G-25
Taloenje enzima
Taloenje enzima bilo solima ili organskim rastvaraima je ujedno i
dobar metod preiavanja tako da je taloenje naroito podesno
koristiti kao I korak u preiavanju enzima
Taloenje enzima neutralnim solima zove se isoljavanje. Paljivim
isoljavanjem enzim se ne denaturie i moe ponovo da se rastvori,
poto se soli uklone dijalizom.

Dodatak malih koliina neutralnih soli u rastvor enzima esto
poveava njihovu rastvorljivost. Meutim, poveavanjem
koncentracije soli iznad neke odreene kritine vrednosti, dolazi do
destabilizacije proteina i njihovog eventualnog taloenja
Svaki enzim se taloi pri odgovarajuoj koncentraciji soli i pH
rastvora pa se mogu frakciono izdvajati enzimi. Hidrofobni enzimi se
taloe pri nioj jonskoj jaini od hidrofilnih
Najveu primenu ima (NH
4
)
2
SO
4
Prednosti:
-velika rastvorljivost u vodi (760 g kg
-1
vode na 20
o
C),
- niska cena,
- netoksinosti i
- sposobnost da stabilizuje veliki broj enzima tako da nije potrebno
koristiti jako niske temperature pri isoljavanju.
Nedostaci:
- korozivne osobine,
- velika gustina rastvora to je smetanja pri izdvajanju taloga
centrifigacijom i
- u alkalnoj sredini stvara amonijak.
Za taloenje se mogu koristiti i druge neutralne soli kao to su
magnezijum-sulfat i natrijum-hlorid. U sutini, veoma je vano
koristiti one soli koje stabilizuju nativnu konformaciju enzima.
Na ovaj nain se mogu frakciono izdvojiti enzimi jer svaki enzim
se taloi pri odgovarajuoj koncentraciji soli i pH rastvora.
Koncentracija soli koja je potrebna da se istaloi odreeni enzim
zavisi naravno od njegovih fiziko-hemijskih svojstava, ali i od
koncentracije.
Izmeu rastvorljivosti enzima, S i jonske jaine rastvora, I
postoji sledea zavisnost:
I K K S
SL
=
1
ln
Anjoni SO
4
2-
>H
2
PO
4
-
>CH
3
COO
-
>Cl
-
>Br
-
>I
-
>ClO
4
-
>SCN

Katjoni NH
4
+
,Cs
+
,K
+
,Na
+
> Li
+
> Mg
2+
> Ca
2+
> Ba
2+
> guanidinium
> urea

Stabilnost enzima u funkciji vrste katjona i anjona
Postupak isoljavanja je jednostavan i sastoji se u dodavanju soli (u
vrstom stanju ili u obliku koncentrovanih rastvora) u porcijama.
Opisati postupak
Taloenje organskim rastvaraima
Organski rastvarai smanjuju dialektrinu konstantu sredine, zbog
ega dolazi do poveanja elektrostatikih privlaenja meu suprotno
naelektrisanim ostacima aminokiselina.
Najee se koriste organski rastvarai koji se meaju sa vodom kao
to su etanol, izopropanol, aceton, dietiletar i drugi.
Problem: inaktivacija enzima organskim rastvaraima, mora se raditi
na niskim temperaturama, skupa oprema
Ovaj postupak se esto primenjuje u praksi, naroito pri izolovanju
amilaza iz plesnih gljivica.
Taloenje organskim polimerima
Taloenje enzima moe se postii i dodatkom organskih polimera kao
to je polietilenglikol, mana: poveanje viskoznosti rastvora
Generalno prednosti taloenja kao postupka koncentrisanja su:
postupci koncentrisanja rastvora taloenjem su veoma jednostavni i
ne zahtevaju primenu sloene opreme. esto su blagi i omoguavaju
ouvanje enzimske aktivnosti ukoliko se izvode pravilno. Naalost,
njihova primena je ograniena u industrijskim razmerama iz sledeih
razloga:
mnogi od talonih sredstava su esto korozivni agensi, pa
mogu otetiti rotore centrifuga koji su izgraeni od nerajueg
elika,
metoda nije dovoljno efikasna za koncentrisanje jako
razblaenih rastvora enzima,
neki organski rastvarai kao to su aceton ili dietiletar su lako
zapaljivi ili veoma skupi,
ostaci talonog sredstva u talogu moraju se ukloniti pre
primene narednih postupaka preiavanja (NH
4
)
2
SO
4
se uklanja
dijalizom

