Sterilizacija u biotehnologiji

Kostić Sandra 5459

Tošić Jelena 5460
Pod pojmom sterilizacije podrazumeva se postupak kojim
se uništavaju svi mikroorganizmi u jednoj sredini.
Na temperaturi od 100°C uništavaju se vegetativni oblici.
Na temperaturi od 100 do 125°C uništavaju se sporogeni
oblici.
Mikrobiološki procesi se izvode pomoću čiste kulture na
hranljivoj podlozi.
Sterilizacija se vrši na povišenoj temperaturi, zračenjem,
isušivanjem...
Dejstvo toplote na mikroorganizme ne zavisi samo od
visine temperature i dužine delovanja , već i od mnogih
drugih faktora.
 Sterilizacija hranljivih podloga
 U fermentacionoj tečnosti (podlozi) se odvijaju paralelno rast
više mikroorganizama što uzrokuje pad proizvodnosti,
 Pri kontinualnim procesima može doći do potpunog
eleminisanja proizvodnog organizma,
 Kontaminanti se mogu naći u finalnom proizvodu, što dovodi
do smanjenja njegovog kvaliteta,
 Kontaminanti otežavaju izdvajanje finalnog proizvoda pri
separaciji proizvoda,
 Kontaminanti mogu da razgrade finalni proizvod, na primer
antibiotike i
 Kontaminacija bakterijskih populacija dovodi do autolize
ćelija.
Kontaminacija se sprečava:
 Upotrebom čistih kultura proizvodnih organizama,
 Sterilizacijom hranljive podloge,
 Sterilizacijom procesne opreme i bioreaktora,
 Sterilizacijom svih komponenata koje se naknadno dodaju u
bioreaktor i
 Održavanjem sterilnih uslova tokom trajanja mikrobiološkog
procesa.
Sterilizacija podrazumeva eleminisanje izdvajanjem ili ubijanjem,
svih mikrobnih ćelija i inaktivaciju virusa prisutnih u hranljivoj
podlozi, materijama koje se dodaju u toku bioprocesa.
 Postupci, mehanizam i kinetika
sterilizacije
Za sterilizaciju se koriste sledeći postupci:
 Razaranje strukture ćelije- (dehidratacija), pomoću jakih
oksidacionih sredstava (azotna, sumporna, hromsumporna kiselina
ili toplotom),
 Inaktivacija mikroorganizama- sprečava se mogućnost njihovog
daljeg razmnožavanja.
 Uklanjanje mikroorganizama fizičkim metodama- koristi se za
gasove i rastvore termolabilnih supstanci (vitamini). Razlikuju se
dva osnovna načina:
- apsolutna filtracija i
- delimična filtracija.
 Sterilizacija hranljive podloge toplotom
o Najvažnije je inaktivisati mikroorganizme koji obrazuju
termorezistentne spore,
o Vrednosti energije aktivacije su u opsegu od 250 do
290kJ/mol,
Organizam T(°C) k.10-3 (s-1) Ead (kJ/mol)
Bacillus subtilis 110 450 309
Spore 104 0.57 284
B. Stearothermophilus
Spore 104 7 343
Clostridium botulinum

Tabela 1: Konstante brzina inaktivacije za sterilizaciju toplotom

Pod dejstvom povišene temperature, tokom sterilizacije hranljive
podloge odigravaju se hemijske reakcije između pojedinih
komponenti, koje menjaju njen sastav. Tipičan efekat ovih reakcija
na prinos proizvoda je prikazan na slici 1:

Slika 1: Uticaj trajanja sterilizacije toplotom na prinos proizvoda

 Diskontinualna (šaržna) sterilizacija toplotom
Odvija se u tri faze:
 zagrevanje do početne temperature sterilizacije Ts
 zadržavanje na temperaturi sterilizacije određeno vreme i
 hlađenje do temperature bioprocesa Tf.

Slika 2. Promene temperature tokom trajanja šaržne sterilizacije

Promene temperature sa vremenom u fazama zagrevanja i hlađenja
zavise od tipa sterilizatora, temperature grejnog medijuma (vodena para),
temperature rashladnog medijuma i njihovih masenih protoka. Na slici 3
su predstavljena četiri osnovna tipa diskontinualnih sterilizatora.

