Professional Documents
Culture Documents
Mapowanie genomów
technikami genetycznymi
Spis treści
2.1 Mapy genetyczne i fizyczne 15
2.2 Markery dla map genetycznych 15
2.2.1 Geny były pierwszymi stosowanymi markerami 15
2.2.2 Markery DNA do mapowania genetycznego 18
2.3 Sposoby podejścia do mapowania genetycznego 22
2.3.1 Analiza sprzężeń jest podstawą mapowania
genetycznego 22
2.3.2 Przeprowadzanie analizy sprzężeń u różnych
typów organizmów 28
14 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Fakty i założenia
Mapowanie genetyczne do tworzenia map genomów wykorzystuje takie techniki
genetyczne jak krzyżowanie organizmów i analiza rodowodów.
Pierwotnie jako markerów używano genów, lecz obecnie uzupełniono je o markery
DNA takie jak RFLP, SSLP i SNP.
Podstawą mapowania genetycznego jest obliczenie częstości rekombinacji poprzez analizę
sprzężeń.
Jeśli możliwe są eksperymenty hodowlane, to przeprowadza się dwu- lub wielopunktowe
krzyżówki testowe.
Trudności w mapowaniu genów u człowieka wynikają z ograniczeń analizy rodowodów.
Analiza genetyczna bakterii wymaga przeniesienia genów z jednej komórki do drugiej.
Następne trzy rozdziały opisują techniki i strategie Samo podejście „shotgun" jest więc nieodpowiednie
stosowane do otrzymania sekwencji genomu. Techniki dla większych, bardziej złożonych genomów. Zamiast
te obejmują znacznie więcej niż tylko same m e t o d y tego, wpierw należy stworzyć mapę genomu. Mapa
sekwencjonowania DNA, które oczywiście mają fun genomu stanowi przewodnik do prac nad sekwen-
damentalne znaczenie. Mają także j e d n o p o d s t a w o w e cjonowaniem, pokazując pozycje genów i innych
ograniczenie: nawet stosując najbardziej rozwinięte charakterystycznych rodzajów sekwencji.
technologie, rzadko m o ż n a w j e d n y m eksperymencie Gdy dostępna jest mapa, fazę sekwencjonowania
otrzymać sekwencję dłuższą niż 750 bp, co oznacza, że można przeprowadzić na jeden z dwóch sposobów
sekwencję długiej cząsteczki DNA trzeba składać z serii (rys. 2.3):
krótszych sekwencji. Jednym z podejść jest podzielenie
cząsteczki na fragmenty, ustalenie sekwencji każdego
z nich i użycie komputera do znalezienia zachodzących DNA
na siebie fragmentów, a następnie złożenie oryginalnej
sekwencji (rys. 2.1). Opisana strategia typu „shotgun"
stanowi standardowe podejście do sekwencjonowania
małych g e n o m ó w prokariotycznych, ale ze wzrostem
fragmenty
liczbv fragmentów, niezbędna analiza danych staje się
niewspółmiernie bardziej złożona (dla n fragmentów
liczbę możliwych zakładek opisuje 2n2-2n). Drugim
problemem w metodzie „shotgun" jest możliwość sekwencje
powstawania błędów podczas analizy repetycyjnych
regionów genomu. Jeśli sekwencję zawierającą po
wtórzenia podzieli się na fragmenty, w wielu otrzy
Rysunek 2.1 Podejście „shotgun" do składania sekwencji
manych kawałkach będą takie same lub bardzo podob
ne motywy sekwencyjne. Łatwo m o ż n a złożyć te Cząsteczkę D N A dzieli się na mate fragmenty, z których każdy
sekwencje tak, że część regionów powtarzających się jest sekwencjonowany. Oryginalną sekwencję składa się przez
zostanie usunięta, a n a w e t tak, że dwa fragmenty tego poszukiwanie zachodzących na siebie kawałków sekwencji
samego lub różnych chromosomów zostaną ze sobą pochodzących z poszczególnych fragmentów. W praktyce, by
ustalić, że dwie sekwencje należy ze sobą połączyć, potrzeba
błędnie połączone (rys. 2.2).
