Phân tích hàm lượng kháng sinh

nhóm tetracyclin
trong thủy sản bằng HPLC
RP - HPLC
Nội Dung

 Đặc điểm của chất phân tích

 Nguồn gốc tetracyclin tồn dư trong thực phẩm
 Chuẩn bị mẫu
 Điều kiện chạy sắc ký
 Kết luận
Đặc điểm chất phân
tích
 Đặc điểm chất phân tích

 Tetracyclin là kháng sinh phổ rộng được sử dụng trong chăn nuôi và thủy sản
 Tetracyclin được chia làm 3 loại: tetracyclin (CT), oxytetracyclin (OTC) và
clortetracyclin (CTC)
 Cấu trúc đều có 4 vòng, mỗi vòng có 6 cạnh và khác nhau ở gốc gắn vào vòng.
 Có tác dụng ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn
 Được hấp thu qua đường tiêu hóa, thấm được vào
loại dịch trong cơ thể và mô, tan trong mạch lipuid
 Giảm hấp thu khi trong ước có Fe2+, Mg2+, Al3+, Ca2+
Tác hại của việc tồn dư kháng sinh

 Gây dị ứng ngay khi sử dụng

 Tạo thể vi sinh kháng thuốc
 Làm giảm đáp ứng miễn dịch
 Gây ung thư
 Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất
 Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi
trường
Chuẩn bị mẫu
 Chuẩn bị mẫu

 Cân 5g mẫu, băm nhuyễn cho vào ống ly tâm 1. Thêm đệm McIlvaine – EDTA.
Nghiền trong 30s rồi ly tâm 10min tốc độ 3000 vòng/phút
 Lấy dịch trong cho vào ống ly tâm 2. Thêm 20ml đệm, trộn đều, ly tâm 10min,
3000 vòng/phút. Lấy dịch trong.
 Thêm 10ml đệm vào ống 1, ly tâm rồi gạn dịch trong vào ống 2.
 Ly tâm ống 2 trong 20min, 3000 vòng/phút
 Lọc dịch và rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần dung 2ml đệm.
 Chuẩn bị mẫu trắng không chứa kháng sinh
 Chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi
Làm sạch dịch chiết

 Chuẩn bị cột: Nối cột Sep – Pak C18 vào đầu ra của xi lanh thủy tinh
100ml. Thêm 20ml methanol, 20ml nước cất vào xi lanh và loại bỏ dung
dịch chảy trong cột.
 Làm sạch dịch chiết: cho dịch chiết lần lượt vào cột. Tráng rửa bình
bằng 2ml dung dịch đệm. Làm khô cột bằng không khí sạch trong 2min
Điều kiện chạy sắc ký

HPLC LOẠI SẮC KÝ PHA ĐẢO

RP – HPLC
 Pha tĩnh RP-HPLC (không phân cực hoặc ít phân cực)

 Silicagel trung tính đã bị alkyl hóa bởi:

CH3-, =C8H17=, =C18H37=
 Nhân phenyl (=C6H5=), nhóm =CN…
 Bề mặt không hay ít phân cực
 Cỡ hạt: 5 – 10 μm
 Diện tích xốp: 100 – 500 m2/g
 Chịu áp: 600bar
 Kị nước
Pha động RP-HPLC

 Là các pha động phân cực;

 Ưa nước và tan tốt trong nước;
 Nước là một dung môi của pha động;
 Là các dung môi hữu cơ phân cực và hỗn hợp của
chúng;
 Hỗn hợp của nước và dung môi hữu cơ.
Chọn Pha động

 Dung môi: hỗn hợp dung dịch axit oxalic – metanol –

axetonitrile.
 Tỉ lệ: hoà tan 1,26 g axít oxalic bằng nước cất trong bình
định mức 1000 ml. Định mức tới vạch. Thêm vào dung
dịch 500 ml axetonitril và 166 ml metanol. Lọc và đuổi
khí
Điều kiện phân tích

 Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
 Thể tích tiêm: 60ul.
 Ổn định cột sắc ký trong 30 phút
 Tiêm dịch chuẩn theo nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần
 Tiêm dung dịch mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi. Mỗi dịch
tiêm 2 lần, tính trung bình
Độ chính xác

 Độ lặp lại của 2 lần tiêm Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic
sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
 Độ thu hồi (RĐộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn
hơn 80 %.
 Đường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt,
hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng
0,995.
 Đối với các mẫu chứa ít hơn 0,5µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra
xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn
trên cột C18 chạy cùng chế độ như cột C8 và so sánh thời gian lưu của
píc mẫu và píc chuẩn.
Phạm vi đo của phương pháp

 UV detetor cũng là loại detetor được sử dụng nhiều nhất

trong các máy HPLC. UV detetor có khoảng tuyến tính
rộng, thể tích chết tương đối nhỏ nên kết hohwp rất hiệu
quả với HPLC. Nếu cần thiết, phạm vi bước sóng có thể
mở rộng sang vùng ánh sáng nhìn thấy để phân tích các
chất có màu.
Điều kiện lọc detector

 Sử dụng đầu dò hấp thu tia tử ngoại UV bước sóng 350nm

 Ưu điểm: Không chạy dưới nhiệt độ, có sự đáp ứng tuyến tính giữa sự
hấp thu UV với lượng mẫu chất.
 Nhược điểm: kén chọn loại chất phân tích
Kết luận
 Kết luận

Hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính

trên cơ sở đường chuẩn dạng y = ax + b:
C (µg/kg) = (Y-b)/a.F.1000
Trong đó:
C: nồng độ các kháng sinh có trong mẫu, tính theo
µg/kg.
Y: hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và
chiều cao pic mẫu trắng
a, b: các thông số củađườ ng chuẩn y = ax + b,
F: hệ số pha loãng mẫu
Phạm vi đo

 Phương pháp sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) có phạm vi ứng
dụng cao, có thể tách được cả các chất phân cực và không phân cực.
Đặc biệt ứng dụng được cho các chất vô cơ và hữu cơ, amin,
aminoaxit, HCBVTV…
 UV detetor cũng là loại detetor được sử dụng nhiều nhất trong các máy
HPLC. UV detetor có khoảng tuyến tính rộng, thể tích chết tương đối
nhỏ nên kết hợp rất hiệu quả với HPLC. Nếu cần thiết, phạm vi bước
sóng có thể mở rộng sang vùng ánh sáng nhìn thấy để phân tích các
chất có màu.