1

Sử dụng vi khuẩn E.coli để sản xuất insulin điều trị bệnh tiểu
đường

Khái niệm
 Insulin là một loại hormone từ các tế bào đảo tụy ở tuyến
tụy tiết ra. Chúng có tác dụng chuyển hóa các chất
carbohydrate trong cơ thể. Insulin còn có tác dụng đến
việc chuyển hóa các mô mỡ và gan thành loại năng lượng
ATP để cung cấp cho hoạt động của cơ thể.
 Insulin được tổng hợp ở tế bào Beta trong đảo tụy bằng
sự hoạt động của bộ máy tổng hợp protein trong tế bào.
Insulin cũng là tác nhân duy nhất trong cơ thể có thể làm
giảm nồng độ Glucose trong máu.

Vai trò của insulin

-Sau khi chúng ta ăn một bữa cơm thì một lượng
tinh bột khá lớn sẽ đi vào cơ thể, khi đó chúng sẽ
làm tăng sự kích thích đến tế bào beta ở đảo tụy để
có thể tiết ra Insulin. Sau đó, Insulin sẽ tác động
vào các quá trình giữ và dự trữ glucose trong cơ thể
và đặc biệt là gan và mô mỡ.

-Khi nồng độ glucose trong máu của bạn cao thì

glucose sẽ được dự trữ dưới dạng glycogen và được
dự trữ trong gan và khi bạn đói, lượng glucose
trong máu giảm, glycogen sẽ được biến đổi trở lại
thành glucose để tiếp tục đi vào máu, đảm bảo lượng đường trong máu.

Vai trò của Insulin:

 Insulin gây ức chế enzyme phosphorylase, khiến cho quá trình biến đổi glycogen
thành glucose trở nên chậm.
 Insulin tăng cường hấp thu glucose.
 Insulin làm tăng cường hoạt tính của enzyme để tổng hợp glycogen.

Insulin ảnh hưởng lớn đến lượng đường trong máu. Bệnh đái tháo đường có nguyên
nhân từ việc lượng đường trong máu tăng cao. Insulin chính là hormone làm ức chế sự
chuyển hóa glycogen thành glucose và đi vào máu, nếu như thiếu hụt Insulin thì glycogen
sẽ không ngừng chuyển hóa và đưa một lượng thừa thãi glucose vào máu gây ra đái tháo
đường.

Mối liên hệ giữa insulin và bệnh tiểu đường

Insulin có mối quan hệ mật thiết đối với bệnh tiểu đường, cụ thể:
 2
Sử dụng vi khuẩn E.coli để sản xuất insulin điều trị bệnh tiểu
đường
Đối với người bệnh tiểu đường type 1 thì các tế bào beta ở tụy bị phá hủy dẫn tới hiện
tượng bị thiếu insulin hoàn toàn, sự thiếu hụt này có ảnh hưởng lớn tới sức khỏe của
người bệnh. Do đó, người bệnh tiểu đường type 1 cần được điều trị bằng cách bổ sung
insulin từ bên ngoài vào trong cơ thể theo phác đồ của bác sĩ.

Ở những người mắc tiểu đường type 2, mặc dù cơ thể vẫn có thể sản xuất được insulin
nhưng quá trình sản xuất này không được tốt như người khỏe mạnh bình thường mà có
hiện tượng kháng insulin ở tế bào đích. Do đó, trong giai đoạn đầu, cơ thể có phản ứng
bằng cách tăng tiết insulin cho tới khi bệnh tiến triển dẫn tới các tế bào ở beta tụy bị suy
giảm dẫn tới người mắc tiểu đường type 2 cần phải được phối hợp điều trị bằng thuốc
hoặc sử dụng cả thuốc cùng với insulin theo chỉ dẫn của bác sĩ.

Từ đó cho thấy insulin đối với cơ thể người mắc bệnh tiểu đường đặc biệt quan trọng bởi
nó đóng vai trò quyết định trong việc điều trị bệnh tiểu đường.

Cấu trúc

Cấu trúc của insulin là một polypeptide bao gồm một chuỗi A với 21 acid
amin và một chuỗi B với 30 acid amin, có một cầu nối disulfur trong chuỗi
A và 2 cầu nối disulfur nối giữa 2 chuỗi A và B. Insulin ban đầu được tổng
hợp dưới dạng tiền insulin (Preproinsulin) trên ribosom trong tế bào beta ở
đảo langerhans của tuyến tuỵ. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao
gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptid C với
31 acid amin và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận
chuyển qua lưới nội chất, peptid tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-
 3
Sử dụng vi khuẩn E.coli để sản xuất insulin điều trị bệnh tiểu
đường
A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba.
Proinsulin bị phân cắt bởi Enzym PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptid C và sau đó bị phân cắt
bởi enzym PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptid C. Hai acid amin đầu N của peptide nối
với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzym
carboxypeptidaseH.