zakładki o długości kilkudziesięciu par zasad
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 15
500 kb markery
Analiza kontigów Analiza typu
klonów „shotgun"
mapa genomowa
mapowany
segment DNA
sekwencjonowanie
metodą „shotgun"
catego genomu
sekwencjonowanie
„shotgun"
zmapowanego
segmentu
złożone
sekwencje
złożona
sekwencja
markery używane do
pozycja zakotwiczenia złożonych
sekwencji jest sekwencji na mapie
już znana
Zmapowano genom, składający się z liniowej cząsteczki D N A długości 2,5 Mb i poznano pozycje ośmiu markerów (A-H). Z lewej
- analiza kontigów klonów rozpoczyna się od segmentu D N A , którego pozycję na mapie genomu zidentyfikowano, ponieważ zawiera)
markery A i B. Segment sekwencjonuje się metodą „shotgun" i otrzymaną sekwencję umieszcza się w znanej pozycji na mapie. Z prawej
- ukierunkowana strategia „shotgun" obejmuje losowe sekwencjonowanie całego genomu. Uzyskuje się kawałki nieprzerwanych
sekwencji, prawdopodobnie o długości setek kb. Jeśli nieprzerwana sekwencja zawiera marker, to można ją umieścić w odpowiednim
miejscu na mapie. Zauważ, że w obu metodach im więcej markerów znajduje się na mapie genomu, tym lepiej. Więcej szczegółów
dotyczących tych strategii sekwencjonowania - patrz podrozdział 4.2.
gen. Na przykład do roku 1922 zmapowano ponad 50 organizmy, jak na przykład bakterie i drożdże, mają
genów na czterech chromosomach muszki owocowej, niewiele cech, które można obserwować wzrokowo,
lecz dziewięć z nich stanowiły geny koloru oczu więc mapowanie genów tych organizmów musi opierać
i każdy nowicjusz, mający nadzieję na wniesienie się na fenotypach biochemicznych, takich jak wymie
czegoś nowego do tej dziedziny, wpierw musiał nione w tabeli 2.1. Ludzie także mają cechy obserwowal-
nauczyć się rozróżniać kolory oczu muchy: czerwony, ne wzrokowo, ale już od lat dwudziestych badano
jasnoczerwony i inne odcienie czerwieni, takie jak: fenotypy biochemiczne uzyskiwane przez typowanie
cynober (cinnabar, vermilion), kolor granatu (garnet), krwi, i były to nie tylko standardowe grupy krwi jak
cielisty (carnation), sepia, szkarłat (scarlet), różowy ABO (Yamamoto i wsp., 1990), lecz także warianty
(pink), purpura (cardinal) lub bordo (claret). Aby alleliczne białek osocza krwi i białka immunologiczne,
stworzyć bardziej ogólne mapy genów, konieczne jak antygeny leukocytów człowieka (system HLA - ang.
stało się znalezienie cech bardziej policzalnych, dają human leukocyte antigens). Dużą przewagą takich
cych się lepiej rozróżniać i mniej złożonych niż nada markerów nad fenotypami widzialnymi jest występowa
jące się do obserwacji wzrokowej. nie alleli wielokrotnych w wielu istotnych genach
Odpowiedzią było wykorzystanie biochemii do roz (Mori i wsp., 1997). Na przykład gen nazywany HLA-
różniania fenotypów, szczególnie ważne u dwóch ty -DRB1 posiada przynajmniej 59 alleli, a HLA-B przynaj
pów organizmów - mikroorganizmów i ludzi. Mikro mniej 60. Ma to znaczenie ze względu na sposób, w jaki
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 17
R a m k a 2 . 1 : K r ó t k i p r z e w o d n i k p o genetyce
mendlowskiej krzyżówka jednopunktowa
