ANALITIKA OTROVA

Doc dr. Maja Vujović

Podela otrova prema sistemskom istraživanju odnosno prema načinu izdvajanja iz
biološkog materijala

1. GASOVI
2. LAKO
7. OSTALO ISPARLJIV
I

3. BILJNI
6.KISELINE
OTROV I
I
SINTETS
BAZE
KI

5. 4.
PESTICIDI METALI
 uzorak

Dijagram analitičkih metoda za lekove i otrove

preliminarni
test
neisparljive sup. isparljive sup.

neorganska sup. organske sup.

imunohemijske
ekstrakcija
metode

PP, TTE
SPE, SPME
RENGENO
FLUORESCENCI „Headspace“- HS
JA

IC AAS FT-IR TLC HPLC GC

ICP-MS MS MS
Opšti postupci toksikološko-hemijske analize
■ Izbor i količina adekvatnog biološkog uzorka
■ Pravilno uzorkovanje (antikoagulans ili ne) i obeležavanje uzoraka
■ Očuvanje stabilnosti uzorka (prezervacija - konzervansi: 1%NaF, temperatura: +4°C/-
20°C) i transport uzoraka
■ Priprema uzoraka za analizu
■ Identifikacija i kvantifikacija analita u uzorku primenom odgovarajućih analitičkih
tehnika
■ Obrada i tumačenje dobijenih rezultata
■ Pisanje Toksikološko - hemijskog izveštaja - finalni zvanični dokument o urađenoj
toksikološkoj analizi
■ Arhiviranje izveštaja i čuvanje uzoraka za potrebe superanalize
 Uzorak Količina kada koristiti komentari
krv, srce 50-100mL uvek Identifikovati uzorak. konzervirati sa 2%
natrijum fluoridom ili kalijumoksalatom.
Čuvati deo uzoraka bez konzervansa ako
je to moguće
Biološku uzorci za sudsko-toksikološku analizu
krv, periferna 10-25mL za kompletnu toksikološku Indetifikovati uzorak. Korististi
analizu femoralnu krv ako je moguće
krv, ugrušak ceo ugrušak slučajevima traume  
urin sve uvek Odredjivanje bilo koje količine, čak i <
1mL za imunoesej skrining
žuč sve uvek Podvezati žučnu kesu da bi se izbegla
kontaminacija.
tečnost staklastog tela sve uvek Sakupiti uzorke iz oba oka i koristiti kao
jedan uzorak
želudačni sadržaj sve za kompletnu toksikološku Podvezati želudac da bi se izbegla
analizu kontaminacija drugih tečnosti
jetra 50g uvek Indetifikovai uzorak. Poželjno je uzeti
desni lobus jetre
bubreg 50g uvek  
slezina 50g metali, etilen glikol Veoma korisna kada nije moguće uzeti
krv (smrt u požaru)
mozak, masti 50g CO, CN Može biti veoma koristan materijal kod
dece čija je smrt uzrokovana drogom
pluća 50g lipofilne droge Sakupiti u zaliven kontejner. Sakupiti i
trahealni vazduh
kosa svežanj trovanja isparljivim Identifikovati proksimalni i distalni deo
jedinjenjima, istorija
trovanja
 Priprema
bioloških uzorka
rka na č e Cilj dobre pripreme - dobijanje
u z o u ti
p r e m a n a l i ze željenog analita što veće:
d a pri fs k ea
ra se t o gra
Sm a t rom a
no s t h
us pe š . - čistoće i
- 9 0 %
od 7 0
iko v a, - prinosa
a : i h p
a uz o r k o gr a f s k e m e i
prem hroma na, t sist
p r i s ke
k v a tna i izgled ih kolo atograf
e ij k
Nead če na loš analitič šuje hrom
- uti ćuje vek /ili zapu tode Uklonjanje interferirajućih endogenih i
ra i e
- sk rava rad ljivost m
o
- usp njuje ose
t egzogenih supstanci iz kompleksnog
a
- sm biloškog matriksa u što većem
procentu!
Vrste interfereci iz biološkog mtriksa
i čistoće posuđa
■ Soli u zavisnosti od koncentracije u uzorku i primenjene detekcione tehnike mogu u velikoj meri
uticati na osetljivost metode. LC i LC-MS analize su znatno manje podložne kontaminaciji solima
u odnosu na GC i GC-MS analize gde može doći do depozicije soli u samom sistemu.
■ Proteini imaju relativno visoku koncentraciju u biloškim uzorcima i hrani. Strukura varira od
naelektrisanih, visoko polarnih do hidrofobnih neutralnih vrsta a njihovo ponašanje u prirodnom
obliku može da varira od uzorka do uzorka. Fizičko taloženje proteina predstavlja mehanički rizik.
■ Masti, hidrofobni a ponekada i naelektrisani deo molekula lipida može izazvati ozbiljene probleme
u hromatografiji; fizičko vezivanje za stacionarnu fazu i jonsku supresiju pa samim tim i na
smanjenje osetljivosti metode.
■ Šećeri
■ Pigmenti - planarne i rektivne prirode, u LC i LC/MS analizi utiču na smanjuju performansi kolona
i supresiju jonizacije, dok kod GC i GCMS analize na taloženje i kvar aparata.
■ Surfaktanti - površinski aktivne supstance lipidne prirode (fizičko vezivanje za kolonu i supresija
jonizacije)
■ Čvrste partikule
Vrste uzoraka za toksikološku
analizu:
■ Humani biološki materijal (krv, urin, lavat,
saliva, TST, organi, CST-likvor, želudačni i
crevni sadržaj, kosa, nokti, kosti i dr.)
■ Biljni, životinjski materijal
■ Nebiološki materijal (praškaste supstance,
vazduh, voda, zemljište)
Osnovni faze u pripremi uzorka
UZORAK

