Nhân bản vô tính và biểu hiện Chymosin hoạt tính của

Yak ở Pichia pastoris

trừu tượng

Rennet, một phức hợp enzym được tìm thấy trong dạ dày của động vật nhai
lại, là một thành phần quan trọng để sản xuất phô mai. Trong nghiên cứu của
chúng tôi, chúng tôi đã mô tả rằng Pichia pastoris tái tổ hợp gen yak
chymosinchủng có thể phục vụ như một nguồn mới để sản xuất rennet. RNA
tổng số của bò Tây Tạng được chiết xuất từ dạ múi khế của bò Tây Tạng
chưa cai sữa. Các gen preprochymosin, prochymosin và chymosin của yak từ
RNA tổng số được phân lập bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu cho
gen dựa trên trình tự gen chymosin của gia súc tương ứng và phân tích kiểu
biểu hiện của chúng bằng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực. Kết quả
cho thấy mức độ biểu hiện gen chymosin của bò Tây Tạng đang bú sữa cao
gấp 11,45 lần so với bò Tây Tạng trưởng thành và chymosin của bò Tây
Tạng thuộc họ Bovidae trong phân tích phát sinh loài. Để thể hiện từng loại,
các gen preprochymosin, prochymosin và chymosin lần lượt được gắn vào
vectơ biểu hiện pPICZαA, và được biểu hiện trong Pichia pastoris X33. Kết
quả cho thấy tất cả các dòng vô tính tái tổ hợp của P. pastorischứa gen
preprochymosin, prochymosin hoặc chymosin có thể tạo ra dạng hoạt động
của chymosin tái tổ hợp vào dịch nổi phía trên môi trường nuôi
cấy. Prochymosin được biểu hiện dị loại (14,55 đơn vị Soxhlet/mL) có hoạt
tính enzym cao nhất trong số ba enzym chymosin được biểu hiện. Do đó,
chúng tôi đề xuất rằng chủng Pichia pastoris tái tổ hợp gen yak chymosin có
thể cung cấp một nguồn sản xuất rennet thay thế.

Từ khóa: Hoạt chất Chymosin, Yak, Biểu hiện, Pichia pastoris

Đi đến:

GIỚI THIỆU
Chymosin, trước đây được gọi là rennin, là một proteinase aspartate được tìm
thấy trong dạ dày thứ tư của bê con đang bú sữa, trong số các loài động vật
khác ( Ustunol và Hicks, 1990 ). Enzym này có thể hoạt động chống lại liên
kết peptit Phe 105 -Met 106 có trong các phân tử k-casein của sữa ( Foltmann, 1969 ),
tạo ra para-k-casein không hòa tan và kết quả là làm đông sữa ( McMahon và
cộng sự, 1984 ). Theo truyền thống, nó được sử dụng trong bước tiền thân
trong quá trình sản xuất các loại pho mát khác nhau ( Rao et al.,
1998). Chymosin được tổng hợp như một protein tiền thân (preprochymosin,
381 axit amin) có một peptide tín hiệu 16 axit amin. Chuỗi tín hiệu này được
loại bỏ để tạo ra prochymosin. Zymogen này sau đó được chuyển thành
chymosin hoạt động bằng cách phân cắt một pro-peptide gồm 42 axit amin ở
đầu NH 2 được tạo điều kiện thuận lợi bởi các điều kiện axit có trong dạ dày
( Pedersen et al., 1979 ).