Koncentrisanje adsorpcijom enzima na jonoizmenjivaima
Izmena jona moe biti efikasna i reletivno jeftina metoda za
koncentrisanje i preiavanje rastvora enzima.
Razliiti enzimi mogu se izdvajati iz rastvora vezivanjem za
jonoizmenjivae pri odreenoj pH i jonskoj jaini. Pozitivno
naelektrisani enzimi vezivae se za katjonske polimere, dok e se
negativno naelektrisani vezivati za anjonske.
Eluacija vezanog enzima moe se postii ispiranjem rastvorima soli
(0.5 M puferni rastvori soli kao to su natrijum-hlorid ili kalijum-
hlorid).
Koncentracija soli i pH moraju biti paljivo odabrani tako da
omogue to je mogue veu razliku u naelektrisanju nosaa i enzima,
a da se pri tome molekuli soli ne vezuju za nosa.
arna adsorpcija enzima na jonoizmenjivaima u razblaenim
rastvorima lako se postie jednostavnim suspendovanjem polimera u
rastvor datog enzima.
Naziv grupe Struktura grupe
Tip
jonoizmenjivaa
O (CH
2
)
2
N
+
(CH
2
-CH
3
)
2

H
Dietilaminoetil
(DEAE)
anjonski
CH
2
N
+
(CH
3
)
3

Kvaterarni
amonijum
(Q)
anjonski
O (CH
2
)
2
N
+
CH
2
-CH-CH
3

(C
2
H
5
)
2

OH
Kvaterarni
aminoetil
(QAE)
anjonski
CH
2
COO
-

O
Karboksimetil
(CM)
katjonski
Metil sulfonat
(S)
CH
2
SO
3
-

katjonski
CH
2
SO
3
-
CH
2
CH
2

katjonski
Sulfopropil
(SP)
Funkcionalne grupe koje se najee vezuju za porozne estice
nosaa u cilju izmene katjona ili anjona

Naziv grupe Struktura grupe
Tip
jonoizmenjivaa
Dietilaminoetil
(DEAE)
Anjonski
Kvaterarni
amonijum (Q)
Anjonski
Kvaterarni
aminoetil (QAE)
Anjonski
Karboksimetil
(C)
Katjonski
Metil sulfonat
(S)
Katjonski
Sulfopropil (SP) Katjonski
O (CH
2
)
2
N
+
(CH
2
-CH
3
)
2