Tabela 2.1 Typowe markery biochemiczne używane w analizie genetycznej Saccharomyces cerevisiae
ADE2 wymaga adeniny rośnie tylko wtedy, gdy w pożywce jest obecna adenina
CANI oporny na kanawaninę rośnie w obecności kanawaniny
CUPI oporny na miedź rośnie w obecności miedzi
CYHI oporny na cykloheksimid rośnie w obecności cykloheksimidu
LEU2 wymaga leucyny rośnie tylko wtedy, gdy w pożywce jest obecna leucyna
SUC2 zdolny do fermentacji sacharozy rośnie, gdy sacharoza jest jedynym węglowodanem w pożywce
URA3 wymaga uracylu rośnie tylko wtedy, gdy w pożywce jest obecny uracyl
18 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Hybrydyzacja m e t o d ą Southerna
Wykrywanie określonych fragmentów restrykcyjnych na tle wielu innych fragmentów
restrykcyjnych
W hybrydyzacji metodą Southerna zestaw fragmentów re chcemy wykryć. Ponieważ sonda i docelowy DNA są kom
strykcyjnych przenosi się z żelu agarozowego na błonę plementarne, mogą tworzyć pary czyli hybrydyzować. Po
nylonową i specyficzny, badany fragment wykrywa się przez zycję docelowego fragmentu restrykcyjnego na filtrze iden
hybrydyzację z sondą. Technika ta, oprócz zastosowania do tyfikuje się przez wykrycie sygnału znacznika dołączonego
mapowania RFLP (sekcja 2.2.2), jest także używana w innych do sondy. Sondą może być syntetyczny nukleotyd (patrz
procedurach wymagających identyfikacji szczególnych frag rys. 2.7) lub sklonowany fragment DNA (Metody badań
mentów restrykcyjnych, na przykład do sprawdzenia klono 3.4, s. 52). W wykrywaniu RFLP sondą jest przeważnie
wanego fragmentu (Metody badań 3.4, s. 52) sklonowany fragment obejmujący polimorficzne miejsce re
Elektroforeza w żelu agarozowym (Metody badań 3.2, s. 43) strykcyjne.
służy do rozdzielania liniowych cząsteczek DNA, takich jak Aby przeprowadzić hybrydyzację, błonę umieszcza się
fragmenty restrykcyjne, zależnie od ich wielkości. Jeśli trawie w szklanej butelce z wyznakowaną sondą oraz buforem
nie dało tylko kilka fragmentów, to każdy tworzy oddzielny i delikatnie obraca przez kilka godzin, aby sonda miała
prążek, który można zobaczyć po wybarwieniu żelu brom możliwość hybrydyzowania z docelowym DNA. Następnie
kiem etydyny. Jeżeli jest więcej niż około 50 fragmentów, błonę płucze się w celu usunięcia sondy, która nie zhyb-
prążki łączą się ze sobą tworząc smugę i nie można zobaczyć rydyzowała, i wykrywa się sygnał znacznika. Szczegóły zna
pojedynczych fragmentów. Wówczas fragmenty przenosi się kowania i detekcji prezentują Metody badań 3.3, s. 46;
na błonę nylonową po prostu kładąc ją na żelu. Bufor w poniższym przykładzie sondę wyznakowano radioaktywnie,
przesiąkając przenosi DNA z żelu na błonę, do której DNA a sygnał wykrywa się stosując autoradiografię. Na auto-
się przyłącza (rysunek u góry). Do przenoszenia można kupić radiogramie widoczne są prążki komplementarne z sondą.
drogą maszynę, lecz prościej użyć pliku papierowych ręcz Widzimy, że w ścieżce 2 jest tylko jeden hybrydyzujący
ników. prążek, a w ścieżce 3 dwa prążki. DNA w ścieżce 3 został
Sondą do hybrydyzacji jest wyznakowana cząsteczka DNA przecięty w polimorficznym miejscu restrykcyjnym, natomiast
o sekwencji komplementarnej do docelowego DNA, który w ścieżce 2 - nie.