Slika 3. Četiri tipa diskontinualnih sterilizatora sa različitim načinima

zagrevanja: a) direktno uvođenje vodene pare; b) zagrevanje pomoću
električnog grejača; c) zagrevanje vodenom parom (T=const); d)
hlađenje
 Kontinualna sterilizacija toplotom
Bazira se na principu “visoka temperatura- ktarko vreme” tj. hranljiva podloga se
zagreva do temperature za kratko vreme, drži kratko vreme na konstantnoj visokoj
temeraturi, a zatim brzo ohladi do temperature biorocesa.
U praksi se najčešće koriste dva tipa kontinualnih sterilizatora:
 sterilizator sa direktnim zagrevanjem pomoću parnog injektora i
 sterilizator sa izmenjivačem toplote
 Sterilizacija sa parnim injektorom se vrši tako što se u hranljivu podlogu
direktno uvodi vodena para visokog pritiska, a istovremeno se i meša u mešaču
pomoću Venturi efekta.
 Kontinualni sterilizator sa indirektnim zagrevanjem zagreva i hladi hranljivu
podlogu u setu izmenjivača toplote. Izmenjivači toplote koji se koriste u
sistemima za kontinualnu sterilizaciju hranljive podloge su obično: pločasti,
spiralni i tipa cev u cev. Postoje tri tipa izmenjivača toplote:
 Pločasti izmenjivači,
 Spiralni,
 Izmenjivači toplote tipa cev u cev.
Slika 4. Šematski prikaz
sistema za kontinualnu
sterilizaciju hranljivih
podloga sa dijagramom
sterilizacije

Slika 5. Šematski prikaz sistema

za kontinualnu sterilizaciju
hranljivih podloga sa
indirektnim zagrevanjem i
hlađenjem sa dijagramom
sterilizacije
Poređenjem diskontinualne i kontinualne sterilizacije može se zaključiti
da i jedna i druga imaju prednosti i nedostatke.
Prednosti kontinualne sterilizacije su:
• povoljni su uslovi za sterilizaciju toplotno osetljivih podloga,
• ravnomerno potrošnja pare tokom čitavog procesa,
• dobijanje i održavanje standardog kvaliteta hranljive podloge,
• proces je ekonomičniji zbog manjeg utroška vodene pare,
• postupak se može u potpunosti automatizovati i
• ukupno vreme potrebno za sterilizaciju određenje zapremine hranljive
podloge je kraće.
Prednosti diskontinualne sterilizacije su:
• manja cena kompletnog postrojenja,
• manji rizik od kontaminacije,
• jednostavnija regulacija i
• lakša sterilizacija viskoznih podloga i podloga u obliku suspenzije.
 Sterilizacija hranljive podloge filtracijom
U filtraciji se koriste dve vrste filtara:
• apsolutni filtri- potpuno izdvajaju mikrobne ćelije iz hranljive
podloge, zadržavanjem na filtru.
• filtri sa dubinskim slojem-prave se od poroznog ili vlaknastog
materijala, Izdvajanje mikrobnih ćelija se zasniva na verovatnoći da
će one pri prolazu kroz filtarsku masu biti zadržane, delovanjem
jednog od sledećih mehanizama (slika 6):
• intercepcijom,
• inercionom impakcijom,
• difuzijom,
• elektrostatskim privlačenjem i
• gravitacijom.
 Intercepcija se zasniva na prodoru mikrobne ćelije u stagnantni sloj
tečnosti oko vlakna, gde biva vezana za vlakno.
 Inerciona impakcija je mehanzam po kome mikrobne ćelije koje udare u
vlakno filtra gube kinetičku energiju i zadržavaju se na vlaknu.
 Difuzija ili Brown-ovo kretanje je karakteristično za ćelije koje su ušle u
stagnantni sloj tečnosti oko vlakna, pri čemu one usled kretanja nalete na
vlakno i bivaju izdvojene iz tečnosti.
 Elektostatsko privlačenje i gravitacija se javljaju zbog delovanja
elektrostatičke i gravitacione sile.