H
CH
2
N
+
(CH
3
)
3

O (CH
2
)
2
N
+
CH
2
-CH-CH
3

(C
2
H
5
)
2

OH
CH
2
COO
-

O
CH
2
SO
3
-

CH
2
SO
3
-
CH
2
CH
2

Razblaeni rastvori koji se koncentriu mogu biti fermentacione
tenosti iz kojih su izdvojene elije biomase ili elijski homogenizati iz
kojih su izdvojeni elijski ostaci i suspendovane estice.
Ova tehnika se esto koristi za koncentrisanje rastvora jer je
reletivno jeftina, jonoizmenjivai se mogu regenerisati i ujedno je
metoda za preiavanje enzima. Na ovaj nain se mogu odvojiti
supstance, koje se ili nee vezivati za polimer pod datim uslovima, ili
se nee eluirati pod uslovima kada se ispira enzim. To su razliiti lipidi,
ugljeni hidrati ili delimino aglomerirani i denaturisani proteini. Moe
se postii i delimino meusobno odvajanje enzima.
Koncentrisanje vakuum uparavanjem
Vakuum uparavanjem se uklanja voda pri snienom pritisku i
temperaturi. Najee se koriste vakuum uparivai s kratkim
vremenom zadravanja proizvoda u njima, na primer, razliiti tipovi
filmskih vakuum uparivaa.
Oslobaanje enzima koji su vezani za
membranu
Periferne enzime
Integralne enzime
Enzimi koji su vezani za intracelularnu ili plazmatinu membranu ne
mogu se ekstrahovati na naine koje smo opisali. Pored toga, neki
enzimi su labovo, a neki vrsto vezani za membranu. Ne postoje opta
pravila za njihovo izdvajanje.
Prema nainu kako su vezani enzimi za membranu dele se na:
Periferni proteini su vezani elektrostatikim ili vodoninim vezama
za polarnu glavu membrane i mogu lako da se desorbuju sa membrane,
tretiranjem membrane sa rastvorima velike jonske jaine kao to je 1
M NaCl, zamrzavanjem i odmrzavanjem ili sonikacijom.
Integralni proteini mogu biti jedino ekstrahovani kada se razore
hidrofobne interakcije izmeu lipida i integralnih proteina. Pri tome,
uslovi treba da budu takvi da ne doe do inaktivacije enzima.
Oslobaanje enzima koji su vezani za
membranu
Neke protein-lipid interakcije se mogu naruiti acetonom ili
dejstvom specifinih enzima. Npr. fosfolipaza i lipaza se koriste za
oslobaanje alkalne fosfataze.
Mogu se koristiti deterdenti da se narui struktura membrane i
ekstrahuju lipoprotein fragmenti u vodeni medijum kao micele.
Deterdenti koji se koriste: nejonski Triton X-100, jonski kao to je
natrijum-dodecilsulfat (kiseli) i CTAB (bazni). Za ekstrakciju enzima u
aktivnom obliku poeljni su nejonski deterdenti.
Enzimi mogu takoe biti ekstrahovani primenom organskog
rastvaraa. Koristi se n-butanol jer ima hidrofilni i hidrofobni deo.
Veliki broj proteina membrane je pronaeno u vodenoj fazi
voda/butanol dvofaznog sistema pri emu je lipidna komponenta
naena u butanolu. Tako se mogu ekstrahovati alkalna fosfataza,
glutamiltransferaza i urat oksidaza.
Hromatografske metode za preiavanje
enzima u klonama
Finije preiavanje enzima postie se hromatografskim metodama.
Ova metoda se zasniva na razliitom zadravanju enzima pri prolazu
rastvora kroz kolonu sa nepokretnim slojem vrstih estica (mobilna
faza) i eluiranju zadranih molekula nekim rastvaraem (mobilna faza).
Svakako da e se molekuli enzima koji su bili slabije vezani kretati
bre kroz kolonu i obratno, tako da e doi do razdvajanja enzima na
frakcije. Pojedine faze enzima se skupljaju u kolektoru za frakcije, koji
se postavlja ispod kolone.
Zatim se u pojedinim frakcijama odreuje katalitika aktivnost
pojedinih enzima.
U zavisnosti od mehanizma vezivanja enzima za vrstu fazu
razlikuje se vie vrsta hromatografskih metoda. Sve ove metode se
zasnivaju na razlikama u nekim fiziko-hemijskim osobinama proteina
kao to su:
Samim tim razlikuju se i sledee hromatografske metode:
Razlika u povrinskom naelektrisanju
Razlika u molekulskoj masi i obliku molekula
Razlika u specifinim interakcijama sa drugim molekulima
(supstartima, inhibitorima)
Razlika u hidrofobnosti povrine
Izoelektrina taka
Hromatografske metode
Jonoizmenjivaka hromatografija
Gel filtraciona hromatografija
Afinitetna hromatografija
Adsorpciona hromatografija (hidrofobna)
Hromatofokusiranje
Jonoizmenjivaka hromatografija
U zavisnosti od aminokiselinskog sastava, enzimi imaju razliitu
koliinu i vrstu ukupnog naelektrisanja pri odreenoj pH vrednosti.
Izoelektrina taka enzima, pI
Jonoizmenjivaka hromatografija zasniva se na reverzibilnom
elektrostatikom vezivanju enzima za suprotno naelektrisane estice
nosaa. Zasniva se na razlici u naelektisanju proteina pri odreenoj pH
vrednosti u zavisnosti od pI enzima.
Na ovaj nain mogu se odvojiti enzimi sa slinim fiziko-hemijskim
osobinama.
