SZEXUÁLIS REPRODUKCIÓ

BIOTECHNIKÁI
ÉS ALKALMAZÁSUK
 A szaporodás biotechnológiája
• A szaprodás biotechnológiája a növények in
vitro végzett reprodukciója
• Lehet: ivaros és
ivartalan
A szexuális (ivaros, generatív) reprodukció (szaporodás) biotechnikái (in vitro
módszerei) azokat a sejt-, szövet-és szervtenyésztési módszereket foglalja
magába, melyekkel a növények ivaros szaporodási folyamatait befolyásolni vagy
módosítani tudjuk.
A növényi ivaros szaporodás biotechnikái
 In vitro haploidia és DH fajták előállítása

Növények regenerációja szomatikus sejtekből (sejt -növény).

Növények regenerálása ivarsejtekből (haploid sejtekből).
Az in vitro indukálható androgenezis (pollen -» növény) és
ginogenezis (petesejt - növény) lehetővé teszi a kultúrnövények
ploidszintjének csökkentését.
 Androgenezis

Az androgenezis mint a haploid apomixis egy fajtája azt a

folyamatot jelenti, mely során a redukált pollenszemből (n) -
megtermékenyítés nélkül - közvetlenül haploid növények (n)
fejlődnek.
Az in vitro androgenezis, portok vagy pollen (mikrospóra)
kultúrában indukálható, mely során a steril tenyészetekben
haploid embriók, vagy kallusz, majd növények jelennek meg.
A portok kultúra esetében, a virágból izolált portokokat, -
melyekben a mikrospórák megfelelő fejlődési fázisban vannak -,
általában szilárd táptalajon tenyésztik.
A mikrospóra tenyésztés szakaszai

1. a portokokból pollenszemeket izolálnak

2. A mikrospórákat folyékony tápközegben tenyésztik (megfelelő tisztítás
követően)
Az in vitro androgenezis lehetséges mert a meiózist követően a kialakuló
mikrospórákban nincs determinálva a továbbfejlődés iránya.
A portokokat, illetve a mikrospórákat indeterminált fejlődési fázisban
kell izolálni.
Indeterminált fejlődési szakasz az egymagvas vakuólumos pollenfejlődési
fázis és az első pollenmitózis közötti, illetve körüli időszakra tehető.

A tenyésztési feltételek megfelelő módosításával (táptalaj összetétel,

előkezelés, stb.) elérhető, hogy a tenyésztett mikrospórák egy részéből ne
érett pollen alakuljon ki, azaz ne a gametogenezist folytassa, hanem egy
új fejlődési (sporofitikus) irányt kövessen
 Ginogenezis

A ginogenezis mint a haploid apomixis egy fajtája azt a folyamatot jelenti, mely
során az embriózsák redukált sejtjéből (petesejt) - megtermékenyítés nélkül -
közvetlenül haploid növények (n) fejlődnek.

Az in vitro ginogenezis termékenyítetlen ovárium (magház) vagy ovulum

(magkezdemény, embriózsák) steril kultúráiban indukálható, melynek végén a
steril tenyészetekben haploid növények jelennek meg.
Kettős megtermékenyülés nélkül a tápszövet (endospermium) sem alakul ki,
ezért a haploid embriók csak mesterséges tápközegben képesek
ernbriógenezisüket befejezni.
Ezt követően a csírázó embriókból haploid növénykék fejlődnek. Egy
ováriumból, mely több ovulumot is tartalmazhat több növény is fejlődhet.

A kukorica, búza, árpa, rozs, napraforgó, hagyma, cukorrépa, olajrepce,

csomós ebír, stb. fajok in vitro tenyészeteiből sikerült ginogenezissel haploidokat
előállítani.
 Haploid parthenogenezis
A petesejt (embriózsák) eredetű haploidok felnevelését jelenti csökkent
életképességű pollennel megporzott ováriumokból és ovulumokból.
A pollen életképessége csökkenthető besugárzással vagy kémiai úton toluidin
kékkel (nyár, cukorrépa).
A technikát pollen stimuluson alapuló parthenogenezisnek is nevezik, mert a
legyengített pollen generatív magja képtelen a petesejttel fuzionálni, de a
pollentömlő behatolása az embriózsákba, mint stressz elősegíti a ginogenezis
indukcióját a petesejtben.

A módszert sikerrel alkalmazzák a dohány, burgonya, nyár és répafélék haploid

alakjainak előállítására.