Slika 6. Prikaz
mehanizma sterilizacije
filtracijom
 Sterilizacija vazduha
U biotehnologiji se sterilni vazduh višestruko koristi:
 kao izvor kiseonika u aerobnim procesima,
 za sterilno pretakanje sterilnih rastvora iz jedne u drugu posudu pod
pritiskom,
 za sušenje sterilnog materijala i
 za održavanje nadpritiska u sterilnim prostorijama.
Sterilizacija vazduha se može ostvariti:
 filtracijom,
 toplotom,
 hemijskim i fizičkim sredstvima i
 elektrostatičkim taloženjem.
U industrijske svrhe najčešće se koristi sterilizacija filtracijom, dok se
ostali postupci primenjuju u laboratorijskim uslovima.
 Sterilizacija vazduha filtracijom
Najčešće korišćeni tipovi filtara su apsolutni i vlaknasti filtri.
 Postupak filtracije u apsolutnom filtru zahteva da se u određenom
vremenu filtarska membrana zameni, kako bi se održao potreban kvalitet i
kapacitet filtracije.
 Vlaknasti filtri - imaju znatno veću primenu, jer su jednostavniji za
proizvodnju i imaju prednosti pri većim protocima. Ovi filtri se prave od
vlaknastih materijala, kao što je pamuk ili staklena vuna. Razlikuju se dva
osnovna tipa vlaknastih filtara (slika 7):
- filtri sa dubinskim slojem i
- filtarski ulošci.
 Filtri sa dubinskim slojem se sastoje od presovanog homogenog sloja
vlaknastog materijala smeštenog u metalnom cilindru sa omotačem za
strilizaciju toplotom.
 Filtarski ulošci se sastoje od jednog ili više tankih slojeva finih vlakana u
omotaču, od tekstila, postavljenih u metalno kućište, radi sterilizacije
toplotom ili formaldehidom.
Slika 7. Šematski prikaz vlaknastih filtra: a) filtar sa dubinskim slojem i
b) filtarski uložak
 Postrojenja za sterilizaciju vazduha
Postrojenje za sterilizaciju vazduha uključuje:
- predfiltar,
- kondicioner za regulisanje vlažnosti vazduha i
- filtar sa dubinskim slojem,
Najčešći problem kod sterilizacije vazduha filtracijom je pojava kondenzata u
vazdušnoj struji po izlasku iz kompresora. Ovaj kondenzat može dospeti u filtar i
izazvati loš rad filtra. Najbolje je, nakon kompresora ugraditi hladnjak, kojim će se
kondenzat izdvojiti iz struje vazduha.

