Proizvodnja krvnih pripravaka

Maja Strauss Patko

Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinu
 Koliko nam je krvi potrebno

WHO 2013. (156 zemalja)

• godišnje se prikupi 112.500.000 doza krvi
• više od 5.000.000 ljudi dnevno treba
transfuziju krvi ili nekog krvnog proizvoda

• razvijene zemlje : 76% KP troše bolesnici

stariji od 65 god
• nerazvijene zemlje: 65% KP troše djeca mlađa od 5 god.

• 25% KP – onkološki bolesnici

• Svaki 7-10-ti hospitalizirani bolesnik treba KP

 Proizvodnja krvnih pripravaka

Cilj: dovoljna količina adekvatnih KP

Nedostak
 bolesnici ne dobivaju potrebnu transfuzijsku terapiju
 izuzetak vitalna stanja

Višak
 uništavanje KP  financijski gubitak
etički problem
 stari KP - “slabija efikasnost” u liječenju
bolesnika
 nepotrebno “trošenje” pula DDK
 ne mogu dati krv kad postoji potreba
 Legislativa - KP je lijek

Krvni pripravci – na listi lijekova HZZO

EU - potreba da zakonodavstvo pokrije područje krvnih pripravaka, tkiva i

organa - zbog velikih razlika između zemalja EU

 2003. - Direktiva 2002/98/EC  cilj propisati standarde za kvalitetu i

sigurnost krvi unutar zemalja EU
 Direktiva 2004/33/EC
 Direktiva 2005/62/EC
 Direktiva 2016/1214/EC – nadopuna Direktive 2005/62/EC
 Zakonska regulativa RH
Hrvatska
 zakoni i pravilnici u skladu s evropskom regulativom

Zakon o krvi i krvnim pripravcima (NN 79/06) – uređuje opskrbu

stanovništva RH krvlju i krvnim pripravcima (obuhvaća sustav društvenih,
skupnih i individualnih mjera i aktivnosti na području planiranja, prikupljanja i
testiranja krvi te proizvodnje, čuvanja i raspodjele krvnih pripravaka

Pravilnik o prostoru, stručnim radnicima i medicinsko-tehničkoj opremi za

obavljanje djelatnosti osebnim tehničkim zahtjevima za krv i krvne
pripravke (NN 80/07) – sukladno Direktivi 2004/33/EZ

Pravilnik o osiguranju kvalitete krvi i krvnih pripravaka u zdravstvenim

ustanovama (NN 80/07; 18/09) – sukladno Direktivi 2005/62/EZ
 revizija do 31.12.2017.
 Preporuke
Hrvatska
 Guide to the preparation, use and quality assurance of blood
components  19. izdanje 2017.
 Krvni pripravci
 proizvodi iz ljudske krvi - osnovna funkcija opskrba stanica
kisikom (eritrociti), korekcija krvarenja i poremećaja zgrušavanja
(trombociti, plazma)
 proizvode se iz pojedinačne doze krvi ili krvnog sastojka davatelja
ili mješavine malog broja (do 12 doza) krvi ili krvnog sastojka
davatelja
 za sada nema spoja koji bi u potpunosti mogao zamijeniti sve
funkcije krvi – djelomična supstitucija pojedinih KP (eritropoetin,
faktori rasta, trombopoetin, rekombinantni faktori)
 predviđanja – 60% sadašnje potrebe za eritrocitima moglo bi se
zamijeniti zamjenicima sposobnim da adekvatno prenose kisik i
korigiraju vaskularni volumen
 Krvni pripravci

Odabrati krvni pripravak koje će najbolje korigirati poremećaj, uz najmanju

vjerojatnost da će izazvati reakcije u transfundiranog bolesnika
1. pravi pripravak
2. u pravo vrijeme
3. u pravoj količini
4. pravom bolesniku
5. u pravim uvjetima

Neracionalna primjena krvi – prema nekim nacionalnim ispitivanjima u

Europi 20% transfuzija je nepotrebno.
 Ulazni materijal za proizvodnju KP

Doza pune krvi ili krvni sastojak dobiven staničnim separatorom

 Zahtjevi za „ulaz” doze PK/afereze u
proizvodnju

 makroskopski: ne smije biti hemolitična, masna, zamazana krvlju, afereza

mora biti bez ugrušaka, plazma ne smije biti masna

 volumen:
PK 470 – 560 mL
afereza više od
 Zahtjevi za „ulaz” doze PK/afereze u
proizvodnju

 intaktnost svih ostalih transfer

vrećica, filtera, sistema, klema

  obilježenost
 Zahtjevi za „ulaz” doze PK/afereze u
proizvodnju
 skladištenje do početka prerade
Zahtjevi za „ulaz” doze PK u proizvodnju

 vrijeme proteklo od uzimanja do prerade – ovisi o vrsti

proizvedenih KP i o temperaturi skladištenja
SSP  6-24 sata
KT  6-8 sati (PRP)
 6-24 sata (BC)
KE  do 72 sata (HO)
 Prerada pune krvi
Prerada krvi = razdvajanje pune krvi na komponente

1. Centrifugiranje = osnovni postupak razdvajanja krvi na komponente –

stanice se razdvajaju sedimentiranjem ovisno o veličini i specifičnoj gustoći
 Biranjem različitih parametara centrifugiranja
(jačina i duljina) odvajamo samo pojedine dijelove –
ovisno što želimo dobiti
Dva tipa centrifugiranja:
 “hard” – snažno - odvajaju se sve stanice od plazme
 “soft” – nježno – odvajaju se samo najteže i najveće stanice, a one
lakše ostaju raspršene u plazmi (odvajanje samo eritrocita)
 Najčešće se kombinira dvostruko centrifugiranje da bi se došlo do
konačnih proizvoda
 Prerada pune krvi