Sử dụng trong y tế

-Insulin sinh tổng hợp (insulin người rDNA, INN) dùng trong
lâm sàng được sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.
Insulin sinh tổng hợp của con người đã tăng độ tinh khiết khi
so sánh với insulin động vật chiết xuất, tăng cường độ tinh
khiết làm giảm sự hình thành kháng thể. Các nhà nghiên cứu
đã thành công trong việc đưa gen cho insulin người vào thực
vật như một phương pháp sản xuất insulin khác
("biopharming") trong hồng hoa. Kỹ thuật này được dự đoán
để giảm chi phí sản xuất.

-Một số chất tương tự của insulin người có sẵn. Các chất

tương tự insulin này có liên quan chặt chẽ đến cấu trúc insulin
của con người, và đã được phát triển cho các khía cạnh cụ thể
của kiểm soát đường huyết về mặt hành động nhanh (insulins
prandial) và hành động dài (insulins cơ bản). Chất tương tự insulin sinh tổng hợp đầu tiên được
phát triển để sử dụng lâm sàng vào bữa ăn (insulin dạng bột), Humalog (insulin lispro), nó được
hấp thu nhanh hơn sau khi tiêm dưới da so với insulin thông thường, với hiệu quả 15 phút sau khi
tiêm. Tương tự nhanh chóng tác dụng khác là Novorapid và Apidra, với hồ sơ tương tự. Tất cả đều
được hấp thụ nhanh chóng do các chuỗi amino acid sẽ làm giảm sự hình thành các chất làm mờ và
hexamer (insulins monomeric được hấp thụ nhanh hơn). Insulins tác dụng nhanh không yêu cầu
khoảng thời gian tiêm vào bữa ăn được khuyến nghị trước đây đối với insulin người và insulin
động vật. Loại khác là insulin tác dụng dài; đầu tiên trong số này là Lantus (insulin glargine).
Chúng có tác dụng ổn định trong thời gian dài từ 18 đến 24 giờ Tương tự, một chất tương tự
insulin kéo dài khác (Levemir) dựa trên phương pháp acyl hóa axit béo. Một phân tử axit myristic
được gắn vào chất tương tự này, liên kết phân tử insulin với albumin huyết thanh dồi dào, từ đó
giúp kéo dài tác dụng và giảm nguy cơ hạ đường huyết. Cả hai chất tương tự kéo dài chỉ cần được
thực hiện một lần mỗi ngày và được sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường loại 1 dưới dạng insulin cơ
bản. Một sự kết hợp giữa tác dụng nhanh và insulin kéo dài cũng có sẵn, khiến bệnh nhân có nhiều
khả năng đạt được một hồ sơ insulin bắt chước việc giải phóng insulin của cơ thể.
 4
Sử dụng vi khuẩn E.coli để sản xuất insulin điều trị bệnh tiểu
đường
Insulin thường được sử dụng dưới dạng tiêm dưới da bằng ống tiêm sử dụng một lần bằng kim, qua
bơm insulin hoặc bằng bút insulin sử dụng nhiều lần bằng kim dùng một lần. Insulin hít cũng có
sẵn ở thị trường Mỹ.

Insulin tổng hợp có thể kích hoạt tác dụng phụ, vì vậy một số người mắc bệnh tiểu đường phụ
thuộc vào insulin nguồn động vật.

Không giống như nhiều loại thuốc, insulin hiện không thể dùng bằng đường uống vì gần như tất cả
các protein khác được đưa vào đường tiêu hóa, nó bị phá vỡ thành các mảnh, do đó mọi tác động
đều bị mất. Đã có một số nghiên cứu về cách bảo vệ insulin khỏi đường tiêu hóa, để nó có thể được
dùng bằng đường uống hoặc ngậm dưới lưỡi.

Công nghệ sản xuất insulin từ vi sinh vật

-Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến
đổi gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis …)hoặc nấm men (Saccharomycescerevisiae,
Pichiapastoris…)

-Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen là: nhóm
phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp miniproinsulin:

+Phương pháp 1: Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp 2 chuỗi
Phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử
dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro tạo cầu nối
disulfur. Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát triển một
phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi
A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt
peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin.
 5
Sử dụng vi khuẩn E.coli để sản xuất insulin điều trị bệnh tiểu
đường

+Phương pháp 2: Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp miniproinsulin(MPI)
Phương pháp này biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với
nhau bằng 2 acid amin, được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in
vitro bằng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối
disulfur được hình thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và
miniproinsulin này được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường
nuôi cấy.
 6
Sử dụng vi khuẩn E.coli để sản xuất insulin điều trị bệnh tiểu
đường
  Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng
rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, tế bào vi sinh
vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy mô sản xuất
công nghiệp, nhiều nhất là E. coli và nấm men. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống
biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp - đó là Bacillus brevis.
            Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển một hệ
thống biểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất
phải ngang bằng hay vuợt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới
nay. Hay nói cách khác, các nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp
cổ điển chuyển các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối
ưu cho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm
ra một hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao.