CÔNG NGHỆ VI SINH

ĐỀ TÀI: Sản xuất insulin tái tổ hợp

GVHD: Nguyễn Thị Lâm Đoàn

Nhóm: 02
Lớp: K63CNSTHA
Danh sách nhóm:

STT Họ và tên MSV Lớp

1 Đỗ Ngọc Linh 636022 K63CNSTHA

2 Vũ Thị Huyền Lâm 634931 K63CNSTHA

3 Nguyễn Thị Hoàng 636016 K63CNSTHA

 TÌM HIỂU VỀ
1 INSULIN

INSULIN TÁI TỔ
HỢP 2

ƯU NHƯỢC ĐIỂM
3 INSULIN

ỨNG DỤNG 4
1. Tìm hiểu về Insulin

1.1 Nguồn gốc:

Insulin là một loại hormon quan trọng, giúp cơ thể hấp thu
glucose – một trong những thành phần chính cung cấp năng
lượng cho con người.

Nguồn gốc của Insulin:

+ Nguồn gốc động vật : từ tụy của bò hay lợn.
+ Insulin người :
Được sản xuất từ Insulin động vật qua các phương pháp:
+ Bán tổng hợp từ Insulin lợn
+ Tái tổ hợp gen: là loại Insulin trung tính đơn thành phần,
được sản xuất bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA.
1.2 Cấu tạo

•Là một protein gồm 51 acid amin tạo thành 2 chuỗi polypeptid:
 Chuỗi A gồm 21 acid amin,
 Chuỗi B gồm 30 acid amin
 Nối nhau bằng 2 cầu nối S-S (disulfua)

Mặc dù trình tự các acid amin khác nhau giữa các loài nhưng 1 số
đoạn nhất định của phân tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó chứa 3 cầu
nối đisulfua , cả 2 đầu của chuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH
của chuỗi B. Sự tương đồng trong trình tự acid amin dẫn đến cấu trúc 3
chiều của Insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau. Insulin chiết rút
từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác.
1.3 Phân loại
 Có 4 loại Insulin :
 Insulin có tác dụng nhanh
 Insulin tác dụng bán chậm ( trung bình)
 Insulin tác dụng chậm
 Insulin hỗn hợp
1.4 Cơ chế
 Thời gian bán hủy 3-5 phút
 Bị phá hủy tại đường tiêu hóa bởi
enzyme proteinase tại dạ dày
 Hấp thu tốt bằng đường tiêm. Mức độ
phụ thuộc vào nồng độ Insuin, vị trí
tiêm, độ sâu của mũi tiêm, vận động
 Insulin bị chuyển hóa tại gan, thận,
cơ. Trong đó 50% tại gan
 Đào thải qua thận
2. Sản xuất Insulin từ DNA tái tổ hợp

2.1 DNA tái tổ hợp:

 Là DNA có thể tạo ra từ nhiều vật liệu di
truyền khác nhau (nhờ kỹ thuật ghép nối các
đoạn DNA cùng một loại hoặc các loại khác
nhau)
 VD: Sản xuất vaccine Covid-19 mang tên
Nanocovax. Các chuyên gia sử dụng công nghệ
tái tổ hợp protein, nCoV có dạng hình cầu, có
các S-protein gai bao quanh. Sử dụng S-protein
trên nCoV gắn vào một dòng tế bào động vật
mà Nanogen nuôi cấy. Tế bào phân chia lớn lên
sản xuất re protein . Sau đó, protein tách riêng
và được làm sạch, chở thành bán thành phẩm
tiếp tục được pha chế với tá dược để chở thành
vaccine thành phẩm.
3, Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp:

Ngày nay, có rất nhiều các phương pháp sản xuất

insulin tái tổ hợp được ra đời với mục đích phát
hiện ra phương pháp sản xuất isnulin có năng
suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang bằng
hoặc vượt trội hơn so với những hệ thống sản
xuất insulin đã có từ trước đến nay. Hầu hết các
phương pháp sản xuất insulin thương mại đều
dựa trên chủng nấm men (saccharomyces
cerevisiae), vi khuẩn (E.coli),… kết hợp với gene
để sản xuất ra insulin

Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp

miniproinsulin(MPI):
 Hướng nghiên cứu mới:

 Nhóm nghiên cứu của Novo Nordisk đã nghiên cứu phát triển về chủng nấm men P.pastorist
thấy có nhiều ưu điểm hơn so với S. cerevisiae

 Sử dụng chủng vi sinh vật Pichia pastoris

 Uư thế của P.pastoris:
+) Vi sinh vật đơn bào, dễ dàng nuôi cấy, dễ thao tác an toàn với con người.
+) Có một promoter mạnh, sử dụng chất cảm ứng là methanol.
+) Phát triển ở pH 3÷ 7 do đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động protase đối với
protein tiết ra
+) Phát triển mật độ tế bào cao hơn nhiều lần so với S. cerevisiae
+) Thành phần môi trường đơn giản ,chi phí lên men thấp.
 
2.2 Sơ đồ quy trình
Mã hóa pCR2.1
miniproinsulin

E.Coli DH5-alpha Chuyển plasmid có đoạn gen

mong muốn vào tế bào
P.pastoris
Tách triết kiểm tra trình
tự gen Sàng lọc tế bào có MPI
cao

Phân lập gen

pPIC9K
Biểu hiện MPI khi
nuôi cấy
Chuyển plasmid pPIC9K vào
tế bào nhân E.coli DH5-alpha
Thu nhận tinh sạch MPI

Tách triết kiểm tra trình tự Chuyển hóa MPI thành

gen insulin
2.3 Thuyết minh quy trình

Bước 1: tổng hợp gen mã hóa cho MPI

 Trong nghiên cứu này,trình tư gen mã hóa insulin
đã được thay đổi so với cấu trúc của proinsulin,
trong đó bao gồm 53 amino acid: chuỗi B 29
amino acid, mini C 3 amino acid ( Asp-Gly-Lys),
chuỗi A 21 amino acid.
 Do có nhiều trình tự bị thay thế trong chuỗi
amino acid sử dụng phương pháp hóa học để
tổng hợp gen với khuôn mẫu mRNA người với
cặp mồi đặc chưng cho gen mã hóa insulin.
 2 chuỗi olinucleotide mã hóa cho MPI sau khi
được tổng hợp hóa học. Tiếp tục Phân tích PCR
để kéo dài 2 đoạn oligonucleotide thành trình tư
DNA mạch đôi hoàn chỉnh.
Proinsulin
 Bước 2: Chuyển plasmid chứa MPI vào E.coli

 PMI và pCR2.1 được dòng hóa trong TA

cloning kit ở nhiệt độ 16 để qua đêm với
enzym nối ligase. Qúa trình nối này sẽ tạo ra
plasmid pCR2.1 có chứa MPI
 Plasmid pCR2.1 chứa MPI được biến nạp
vào E.coli. Trong môi trường LB chứa Amp.
Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mọc plasmid pCR2.1
lên có màu trắng và tiếp tục đi phân tích
PCR với cặp mồi m13F
 Khuẩn lạc cho kết quả dương tính được tách
triết plasmid được cắt bởi các enzym giới
hạn EcoRI và NotI.
Bước 3: Chuyển plasmid pPIC9K vào tế bào nhân E.coli

 Plasmid pCR2.1 có chứa MPI và Plasmid

pPIC9k được cắt bởi enzym giới hạn. Nối
đoạn cắt pCR2.1 có chứa MPI vào Plasmid
pPIC9k bằng enzym nối tạo ra plasmid tổ hợp
mới plasmid pPIC9k chứa MPI
 Tiếp tục, được cấy vào E.coli và được nuôi
cấy trên môi trường LB lần 2 chứa Amp ủ ở
37. Sau đó các khuẩn lạc được kiểm tra bằng
phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F và
AOX1-R
 Plasmid pPIC9k chứa MPI sử dụng enzym
giới hạn cắt tại vị trí HIS4 và điện biến nạp
vào tế bào của nấm men
 Bước 4: Chuyển Plasmid có chứa gen mong muốn vào P. pichiapastoris

 plasmid pPIC9k chứa MPI điện biến nạp vào tế bào của nấm men. Sau khi biến nạp tái tổ
hợp tương đồng diễn ra giữa plasmid pPIC9k và genome nấm men, đem sàng lọc trên môi
trường MD.
 plasmid pPIC9k chứa MPI có chứa gen HIS4 có khả năng tổng hợp histidine. Do đó tái tổ
hợp tương đồng diễn ra giữa plasmid pPIC9k và genome nấm men mới có thể mọc trên
môi trường này.
 Các khuẩn lạc mọc trên MD được tách triết genomic DNA để kiểm tra sự hiện diệc của
MPI bằng PCR vời cặp mồi AOXI-F và AOXI-R
 Bước 5:Sàng lọc tế bào có MPI cao

 Khuẩn lạc cho kết quả dương tính tiếp

tục được nuôi cấy môi trường YPD với
nồng độ kháng sinh Genetici tăng dần
nhằm sàng lọc chủng P. pastoris có nhiều
bản sao mã hóa cho MPI.
 Màng nitocelluse được áp lên màng
nấm men tiếp tục nuôi cấy qua đêm.
MPI được nấm men tiết ra sẽ bám trên
màng. Kháng thể đặc hiệu Abcam đậm
hay nhạt sẽ là biểu hiện khả năng sinh
MPI cao hay thấp.

Biểu hiện của MPI trong tế bào nấm men

 Bước 6: Biểu hiện MPI khi nuôi cấy

Biểu hiện ở quy mô nuôi lắc Biểu hiện ở quy mô fermentor

 Bước 7: Thu nhận và tinh sạch MPI Chuyển hóa MPI thành Insulin

 MPI sau khi tinh sạch được cắt bằng trispsin để loại bỏ C- pepdide (phân cắt proinsulin) ,
đồng thời gắn thêm Thr(b30) để tạo thành insulin hoàn chỉnh.

PMI chuyển hóa thành insulin

 3. Ưu điểm, nhược điểm của insulin tái tổ hợp

3.1 Ưu điểm:
- Insulin tái tổ hợp có thể được điều chế trên quy mô lớn mà
không cần lo lắng về nguồn động vật.
- Có thể duy trì tính nhất quán của từng mẻ và chất lượng cũng có
thể được duy trì.
- Giúp ngăn chặn sự tàn ác đối với động vật.
- Các cơ hội phản ứng dị ứng đã được giảm thiểu.
- Các cơ hội lây truyền bệnh từ nguồn động vật đã bị vô hiệu hóa.
- Insulin tái tổ hợp gần như đã thay thế được insulin có nguồn gốc
từ động vật trên khắp thế giới.
3. 2 Nhược điểm:
- Một số bệnh nhân tiểu đường phàn nàn về sự gia tăng các đợt biến
chứng hạ đường huyết
- Chi phí sản xuất có xu hướng cao
4. Ứng dụng insulin

Điều trị bệnh đái tháo đường

Cách tiêm insuln vào cơ thể

Link tham khảo:
 https://%3A%2F%2Fluanvan.net.vn%2Fluan-van%2Fsan-xuat-insulin-tai-to-hop-70163%2F%3Ffbclid
%3DIwAR19W8Rj8e0D3bnEpOMt-
JWqMSYiorOu7ZDU5G74Sg6znH4MKO2tjly2Uf8&h=AT2Mxi5w5VaFS6Hs4pu8vvN7rsgG-
dmHqpcQEbCvTYpKy6TDzJ8qnJUFga8p00WlIiYrFfHjWrg2dJ5kA8wYnY2taIb14L9E3iYJkeDe3k87Sm
8FPGQiBp_qTotzbcwIQbC_fd8Oar_kYCs
 https://www.scribd.com/presentation/60795806/Cong-ngh%E1%BB%87-s%E1%BA%A3n-xu%E1%BA
%A5t-insulin-tai-t%E1%BB%95-h%E1%BB%A3p?fbclid=IwAR3yJuJsoLKjRnQTn6u-9dRAQwOuVcF
x3di8agFCEklS4fnbUtiuuoN0b9g
 http://bvdkquangnam.vn/index.php/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dn
a-tai-t-hp-
 http://khoasinhhoc.vinhuni.edu.vn/nghien-cuu-khoa-hoc/seo/insulin-va-cong-nghe-san-xuat-insulin-tren
-the-gioi-48864
 https://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin
 https://www.toppr.com/ask/question/list-the-advantages-of-recombinant-insulin/?fbclid=IwAR01UdgzF
R0jbrg2GdNYamgtFmdd25HSu6lwMXdNyiOXt7P68CFAPNI6VIo
 https://www.thuocbietduoc.com.vn/tin-tuc-27760-1-23/cac-loai-insulin-trong-dieu-tri-dai-thao-duong.as
px