Cho đến nay, rennet thương mại đến từ bốn nguồn khác nhau: Động vật, thực
vật, vi sinh vật và rennet tái tổ hợp. Tất cả bốn loại rennet thương mại đều
được sử dụng bởi ngành công nghiệp phô mai ( Vallejo et al., 2008 ). Tầm
quan trọng thiết yếu của nó trong sản xuất pho mát kết hợp với nhu cầu pho
mát cao hiện nay đã dẫn đến sự thiếu hụt rennin trên toàn thế giới. Sự thiếu
hụt này càng trở nên trầm trọng hơn do thị trường thịt bê bị thu hẹp; rennet
bò theo truyền thống được chiết xuất từ dạ dày của những con bê chưa cai
sữa. Nhu cầu khổng lồ này đã dẫn đến một số sản phẩm thay thế, đáng chú ý
là rennet thực vật, vi khuẩn và tái tổ hợp. Dịch rennet có nguồn gốc từ thực
vật đã được chiết xuất từ thực vật như atisô ( Chazarra et al., 2007), tuy
nhiên, những cây này chỉ được tìm thấy ở những khu vực địa lý hạn chế và
được sử dụng để sản xuất một số loại phô mai cụ thể. Rennet vi sinh vật thu
được từ dịch nổi nuôi cấy vi khuẩn như Aspergillus oryzae ( Vishwanatha et
al., 2010 ) hoặc Endothia parasitica ( Sardinas, 1968 ). Loại men dịch vị này
chứa hàm lượng protease cụ thể thấp có thể tạo ra vị đắng trong sản phẩm và
tạo ra sản lượng sữa đông thấp trong quá trình làm pho mát ( Davies và Law,
1984 ). Loại rennet còn lại thường được sử dụng, rennet tái tổ hợp, thu được
từ các vi sinh vật tái tổ hợp có chứa gen chymosin từ Bos Taurus (Emtage và
cộng sự, 1983 ; Cullen et al., 1987 ) có và các tính năng của cả chi phí thấp
và nguồn ổn định.

Bò Tây Tạng (Bos grunniens) là một loài gia súc ăn cỏ quan trọng được tìm
thấy trên cao nguyên Tây Tạng, nơi mà rất ít động vật nuôi trong nhà khác có
thể sống sót. Nó cung cấp hầu hết các sản phẩm động vật (thịt, lông, sữa,
v.v.) cho người dân sống trên cao nguyên Tây Tạng ( He và Li, 2004 ). Hiện
nay, chymosin của dê ( Vega-Hernandez và cộng sự, 2004 ), chymosin của
lạc đà ( Kappeler và cộng sự, 2006 ) và chymosin của trâu ( Vallejo và cộng
sự, 2008 ) đã được sản xuất bởi các vi sinh vật. Tuy nhiên, chymosin của yak
do giá trị thương mại cao đã không được báo cáo trước đây. P. pastoris một
hệ thống biểu hiện sinh vật nhân chuẩn tuyệt vời mang lại mức độ biểu hiện
cao của protein tái tổ hợp, xử lý protein, gấp protein và biến đổi sau dịch
mã. Ngoài ra, P. pastoris đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kỳ (FDA) ( Zhang et al., 2009 ) phê chuẩn là một hệ thống biểu
hiện an toàn và hiệu quả. Do đó, P. pastoris là sự lựa chọn ưa thích để sử
dụng làm vật chủ để biểu hiện yak chymosin tái tổ hợp. Trong bài báo này,
chúng tôi báo cáo quá trình nhân bản, phân tích tin sinh học, phát hiện biểu
hiện và phân tích enzyme của yak chymosin dị loại, đồng thời cung cấp một
chymosin mới để sử dụng trong sản xuất pho mát.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động
vật Thể chế của Đại học Tây Nam (số giấy phép: 2013-3-2).

Động vật và mẫu

Ba con bò Tây Tạng đực khỏe mạnh 2 tháng tuổi và 3 đến 4 tuổi từ quận
SongPan của tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc đã được chọn cho thí nghiệm
này. Các mẫu mô từ mô dạ múi khế được thu thập sau khi động vật được phú
dưỡng.