BEZ SA ANALIZA
PRIPREME PRIPREMOM METALA
- Fluoridi urinu - Mineralizacija do suva
- Kiseline/baze HROMATOGRAFI
- Razblaživanje 1%HNO3
- Alkoholi JA - Filtriranje
„headspace“ - Merenje
ekstrakcijim
Tehnike pripreme bioloških uzoraka
■ Razblaživanje uzorka
■ Precipitacija proteina (PP)
■ Tečno-tečna ekstrakcija (TTE) (neisparljiva organska jedinjenja)
■ Tečno-čvrsta ekstrakcija (SPE)
■ Headspace (HS) metoda, (lakoisparljiva jedinjenja)
■ Mineralizacija (minerali)
Izbor tehnike zavisi od
- suva (žarenjem na visokim tem.),
• vrste uzorka,
- mokra (na niskoj temperaturi + oskdaciono sredstvo) • osobina otrova i
■ Mikrotalasna pećnica, (minerali) • primenjene anlitičke
■ Destilacija ili difuzija (lakoisparljiva jedinjenja) metode
■ Dijaliza (anjoni)
Precipitacija proteina (PP)
Princip
Taloženje proteina, denaturacija
pomoću: org,rastvarača (metanol,
etanol, acetonitril, aceton), toplote,
enzima, ultrazvuka i dr.
Prednosti
- efikasna metoda za uklanjanje proteine
(albumina) iz uzoraka plazme,
- omogućuje pripremu većeg broja uzoraka
za kraće vreme,
- pogodna je za automatizaciju i predstavlja
opštu metodu za pripremu uzoraka
plazme
Nedostaci
- nedovovoljno čisti uzorci (soli i masti),
- mogućnost kontaminacije kolone i
instrumenta,
- otežano uparavanje rastvarača
Tečno-tečna ekstrakcija (TTE)

Najčešći organski rastvarači za TTE

Spec. gust. TK Limit UV Zapaljivos Rastvorlj. u

Rastvarač DC Polarnosta
(g/cm3) (˚C) det. (nm ) t vodi (g /L)

Butil acetatb 0.88 125 255 Da 5.01 - 7.0

Hloroformc 1.49 61 245 Ne 4.81 4.4 8.0
Cikloheksan 0.78 81 210 Da 2.03 0.0 0.0
1,2-Dihloretan 1.25 83 230 Da 10.65 3.7 8.7
Dihlormetan 1.32 40 235 Da 8.93 3.4 13
Etil acetatb 0.90 77 255 Da 6.02 4.3 83
Heptan 0.68 98 210 Da 7.92 0.0 0.5
MTBE 0.74 55 220 Da 4.50 - 48
Petrol etar 0.65 40-60 210 Da oko 2 - 0.0
Toluen 0.87 111 285 Da 2.38 2.3 0.5
 Ekstrakti lekova i nekih supstanci koji se zloupotrebljavaju
dobijeni tečno-tečnim ektrakcionim postupkom