pH i koncentracija soli moraju biti paljivo odabrani tako da budu
dovoljno naelektrisani i nosa i enzim, a da pri tome se molekuli soli
ne takmie sa molekulima enzima u vezivanju za nosa.
Postupak se obino izvodi pri neutralnim pH vrednostima i pri
niskoj jonskoj jaini rastvora, pa se regeneracija nosaa i spiranje
enzima postie eluiranjem sa rastvorima soli visoke jonske jaine.
Jonoizmenjivaka hromatografija
Jonoizmenjivai su u vodi nerastvorni polimeri koji sadre
kovalentno vezane katjonske ili anjonske grupe. Slabi i jaki
jonoizmenjivai
Kako je veliki broj enzima pri neutralnim pH vrednostima
naelektrisano negativno, vei znaaj imaju anjonski jonoizmenjivai.
Nosa treba da zadovolji vie zahteva: da je inertan, da ima dobre
mehanike osobine i da je makroporozan.
Kao nosai koriste se celuloza, sephadex, agaroze (Bio Gel A) i
drugi.
U novije vreme koriste se nosai za koje su kovalentno vezane duge
razgranate grupe. Efikasnost razdvajanja moe se podeavati na
osnovu duine noice.
Polistiren-mali kapacitet prema proteinima zbog malih pora
Celuloza ima velike pore, uvode se razliite grupe, anjonske ili
katjonske. Ne sme vie od mol po kg.
Jonoizmenjivaka hromatografija
Hromatografija na jonskim izmenjivaima
Katjonski izmenjiva Anjonski izmenjiva
Odvajanje se vri pri neutralnim pH vrednostima i niskoj jonskoj
jaini, tako da se vezani proteini mogu eluirati rastvorima soli
Afinitetna hromatografija
Ova tehnika zasniva se na mogunosti enzima da se specifino i
reverzibilno vezuje za neka jedinjenja, najee ligande.
esto veoma efikasna metoda za razdvajanje enzima veoma slinih
fiziko-hemijskih osobina. Ponekad se enzimi mogu dobiti u
homogenom stanju primenom samo afinitivne hromatografije.
Pri proputanju datog rastvora, samo onaj enzim koji se selektivno
vezuje za imobilisani ligand bie zadran u koloni, dok e ostali
proteini i primese prolaziti kroz kolonu bez vezivanja. Nakon
razdvajanja i uklanjanja svih ostalih molekula, ciljni enzim se moe
isprati sa nosaa proputanjem rastvora nekog kompetitivnog liganda,
kao to je rastvor supstrata.
Jako veliki broj razliitih liganada moe se kovalentno vezati za
inertne vrste nosae i ovako pripremljen matriks koristi se za punjenje
hromatografske kolone. Na osnovu stepena specifinosti, ligandi se
mogu podeliti na SPECIFINE ligande i ZAJEDNIKE ligande.
Afinitetna hromatografija koja se zasniva
na primeni zajednikih liganada
Primena kofaktora kao to su ATP ili NAD kao liganada za dizajn
afinitetnog sistema ili LEUCINA za preiavanje glikoproteina
predstavlja primere afinitetne hromatografije koja se zasniva na
zajednikim ligandima.
Prednost ovih sistema je to se isti matriks moe koristiti za
preiavanje velikog broja razliitih enzima, ali je efikasnost
preiavanja manja nego u sluaju primene specifinih liganada.
Primena sintetikih boja na bazi triazina kao zajednikih
liganada ima sve veu primenu za preiavanje enzima zbog znatno
nie cene liganada, lake pripreme matriksa, smanjenog spiranja
liganda. Ukoliko i doe do spiranja liganada u toku rada, to se lako
uoava.
Hlortriazinske boje se direktno vezuju za vrste nosae kao to je
agaroza pod alkalnim uslovima.
Vezivanje liganda za matriks je znatno olakano i ne primenjuju se
toksine hemikalije, ve je dovoljna samo alkalna sredina. Hidroksilna
grupa matriksa brzo i lako reguje sa hloridnim atomom iz boje. Ovako
pripremljeni matriks koristi se za preiavanje dehidrogenaza koje
koriste NAD i NADP kao koenzime, kao i neke druge enzime.
Taan mehanizam vezivanja nije poznat, ali neke triazinske boje
imaju veliku strukturnu slinost sa navedenim koenzimima to moe
objasniti mehanizam vezivanja velikog broja dehidrogenaza.
Mogu se preistiti i drugi enzimi to se pripusuje jonskim
interakcijama sa negativno naelektrisanim sulfonatnim grupama,
hidrofobnim interakcijama sa benzolovim prstenom i na duge naine.
Metal helatna afinitetna hromatografija
Metal helatna afinitetna hromatografija se zasniva na formiranju
kordinativnih veza izmeu grupa u molekulu enzima i metalnog jona
imobilisanog za hromatografske estice
Najee se koriste Zn
2+
, Ni
2+
, Cu
2+
koji se vezuju kordinativnim
vezama za histidin
Metal helatna afinitetna hromatografija
Biospecifina afinitetna hromatografija
Specifini ligandi koji se koriste su inhibitori i supstrati enzima ili
njihovi analozi.
Primer specifine afinitetne hromatografije je preiavanje laktat
dehidrogenaze (LDH) primenom oksamatne afinitetne kolone
Princip afinitetne hromatografije
NH CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2