Các chủng, vectơ và điều kiện nuôi cấy

Các tế bào Escherichia coli DH5α và vec tơ pMD19-T (TAKARA, Đại Liên,

Trung Quốc) đã được sử dụng để thao tác và khuếch đại DNA. P.
pastoris X33 và pPICZαA được sử dụng để biểu hiện các gen
preprochymosin, prochymosin và chymosin.
Môi trường Luria Bertani (10 g/L tryptone, 5 g/L chiết xuất nấm men và 10
g/L NaCl, ở độ pH từ 7 đến 7,5) được bổ sung ampicillin (100 μg/mL) hoặc
Zeocin (25 μg/mL) được được sử dụng để nuôi cấy E. coli DH5α. Môi trường
chiết xuất nấm men, peptone, dextrose (YPD) (chiết xuất nấm men 10 g/L,
peptone 10 g/L và glucose 20 g/L) được bổ sung Zeocin (100 μg/mL) được
sử dụng để lựa chọn chất biến đổi P. pastoris X33. Phức hợp đệm glycerol
(BMGY) (20 g/L tryptone, 10 g/L chiết xuất men, 3 g/LK 2 HPO 4 , 11,8 g/L
KH 2 PO 4, 100 mL/L 10×bazơ nitơ men không có axit amin (YNB), 1 mL/L
500×Biotin và 10 mL/L glycerin) và phức metanol đệm (BMMY) (20 g/L
tryptone, 10 g/L chiết xuất nấm men, 3 g/LK 2 HPO 4 , 11,8 g/L KH 2 PO 4 ,
100 mL/L 10×YNB, 1 mL/L 500×biotin và 5 mL/L Methanol) đã được sử
dụng để biểu hiện P tái tổ hợp .mục sư.

Phân lập và nhân bản các gen preprochymosin, prochymosin và chymosin

Các mẫu mô của dạ múi khế đã được thu thập ngay sau khi một con bò Tây
Tạng đang hút thuốc trợ tử. Mô này được rửa sạch trong nước đã xử lý bằng
diethyl pyrocarbonate (DEPC) và sau đó được đông lạnh trong nitơ
lỏng. Tổng RNA được phân lập từ dạ dày bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen,
Grand Island, NY, USA), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng và
nồng độ của từng mẫu RNA được đánh giá bằng phương pháp quang phổ tử
ngoại.

Chuỗi cDNA đầu tiên được tổng hợp bằng cách sử dụng PrimeScript RT-
PCR Kit (TAKARA, Đại Liên, Trung Quốc), theo hướng dẫn do nhà sản xuất
khuyến nghị. Gen của preprochymosin thu được bằng phản ứng chuỗi
polymerase (PCR) sử dụng đoạn mồi đặc hiệu theo trình tự Preprochy-F và
Preprochy-R (Bảng 1) được thiết kế từ trình tự preprochymosin của B.
Taurus (mã gia nhập Genebank: NM_1890994). Hỗn hợp phản ứng chứa
mẫu cDNA 1 μL, Bộ đệm 10×Ex Taq 2,5 μL, dNTP Mix 2 μL, Preprochy-F 1
μL, Preprochy-R 1 μL, ExTaq DNA polymerase 0,13 μL, Mgcl 2 2 μL và
ddH 2O 15,37 μL. Chương trình cho phản ứng PCR này là 95°C trong 2 phút,
35 chu kỳ ở 95°C trong 30 giây; 66°C trong 1 phút và 72°C trong 2 phút; và
bước cuối cùng là 72°C trong 5 phút. Quá trình sản xuất PCR sau đó được
sao chép vào vec tơ pMD19-T (TAKARA, Đại Liên, Trung Quốc), có tên là
pMD19-T-Preprochy, và đoạn gen chèn vào đã được giải trình tự bởi Sangon
Biotech Co., Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc). Các gen preprochymosin,
prochymosin và chymosin được khuếch đại từ pMD19-T-Preprochy bằng
cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu cho gen: Pre-F và Chy-R, Pro-F và Chy-
R, Chy-F và Chy-R (Bảng 1), và sau đó các đoạn khuếch đại được chèn vào
vectơ pMD19-T, có tên gọi lần lượt là pMD19-T-Pre, pMD19-T-Pro và
pMD19-T-Chy.

Bảng 1
Oliglonucleotide được sử dụng trong công việc này 1

 Các nucleotide được gạch dưới biểu thị trình tự phân cắt của Xho I hoặc Xba I. Các nucleotide
1

được đóng hộp biểu thị trình tự phân cắt của endopeptidase được mã hóa bởi gen KEX2 . Các
nucleotide được tô bóng đại diện cho trình tự phân cắt của dipeptidyl aminopeptidase được mã
hóa bởi gen STE13 .