Odvojeni pojedini dijelovi (koncentrirane stanice, plazma) po potrebi

se dalje procesiraju (filtracija, pranje, dodatno koncentriranje
 Prerada pune krvi

Centrifugiranje - ovisi o proizvodnji trombocita

1. KT se ne rade  snažno centrifugiranje – odvajanje svih stanica od
plazme
2. Proizvodnja KT  PRP postupak (SAD, Japan)
 BC postupak (Europa, Kanada)
 Prerada pune krvi

PRP postupak vs BC postupak

1. PRP – trb. jače aktivirani  slabija kvaliteta trb
2. PRP – nema odgode prerade
3. PRP – pojedinačna (pedijatrijska) doza
4. BC – gubitak 15-35 mL eritrocita u KE
5. BC – odgoda prerade do 24 sata
6. BC – proizvodnja pulova
7. BC – odgoda više od 6-8 sati  niže vrijednosti FVIII u plazmi
Proizvodi koje dobijemo iz 1 doze krvi

PUNA KRV

KE KL Pl. KT

SSP Derivati pl.

Kriodp. FVIIa Ig
Krio
pl.
FVIII alb.

FIX ost.
 Sustavi za naglo hlađenje krvi i
skladištenje do prerade
Aktivnost Prednost Nedostatak
Dostava krvi u HZTM Uzimanje krvi Prerada krvi
Temperatura čuvanja krvi na Uzimanje i prerada krvi /
uzimanju
Temperatura transporta Uzimanje i prerada krvi /
Rok prerade Prerada krvi Prerada krvi
Nabava i zanavljanje opreme / stalni trošak
Kvaliteta KP KE, KT KE, SSP
Organizacija rada djelatnika OKP (manje posla u OKP (rad subotom i
popodnevnoj smjeni) praznikom)
 Zašto se krv davatelja razdvaja na
komponente ?
1. U konzerviranoj krvi postepeno dolazi do raspadanja i gubitka funkcije
pojedinih stanica i aktivnosti proteina plazme – promjene različito
izražene u različitim uvjetima čuvanja - razdvajanjem krvi na pojedine
komponente, omogućuju se optimalni uvjeti čuvanja za svake od njih

 Eritrociti  najbolje održana funkcija na +4C

 Plazma  smrznuta (-25C)
 Trombociti i granulociti  sobna temperatura (+22C)

2. Bolesnici se transfundiraju samo onim krvnim pripravcima koji su im

potrebni

3. Iz jedne doze krvi priređuje se više krvnih pripravaka i istovremeno

liječi više bolesnika
 Razdvajanje krvi na komponente

 Razlike između DDK i primatelja  nuspojave u primatelja - smanjiti

količinu komponente koja trenutno nije potrebna bolesniku
 Promjene u KP tijekom skladištenja  osigurati uvjete za svaku
komponente u kojima su najmanje promjene
 Istovremeno iz 1 doze mogu se dobiti 2-3 krvna pripravka

Na kvalitetu utječe vrsta i sastav otopina u dozi KP

 AK, HO (soli, šećer, alkohol, nukleotidi) – elementi koji su

važni za odražavanje komponenti krvi u vrećici, ali mogu biti
štetni/opasni za primatelja

 in vitro promjene u KP koje nastaju tijekom

skladištenja, stvaranje i nakupljanje štetne tvari
 Uloga antikoagulantne otopine

Natrijev citrat i limunska kiselina

sprečavaju zgrušavanje  blokira Ca++
(neophodan u procesu zgrušavanja

Limunska kiselina - osigurava potrebnu

koncentraciju vodikovih iona na +4C
(u protivnom krv bi bila previše alkalna
na temperaturi čuvanja)

Fosfat, adenin - djeluju kao konzervansi koji omogućuju eritrocitima optimalne

uvjete za održavanje života i funkcije u konzerviranoj krvi kroz ATP i 2,3
DPG
Dekstroza/glukoza  za metabolizam stanica, potiče stvaranje ATP-a (90%)
 Funkcija ATP i 2,3-DPG u eritrocitima

ATP
održavanje integriteta eritrocitne
membrane
važan za rad Na/K pumpe u
eritrocitnoj membrani – oblik
eritrocita  sekvestracija u slezeni, (oprez kod srčanih bolesnika,
hemoliza
funkcija hemoglobina
stvaranje nukleotida
2,3-DPG
funkcija hemoglobina u eritrocitima –
prijenos O2 i CO2 do tkiva i natrag
tijekom skladištenja - slabije
otpuštanje kisika stanicama tkiva
kardiovaskularnih operacija, pacijenta
u šoku, nedonoščad)
normalizira se unutar 24 sata od
transfundiranja

metabolizam lipida u eritrocitima

 Vrećice za uzimanje krvi

 plastične vrećice za krv u uporabi od 60-tih godina - cilj smanjiti

mogućnost bakterijske kontaminacije, oštećenja, ulazak zraka u
cirkulaciju (nedostaci boca), omogućiti sterilnu proizvodnju, odvajanje i
skladištenje pojedine komponente krvi, te transfundiranje pod pritiskom
 materijal vrećica: otporan na različite temperature, proziran (omogućava
vizualan pregled pripravaka) i otporan na sile centrifugiranja

 PVC uz dodatak plasticizera  di-2-ethylhexyp phthalate (DEHP)

Prowse CV at al. Commercially availale blood storage containers.

Vox Sang 2014;106(1):1-13.
 Vrećice za uzimanje krvi

Prednosti:
1. stabilizira membranu eritrocita  reducirana hemoliza eritrocita u
odnosu na staklo i bolji in vivo recovery eritrocita
2. smanjena bakt. kontaminacija (0,53% vs. 6,7% u bocama)
3. smanjena učestalost pirogenih reakcija

Nedostaci: toksičnost ???