NH
C O
C
O O
-

vrst nosa
Imobilisani
oksamat
CH
3

C O
C
O O
-

Piruvat
NH
3
+

C O
C
O O
-

Oksamat
Umetnuti agens
Princip afinitetne hromatografije
Struktura supstrata LDH (piruvat), njegovog analoga (oksamat) i
imobilisanog oksamata koji se koristi kao matriks za afinitetnu
hromatografiju
Razvoj i dizajn afinitetnog sistema
Razvoj i dizajn afinitetne kolone za preiavanje nekog enzima
sastoji se iz sledeih faza:
Izbora liganda,
Izbora vrstog nosaa i
Izbora hemijske metode vezivanja liganda za vrst nosa.
Ligand treba da ima veliki afinitet prema datom enzimu i vezivanje
treba da bude reverzibilno. On takoe treba da bude stabilan jer uslovi
njegovog hemijskog vezivanja za nosa mogu biti otri. Primena
velikog broja jedinjenja ograniena zbog visoke cene i male stabilnosti.
Primenom sintetikih boja kao liganada za preiavanje velikog broja
enzima mogu se prevazii ovi nedostaci.
vsti nosa treba da bude hemijski stabilan, hemijski inertan,
makroporozan, mehaniki vrst, jeftin i da se lako regenerie. Kao
nosai najee se koriste agaroza, celuloza i razliiti sintetski
polimeri.


Razvoj i dizajn afinitetnog sistema
Veliki broj razliitih imobilizacionih metoda moe da se koristi pri
vezivanju liganda za vrst nosa. Nosa se prethodno aktivira na
razliite naine, najee cianogenbromidom ukoliko ligand sadri
amino grupe.
U veini sluajeva, ligand se ne vezuje direktno za nosa, ve preko
nekog agensa da bi se olakalo vezivanje enzima tako to se smanjuju
sterne smetnje. Najei agensi su oni koji se sastoje od velikog broja
metilenskih grupa.
Spiranje vezanog enzima sa kolone se moe promenom uslova. tako
da se znaajno smanji afinitet vezanog enzima prema ligandu. To moe
biti promena pH, jonske jaine, dodatak deterdenta, PEG itd. Tako, |-
galaktozidaza koja se izdvojila na afinitativnoj koloni sa imobilisanim
p-aminofenil |-D-galaktozidom kao ligandom, spira se 0,1 M boratnim
puferom pri pH 10,0.
Najee se kolona ispira puferom koji sadri kompetitivni ligand