Chuyển đổi và sàng lọc nấm men

Ba đoạn Xho I và Xba I của preprochymosin, prochymosin và chymosin được

thu được từ vectơ pMD19-T chứa các trình tự cDNA giống nhau và được sao
chép vào vectơ pPICZαA đã được tiêu hóa trước đó bằng cùng một loại
enzyme cắt giới hạn. Sau đó, các vectơ này được biến đổi thành E.
coli DH5α. Plasmid pPICZαA tái tổ hợp được tuyến tính hóa bởi Sac I sau đó
biến nạp vào P. pastorisX33 bằng điện di. Cuối cùng, các tế bào biến đổi
được sàng lọc trên môi trường peptone detrose chiết xuất men với sorbitol
(YPDS) (1% [w/v] chiết xuất men, 2% [w/v] peptone, 2% [w/v] dextrose, 1
M sorbitol , và các đĩa thạch 2% [w/v] chứa zeocin ở nồng độ cuối cùng là
100 μg/mL. Sự tích hợp của các gen preprochymosin, prochymosin và
chymosin vào bộ gen P. pastoris đã được xác nhận bằng PCR sử dụng DNA
bộ gen của nấm men làm khuôn mẫu và các đoạn mồi đặc hiệu của gen
trongBảng 1.

Biểu hiện ở P. pastoris

Các khuẩn lạc tái tổ hợp của P. pastorisđược nuôi cấy trong 25 mL BMGY ở
30°C và quay ở tốc độ 240 vòng/phút cho đến khi nuôi cấy đạt OD600 = 2
đến 6 (~16 đến 18 giờ). Các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 1.500
× g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, phần nổi phía trên được gạn và
viên tế bào được tái huyền phù thành OD600 là 1,0 trong môi trường BMMY
để tạo biểu hiện (khoảng 100 đến 200 mL). Nuôi cấy được đặt trong một bình
500 mL. Tiếp theo, bình được phủ 7 lớp gạc vô trùng và đưa trở lại tủ ấm để
tế bào tiếp tục phát triển. Methanol tinh khiết được thêm vào môi trường nuôi
cấy với nồng độ cuối cùng là 1% cứ sau 24 giờ để duy trì cảm ứng. Một mL
dịch nổi phía trên của môi trường nuôi cấy biểu hiện được chuyển vào ống vi
ly tâm 1,5 mL cứ sau 24 giờ. Những mẫu này được sử dụng để phân tích hoạt
động của enzyme và xác định thời điểm thu hoạch tối ưu. Amoni sulfat bão
hòa được thêm vào phần nổi phía trên để đạt được nồng độ cuối cùng là
60%. Phần nổi phía trên sau đó được ly tâm ở tốc độ 12.000 × g trong 2 phút
và protein nổi phía trên được thu thập để phân tích điện di trên gel natri
dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE).

xét nghiệm enzyme

Quá trình nuôi cấy cảm ứng của P. pastoris tái tổ hợp được ly tâm ở
12.000×g trong 2 phút. Sau đó, phần nổi phía trên được sử dụng trực tiếp để
xác định hoạt tính chymosin.

Hoạt tính chymosin trong dịch nuôi cấy nổi phía trên được đo bằng phương
pháp của Arima K ( Arima et al., 1970 ). Tóm lại, 0,5 mL dung dịch enzyme
được đặt vào ống nghiệm 10 mL, sau đó thêm 5 mL dung dịch sữa bột gầy
10% (w/w) có chứa canxi clorua 0,01 M (Tất cả các thuốc thử được ủ trước ở
35°C trong ít nhất 10 phút). Thời gian (t) trôi qua giữa việc trộn thuốc thử và
sự xuất hiện đầu tiên của chất rắn được ghi lại. Với điều kiện trên, lượng
enzyme đủ để làm đông tụ dung dịch sữa trong 40 phút được định nghĩa là
một đơn vị Soxhlet (SU).
Hoạt động rennet =Khối lượng sữa gầyThể tích dung dịch
rennet×40t
Tất cả các lần phát hiện được lặp lại 3 lần và kết quả được biểu thị bằng giá
trị trung bình của ba lần lặp lại.