20 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR - ang. polymerase Ponieważ polimeraza Taq jest termostabilna, mieszaninę
chain reaction) prowadzi do powielenia wybranego fragmentu reakcyjną można podgrzać do 90°C bez niszczenia aktywności
cząsteczki DNA. Bez trudu można namnażać odcinki długości enzymu. W tej temperaturze nowe nici oddzielają się od
nawet ponad 5 kb, a po zmodyfikowaniu standardowej matrycowego DNA. Po ochłodzeniu mieszaniny do mat
techniki możliwe są dłuższe amplifikacje - aż do 40 kb. rycowego DNA, a także do nowych nici, przyłącza się więcej
Technika PCR ma wiele zastosowań w biologii molekularnej, starterów. Wtedy polimeraza Taq przeprowadza drugi cykl
na przykład w mapowaniu DNA (patrz sekcja 2.2.2), sekwen- syntezy DNA.
cjonowaniu DNA (patrz sekcje 4.1.1 i 4.2.1) i filogenetyce
molekularnej (rozdział 15). Zmodyfikowaną wersję reakcji
PCR można stosować do namnażania cząsteczek RNA w po
staci DNA (Metody badań 5.1, s. 91). Technika PCR jest także
szeroko używana w wyspecjalizowanych dziedzinach, takich
jak medycyna sądowa i diagnostyka kliniczna, gdzie szczególnie
użyteczna jest możliwość pracy z niewielką wyjściową liczbą
cząsteczek.
Reakcję przeprowadza się przez zmieszanie ze sobą cząs
teczki DNA stanowiącej matrycę, która może być obecna
w bardzo niewielkich ilościach, oraz nukleotydów, dwóch
syntetycznych oligonukleotydowych starterów i termostabil-
nej polimerazy DNA (patrz Metody badań 4.2, s. 64), odpornej
na denaturację pod wpływem wysokiej temperatury. Zwykle
używa się polimerazy Taq z bakterii Thermus aquaticus żyjącej
w gorących źródłach. Dwa startery muszą się przyłączyć do
matrycy na obu końcach namnażanego regionu, co oznacza,
że aby przygotować odpowiednie oligonukleotydy, musimy PCR można kontynuować przez 30-40 cykli, nim enzym
znać skrajne sekwencje. Oligonukleotydy zapoczątkowują ulegnie ostatecznej inaktywacji albo startery lub nukleotydy
syntezę nowego, komplementarnego polinukleotydu tworzo zostaną zużyte. Pojedynczą cząsteczkę wyjściową można
nego - jak we wszystkich enzymatycznych syntezach DNA namnożyć do dziesiątek milionów identycznych fragmentów,
- w kierunku od 5' do 3' przez kopiowanie matrycowego co stanowi kilka mikrogramów DNA. Obecność polimorficz-
DNA w kierunku od 3' do 5' (patrz rys. /./, s. 3 i sekcja nego miejsca restrykcyjnego w namnożonym regionie można
12.3.2). sprawdzić przez trawienie produktu reakcji PCR enzymem
restrykcyjnym i sprawdzenie próbki w żelu agarozowym.
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 21
„Chip" DNA
G ę s t o u ł o ż o n e c z ą s t e c z k i D N A d o r ó w n o l e g ł y c h analiz h y b r y d y z a c y j n y c h
hybrydyzacja mikroskopia
konfokalna
„chip" DNA
24 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Częściowe sprzężenie o d k r y t o na początku XX wieku. Pokazaną tutaj krzyżówkę przeprowadzili Bateson, Saunders i Punnett w roku
190S na grochu c u k r o w y m . Krzyżówka rodzicielska daje wynik t y p o w y dla krzyżówek d w u p u n k t o w y c h (patrz ramka 2. /, s. I 7), gdzie
wszystkie rośliny F 1 mają taki sam fenotyp, wskazując, że za fioletowe kwiaty i podłużne ziarna pyłku odpowiadają allele dominujące.
Nieoczekiwanie p o t o m s t w o krzyżówki F ( nie wykazywało stosunku fenotypów 9:3:3:1 (oczekiwanego dla genów na różnych
chromosomach) ani 3:1 (oczekiwanego przy całkowitym sprzężeniu). Ten niezwykły stosunek jest t y p o w y dla częściowego sprzężenia
Zachowanie się chromosomów w czasie mejozy mosomy są rozdzielane między dwa n o w e jądra
wyjaśnia, dlaczego geny wykazują sprzężenie w czasie mitozy. Szczególnie istotne jest, że każde
częściowe, a nie całkowite p o t o m n e jądro otrzymuje pełen zestaw chromoso
Przełomowego odkrycia dokonał Tomasz H u n t Mor mów, a większość zdarzeń, które składają się na
gan wyjaśniając zależność między sprzężeniem częś proces mitozy, służy osiągnięciu tego celu.