Prednosti afinitetne hromatografije:
omoguava meusobno razdvajanje enzima veoma slinih fiziko-
hemijskih karakteristika.
Veoma velika efikasnost razdvajanja. Enzim se moe preistiti i do
1000 puta sa prinosom od 100%.
Uvoenje afinitetne hromatografije u emu preiavanja moe
znaajno smanjiti broj narednih koraka preiavanja.
Nedostaci afinitetne hromatografije:
Visoka cena specifinih liganada,
Zametne i skupe imobilizacione metode
Mogunost spiranja liganda sa matriksa to dovodi do smanjenja
stepena efikasnosti razdvajanja kolone i do kontaminacije ve skoro
finalnih proizvoda toksinim hemikalijama.
Problemi se donekle prevazilaze primenom sintetikih boja kao
liganada, ali se smanjuje efikasnost razdvajanja
Kada se koristi afinitetna hromatografija?
Svakako da se ova hromatografija koristi u poslednjim fazama
preiavanja enzima, nikako u poetnim, jer prisustvo primesa pri
velikim koncentracijama moe dovesti modifikacije, pa ak i
degradacije skupih matriksa.
Hidrofobna hromatografija
Svaki enzim ima karakteristian stepen hidrofobnosti na emu se
zasniva njegovo razdvjanje od ostalih enzima
Jaina hidrofobnih interakcija je proporcionalna jonskoj jaini
rastvora
Nain izvoenja: proputanje rastvora enzima kroz klonu sa
adsorbensom pri visokoj jonskoj jaini. Enzim se sa adsorbensa
uklanja eluiranjem prosto promenom uslova, dakle dodatkom sredstva
koji naruava hidrofobne interakcije (deterdenti, etanol, etilenglikol)
Koristi se umreene agaroze-sefaroze za koju su vezane hemijskom
vezom hidrofobne grupe
Hidrofobna hromatografija
Oktil- i fenil- sefaroze su najvaniji primeri nosaa koji se koriste za
afinitetnu hromatografiju
Treba voditi rauna kada se preiavaju enzimi velikog stepena
hidrofobnosti-ne treba koristiti oktil-sefrazu da se ne bi stvarale jako
hidrofobne interkcije
Reversnofazna hromatografija na obrnutim fazama koriste se
izuzetno hidrofobni nosai za koje se vezuje veliki broj enzima koji se
eluiraju sa opadajuim gradijentom rastvora soli ili rastvorima
opadajue polarnosti
Hemijska struktura oktil-sefaroze
Gel-filtracija ili hromatografija na
molekulskim sitima
Razdvajanje enzima zasniva se na razlici u obliku i veliini
njihovih molekula.
Pri proputanju rastvora kroz hromatografsku kolonu sa poroznim
esticama gela suvie veliki molekuli nesmetano prolaze, dok oni ija
veliina molekula odgovara veliini pora zadravaju se u koloni.
Molekuli unutar estica gela ne zadravaju se isto vreme, manji
molekuli imaju na raspolaganju za kretanje znatno veu unutranju
povrinu i due e se zadravati u esticama gela.
Pri eluaciji jedinjenja e se spirati onim redom u pravcu smanjenja
veliine molekula.
Koristi se veliki broj nosaa: umreeni dekstrani (Sefadeksi G-
serije), alil dekstrani, poliakrilamidi, umreeni derivati agaroze
(Sefaroze) za enzime vee molekulske mase i kopolimeri
etilenglikolmetakrilati.
Veliina pora gela kontrolie se stepenom umreavanja. Gelovi od
istog polimernog materijala sortirani su na osnovu veliine pora,
odnosno molekulske teine jedinjenja koja mogu da razdvajaju.
Sephadex G-25 ili Bio Gel P2 imaju jako male pore, znaajno
manje od veliine bilo kog enzima. Ovi gelovi koriste se za razdvajanje
enzima od soli, deterdenata i drugih malih molekula jedinjenja.
Ukoliko se upotrebi gel sa veim prenikom pora, mogu da se
odvoje enzimi na osnovu razlike u veliini molekula. Takve gel
supstance zovu se MOLEKULSKA SITA. U tu svrhu koriste se
Sefadeksi G-75, G-100, G-200. Za razliku od Sephadexa G-25, koji je
mahaniki vrst, ovi sefadeksi su stiljivi, pa se mogu koristiti samo u
manjim razmerama.
Geli na bazi alil dekstrana, dobijeni njegovim umreavanjem sa N-
N-metilen bisakrilamidom (Sephacryl) imaju neto bolje mehanike
karakteristike, pa su podesniji za industrjsku primenu.
Iako su geli na bazi agaroze (Sepharose) podesni za razdvajanje
enzima velike molekulske teine, oni imaju loe mehanike i termalne
osobine zbog ega se ne koriste u veim razmerama.
Geli na bazi umreenog akrilamida (Bio-Gel) su podesni za
preiavanje enzima jer se ne mogu degradirati pod njegovim
uticajem, za razliku od dekstrana.
Pored razlika u veliini pora, dostupni su geli sa razliitim
veliinama estica. Iako manje estice omoguavaju efikasnije
razdvajanje, razdvajanje se mora izvoditi pri niim protocima.
Frakcionisanje enzima zahteva primenu jako dugakih
hromatografskih kolona (visina treba da bude 25-40 puta vea od
prenika). Industrijske gel-filtracione kolone mogu biti dugake
nekoliko metara. Zbog toga, da ne bi dolazilo do znaajnijeg pada
pritiska kroz kolonu, gel mora imati veliku mehaniku vrstou. Drugi
pristup je da se koriste vei broj kraih identinih kolona povezanih na
red, pri emu rastojanje izmeu kolona treba da bude minimalno. Ovaj
sistem ima prednosti.