Phát hiện mức độ biểu hiện của gen yak chymosin

Sự biểu hiện của gen yak chymosin được phát hiện trong mô dạ múi khế ở
các độ tuổi khác nhau của bò Tây Tạng bằng phương pháp real-time
PCR. Tổng RNA của dạ múi khế được chiết xuất từ mô dạ múi khế của ba
con bò Tây Tạng đang chích hút và ba con bò Tây Tạng trưởng thành. Chuỗi
cDNA đầu tiên được tổng hợp bằng phương pháp tương tự được mô tả trong
phần trước. Tất cả các mẫu cDNA đã được sử dụng làm mẫu trong phân tích
PCR thời gian thực. Hệ thống phản ứng như sau: Mẫu 2 μL, SsoFast
EvaGreen supermix (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) 5 μL, mồi đặc hiệu gen
q-Chy-F 0,5 μL, mồi đặc hiệu gen q-Chy-R 0,5 μL (Bảng 1), ddH 2 O 2 μL,
với tổng thể tích là 10 μL. PCR thời gian thực được thực hiện với chương
trình sau: 50°C trong 2 phút, 95°C trong 10 phút, 40 chu kỳ 95°C trong 15
giây; 57,6°C trong 1 phút; sau đó 95°C trong 15 giây, 65°C trong 15
giây. Gen glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH ) và β-
actin đã được sử dụng làm chất kiểm soát tải trong thí nghiệm này (đoạn mồi
GAPDH GF, đoạn mồi GAPDH GR, đoạn mồi β-actin β-F và đoạn mồi β-
actin β-R có mặt trongBảng 1).

Phân tích trình tự và phát sinh gen của gen chymosin

Trình tự cDNA của gen chymosin đã được tìm kiếm dựa trên cơ sở dữ liệu
không dư thừa (nr) tại Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia
( //www.ncbi.nlm.nih.gov/USA ) bằng thuật toán Blastx. Phân tích peptide tín
hiệu được thực hiện bởi công cụ trực tuyến của Máy chủ SignalP 3.0
(//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ) . Để làm rõ mối quan hệ giữa yak và
chymosin từ các loài khác, trình tự axit amin từ yak chymosin và 53
chymosin khác đã được lấy từ Ngân hàng gen, căn chỉnh và cây phát sinh loài
được tạo bởi Mega phiên bản 5.0 bằng cách sử dụng khả năng tiếp cận tối đa
và liên kết hàng xóm bằng cách sử dụng Tamura- Mô hình tiến hóa Nei
( Tamura et al., 2011 ). Phân tích Bootstrap với 1.000 bản sao đã được sử
dụng.
Đi đến:

KẾT QUẢ
Phân lập và nhân bản các gen preprochymosin, prochymosin và chymosin
của yak

Sử dụng RT-PCR và cặp mồi đặc hiệu gen Pre-F và Chy-R, Pro-F và Chy-R,
và Chy-F và Chy-R (Bảng 1), thu được ba dải kích thước 1.182, 1.135 và
1.008 bp (Hình 1) tương ứng với các gen preprochymosin, prochymosin và
chymosin. Ba đoạn được sao chép vào một vec tơ pMD19-T, trong đó gen
được giải trình tự và gửi vào Ngân hàng gen (Số đăng nhập JX839990 ).
Hình 1
Các sản phẩm phản ứng chuỗi polymerase của gen yak preprochymosin, prochymosin và
chymosin. Ngõ 1: DNA đánh dấu DL2000; Ngõ 2: gen preprochymosin; Ngõ 3: gen
prochymosin; Ngõ 4: gen chymosin.