DEHP) – otpušta se i ulazi u plazmu i staničnu membranu tijekom
skladištenja  kumulativni efekt kod masivnih ili učestalih transfuzija K
1. ET neonatusa
2. pacijenti na ECMO aparatima
3. dijalizirani, kardiokiruški
 rješenje u svježijim KP
Prowse CV at al. Commercially availale blood storage containers.
Vox Sang 2014;106(1):1-13.
 Vrećice za uzimanje krvi

Vrećice za eritrocite

 DEHP je još uvijek standard u proizvodnji plastičnih vrećica prvenstveno

za eritrocite, razne alternative još u fazi ispitivanja
 BTHC (n-buttryryl-tri(n-hexyl)-citrate  također zadovoljava i za
eritrocite, ali se puno manje koristi
 DINCH (di-isononyl cyclohexane-1,2-dicarboxyli acid  jače izražena
hemoliza

Prowse CV at al. Commercially availale blood storage containers.

Vox Sang 2014;106(1):1-13.
 Vrećice za uzimanje krvi

Vrećice za trombocite  moraju biti propusne za plinove kako bi se održao

adekvatan pH tijekom skladištenja.

 DEHP-PVC  PRP trombociti do 3 dana  napušteno

 TOTM-PVC (Tris-octyl trimellitate) – PRP trombociti do 7 dana
skladištenja
 Polyolefin  PRP trombociti do 7 dana skladištenja
 BTHC-PVC  bolji od polyolefina
 DnDP (di n-decyl phthalate) PVC  pad pH iza 5. dana skladištenja

I dalje se traže novi materijali bez ftalata, a koji bi zadovoljili produženo

čuvanje trombocita.

Prowse CV at al. Commercially availale blood storage containers.

Vox Sang 2014;106(1):1-13.
 Vrećice za uzimanje krvi

Vrećice za plazmu
 najviše se koristi DEHP-PVC, ali i druge vrste  ne dolazi do aktivacije
faktora
 materijal mora biti otporan na smrzavanje, problem oštećenje u
transportu

Vrećice za inaktivaciju patogena

 plazma  nema razlike
 trombociti  mora biti propusna z plinove i otporna na UV sjetlost

Prowse CV at al. Commercially availale blood storage containers.

Vox Sang 2014;106(1):1-13.
 Sintetske otopine za čuvanje KP

Eritrociti:
 Stabilizira stjenku eritrocita (oblik)
 Smanjena hemoliza
 Produženo čuvanje 35-49 dana

Trombociti:
 Bolje očuvana funkcija trombocita, manje su aktivirani
 Manja količina plazme u KT - smanjena mogućnost prijenosa patogena
 Primjena ABO inkompatibilnih KT
 Više plazme za SSP
 Zahtjev za inaktivaciju patogena
Priprema doza krvi za centrifugiranje
 Aparati za razdvajanje centrifugirane krvi
Uporaba automatiziranih proizvodnih tehnika reducira utjecaj ljudskog faktora
u proizvodnji krvnih pripravaka, te poboljšava kvalitetu i omogućuje
standardizaciju proizvedenih pripravaka
 Ozljede ruku pri otvaranju klemica

 djelatnik u proizvodnji i po nekoliko stotina puta otvara klemice  1

doza 2-4 transfer vrećica
 često uz uporabu sile  rezultira ozljedom i bolovima prsta i zgloba
šake
 automatsko otvaranje klemica značajno olakšava rad i sprečava
neadekvatno ili nedovoljno otvaranje kleme na vrećici za eritrocite 
može smetnja protoku krvi i dovesti do pojačane hemolize eritrocita

Fresenius Compoflow sistem - preuzeto s interneta - ISBT 2012. Cancun

 Aparati koji objedinjuju centrifugu i
aparata za razdvajanje na komponente
Procesiranje 1 doze

Atreus, Terumo
 za procesiranje 1 doze PK  KE, Pl, Orbisac, Terumo
KT (PRP u plazmi ili PAS)  za procesiranje 1 pool-a BC 
KT-BC pool
1 x KE

1 x KT-
PRP

1 x pool
KT-BC
1 x pl
 Aparati koji objedinjuju centrifugu i
aparata za razdvajanje na komponente
Procesiranje više doza
 Reveos (Terumo) – za 4 doze PK  FKE, Pl, KT (PRP)

4 x FKE 4 x KT-PRP 4 x Pl

Preuzeto iz kataloga - Terumo

 Aparati koji objedinjuju centrifugu i
aparata za razdvajanje na komponente
Procesiranje više doza
 TACSI WB (Terumo) – za 6 doza PK  KE, Pl i BC
 TACSI PL (Terumo) – za 6 pool-a BC  pool-a KT-BC

 6 x pool-a
KT-BC

6 x FKE, 6 x BC, 6 x pl
 Leukodeplecija

 uklanjanje leukocita iz KP postupkom filtracije

 univerzalna leukoredukcija - “pre-storage” (100% leukofiltracija svih KP)
danas se smatra znakom moderne, visoko kvalitetne transfuzijske
terapije
 značajno poskupilo transfuzijsko liječenje
 nije upitna prednost za bolesnike:
značajno smanjene PTR,
povećana kvaliteta KP

Novi Pravilnik osiguranju kvalitete

krvi i krvnih pripravaka u
zdravstvenim ustanovama (2017.)
 100% leukofiltracija u RH
Zahtjev kvalitete: ostatni leukociti - manje od 1x106/dozi (eritrociti)
- manje od 0,2x106/dozi (trombociti)
Proizvodnja koncentrata trombocita iz PK