Gel-filtracija ili hromatografija na
molekulskim sitima
Gel-filtracija ili hromatografija na
molekulskim sitima
Nedostaci gel-filtracione hromatografije:
Radi se sa malim zapreminama uzorka (2-4% od zapremine kolone)
Primenjuju se mali radni protoci pa je metoda vremenski zahtevna
Nije podesna u industrijskim razmerama
Kada se koristi gel-filtraciona hromatografija?
Svakako da se ova hromatografija koristi u poslednjim fazama
preiavanja enzima, nikako u poetnim, jer prisustvo primesa pri
velikim koncentracijama moe dovesti do zaepljenja kolona.
Moraju se preiavati manje zapremine da bi se postiglo efikasno
razdvajanje. Zapremina rastvora koji se preiava je 2-5% od
zapremine kolone
Postoji niz metoda za odreivanje stepena istoe i homogenosti
enzima
Odreivanje istoe i homogenosti
enzimskog preparata
Elektroforeza
Ultracentrifugiranje
Postupci hromatografije
Elektroforeza je jedna od najboljih metoda za utvrivanje istoe
nekog enzimsog preparata.
Pod elektroforezom se podrazumeva kretanje nekih naelektrisanih
estica u elektrinom polju prema suprotno naelektrisanoj elektrodi.
Pokretljivost molekula enzima u elektrinom polju zavisi od njihovog
ukupnog naelektrisanja i bie vea to je vea razlika izmeu njihove
izoelektrine take i pH sredine u kojoj se estice kreu.
Postoji vie elektroforetskih metoda:
Jednodimenzionalna poliakrilamid gel elektroforeza u prisustvu
negativno naelektrisanog deterdenta, natrijumdodecil-sulfata (SDS-
PAGE),
Jednodimenzionalna poliakrilamid gel elektroforeza (PAGE),
Izoelektrino fokusiranje,
Dvodimenzionalna elektroforeza i
Kapilarna elektroforeza
U sluaju PAGE, molekuli enzima se kreu kroz poliakrilamidni
gel, ija veliina pora zavisi od koncentracije poliakrilamida. Tako,
razdvajanju enzima doprinosi i zadravanje molekula u porama gela i u
tom sluaju brzina kretanja enzima zavisi od veliine, oblika i
naelektrisanja njegovih molekula.
Inkubacija molekula enzima sa SDS ima dvostruki efekat: enzimi
postaju slinog oblika i dobijaju priblino isto negativno naelektrisanje
i sada se kreu ka anodi brzinom koja zavisi samo od veliine
molekula: manji molekuli e se kretati bre.
SDS-PAGE se koristi za odreivanje stepena istoe enzima i za
odreivanje njegove molekulske teine.
Moe se koristiti i jednodimenziona PAGE enzima koji nisu
denaturisani-ISTOA SE DOKAZUJE PRISUSTVOM SAMO
JEDNE PROTEINSKE TRAKE (dve u sluaju dimera)
Izoelektrino fokusiranje se koristi za odreivanje istoe i
homogenosti enzimskog preparata i za odreivanje IZOELEKTRINE
TAKE ENZIMA
istoa se dokazuje prisustvom samo jedne mrlje u sluaju enzima
sa jednim polipeptidnim lancem. Dimeri sa dve razliite subjedinice
pokazae dve ili vie mrlja na gelu. Proteinske mrlje se vizualizuju sa
proteinskim bojama kao to je Coomassie blue.
standard
Preieni
enzim
Smea
proteina
Log molekulske teine
P
o
k
r
e
t
l
j
i
v
o
s
t