ciowym a z a c h o w a n i e m c h r o m o s o m ó w w czasie Proces mitozy nie ma bezpośredniego związku
podziału jądra komórkowego. Cytolodzy w końcu z m a p o w a n i e m genetycznym. Z m a p o w a n i e m zwią
XIX wieku rozróżniali d w a typy podziału jądra: zany jest inny proces podziałowy - mejoza. Mejoza
mitozę i mejozę. Powszechniejszy z nich - mitoza zachodzi tylko w komórkach rozrodczych. W jej
to proces, w którym diploidalne jądro komórki so wyniku z komórki diploidalnej powstają cztery hap-
matycznej dzieli się na dwa p o t o m n e , wciąż di loidalne gamety, z których każda może połączyć się
ploidalne jądra (rys. 2.9). Aby stworzyć wszystkie z gametą płci przeciwnej w czasie rozmnażania płcio
komórki niezbędne w ciągu całego ludzkiego życia, wego. Łatwo wyjaśnić to, że po mejozie powstają
17
potrzeba około 10 mitoz. Zanim rozpocznie się cztery komórki haploidalne. Mitoza p r o w a d z i do
mitoza, każdy chromosom w jądrze replikuje się, powstania dwóch komórek diploidalnych: w mejozie
ale kopie nie od razu oddzielają się od siebie. Na zachodzą, jeden po drugim, dwa podziały jądra.
początku pozostają połączone w swoich centrome- Podstawowa różnica między mitozą i mejoza jest
rach i nie rozłączają się do m o m e n t u , gdy chro subtelniejsza. Przypomnijmy, że w komórce diploidal-
2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 25
interfaza
btona jądrowa
telofaza
późna profaza
centromer
mikrotubule
anafaza metafaza
W interfazie, czyli okresie między podziałami jąder, chromosomy znajdują się w formie rozciągniętej (sekcja 6.1.1). Na początku mitozy
chromosomy kondensują i do późnej profazy formują struktury widoczne w mikroskopie świetlnym. Każdy chromosom właśnie
przeszedł replikację D N A , ale dwa p o t o m n e chromosomy są połączone centromerami. W czasie metafazy pęka błona jądrowa (u
większości eukariotów) i chromosomy ustawiają się w jednej płaszczyźnie na środku k o m ó r k i . Teraz mikrotubule odciągają siostrzane
chromosomy w stronę przeciwnych k o ń c ó w k o m ó r k i . W telofazie w o k ó ł każdego zbioru potomnych c h r o m o s o m ó w odtwarzają się
błony jądrowe. Wynikiem jest powstanie z jednego jądra rodzicielskiego d w ó c h identycznych jąder potomnych. Dla ułatwienia pokazano
tylko jedną parę c h r o m o s o m ó w homologicznych; jeden w parze jest czerwony, a drugi - niebieski
nej są dwie oddzielne kopie każdego chromosomu -over może mieć na dziedziczenie genów. Rozważmy
(sekcja 1.1.1), n a z y w a n e chromosomami homologicz dwa geny, oba o dwóch allelach. Gen pierwszy na
nymi. W czasie mitozy chromosomy homologiczne zwijmy A, a jego allele A i a, zaś drugi gen B o allelach
pozostają oddzielone od siebie. Każdy z pary replikuje B i b. Wyobraźmy sobie teraz, że te dwa geny leżą na
się i jest przenoszony do jądra p o t o m n e g o niezależnie chromosomie 2 Drosophila melanogaster, gatunku mu
od swojego homologa. Natomiast w czasie mejozy szki owocowej badanego przez Morgana. Prześledzimy
chromosomy homologiczne nie zachowują się nieza teraz przebieg mejozy diploidalnego jądra, w którym
leżnie. W pierwszym podziale mejotycznym każdy jedna kopia chromosomu 2 ma allele A i B, zaś druga
chromosom łączy się z homologiem tworząc biwalent ma a i b. Sytuację tę ilustruje rysunek 2.11. Rozważmy
(rys. 2.10). Zachodzi to po replikacji każdego chromo d w a alternatywne scenariusze:
somu, ale przed rozdzieleniem zreplikowanych struk
tur. Biwalent w rzeczywistości zawiera cztery kopie 1) Crossing-over nie zachodzi między genami A i B.