Távoli keresztezés
E módszer alkalmazása esetén haploidokat kétféle úton kaphatunk,
a parthenogenezissel (phureja-technika) és
posztzigótikus kromoszóma eliminációval (bulbosum-technika)
Hordeum vulgare x Hordeum bulbosum
GENETIKAI NEMESÍTÉS JELENTŐSÉGE

A kultúrnövények ploidszintjének redukciójával a haploid

nemesítés alkalmazását segítik elő

A gaméták szintjén jelentkező genetikai változatosságot (oka a

meiózis során bekövetkező rekombináció), azaz a gametoklonális
variabilitást - a másik gaméta hatása (megtermékenyítés) nélkül - az
intaktnövények szintjére hozzuk.

A kifejlett egyed szintjére hozott növényi gametoklonális

variabilitás ma még egyedülálló az élővilágban.
A haploidokból (n) reduplikációval (rediploidizáció) homozigóta
diploid (2n) növények (autódiploidok, doubled haploidok,
dihaploidok) röviden DH-növények
előállítását.
Ezzel az idegentermékenyülő növények beltenyésztésének ideje - amely fajtól
függően 6-10 generáción keresztül végzett öntermékenyítést jelent-végül is 1
generációra redukálható.

Transzgénikus növényekből a transzgénre nézve - egy generáció alatt -

homozigóta növények állíthatók elő.

A homozigóta DH növényekben lehetőség van a rejtve maradó recesszív

tulajdonságok fenotípusos manifesztálódására és az ezekre irányuló
szelekcióra, továbbá jelentősen növelhető a sejtszintű mutánsizolálás
hatékonysága is.
 Ivarsejtek izolálása és in vitro
fúziója
Fogalma: Az állatokkal és az alacsonyabb rendű növényekkel
ellentétben, a magasabb rendű növények gamétáinak izolálása és az
ivarsejtek in vitro fúziója majd „lombik" növények felnevelése csak
a '90-es években vált lehetségessé.
A magasabb rendű növények gamétái az állatoktól eltérően - ugyanis
nem szabadon mozgó önálló sejtek, hanem részei az embriózsáknak
a petesejt esetében, vagy a pollennek a hímivarsejt esetében.

A magasabbrendű növények hím gamétáit a pollenben levő két

generatív sejt (sejtmag) jelenti.
A női gaméta alatt az embriózsák mikropile felé eső oldalán a két
szinergida sejt között lévő petesejtet értjük.
Az ivarsejtek izolálása az a folyamat, mely során a gamétákat
kiszabadítják a részben haploid, részben diploid sejtből
(pollen), illetve szervből (portok, embriózsák), hogy azok az
állati ivarsejtekhez hasonlóan szabad sejtekké váljanak.
Az in vitro termékenyítés az egyedülálló hím-, illetve női
ivarsejtek mesterségesen kiváltott fúzióját jelenti steril
körülmények között

Az in vitro termékenyítés nem azonos az in vitro megporzással

(ahol a táptalajon tenyésztett ováriumra, illetve ovulumokra
közvetlenül juttatjuk a pollent steril körülmények között.
.
 Ivarsejt izolálás és fúzió módszerei

A hímivarsejteket ozmotikus sokk

alkalmazásával szabadítják ki a pollenből,
melyeket az éppen felpattanó portokokból
izolálnak. Az oldatban kiszabaduló
hímivarsejteket (sejtmagokat) izolálják A
petesejtek kiszabadítása
mikromanipulátorban, mechanikusan
üvegtűkkel történik.
Majd ezt követi a gaméták fúziója elektro,
vagy kémiai fúzióval

ín vítro termékenyítés a gaméták

izolálásával (1) és fúziójával (2). (Kranz
és Dresselhaus, 1996 nyomán).
Növényregenerálás az in vitro tenyésztett zigótákból

Az in vitro fúziót követően a zigóták gyorsan soksejtes

struktúrákká fejlődnek.
A fúziót követő 10-15 napon az embriókat szilárd táptalajra
oltják át.
A kis növények a 3-5. héten alakulnak ki.
Az in vitro megtermékenyítésből felnevelt növények fertilisek
voltak és a hibrid fenotípust mutatták, abban az esetben,
amikor a szülői gaméták különböző vonalakból származtak.