Phân tích trình tự gen yak chymosin

Gen chymosin của Yak có khung đọc mở 1.146 bp và mã hóa 381 axit amin
cũng chứa peptit tín hiệu 16 axit amin được loại bỏ để tạo ra prochymosin từ
preprochymosin. Zymogen này sẽ trở thành chymosin bằng cách phân cắt
propeptide gồm 42 axit amin tại đầu tận cùng NH 2 .
Việc sắp xếp các trình tự DNA cho thấy sự đồng nhất trình tự của yak
chymosin ( JX839990.1 ) với chymosin từ Bos Taurus (NP851337.1,
99,39%), Bubalus bubalis (XP006065015.1, 98,17%), Ovis
aries (NP001009804.1, 95,55 %), Capra hircus (NP001272688.1,
95,38%), Camelus dromedarius ( NP_001290503.1 , 88,13%) và Rattus
norvegicus ( NP_064476.1 , 77,66%). Sự sắp xếp trình tự axit amin của Yak
chymosin cho thấy sự giống nhau giữa bò Tây Tạng và Bos Taurus , Bubalus
bubalis , Ovis aries , Capra hircus ,Camelus dromedarius và Rattus
norvegicus lần lượt là 99,21%, 98,16%, 93,96%, 93,70%, 83,73%, 72,18%.

Một phân tích phát sinh loài của các chymosin khác nhau từ yak và 53 loài
động vật khác được xây dựng dựa trên trình tự axit amin của chúng (Hình
2). Kết quả cho thấy có 4 nhóm lớn và 2 nhóm nhỏ trong cây phát sinh loài
này. Nhóm I bao gồm Bovidae, Camelidae và Cetacea. Nhóm II bao gồm
Vespertilionidae, Felidae, Mustelidae, Canidae, Ursidae, v.v. Nhóm III gồm
Linh trưởng, Erinaceinae, Leporidae, Chrysochloridae, Elephantidae. Nhóm
IV bao gồm Muridae và Lemuridae thành lập Nhóm V. Sarcophilus
harrisii và Monodelphis domestica thành lập Nhóm VI. Yak chymosin được
xếp vào Nhóm I, và Bos Taurus , Bison bison , Bos mutus , Bos grunniens ,
và Bubalus bubalis tạo thành một phân nhóm, do đó cho thấy mối quan hệ
tiến hóa chặt chẽ giữa chúng. Một cách thú vị,Bos mutus (yak hoang dã)
và Bos grunniens (yak nội địa) không tạo thành một nhóm gần gũi, mặc dù
các nhà nghiên cứu cho rằng chúng thuộc các phân loài khác nhau của yak.
Hình 2
Cây phát sinh gen của trình tự chymosinamino (xây dựng bằng phần mềm Mega phiên bản 5.0).

Mức độ biểu hiện của gen yak chymosin ở các độ tuổi khác nhau

Để mô tả sự thay đổi biểu hiện gen chymosin giữa bò Tây Tạng đang bú sữa
và bò Tây Tạng trưởng thành, mức độ biểu hiện của gen này ở ba bò Tây
Tạng chích hút và ba bò Tây Tạng trưởng thành đã được phát hiện bằng
qPCR (PCR định lượng thời gian thực). Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện
của gen này trong mô dạ dày của bò Tây Tạng đang bú sữa cao hơn 11,45 lần
so với ở bò Tây Tạng trưởng thành. Quan sát này cho thấy gen chymosin của
yak đóng vai trò quan trọng trong việc hút sữa của yak để tiêu hóa các thành
phần sữa (Hình 3).

Hình 3
Biểu hiện gen yak chymosin ở các độ tuổi khác nhau.