chromosomów, a przeznaczeniem każdej z nich jest W tym przypadku dwie powstające gamety będą
odnalezienie drogi do jednej z czterech gamet wy zawierały kopie chromosomów z allelami A i B,
tworzonych na końcu mejozy. Wewnątrz biwalentu a pozostałe dwie będą zawierać a i b. Innymi słowy,
ramiona c h r o m o s o m ó w (chromatydy) przechodzą dwie gamety mają genotyp AB, a dwie genotyp ab.
fizyczne przerwanie i w y m i a n ę segmentów DNA. 2) Crossing-over zachodzi między genami A i B. Do
Proces ten nazywa się crossing-over lub rekombina prowadzi to do wymiany segmentów DNA zawie
cją i został odkryty przez belgijskiego cytologa Jans- rających gen B między chromosomami homologicz
sensa w 1909 r., zaledwie na dwa lata przed tym, nim nymi. W końcu otrzymuje się cztery gamety o róż
Morgan zaczął zastanawiać się n a d częściowym sprzę nych genotypach: AB, aB, Ab, ab.
żeniem.
W jaki sposób odkrycie crossing-over pomogło Mor Pomyślmy teraz, co się zdarzy jeśli spojrzymy na
ganowi wyjaśnić częściowe sprzężenie? Aby to zro wyniki mejozy w 100 identycznych komórkach. Jeśli
zumieć, musimy pomyśleć o wpływie jaki crossing- nigdy nie zachodzi rekombinacja, uzyskamy gamety
26 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Pokazano zdarzenia obejmujące jedną parę c h r o m o s o m ó w homologicznych; jeden z c h r o m o s o m ó w tworzących parę jest czerwony,
drugi niebieski. Na początku mejozy chromosomy kondensują i każda para c h r o m o s o m ó w homologicznych ustawia się, by utworzyć
biwalent. W biwalencie może zajść crossing-over, obejmujący przerwanie ramion c h r o m o s o m ó w i wymianę D N A . Później w mejozie
następują dwa podziały jądra; wynikiem pierwszego są dwa jądra, oba z dwiema kopiami każdego chromosomu. W końcu powstają
cztery jądra, każde zawierające pojedynczą kopię każdego chromosomu. Końcowe produkty mejozy - gamety są więc haploidalne.
Molekularne podstawy rekombinacji opisano w podrozdziale I 3.2
Rysunek pokazuje parę c h r o m o s o m ó w homologicznych jeden czerwony, a drugi niebieski. A i B są sprzężonymi genami o allelach A, a,
8 i fa. Z lewej strony pokazano mejozę, w której między A i B nie zaszedł crossing-over. D w i e otrzymane gamety mają genotyp AB,
a pozostałe dwie ab. Z prawej strony między A i B zaszedł crossing-over: cztery gamety wykazują wszystkie możliwe genotypy: AB, aB,
Ab i ab
binacji dla różnych par genów, można skonstruować nazywanych gorącymi punktami rekombinacji, cros
mapę ich względnych pozycji na chromosomie (rys. sing-over zachodzi częściej niż w innych. Oznacza to,
211): że odległość na mapie genetycznej niekoniecznie
Okazało się, że założenie Sturtevanta o losowości odzwierciedla fizyczną odległość między dwoma mar
crossing-over nie było do końca uzasadnione. Porów kerami. Teraz zdajemy sobie także sprawę z tego, że
nania między mapami genetycznymi a rzeczywistymi pojedyncza chromatyda może brać udział w więcej
pozycjami genów w cząsteczkach DNA określonymi niż jednym akcie rekombinacji jednocześnie, ale też że
przez mapowanie fizyczne i sekwencjonowanie DNA odległość, w której te dwie rekombinacje mogą zajść,
wykazały, że w niektórych obszarach chromosomów, jest ograniczona. Prowadzi to do dalszych niedokład-
28 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
ności w procedurze mapowania. Niezależnie od tych ciąży czy czas potrzebny potomstwu do osiągnięcia
zastrzeżeń analiza sprzężeń zwykle prowadzi do dojrzałości (a więc uczestniczenia w następnych krzy
prawidłowych wniosków o porządku genów, a oszaco żówkach) ograniczają efektywność metody w stosunku
wania odległości są wystarczająco dokładne do stworze do niektórych zwierząt i roślin.
