TUYỂN CHỌN VÀ NUÔI CẤY

DÒNG SINH VẬT, TẾ BÀO CÓ

KHẢ NĂNG SINH ENZYME
Nguyễn Đức Chung
Key points

1. Nguồn nguyên liệu thu enzyme

2. Tuyển chọn và nuôi cấy vi sinh vật

3. Bảo quản vi sinh vật

4. Tuyển chọn và nuôi cấy dòng tế bào

5. Bảo quản tế bào

Nguồn nguyên liệu thu enzyme

❖ Nấm mốc và nâm men: 50%

❖ Vi khuẩn: 38%

❖ Động vật: 8%

❖ Thực vật: 4%
Nguồn nguyên liệu thu enzyme và ứng dụng
❖ Ghi chú:
I (intracellular): nội bào
E (extracellular): ngoại bào
Dấu
+++: hơn 100 tấn/năm
++: hơn 10 tấn/năm
+: hơn 1 tấn/năm
-: dưới 1 tấn/năm
e: triacylglycerol lipase
f: chymosin
g: endo-1,3(4)-
betaglucanase
h: xylose isomerase
i: substilisin
j: -dextrin endo-1,6-
alphaglucosodase
k: glucan-1,4-alpha glucosidase
l: beta-galactosidase
m: protease aspartic từ vi sinh
vật
n: polygalacturonase
o: alphagalactosidase
p: betafructofuranosidase
 Quy
Nội/Ngoại SD trong
Tên E Mã số E Nguồn mô
bào công nghiệp
SX
1. E động vật
Catalase 1.11.1.6 Gan I - Thực phẩm
Chymotrypsin 3.4.21.1 Tụy tạng E - Thuộc da
Lipasee 3.1.1.3 Tụy tạng E - Thực phẩm
Resin 3.4.23.4 Dạ dày dê E + Pho mat
Trypsin 3.4.21.4 Tụy tạng E - Thuộc da

2. E nấm men
Invertasep 3.2.1.25 Saccharomyces I/E + Mứt, kẹo
Lactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E +++ Sữa
Lipasee 3.1.1.3 Candida E - Thực phẩm
Raffinaseo 3.2.1.11 saccharomyces I - Thực phẩm
 Quy
Nội/Ngoại SD trong công
Tên E Mã số E Nguồn mô
bào nghiệp
SX
3. E thực vật
Actinidin 3.4.22.14 Quả kiwi E + Thực phẩm
-amylase 3.2.1.1 Malt đại E +++ Đồ uống lên
mạch men (brewing)
β-amylase 3.2.1.2 Malt đại E - Rượu bia
mạch
Bromelin 3.4.22.4 Nhựa dứa E - Rượu bia
β-glucanaseg 3.2.1.6 Malt đại E ++ Rượu bia
mạch
Ficin 3.4.22.3 Sung, vả E - Thực phẩm
Lipoxygenase 1.13.11.12 Đậu tương I - Thực phẩm
Papain 3.4.22.2 Nhựa đu đủ E ++ Thịt
 Quy
Nội/Ngoại SD trong công
Tên E Mã số E Nguồn mô
bào nghiệp
SX
4. E vi khuẩn
-amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Tinh bột
β-amylase 3.2.1.2 Bacillus E + Tinh bột
Asparaginaseh 3.5.1.1 Escherichia I - Sức khỏe
coli
Glucose 5.3.1.5 Bacillus, I ++ Siro fructose
Isomerase Steptomyces
Penicillin- 3.5.1.11 Bacillus I - Dược
amidaseh
Proteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ Tẩy rữa
Pullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella, E - Tinh bột
Bacillus
 Nội/Ngoại Quy SD trong công
Tên E Mã số E Nguồn
bào mô nghiệp
5. E nấm sợi
-amylase 3.2.1.1 Aspegillus E ++ Bánh mì
Aminoacylase 3.5.1.14 Aspegillus I - C.nghệ dược
Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspegillus, E +++ Tinh bột
Rhizopus
Catalase 1.11.1.6 Aspegillus I - Thực phẩm
Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Chất thải
Dextranase 3.2.1.11 Penicillium E - Thực phẩm
Glucooxydase 1.1.3.4 Aspegillus I - Thực phẩm
Lactasel 3.2.1.23 Aspegillus E - Sữa
Lipase 3.1.1.3 Rhizopus E - Thực phẩm
Renninm 3.4.23.6 Mucor meihei E ++ Pho mát
Pectinasen 3.2.1.15 Aspegillus E ++ Đồ uống
Pectinlyase 4.2.2.10 Aspegillus E - Đồ uống
Proteasem 3.4.23.6 Aspegillus E + Bánh mì
Raffinaseo 3.2.1.22 Mortierelia I - Thực phẩm
Thu nhận enzyme từ động vật và thực vật