Biểu hiện của yak chymosin trong P. pastoris

Preprochymosin, prochymosin và chymosin được biểu thị bằng cách sử

dụng P. pastoris X33 và vectơ biểu hiện pPICZαA. Tất cả các dòng vô tính
chứa gen preprochymosin, prochymosin hoặc chymosin đều biểu hiện hoạt
tính chymosin trong dịch nổi mà không cần quá trình kích hoạt in vitro (hinh
4). Hoạt tính chymosin của dịch nuôi cấy nổi phía trên là 4,00 SU/mL, 14,55
SU/mL và 4,21 SU/mL tương ứng với preprochymosin, prochymosin và
chymosin tương ứng sau 184 giờ ủ (Hình 5). Tuy nhiên, chỉ có phần nổi phía
trên của môi trường nuôi cấy biểu hiện trình tự prochymosin mới cho thấy dải
protein dị loại rõ ràng khi được phát hiện bằng phương pháp SDS-PAGE
(Hình 6).
hinh 4
Xét nghiệm đông tụ sữa của preprochymosin, prochymosin và chymosin tái tổ hợp được thể hiện
bởi P. pastoris . 1: sữa được xử lý bằng dịch nổi nuôi cấy với vectơ pPICZαA trống; 2: sữa được
xử lý với dịch nổi nuôi cấy có chứa preprochymosin tái tổ hợp; 3: sữa được xử lý với dịch nổi
nuôi cấy bằng prochymosin tái tổ hợp; Hình 4: sữa được xử lý với dịch nuôi cấy nổi phía trên
bằng chymosin tái tổ hợp.
Hình 5
Các đường cong hoạt động của preprochymosin tái tổ hợp, prochymosin và chymosin được biểu
thị trong P. pastoris được cảm ứng trong 184 giờ.
Hình 6
Phân tích điện di trên gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide của dịch nổi P. pastoris tái tổ
hợp . Ngõ M: chất đánh dấu protein; Ngõ 1: điều khiển âm (vectơ pPICZαA trống không
chèn); Ngõ 2 và ngõ 3: vec tơ pPICZαA với gen prochymosin.
Đi đến:

THẢO LUẬN

Các nguồn rennet truyền thống không đủ để đáp ứng nhu cầu hiện tại và chi
phí sản xuất rennet cao do thiếu hụt bê trên toàn cầu ( Yuan et al.,
2010 ). Hơn nữa, mặc dù các nhà nghiên cứu đã đạt được tiến bộ ổn định
trong việc mở rộng các nguồn và tăng hoạt động của rennet với một số thành
công, nhưng vẫn còn những trở ngại lớn cần vượt qua bao gồm nguồn cung
tiếp tục thấp và chi phí sản xuất cao của rennet. Nghiên cứu thêm là cần thiết
để giải quyết những vấn đề này. Với sự phát triển của công nghệ kỹ thuật di
truyền, giờ đây có thể sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp và vi sinh vật để
sản xuất rennet tái tổ hợp nhằm đáp ứng sự thiếu hụt rennet. Trong nghiên
cứu của chúng tôi, P. pastoris đã được chọn làm vật chủ để biểu hiện gen yak
chymosin và cuối cùng cung cấp một nguồn rennet mới để sản xuất pho mát.

Rennet có thể được chia thành ba loại: prochymosin A, B và C. Dư lượng

axit amin thứ 244 của loại A là Asp, trong khi ở loại B là Gly. Sự khác biệt
trong hoạt động giữa loại A và B có thể là do hoạt động điện tử mạnh của
Asp244 được tìm thấy trong loại A đã được chứng minh là tăng cường ái lực
liên kết của nó. Prochymosin A có hoạt tính mạnh hơn với k-casein, nhưng
kém ổn định hơn so với prochymosin B. Prochymosin C là sản phẩm tự phân
giải của prochymosin A, Asp286-Glu287-Phe288 của A bị loại bỏ để tạo ra
Prochymosin C ( Kageyama, 2002 ). Yak chymosin, trong đó gốc axit amin
thứ 244 là Asp, thuộc loại A và do đó có hoạt tính mạnh đối với k-casein.