Fertilis növényt napjainkig a kukoricánál, búzánál és árpánál

neveltek fel.
 Zigotikus proembriók és embriók tenyésztése in vitro
Az embriótenyésztés a zigotíkus embriógenezis különböző
stádiumában lévő embrióinak kipreparálását, ontogenezisének
fenntartását és befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált
feltételek között.
Célja - a zigotikus embriók növekedéséhez és fejlődéséhez
szükséges feltételek mesterséges biztosításával - kifejlett csíraképes
embriókat kapni, melyekből intakt növények fejlődnek.
Az embriókultúrák szempontjából az embriógenezis két fő
szakaszra és 3 stádiumra osztható:
/, heterotróf szakasz: a proembriónak a táptalajban kell
biztosítani minden szervetlen és szerves tápanyagot.
//. autotróf szakasz: az embrió embriógenezise annyira
előrehaladott, hogy pusztán szervetlen sókat és szénforrást
tartalmazó tápközegben is továbbfejlődik.
1. autonóm stádium: fejlődésben lévő embrió, mely azonban
nem képes a csírázásra.
2.élettani érettség stádiuma: az embrió elérte teljes
embrionális differenciáltságát, de nem képes a csírázásra
(csíranyugalom).
3.ökológiai érettség stádiuma: teljesen kifejlett, érett és
csíraképes embrió.
Az izolált embriók fejlettsége alapján - az embriótenyésztést
két módszerre osztják fel.
Az egyik a proembrió (pregerminal) kultúra,
a másik a tulajdonképpeni érett embrió (postgerminal)
kultúra.
A proembrió tenyésztés esetében az embriókat az
embriógenezis heterotróf fázisában, vagy az autotróf fázis
autonóm, illetve élettani érettségű stádiumában izolálják.
A kétszikű növények esetében ez a gömb és a korai
szívstádiumú proembrió fázisokat jelenti.

A érett-embrió tenyésztés létesítésekor viszont

már vagy ökológiai érettségű, vagy teljesen kifejlett
embriókat izolálnak.
A késői szív-, torpedó- és szikleveles stádiumú kétszikű
embriók tartoznak ebbe a csoportba
 Proembrió kultúra és felhasználási területei

A proembrió tenyésztés célja az izolált proembriók

embriógenezisének fenntartása in vitro és kifejlett embriók,
valamint növények felnevelése.
A proembrió kultúrákat olyan esetekben kell használni, amikor
a petesejt megtermékenyül, azonban - in situ - az életképes
csírák (embriók) kialakulásának valamilyen akadálya van.
Ebben az esetben az embriókultúra felhasználásának célja - a
normális embriógenezist akadályozó posztzigotikus endogén és
exogén faktorok hatásának kiküszöbölésén keresztül - in vitro
életképes növények felnevelése.
Fejlett embriók tenyésztése és alkalmazása
Az embriókultúrák e típusának célja a részben vagy teljesen
kifejlett embriók csírázásának indukálása és növények felnevelése.

A kultúrák létesítésekor az embriógenezis utolsó stádiumában lévő

élettani vagy ökológiai érettségű embriókat vagy érett magvakból
teljesen kifejlett embriókat (csíra) izolálnak.
.
Az embriók az embriógenezis befejezése után - nyugalmi
periódus nélkül - azonnal csíráznak.
Ezért az érett embriók in vitro tenyésztését olyan
növényfajoknál érdemes használni, amelyeknél a magvak
érési ideje, illetve a csíra nyugalmi szakasza hosszú.
A fejlett embriótenyésztésnek célja a csírázást gátló endogén
és exogén faktorok hatásának kiküszöbölésén és a csírázás
indukálásán keresztül életképes növények felnevelése.
Felhasználási területeit
a mag hosszú érési idejének lerövidítése és ezzel a
generációváltás gyorsítása,
csíranyugalom megszüntetése és ezzel a generációváltás
meggyorsítása,
és azok az esetek, amikor a normális csírázásnak in situ
valamilyen akadálya van
A termésérés időtartama a kultúrnövények tenyészidejének
50-60%-át is elérheti (pl. szója, napraforgó, tavaszi gabonák,
kukorica, stb.).
Tehát jelentős időmegtakarítást ha a következő generáció
egyedeit az embriók mesterséges felnevelésével állítjuk elő.
Ez az időmegtakarítás az egynyári növények esetében 1-3
hónap, évelő növények esetében 1-3 év, sőt több is lehet.
E módszer felhasználásával kukoricából évente 2 generációt,
gabonafélékből 2-3 generációt is felnevelhetünk. Ennek nagy
jelentősége van a növénynemesítésben