 Europa  većina BC postupak

 SAD - PRP
 Pool koncentrata trombocita iz buffy coat-a  gotovi pulovi na zalihama
za izdavanje
 Zahtjevi: propusnost vrećice, kontinuirano miješanje, temperatura +22°C
 4-6 doza BC + 1 doza plazme/HO
a) razdvajanje krvi unutar 6 sati od uzimanja – plazma se odmah zamrzava,
BC miruje najmanje 2 sata pa dalje preradi u pool
b) razdvajanje krvi unutar 6 sati od uzimanja – plazma se odmah zamrzava,
BC miruje tijekom noći, a puliranje se radi slijedeći dan
c) razdvajanje krvi unutar 24 sata od uzimanja – plazma se odmah
zamrzava, BC miruje najmanje 2 sata pa se dalje preradi u pool –pulovi su
za izdavanje u popodnevnim satima
 Koncentrat trombocita - puliranje

1. „vlakić” metoda

2. Set za puliranje (+ in-line leukocitni filter)

Koncentrat trombocita dobiven aferezom

 nakon uzimanja 2 sata miruje prije stavljanja u agitator  uzorkovanje

za KK, razdvajanje u pridruženu transfer vrećicu
 transfundiranje djece, HLA/HPA tipirani KT, mogućnost križne reakcije,
refraktorni bolesnici, popunjavanje zaliha
 postotak u odnosu na trombocite iz PK jako se razlikuje među zemljama
 Ostali KP dobiveni aferezom

 Koncentrat eritrocita – „duble dose” – autologna krv, O neg

 Koncentrat granulocita – stimulacija granulocitne loze faktorima rasta
(G-CSF) – povećan broj i morfologija  još uvijek upitna dugoročni
učinak – 6x1010 stanica
 Plazma  volumen do 600 mL
 Oprani krvni pripravci

 Samo na zahtjev za određene bolesnike.

 Spriječavanje zeških alergijski / anafilaktičnih reakcija
 IgA imunodeficijencija
 Pranje u FO ili HO (eritrociti SAGM, trombociti SSP+ i sl.)
 Eritrociti - resuspenzija u HO – produljenje roka valjanosti  2 tjedna
(ACP 215, Haemonetics)
 Trombociti – manualno
 istiskivač plazme
 resuspenzija u HO
(očuvanje kvalitete)

Pranjem se puno gubi stanica, kompromitira

kvaliteta (mehaničko oštećenje, „stres”)
Zahtjev kavalitete: manje od 0,5 g/pripravku
 Zračenje KP
 Zračenje - prevencija GvHR
 sprečava reakciju limfocita iz KP na organizam primatelja (krv,
jetra, koža, crijeva) primatelja oslabljenog ili nerazvijenog
imunološlog statusa

 Indikacije:
 transplantacija koštane srži
 prirođene imunodeficijencije
 IUT  ET  transfuzije neonatusa
 KP od bliskih krvnih srodnika (podudaranje u dijelu HLA
ustava)
 transfuzije granulocita (velika količina limfocita)
 Aparati za zračenje KP
Rendgenske zrake (x-zrake)

Raycell MK2 Radgill Radsource

Radioaktivni izotop Linearni akcelerator na radiologiji

(Cz 137, Co60)
Gammacell
1000/3000
 Inaktivirani krvni pripravci

 postupak kojim se u krvnom pripravku uklanjaju ili onemogućuje

proliferacija uzročnika zaraznih bolesti koji se prenose putem krvi, bez
značajnijeg utjecaja na terapijsku učinkovitost stanica i proteina u KP i
nuspojava u primatelja KP

 različiti termini  različito značenje

inaktivacija, redukcija, eliminacija patogena…
 Nedoumice…..

 Toksičnost za ostale komponente u KP

 Toksičnost za samog primatelja
 provedena brojna ispitivanja toksičnosti za sve postupke
kada se dodaje nešto u KP – radi se o maloj količini  ne
uzrokuje toksičnost, karcinogenezu, mutagenost,
genotoksičnost i toksičnost na reprodukciju
 Utjecaj na imuni sustav
 IP može inducirati modifikaciju proteina plazme i trombocita –
stvaraju se novi AG (neoantigeni), AT
 transfuzijska reakcija i refrakternost (MB i pojava alergijskih
reakcija, nije zabilježeno kod ostalih postupaka inaktivacije)
 Nedoumice…..

 Utjecaj na hemostatku funkciju KT

 neka ispitivanja 20-30% smanjen recovery i preživljavanje trb.
 pretpostavka da inaktivacija KT uzrokuje ranije uklanjanje
transfundiranih trombocita iz cirkulacije - nije potvrđeno
ispitivanjima in vitro

 Trombociti
 niži CCI i CI, kraći intervali između transfuzija

 Plazma
 smanjenje aktivnosti proteina plazme - i do 30%
 O čemu ovisi uspjeh inaktivacije

 uspješna inaktivacija = nakon procesa ostatni broj patogena je ispod

praga potrebnog za prijenos infekcije

 ovisi o ukupnoj dozi (volumen x titar) patogena i efikasnosti postupka za

pojedini agens

 izražava se kao logaritamska redukcija (log)

 zahtjev za inaktivaciju/redukciju je >6 log-a (99,9999%)

 niti jedan postupak to ne zadovoljava za sve patogene

 određeno na temelju procijenjenog nivoa bakterija koje se mogu naći u

proizvodnji u nesterilnim uvjetima

 za većinu virusa dovoljno obzirom na nivo viremije u window periodu i

kod kronične infekcije
 Količina patogena u infekciji - virusi

Agens Stadij infekcije Količina patogena

(geg/mL)
HIV, HCV, HBV Window period 106-108
Kronična infekcija 104-106
CMV, EBV, HTLV Window period 104-106
Kronična infekcija <102-104
HAV, B19 Window period 108-1012
Kronična infekcija <102-104
HGV, TTV Window period 104-106
WNV, enterovirusi Kronična infekcija 101-106
 Ostali patogeni