Trong bài báo này, các gen preprochymosin, prochymosin và chymosin đã

được sao chép từ RNA được chiết xuất từ dạ múi khế của một con yak đang
bú bằng kỹ thuật RT-PCR. Các trình tự cDNA thu được (mã gia nhập
Genbank: JX839990 ) cho thấy tính tương đồng cao với các đối tác Bos
taurus của nó. Các trình tự cDNA đã được chèn vào vectơ pPICZαA và được
biểu thị bằng P. pastoris X33. Tất cả các dòng vô tính đều dẫn đến sự biểu
hiện của dạng chymosin hoạt động. Tuy nhiên, chúng tôi chỉ thu được dải
protein dị loại mạnh bằng cách sử dụng dịch nuôi cấy nổi phía trên của P.
pastoris chứa gen prochymosin bằng SDS-PAGE. Có thể suy ra rằng hai thể
tái tổ hợp còn lại của P. pastoriscó mức độ biểu hiện thấp. Hoạt tính enzym
được phát hiện của chymosin tái tổ hợp là do trình tự Lys-Arg và các đoạn
lặp Glu-Ala được thiết kế trong đoạn mồi. Trình tự tín hiệu yếu tố α đã bị loại
bỏ bởi một hệ thống peptidase tín hiệu để tạo ra chymosin hoạt động, liên
quan đến hoạt động của một endopeptidase được mã hóa bởi gen Kexin
( KEX2 ) để tách trình tự Lys-Arg và một dipeptidyl aminopeptidase được mã
hóa bởi gen STE13 thành loại bỏ các lần lặp lại Glu-Ala ( Phanh và cộng sự,
1984 ). Trong trường hợp của yak prochymosin và preprochymosin được
nhân bản vô tính, những chất tái tổ hợp này cũng cho thấy hoạt tính rennet có
thể được giải thích bằng sự có mặt của Lys-Argin đích. Endopeptidase được
mã hóa bởi KEX2gen này có thể tách mục tiêu này để tạo ra protein hoạt
động trong dịch nổi tương tự như protein giả chymosin được Pedersen và
Foltmann (1973) đặt tên . Khi các gen chymosin, prochymosin và
preprochymosin của trâu được biểu hiện trong Pichia pastoris GS115, chỉ có
prochymosin được chứng minh là có hoạt tính enzym ( Vallejo et al.,
2008 ). Sự khác biệt này có thể là kết quả của việc sử dụng một vectơ biểu
hiện khác và/hoặc nguồn gen rennet khác.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã biểu hiện thành công các gen yak
chymosin, prochymosin và preprochymosin ở P. pastoris và thu được dạng
hoạt động của chúng trong dịch nổi nuôi cấy. Vì protein chymosin dị loại
không cần kích hoạt và có thể được tiết vào dịch nuôi cấy phía trên, nên
chúng ta không cần phải ly giải tế bào để tinh chế rennet. Thuộc tính này có
thể giảm số bước sản xuất cần thiết và cuối cùng là giảm chi phí. Ngoài ra,
chymosin yak thu được không có trình tự bổ sung không ảnh hưởng đến hoạt
động của nó so với prochymosin từ trâu ( Vallejo et al., 2008 ), điều này có
thể giảm thêm chi phí sản xuất nó. Do đó, chúng tôi nghĩ rằng các chủng tái
tổ hợp thu được trong nghiên cứu này có thể là một ứng cử viên tuyệt vời để
sản xuất rennet.
Đi đến:

HÀM Ý

Cuối cùng, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhân bản gen preprochymosin,
prochymosin và chymosin và biểu hiện các gen này trong Pichia
pastoris . Gen chymosin của Yak có trình tự mã hóa 1.146 bp mã hóa một
preprochymosin dài 381 axit amin. Prochymosin có thể được tạo ra từ
preprochymosin bằng cách tách peptit tín hiệu 16 axit amin và sau đó loại bỏ
propeptide 42 axit amin khỏi chymosin tạo ra đầu N của nó. Phân tích phát
sinh loài chỉ ra rõ ràng rằng gen chymosin của yak thuộc họ Bovidae và được
biểu hiện cao ở yak chưa cai sữa.

Tất cả các preprochymosin, prochymosin và chymosin dị hợp biểu hiện của

yak đều biểu hiện hoạt tính chymosin và gây đông tụ sữa, nhưng biểu hiện
lớn nhất trong nghiên cứu này là từ gen prochymosin biểu hiện dị hợp (14,55
SU/mL). Do đó, prochymosin được biểu hiện dị loại từ chủng Pichia
pastoris tái tổ hợp của chúng tôi có thể được sử dụng làm enzyme đông tụ
sữa trong sản xuất pho mát.