Opšta šema ekstrakcije

supstanci iz biološkog uzorka
TTE
Prednost
- jeftina i efikasno uklanja neorganska jedinjenja i soli,
- dobijaju ekstrakti zadovoljavajuće čistoće, ali sam postupak je nisko reproduktivan i
dugo traje.
Nedostaci
- ekstrakti moraju da se uparavaju,
- koristi velike količine rastvarača (hlorisanih),
- komplikovana za automatizaciju,
- neselektivna, stvara emulzije i loše razdvaja faze.
Princip
Nerstov zakon, više puta sa manjom količinom ratvarča, film epruvete
Tečno-čvrsta ekstrakcija (SPE, solid phase
extraction)

HLB MCX MAX

Vrste kopolimerizovanih adsorbenasa: HLB - neutralni; MCX – katjonski
jonoizmenjivač; MAX - anjonski jonoizmenjivač
Osnovni principi SP ekstrakcije

1. kondicioniranje (conditioning),
2. nanošenje uzorka (sample
addition), Tipovi adsorbensa u
SPE kertridžima
3. pranje (washing) i
4. eluiranje analita (elution)
Prednosti SPE:
- veliki izbor nosač/rastvarač kombinacija -
visoka specifičnost i selektivnost
- ne zahteva primenu višekomponentnih Glavni nedostatak je vreme
pufera,, potrebne male količine uzorka i potrebno za razvijana metode i cena
rastvarača, separacionog sistema (kertridži,
manifold, vakum pumpa)
- jednostavna upotrebe, nije neophodno
uparavanje ekstrakta što je pogodno za
termolabilne analite,
- smanjen kontakt sa štetnim materijama i
minimalno isparavanja rastvarača,
- minimalan transfer uzorka, visoki prinosi
(>95%) i čistoća ekstrakata, ne javlja se
problem emulzije,
- izolovanje jonizovanih oblika molekula
(kvater. amon. soli)
Šema LC sistema sa on line ekstrakcijom
- ne zahtevaju ekstremno visoke pH
- automatizacija – on line ekstrakcija
Nebiološki materijal-priprema

■ Vazduh – adsorpcija na čvrstom nosaču, ekstrakcija

■ Zemljište – homogenizacija, ekstrakcija
■ Voda – ukoncentrisanje, ekstrakcija, SPE

Uzorkivač vazduha

Gasne ispiralice
Hemijske i fizičko-hemijske metode za
određivanje otrova
Tip analize
• Predhodne probe, preliminarni testovi:
imunohemijska test trake, kolor testovi
(bojene reakcije) sa pripremom i bez
pripreme uzorka tzv. direktne probe iz
krvi, urina i/ ili žel. sad.
• „Screening“ tesovi (test trake, kolor
testovi, tehnike: GC/MS, multikolonski
HPLC, TLC)
• Ciljane analize
• Konfirmacione analize
Prethodne probe

■ Reakcija materijala (lakmus hartija)

■ Miris i boja (cijanidi, fenol, hloroform)
■ Probe reagens hartijama :
Guignard –ov reagens: cijanovodonik→crveno
Olovo – acetat: H2S →crno
AgNO3: H2S ili P → crno
■ Spektroskopsko ispitivanje krvi (CO)
Kolor testovi
1. Salicilati – Trinderov test, (4% Fe(NO3)3 u 0,01M HCl )

2. Isparljive redukcione supstance (etanol, metanol)– Test bihromata

3. Fenotiazini – FPN reag., (50 % v/v HNO3, 45 % v/v HClO4 i 5 % v/v FeCl3 )

5. Triciklični antidepresivi – Forestov reag.

6. Trihloro jedinj. (crvena boja u piridinu)– Fujiwara test (piridin)

7. Paracetamol (plavo) – Krezol amonijačni test

8. Ethlorvinol – Difenilamin test

9. Parakvat (plavo) i dikvat (zeleno) – Ditionit test (Na ditionat)

■ Prednosti kolor testova - brzi, jeftini i jednostavni za izvođenje; usmeravaju i
olakšavaju dalja istraživanja.
■ Nedostaci kolor testova – nisu specifični (jedan reagens daje boju sa većim brojem
jedinjenja/funkcionalnih grupa; jedno jedinjenje sa više funkcionalnih grupa se može
dokazati sa većim brojem kolorh testova); veliki broj interferirajućih supstanci; teško
tumačenje testa ako su polazna jedinjenja već obojena.
■ Kolor testovi se izvode na sahatnim staklima sa malom količinom uparenog ekstrakta.
Uporedo se rade i reakcije sa kontrolnim uzorkom/ekstraktom i standardom (čistom
supstancom).
Imunohemijske metode