Bakterije
 sve više od interesa prijenos putem KP
 najčešće kontaminacija s kože, a radi se o malom broju bakterija (10-
100) u 300 mL krvnog pripravka = 0,03-0,3 bakterije/mL – inaktivacija u
„svježem” pripravku
 postupak treba inaktivirati sve bakterije

Paraziti
 kod kronične infekcije – niska konc. parazita u krvi  inaktivacija 6 log-
a uglavnom dovoljna
 Inaktivacija 6 log-a

 u nekim slučajevima nedovoljno, u nekim više nego dovoljno, u nekim

adekvatno
 npr. za HBV inficirani pripravak  inaktivacija 6 log-a je nedovoljna za
sve faze infekcije (u fazi najveće viremije titar virusa može biti 9-10
(geg/mL u krvi)
 najveća korist kada je količina virusa niska, ispod praga osjetljivosti NAT
testa (window period, OBI)
 zato uvođenje inaktivacije ne može biti praćeno ukidanjem rutinskog
testiranja
 Postupci inaktivacije patogena u KP

4 za plazmu:
 S/D  djelovanjem deterđenta i ptapala na membranu patogena
 Intercept – derivat psoralena + UVA  sprečavanje proliferacije
patogena (virusi, bakterije, paraziti)
 Mirasol – vitamin B2 + UVA i UVB svjetlo  sprečavanje
proliferacije patogena (virusi, bakterije, paraziti)
 Theraflex – metilensko modrilo + vidljiva svjetlost  sprečavanje
replikacije NK (virusi s lipidnim omotačem, u manjoj mjeri ostali
virusi)
3 za trombocite  Intercept, Mirasol i Therafleflex
1 za punu krv  Mirasol
1 za eritrocite  Intercept
 Solvent / detergent postupak (S/D)

• 1990.g. počelo u SAD-u, kasnije u Europi (Baxter, Octalpharma, Grifols,

Kedrion, LFB Biomédicaments, ostalo centri na nacionalnoj razini)
• primarno inaktivacija samo virusa s lipidnim omotačem, danas dodatnim
postupkom i na viruse bez omotača i ,
• pod djelovanjem otapala i deterđenta dolazi do pucanja lipidne ovojnice
• pulirana plazma:
otapalo 1% TNBP = tri-(N-butyl)-phosphate
deterđent 1% Triton X-100= polyoxyethylene-p-octylphenol
• TNBP uklanja lipide s membrane virusa , a Triton X-100 pospješuje
njegovo djelovanje i prekida dvostruki lipidni sloj za lakšu ekstrakciju
lipida
 Solvent / detergent postupak (S/D)

 postupak uspješan za viruse sa i bez lipidnog omotača, dodatni postupak

za redukciju priona (redukcija PrPc za 3 log-a)
 otapalo i derergent se naknadno odstranjuju kromatografskim postupkom
 zaostala količina supstanci do sada nije pokazala toksične efekte ni u
masivnim transfuzijama
 primarno na velikim pulovima plazme (3.000-4.000L), kasnije i mini pulovi
60-300L)
 u primjeni u velikom broju zemalja (Austrija, Njemačka, V. Britanija, Irska,
100% u skandinavskim zemljama)
 nema evidentiranih slučajeva TRALI-ja, vrlo niska učestalost alergijskih
reakcija
 Postupci koji koriste supstance i
svjetlost različite valne duljine

Relativno jednostavni, primjenjivi na pojedinačnu dozu

Metilensko modrilo (fenotijazinska boja) - u primjeni 1992.-1998., posljednjih

15-tak godina

Psoralen, riboflavin - intenzivnija primjena od 2007.-2008.g. pojava

epidemija bolesti koje se prenose krvlju (WNV, Chikungunia, Denge)

UVC – samo vidljiva svjetlost

57
 Metilensko modrilo (MM)

 fenotijazinska boja
 u kliničkoj uporabi od 1890.g. (Paul Erlich)
 1950.g. Walter Reed bolnica (SAD) za uništavanje virusa
 originalni postupak – razvijen u Njemačkoj (Springe) za inaktivaciju
virusa u plazmi početkom 90-tih  za pojedinačnu dozu plazme
 danas licencirani postupak Grifolsa i MacoPharme - dodali lekodepleciju i
uklanjanje preostalog MM)
 Metilensko modrilo (MM)

 djelovanje na viruse izvan stanica (leukociti), preduvjet – leukodeplecija

PK ili plazme
 mehanizam djelovanja  pod djelovanjem vidljive svjetlosti MM stvara
reaktivne kisikove spojeve koji onemogućuju replikaciju nukleinskih
kiselina patogena (stvaraju se reaktivni spojevi kisika koji se vežu na
gvanozin nukleinske kiseline)
 može se primijeniti i na već smrznutu plazmu – centralizirana inaktivacija
 danas u primjeni u Španjolskoj,
Francuskoj, Portugalu,
V. Britaniji (postepeno se
zamjenjuje drugim postupcima)
 Intercept Blood System
 razvio Cerus s Baxterom (SAD, Cerus Europe, Nizozemska) -danas
zastupa Fresenius, CE za KT 2002.g. a plazmu 2006.g, 2016. FDA
 derivat psoralena (amotosalen HCl = S-59) - pod djelovanjem UV
svjetla reagira sa spiralnim lancima DNK i RNK patogena i stvara
ireverzibilne kovalentne veze s pirimidnskim bazama nukleinskih kiselina
 takav genom patogena i stanica ne može se više replicirati
 na isti način amotosalen djeluje na leukocite (prevencija GvHR)
 inaktivacija plazme i KT (isti iluminator, razlika u setu) - najviše
zastupljen za KT (gubitak oko 12-13% trombocita, jače aktivirani), manje
za plazmu (nema značajne redukcije f. zgrušavanja – neznatno FBG,
FXIII, FII)
 Austrija, Belgija, Francuska, Slovenija, Švicarska
Intercept - proces inaktivacije
 Mirasol inaktivacija

 inaktivacija riboflavinom i UVA i UVB svjetlom

 riboflavin (vitamin B2) = prirodni spoj –

prisutan u hrani, normalno se nalazi u krvi

 naveliko se koristi u farmaceutskoj industriji i

u terapiji neonatalne žutice (fototerapija)