1. Tinh chế enzyme từ các chất dịch của cơ

thể sinh vật

2. Nuôi cấy tế bào động vật hoặc thực vật để

thu nhận enzyme từ tế bào hoặc từ dịch
nuôi cấy
Thu nhận enzyme từ vi sinh vật (VSV)

❖ Enzyme VSV là nguồn phòng phú do có vô số

loài VSV khác nhau.
❖ Hệ enzyme VSV có khả năng thay đổi bằng
cách thay đổi điều kiện nuôi cấy và dùng các
tác nhân điều chỉnh.
❖ Mỗi loài VSV có thể sinh tổng hợp mạnh một
hay một số enzyme nào đó theo ý muốn.
❖ VSV có khả năng sinh sản, phát triển và sinh
tổng hợp enzyme với tốc độ cao, cho phép tạo
ra lượng enzyme lớn trong thời gian ngắn.
❖ Hoạt tính của E từ VSV mạnh hơn rất nhiều từ
các nguồn khác.
Cơ chế chung của sản xuất enzyme từ vi sinh vật

❖ 1. Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

cho enzyme có hoạt lực cao:
➢ Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất,
nước, lương thực, thực phẩm….

➢ Tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học,
lý, hóa học…để tạo chủng có khả năng “siêu tổng
hợp enzyme” (phương pháp gây đột biến; phương
pháp biến nạp; phương pháp tiếp hợp gene; phương
pháp tải nạp).
Cơ chế chung…(tt)
2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật: Phương pháp
cấy chuyền; Phương pháp làm khô; Phương pháp đông
khô; Phương pháp bảo quản lạnh sâu.
3. Môi trường dinh dưỡng và giai đoạn nuôi vi sinh vật:
➢ Thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp
đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
➢ Môi trường phải có đủ hợp chất chứa C, N, H, O và các
chất khoáng Mg, Ca, S, Fe, K, Cu, Zn, Co,.., vitamin.

Đặc biệt, để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường cho

thêm vào môi trường nuôi “chất cảm ứng” tổng hợp enzyme,
thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Cơ chế chung…(tt)
❖ Trong quá trình nuôi vi sinh vật, phải lưu ý đến

➢ Nồng độ chất cho phù hợp

➢ Nhiệt độ nuôi

➢ Độ pH môi trường

➢ Độ ẩm

➢ Độ thoáng khí

➢ Thiết bị và phòng nuôi...v.v…,

➢ Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật.

Cơ chế chung…(tt)
❖ 4. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme

Biện pháp phá vỡ cấu trúc tế bào

➢ Cơ học: như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch
anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa
(homogenizator).
➢ Sóng siêu âm
➢ Dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton,
glycerin, ethyl acetate... và chất detergent. Các hóa
chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế
bào.
Phương pháp nuôi cầy VSV
Phương pháp nuôi cấy vsv (tt)
❖ Pha loãng vsv trước khi nuôi cấy lên đĩa
thạch