■ Imunohemijski analizatori
■ Imuhemijske test trake
Separacione i druge metode
■ Tankoslojna hromatografija (TLC)
■ Gasna hromatografija (GC), GC/FID, GC/MS
■ Tečna hromatografija (LC), HPLC, LC/MS
■ ICP/MS
HS-GC/MS
■ UV/VIS detekcija, PDA
■ AAS, AES
■ IR
■ Polarografija
■ Kolorimetrija

TLC
LC/MS
 Primena hromatografskih tehnika

GC HPLC LC/MS

barbiturati benzodiazepini antibiotici

meprobamat fenotiazini kofein
glutetimid salicilati teofilin
salicilati barbiturati teobromin
fenitoin verapamil nifedipin
pesticidi atenolol enalapril
etilalkohol propranolol LSD
metanol tri/tetracik. antidepr. morfin (metab.)
kodein (metab.)
 Analitičke metode koje se najčešće koriste za analizu
bioloških uzoraka na prisususto otrova/lekova
Metoda Specifičnost Osetljivost Više droga Kvalitativna Kvantiativna Labor Pouzdanost
analiza analiza

Kolor test + + Da + Neke + +

UV/VIS + + Ne ++++ Da ++ ++

IA ++ ++ Neke Ne Neke + +

GC ++ ++ Da ++ Da ++ ++

TLC ++ + Da ++ Ne +++ +++

HPLC ++ ++ Da ++ Da ++ ++

GC/MS ++++ ++++ Da ++++ Da +++ ++++

AAS +++ +++ Ne ++ ++++ +++ ++++

ICP/MS ++++ ++++ Da ++++ ++++ ++++ ++++

Nisko= +; Visoko=++++; UV-VIS = Ultra ljubičasta i vidljiva spectrofotometrija; TLC=Tankoslojna

hromatografija; IA= Imunoesej;GC= Gasna hromatografija;AAS=Atomska absorpciona
spektrometrija; ICP-MS=Induktivno spregnuta gasno masena spektrometrija
 Analiza jedinjenja srednje

UHPLC-MS/MS • Brza
• Osetljiva
i visoke polarnosti
(lekovi, pesticidi, droge,
proteini, nukleinske kiseline,
• Specifična
ugljenihidrati, azo -
jedinjenja, steroidi,
ugljovodonici, antibiotici,
metalo-organska jedinjenja)

Primena široka: analiza kvaliteta životne sredine,

hrane, proteomika, genomika, kontrola SKIZ, u
farmaceutskoj industriji otkrivanje i razvoj novih
lekova, prevencija i/ili praćenju mogih bolesti
genetske, endokrinološke, metaboličke ili
hematološke etiologije, pre-natalnim i post-
natalnim screenig

Šema MRM – Multi Reaction Monitoring moda

Validacija bioanalitičkih (BA) metoda
■ Validacija metode može biti delimična ili potpuna i obuhvata najmanje 4 faza: 1)
validaciju softvera, 2) kvalfikaciju ili validaciju analtčkih instrumenata, 3)
validaciju metode, i 4) validaciju pogodnosti sistema
■ Proces validacije BA metode otpočinje validacijom softvera i kalibracijom
instrumenta, zatim se ispituje i razvija analitička metoda i na kraju potvrđuju
performanse metode testovima za pogodnost sistema (test uzorci – kalibratori)
■ Referentni analitički standardi
■ Interni standardi
■ Osnovni rastvori standarda
■ Radni rastvori standarda
■ Opterećeni uzorci (važni za određivanje prinosa metode)
Validacioni parametri
■ Razvoj bioanalitičke metoda može se podeliti na tri dela:
o priprema referentnih standarada,
o razvoj i validacija metode i
o primena validirane metode na rutinske analize otrva/lekova.
■ Analitičke karakteristike koje se ispituje u validaciji bioanalitičkih metoda su:
o Limit detekcije (LOD), limit kvantifikacije (LOQ), linearnost, opseg merenja,
kalibracione krive standarda i kalibtratora
o Selektivnost/specifičnost
o Tačnost, preciznost (inter i intra dnevna) i ekstrakcioni prinos
o Stabilnost uzoraka
o Robustnost (postojanost) metode
Kraj