 NETOKSIČAN
 Mirasol tehnologija – mehanizam
djelovanja
 riboflavin ulazi u stanicu/patogen, stvara kovalentne veze između parova
baza NK i pod utjecajem UV svjetla izaziva fotokemijsko oštećenje NK
patogena (oksidacija gvanozinskih ostataka i prekid lanca NK)
 oksidacijm gvanozinskih ostataka nastaje
ireverzibilno oštećenje NK
 nemogućnost transkripcije, replikacije
i translacije nukleinskih kiselina
 djelovanje na leukocite - reducija vijabilnih
T-limfocita za >6 log  sprečavanje GvHR
 sprečavanje prezentacije antigena in vitro i stvaranja
aloprotutijela u životinjskom modelu
 inhibicija stvaranja citokina – redukcija FNHTR
 klinička ispitivanja od 2002.g.
 2007.g. CE za KT u plazmi i plazmu
 2008.g. CE za KT u HO

Slika: Terumo BCT

 Mirasol tehnologija

KP nakon inaktivacije osjetljiv je na svjetlo

 spriječiti izloženost svjetlu tijekom skladištenja i transporta
 preporuka proizvođača da inaktivirani KP može biti do 1 sat izložen
svjetlu bez posljedica (vrijeme potrebno da se plazma otopi, KP priprema za
transfundiranje – ako se ne transfundira vratiti u omot, agitator, hladnjak)

Kod uobičajenog trajanja transfuzije nije potrebna

posebna zaštita
 Djelovanje na viruse – usporedba
Intercept i Mirasol tehnologije
Virus Intercept Mirasol
Virusi s ovojnicom
HIV (izvan stanice) > 6,2 5,9
HIV (u stanici) > 6.1 4,5
HBV > 5,5 2,3
HCV > 4.5 3,2
CMV > 5,9 np
WNV >6.0 5.1
VSV > 5.8 > 6.3
Influenza A H1N1 > 5.9 > 5.3
Chicungunia > 6,4 2,1
Virusi bez ovojnice
Parvo B19 3,5-5,0 >5
Porcine Parvovirus 0 >5.0
Canine Parvovirus 0 >5.0
HAV 0 1,8

Prowse CV. Vox Sang 2013;104:183:199

Djelovanje na bakterije, spirohete i parazite –
usporedba Intercept i Mirasol tehnologije
Bakterije Intercept Mirasol
S. aerus 6,6 4
S. epidermis > 6,6 4,2
P. aeruginosa 4,5 > 4,6
E. coli > 6,4 4,4
Serratia marsescens >6,7 4,0
Klebsiella pneuminia > 5,6 2,8
Yersinia enterocolitica > 5,9 3,3
Spirohete
T. Pallidum > 6,8 np
B. Burgdorfini > 6,8 np
Paraziti
T. Cruzi >5,3 6
P. Falciparum >6 >3,2
BEZ UČINKA NA PRIONE I BAKTERIJSKE SPORE
Prowse CV. Vox Sang 2013;104:183:199
 Utjecaj Mirasol patogene inaktivacije na
faktore u plazmi
FBG 77%
FII 80%
FV 73%
FVIIIC 75%
vWF 117%
FIX 76%
FX 80%
FXI 67% gubitak do 33% (FXI, FV i FBG)
FXII 96%
FXIII 100%
Protein C 81%
Protein S 91%
antitrombin 99%
Smith i sur. Transfusion 2010;50:926-931
2-antiplazmin 93%
 Otopine za rejuvenaciju

 sadrže: fosfat, inozin, glukozu, piruvat, adenin

 povećavaju nivo ATP-a i 2,3-DPG-a u konzerviranim eritrocitima
 dodaju se od 3. dana po uzimanju krvi do 3 dana nakon isteka roka
eritrocita
 nakon miješanja s eritrocitima – inkubacija 1 sat na +37°C, pa
zamrzavanje u glicerolu illi pranje u FO i skladištenje narednih 24 sata
na +4°C
 postupak je skup, zahtjeva dosta dodatnog rada i rijetko se koristi
(vojska)
 Smrznuti eritrociti

 Sam postupak zamrzavanja eritrocita oštećuje eritrocite

 stvaraju se kristalići leda
 Dodatak glicerola (krioprotektivni agens) ograničava stvaranje tih
kristalića
 mora se dodati unutar 6 dana od uzimanja krvi, dodaje se
polako uz miješanja, pa naglo zamrzava (najčešće na
-65°C) u posebnim spremnicima
 češće se koristi glicerol u visokoj koncentracoji – 40%
 Smrznuti eritrociti se primarno koriste za autologne transfuzije i čuvanje
eritrocita rijetkih krvnih grupa, za bolesnike imunizirane na antigene
visoke učestalosti
 Čuvanje 10 godina, pranje odmah po otapanju i transfundiranje unutar 24
sata
 Otopine za rejuvenaciju

 sadrže: fosfat, inozin, glukozu, piruvat, adenin

 povećavaju nivo ATP-a i 2,3-DPG-a u konzerviranim eritrocitima
 dodaju se od 3. dana po uzimanju krvi do 3 dana nakon isteka roka
eritrocita
 nakon miješanja s eritrocitima – inkubacija 1 sat na +37°C, pa
zamrzavanje u glicerolu illi pranje u FO i skladištenje narednih 24 sata
na +4°C
 postupak je skup, zahtjeva dosta dodatnog rada i rijetko se koristi
(vojska)
 Posebni zahtjevi – koncentrat eritrocita