Phạm vi tiệt trùng 10 cm

của đèn cồn
 Phương pháp nuôi cấy vsv (tt)
Hiếu khí

Cấy yếm
khí
Phương pháp nuôi cấy VSV (tt)

❖ Nuôi cấy với lượng lớn (sử dụng bioreactor)

Tuyển chọn chủng vi sinh vật

❖ Vi sinh vật được tuyển chọn bằng cách nuôi

cấy trong môi trường tương thích với loại vi
sinh vật muốn thu nhận.
❖ Chuẩn hóa môi trường và cấy truyền để thu
được các dòng tế bào thuần.
❖ Phân tích khả năng sản xuất enzyme của
các dòng tế bào để chọn ra dòng có khả
năng sinh enzyme cao nhất.
❖ Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để sản phẩm
enzyme tạo ra ở mức cao.
Cải tạo vi sinh vật

❖ Nhằm tạo ra dòng vsv thuần có khả năng

sinh tổng hợp protein/enzyme cao.

❖ Tạo ra vsv có khả năng sinh trưởng trong

điều kiện nhất định và tổng hợp enzyme cần

thiết phù hợp với mục đích sử dụng.
Bảo quản vi sinh vật

❖ Cần:

➢ Duy trì khả năng sống của vsv bảo quản (BQ)

➢ Quan tâm đến số lượng tế bào khi tiến hành BQ

➢ Duy trì đặc tính di truyền ổn định của chủng vsv

➢ Đảm bảo tính thuần chủng của giống

➢ Kiểm tra định kỳ trong quá trình BQ

Bảo quản vsv (tt) (phương pháp BQ)
A. Phương pháp cấy truyền

VSV Nuôi cấy Bảo quản

Nhược điểm
1. Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
2. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong
quá trình bảo quản.
3. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền
thích hợp đối với các chủng bảo quản.
4. Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
5. Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường
cấy truyền không thích hợp.
6. Chủng VSV cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm
sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
B. Phương pháp làm mất nước trong môi trường
bảo quản (thường dùng để BQ nấm men, nấm
sợi)
➢ Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là
bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị làm khô trong
đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học.
➢ Bảo quản trên giấy. Các chủng nấm men và nấm sợi
được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy
bạc và đựng trong hộp kín.
➢ Bảo quản trên gelatin. Để thực hiện phương pháp này,
người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi
trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô
trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được
vi khuẩn trong vài năm.
C. Phương pháp bảo quản lạnh đông

Glycerol 15%
Glucose hoặc lactose 10%

➢ Phương pháp này có ưu điểm là bảo quản được lâu

➢ Giữ ở nhiệt độ từ -15 độ C đến -20 độ C thì 6 tháng cấy

truyền lại 1 lần.

➢ Giữ ở nhiệt độ -30 độ C thì 9 tháng cấy truyền lại 1 lần.

➢ Giữ ở nhiệt độ -40 độ C thì 12 tháng cấy truyền lại 1 lần.

➢ Giữ ở nhiệt độ -50 độ C thì 3 năm cấy truyền lại 1 lần.

➢ Giữ ở nhiệt độ -70 độ C thì 10 năm cấy truyền lại 1 lần.

D. Phương pháp đông khô vi sinh vật
➢ Nước được lấy ra khi mẫu đang ở trạng thái lạnh
sâu.
E. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp
➢ Mẫu không cần làm lạnh từ trước.
F. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
➢ VSV được bảo quản trong môi trường dịch thể
➢ Nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị
bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C)

Chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan

nhanh: glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide)
Sử dụng VSV trong và sau bảo quản lạnh đông

❖ Tránh thực hiện rã đông/tái đông nhiều lần.

❖ Mẫu bảo quản lạnh đông cần được rã đông

từ từ bằng cách đặt trên khay đá.

❖ Việc cấy truyền phải được thực hiện ở điều

kiện vô trùng.

❖ Trước khi sử dụng cần cấy truyền 2-3 lần để

đảm bảo vsv phát triển ổn định.