k
r
o
z

g
e
l
,
m
m

Moe se koristiti i jednodimenzionalna PAGE enzima koji nisu
podvrgnuti denaturaciji. I u ovom sluaju, nakon bojenja, pojavie se
jedna mrlja ukoliko je enzim homogen.
Izoelektrino fokusiranje je takoe elektroforetska metoda koja se
koristi za analizu ili ponekad mikropreiavanje enzima. U ovom
sluaju ponovo se koristi poliakrilamidni gel, ali u prisustvu organskih
kiselina male molekulske teine i baza. Amfoliti e se distribuirati
unutar gela pod uticajem elektrinog polja, gradei pH gradijent.
Kada se rastvor enzima izloi dejstvu elektrinog polja, enzimi e se
kretati do one pH vrednosti koja odgovara njihovoj izoelektrinoj
taki. Primenom smee standarda enzima poznatih pI vrednosti, moe
se odrediti standardna kriva koja predstavlja zavisnost rastojanja od pI
vrdnosti. Na taj nain moe se odrediti pI ispitivanog enzima.
Savremeni pristup odreivanja istoe enzimskog preparata je
istovremena primena SDS-PAGE i izoelektrinog fokusiranja, u tzv.
dvodimenzionalnoj elektroforetskoj analizi. Ova tehnika se moe
koristiti za analizu kompleksnih smea.

Kapilarna elektroforeza se zasniva na razlici u naelektrisanju enzima
i u ovom sluaju, umesto na poliakrilamidnom gelu, separacija se
odvija du uske kalibrisane kapilarne cevi obino napunjene
silicijumom.
KRITERIJUMI KOJI SE PRATE PRI SVAKOM KORAKU
PREIAVANJA
Zapremina rastvora enzima (cm
3
)
Aktivnost enzimskog rastvora (U cm
-3
)
Koncentracija proteina (mg cm
-3
)
Ukupna aktivnost rastvora (U)
Specifina aktivnost (U mg
-1
)
Prinos enzima (%)
Stepen preiavanja (odnos specifine aktivnosti enzima posle preiavanja i pre
preiavanja)
Regulative, klasifikacija i oznaavanje enzimskih preparata
podleu istim pravilima kao i ostale hemikalije
Proizvoai enzima moraju imati sertifikate kojima se
garantuje pouzdana primena enzima bez opasnosti po ljudsko
zdravlje ili okolinu
Enzimski preparati ne smeju da izazivaju alergijske reakcije,
niti da sadre patogene mikroorganizme ili toksine supstance
Za enzime koji se dobijaju iz jestivih biljaka i ivotinja, kao i
mikroorganizama iz klase I (GRAS status) nisu potrebne
toksikoloke studije
U sluaju proizvodnje iz nepatogenih MO-nemaju GRAS
status-kratkotrajne toksikoloke studije
Enzimi iz genetiki manipulisanih MO-dugotrajna i zametna
ispitivanja

Standardi kvaliteta enzimskih preparata
ta treba kontrolisati:
Sadraj arsena, olova i tekih metala
Mikotoksini
Broj koliformnih bakterija
Prisustvo E. coli i Salmonelle ne sme
da bude detektovanu u 25 g preparata
Ukupan broj ivih bakterija
Standardi kvaliteta enzimskih preparata
Enzimski preparati ne smeju izazivati alergijske reakcije
Standardi kvaliteta i istoe enzimskih preparata zavise od
krajnje primene enzima
Nekada je veoma vano da enzimski preparati ne sadre
primese drugih enzima
Kada se koristi imobilisani enzim-treba specificirati metod
imobilizacije kao i toksinost nosaa
Standardi kvaliteta enzimskih preparata
Tipian sastav velikog broja komercijalnih tehnikih enzima
Sastav enzimskih preparata za analitike, dijagnostike i
terapeutske svrhe je drugaiji