1. Starost KP – vezano uz sposobnost prijenosa kisika (raste konc. K, pada

pH i 2,3 DPG) – neke promjene reverzibilne i korigira se 48-72 sata
nakon transfundiranja
 novorođenčad  3-7 dana
 kardiološki, kardiokiruški bolesnici  7-14 dana
 kronične anemije, dijalizirani  do 7 dana

2. Pranje eritrocita – teške alergijske reakcije, anafilaktičke reakcije, IgA

imunodeficijencija

3. Smanjenje broja leukocita – 100%

4. Zračenje
Posebni zahtjevi – koncentrat trombocita
1. Starost KP – refraktorni bolesnici – do 3 dana ?

2. Smanjenje volumena :
novorođenčad – preopterećenje volumenom
ABO inkompatibilna plazma – smanjenje titra anti A i/ili anti B At
alergijske reakcije

3. Pranje trombocita - teške alergijske reakcije, anafilaktičke reakcije, IgA

imunodeficijencija

4. Smanjenje broja leukocita – isto kao za eritrocite

5. Zračenje – isto kao za eritrocite

Smanjenje volumena
Oprani trombociti
 Plazma muških DDK

 u HZTM (RH) plazma ženskih DDK se ne koristi za kliničku primjenu

posljednjih 10-tak godina – praksa u većini razvijenih zemalja

 ovisno o postotku ženskih DDK – učinak na rezerve SSP – nije bitno za

frakcioniranje

 SSP za neonatuse  cell – leukodepletirana, redoviti DDK

 Promjene u eritrocitima tijekom skladištenja
Hemoliza – porast konc. K+
 smanjuje se leukoredukcijom, dodatkom manitola u AO
 viša konc. K+ opasna samo u transfundiranju male djece i neonatusa u
masivnim transfuzijama

ATP
 koncentracija se smanjuje tijekom skladištenja
 niska konc. – hemoliza eritrocita i skaćeno
preživljavanje transfundiranih eritrocita

2,3-DPG
 koncentracija pada tijekom skladištenja - nije limitirajuća za transfuziju
starijih eritrocita - u cirkulaciji se u potpunosti regenerira unutar 24 sata
(izuzetak kardiovaskularni bolesnici, neonatusi)

Teško povezati učinak na bolesnika samo sa starošću krvi – niz dodatnih

faktora, učinak nije specifičan
 Promjene u konzerviranoj krvi
tijekom čuvanja na +4oC
Stvaranje mikroagregata, nakupljanje citokina i drugih bioaktivnih spojeva
izlučenih iz stanica
Leukociti – unutar nekoliko sati raspadanje granulocita, nakon 72 sata
većina dezintegrirana
Trombociti – raspadanje počinje nakon 2 dana, i postepeno se povečava
tijekom skladištenja, ali značajniji je gubitak hemostatske funkcije
Eritrociti – stabilni i funkcionalno očuvani tijekom čuvanja do isteka roka
valjanosti
Labilni faktori zgrušavanja (FV, FVIII) – nakon 24 sata aktivnost smanjena
za 25 %,nakon 14 dana aktivnost manja od 10 % (FVIII)
Albumin, gamaglobulini, fibrinogen – stabilni tijekom čuvanja, više od 95%
očuvana aktivnost
Plazma – raste konc. kalija, laktata
 Promjene u KT tijekom skladištenja

 stvaranje bioaktivnih suspstanci  odgovorne za PTR - značajno

smanjeno kod “prestorage” leukoredukcije

 Način proizvodnje (prerada pune krvi BC postupkom – manja aktivacija

trombocita - bolje očuvana funkcija trombocita  aktivirani trombociti
brže se uklanjaju iz cirkulacije  slabiji učinak transfuzije trombocita)
 Održavanje viabilnosti i hemostatke aktivnosti
trombocita u koncentratima za transfuzijsko
liječenje

Potrebno osigurati adekvatne uvjete

 dovoljno energije za stvaranje ATP koji omogućuje adekvatani metabolizam
trombocita (leukodeplecija)
 dovoljno kisika za održavanje aerobnog metabolizma (propusne stijenke
vrećice)
 spriječiti aktiviranje trombocita (manipulacija)
 spriječiti oštećenje površinskih receptora na trombocitima (leukodeplecija,
manipulacija)

Spriječiti stvaranje produkata odgovornih za PTR primatelja i negativni učinak na

kvalitetu

Spriječiti bakterijsku proliferaciju u pripravku

 Održavanje viabilnosti i hemostatke aktivnosti
trombocita u koncentratima za transfuzijsko liječenje

Potrebno osigurati adekvatne uvjete

 dovoljno energije za stvaranje ATP koji omogućuje adekvatani
metabolizam trombocita
 dovoljno kisika za održavanje aerobnog metabolizma
 spriječiti aktiviranje trombocita
 spriječiti oštećenje površinskih receptora na trombocitima
Spriječiti stvaranje produkata odgovornih za PTR primatelja
Spriječiti bakterijsku proliferaciju u pripravku
 Platelet storage lesion (PSL)

PSL = skup morfoloških, metaboličkih i biokemijskih promjena u

trombocitima koje nastaju od trenutka uzimanja krvi, tijekom transporta
krvi, proizvodnje, skladištenja i transporta KT do primatelja, a utječu na
njihovu viabinost i funkciju nakon transfundiranja
Promjene su djelomično reverzibilne i nestaju nakon transfundiranja, ali
mogu biti dobra pretpostavka za klininičku efikasnost
• Tradicionalno se odnosi samo na morfološke promjene (gubitak
diskoidnog oblika, promjena morfološkog score-a, oblika na djelovanje
agonista, odgovor u reakciji hipotoničkog šoka), ispoljavanju
aktivacijskih markera (P-selektin i sl.) i biokemijske promjene (pad pH,
glukoze, pO2,porast pCO2, laktata, stvaranje i oslobađanje bioaktivnih
supstanci )
 Promjene koje nastaju tijekom skladištenja -
PSL