Slika 8. Šematski prikaz postrojenja za

sterilizaciju vazduha filtracijom
 Podela sterilizacije
FIZIČKE METODE STERILIZACIJE:
1. Suva: - plamenom
- toplim vazduhom.
2. Vlažna: - vodom i
- vodenom parom.
3. Sterilizacija zračenjem: - jonizujuće
- ultraljubičasto zraćenje.
HEMIJSKE METODE STERILIZACIJE:
1. Vodonik-peroksidom
2. Formaldehidom
3. Etilen-oksidom
MEHANIČKE METODE STERILIZACIJE:
1.Sterilizacija filtriranjem.
 FIZIČKE METODE STERILIZACIJE
1. Suva sterilizacija
Postoje dva tipa sterilizatora koja rade na ovom principu:
 Suvi sterilizator - je obična kuhinjska peć koja se zagreva, a
pomoću termostata se održava temperatura. Sterilizacija se
odvija na temperaturi od 160 do 180 °C, ne kraće od jednog
sata. Na ovaj način se mogu sterilisati stakleni i metalni
predmeti, ulja i dr.
 Sterilizator sa pokretnom trakom - na ovoj traci prolaze
predmeti ispod grejača sa infracrvenim zracima. Sterilizacija se
vrši na temperaturi od 180°C u trajanju od 8 minuta i koristi se
za sterilizaciju manjih instrumenata.
2. Vlažna sterilizacija
Ova metoda je najpogodniji način za sterilizaciju svih vrsta materijala,
sprovodi se u autoklavima. Vlažna sterilizacija se izvodi uz pomoć vodene
pare. Vreme sterilizacije zavisi od temperature, što je temperatura niža,
sterilizacija će trajati duže. Sterilizacija na 134°C ne sme trajati kraće od 5
minuta, a sterilizacija na 120°C mora trajati 20 minuta.
 Autoklav je izrađen od specijalnog čelika, sastoji se od unutrašnjeg i
spoljašnjeg zida između kojih je prostor ispunjen vodenom parom pod
pritiskom.
3. Sterilizacija zračenjem
Dejstvo na mikroorganizme može biti mutageno i mikrobicidno, što
zavisi od intenziteta zraćenja, talasne dužine, od vrste mikroorganizama
i od karakteristike sredine.
Jonizujuće zračenje
Jonizujuće zračenje je zračenje kratkih talasnih dužina, koja poseduju
veliku energiju. Jonizujuće zračenje za razliku od UV zračenja ima
dubinsko mikrobicidno dejstvo, jer prodire u materiju izazivajući
jonizaciju, iz tog razloga nema široku primenu za sterilizaciju.
Ultraljubičasto zračenje
UV- zraci u molekulu DNK deluju purinske i pirimidinske baze, pri
čemu ometaju normalnu sintezu DNK. Sterilizacija UV zračenjem ne
smanjuje značajno broj mikroorganizama u sredini.
HEMIJSKE METODE STERILIZACIJE
1.Vodonik-peroksidom
Sterilizacija vodonik-peroksidom se izvodi u specijalno sterilizacijskoj
komori iz koje se evakuiše vazduh. Vrši se na temperaturi od 40°C u
trajanju od jednog časa. Ova sterilizacija se koristi za predmete
osetljive na vlagu.

2. Formaldehidom
Sterilizacija formaldehidom se odvija na temperaturi od 60 do 80°C u
trajanju od 30 minuta do 3 sata, zavisno od koncentracije gasa i visine
temperature. Ova metoda se danas retko koristi.
 Prednosti sterilizacije formaldehidom su:
- postupak je brz i
- može da se koristi za sve termoosetljive predmete.
 Nedostaci sterilizacije formaldehidom su:
- skupa oprema i
- toksičnost formaldehida.
3. Etilen-oksidom
Ovaj način sterilizacije daje zadovoljavajuće rezultate u pogledu
očuvanja organoleptičkih svojsatava, kao i sa gledišta higijene. Etilen-
oksid je izrazito toksičan gas, bez boje i mirisa, rad sa etilen-oksidom
zahteva posebne uređaje zbog svoje zapaljivosti i eksplozivnosti. Vrši
se na temperaturi od 40 do 60°C, 2 do 4 sata, uz relativnu vlažnost od
50 do 60%. Sterilizacija etilen-oksidom ima dosta prednosti a i
nedostataka:
 Prednosti sterilizacije etilen-oksidom su:
- uništavaju se virusi i
- uništavaju se bakterijske spore.
 Nedostaci sterilizacije etilen-oksidom su:
- toksičnost gasa,
- skupa oprema i
- dugo vreme sterilizacije.
 MEHANIČKE METODE STERILIZACIJE

Sterilizacija filtriranjem
U postupku sterilizacije filtriranjem se kao filtar koristi porcelan,
dijatomejska zemlja, presovani azbest, isitnjeno i na povišenoj
temperaturi homogenizovano staklo. Ova metoda se uglavnom
koristi za sterilizaciju rastvora odabirom pora određenih veličina,
iz određene tečne sredine mogu se ukoloniti mehaničkim putem
bakterije i mikroorganizmi. Filtrima se sterilišu razne tečnosti
koje ne trpe povišene temperature ili druge drastične fizičke
uticaje, to su tečnosti bogate belančevinama, polisaharidima i sl.
HVALA NA PAŽNJI!!!