Izmjena plinova

 U hipoksičnim uvjetima (smanjenog pO2) trombociti se okreću

anaerobnom metabolizmu  6-7 puta povećano stvaranje mliječne
kiseline čijom disicijacijom raste konc. vodikovih iona  pad pH

 Pad pH ispod 6,2 značajno reducirana vijabilnost trombocita in vivo

– odličan, a jednostavan test in vitro koji korelira s recovery-em i
preživljavanjem trombocita in vivo
 Promjene koje nastaju tijekom skladištenja -
PSL

 Temperatura čuvanja
 Na +22°±2°C najbolje održavanje oblika i funkcije trombocita
 Ispitivanja skladištenja koncentrata trombocita na +4 °C  dolazi do
aktivacije trombocita, ali zbog polimerizacije aktinskih niti i promjene oblika
- gubitak diskoidnog oblika i površinsko nakupljanje GPIb/IX/V, a ne zbog
povećanja ekspresije membranskih proteina i pojave aktivacijskih markera
na površini (Vox Sang 2007.)
 Studija van Zantena i sur (1996.) da znatno reducirana ekspresija GPIb ne
kompromira adheziju trombocita
 Zahtjev za čuvanjem na +4 °C - smanjenje rizika bakterijske proliferacije
Promjene koje nastaju tijekom skladištenja -
PSL

 Vrećice za skladištenje

 Površina vrećica mora biti propusna i osigurati izmjenu plinova za

sve trombocite u pripravku

 Problem ako se čuvaju pulovi s velikim brojem trombocita, više od

4x1011  volumen od 1,3 – 1,5 L

 Vrećice á 1L samo ako broj manji od 2,5-x1011 trb – u protivnom 

pad pH, pO2 i porast CO2
 Miješanje trombocita tijekom skladištenja

 Ravnomjerno raspoređeni trombociti u područje s najboljom izmjenom

plinova – važno za održavanje pH – u protivnom trombociti se okreću
anaerobnom metabolizmu  pad pH
 Horizontalni agitatori – bolji od rotacionih
 Ispitivanja prekida agitiranja (transport):
 do 24 sata – pri ponovnom agitiranju trombocit se vraća aerobnom
metabolizmu, ali pH ostaje niži nego u kontrolnoj skupini, veći učinak
1 dulji prekid i konc. trombocita viša od 2,5x1011 (Dumont
L.J.Transfusion 2007, Wagner J.S. Transfusion 2008)
 preporuka ne više od 12 sati
 Mirovanje KT prije stavljanja u agitator 1 sat na sobnoj temperaturi
 Stvaranje bioaktivnih supstanci tijekom
skladištenja

 100% “prestorage”leukoredukcija – značajno smanjila stvaranje

bioaktivnih supstanci u KT (proupalni i imunomodulatorni citokini/ili
kemokini: IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α )
 preostali citokini –izlučuju sami trombociti ili leukociti prije uklanjanja –
stajanje PK ili BC )
 RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed and
presumably secreted) - proinflamatorni citokini koji sudjeluju u
alergijskim reakcijama, oslobađaju se iz α granula tijekom aktivacije
 privlače i aktivitaju eozinofile i bazofile i uključeni su u proizvodnju IgE i
alergijske reakcije na HPA-1a i promjene u kompleksu GPIIB/IIIa
 sve to dešava se i na trombocitima kao posljedica spontane aktivacije
uslijed proizvodnje, rukovanja i stimulacije in vitro
 Stvaranje bioaktivnih supstanci tijekom
skladištenja
 aktivacija trombocita dovodi do degranulacije i otpuštanja citokina iz
trombcita među kojima je CCL5 (RANTES) uključen u nehemolitičke
PTR, a transforming faktor-β1 (TGF-β1) djeluje imunosupresivno
 KT s visokom koncentracijom CCL5 su uključeni u teške alergijske
reakcije
 IL-1ß stvaraju neutrofili i B limfociti, IL-6 T i B, makrofagi i monociti,
TNF-α makrofagi
 Kod leukodepletiranih KT - nema značajnog porasta citokina od
strane leukocita, iako je njihova koncentracija manja unutar 1-2
dana skladištenja
 Nakupljanje bioaktivnih supstanci tijekom
skladištenja

 Koncentracija bradikinina i njegova aktivnog metabolita raste do 5.

dana i u “prestorage” filtriranim KT– opaženo u oko 20% KT
 Kinini – izazivaju hipotenzivne reakcije – pogotovo u bolesnika koji
primaju ACE inhibitore
 Histamin – reducirana koncentracija tijekom skladištenje zbog
leukodeplecije
 Aktivacija tombocita tijekom skladištenja

 In vitro: mjeri se određivanjem membranskih proteina (CD62P, CD40L,

CD41, CD 63 ...), ß-tromboglobulina
 CD62P - adhezivna molekula koja omogućuje vezanje trombocita na
monocite i makrofage RES-a – uklanjanje iz cirkulacije nakon
transfundiranja  slabiji učinak transuzije
 CD40 – inducira proliferaciju B limfocita i stimulira proizvodnju IgE,
triger za endotelne stanice da otpuštaju proupalne citokine
 afreza – iako sama ne izaziva značajnu aktivaciju tijekom procesiranja
– ipak razlika između separatora
 postoje davatelji sa već aktiviranim trombocitima
 Aktivirani trombociti – brže se uklanjaju iz cirkulacije - eventualno bolji
za brzo popravljanje hemostaze kod akutnog krvarenja