nia m a p genetycznych nadających się do zastosowania Jeśli wrócimy do rysunku 2.11, zobaczymy, że kluczem
jako szkic w projektach sekwencjonowania genomów. do mapowania genetycznego jest możliwość ustalenia
genotypów gamet powstałych po mejozie. W kilku
przypadkach jest to możliwe przez bezpośrednie
2.3.2 Przeprowadzanie analizy sprzężeń badanie gamet. Na przykład gamety wytwarzane przez
u różnych typów organizmów niektóre mikroorganizmy eukariotyczne, z Saccharomy-
ces cerevisiae włącznie, można hodować jako kolonie
Aby zobaczyć, jak rzeczywiście przeprowadza się anali komórek haploidalnych i określać ich genotyp stosując
zę sprzężeń, powinniśmy rozważyć trzy różne sytuacje: testy biochemiczne. Bezpośrednie genotypowanie ga
met jest także możliwe u wyższych Eukaryota z użyciem
• Analiza sprzężeń u organizmów takich jak muszka markerów DNA. DNA z pojedynczego plemnika może
owocowa i mysz, które można p o d d a w a ć planowa służyć do przeprowadzenia reakcji PCR, umożliwiając
nym eksperymentom hodowlanym. oznaczenie RFLP, SSLP i SNP. Niestety analizy DNA
• Analiza sprzężeń u ludzi, na których nie można z plemników są dość pracochłonne. Rutynowej analizy
przeprowadzać planowanych eksperymentów, sprzężeń u wyższych Eukaryota nie przeprowadza się
można jednak wykorzystać r o d o w o d y rodzin. więc bezpośrednio badając gamety, lecz ustalając
• Analiza sprzężeń u bakterii, które nie przechodzą genotypy diploidalnego potomstwa powstałego z fuzji
mejozy. dwóch gamet, po jednej od każdego z rodziców. Innymi
słowy przeprowadza się krzyżówkę genetyczną.
Analiza sprzężeń, gdy możliwe sq planowane Komplikacją krzyżówki genetycznej jest to, że uzys
eksperymenty hodowlane kane potomstwo nie jest wynikiem jednej, lecz dwóch
Pierwszym typem analizy sprzężeń jest nowoczesne mejoz (jednej u każdego z rodziców), a u większości
uzupełnienie metody wynalezionej przez Morgana organizmów przypadki rekombinacji są równie praw
i jego współpracowników. Metoda opiera się na ana d o p o d o b n e w czasie tworzenia gamet z a r ó w n o męs
lizie potomstwa z eksperymentalnych krzyżówek mię kich, jak i żeńskich. Musimy w jakiś sposób móc
dzy rodzicami o znanych genotypach i można ją wyłonić z genotypów diploidalnego potomstwa przy
stosować, przynajmniej w teorii, u wszystkich euka- padki rekombinacji, które zaszły w obu tych mejozach.
riotów. Względy etyczne wykluczają jej zastosowanie Oznacza to, że krzyżówkę należy przeprowadzać
u ludzi, a problemy praktyczne, takie jak długość bardzo starannie. Standardowo wykorzystuje się krzy-
2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 29
żówkę testową. Ilustruje ją rysunek 2.13, scenariusz 1, p r o d u k o w a n e przez drugiego z rodziców, będącego
gdzie przeprowadziliśmy krzyżówkę testową, by zma- podwójną homozygotą, będą mieć genotyp ab niezależ
pować dwa spotkane wcześniej geny A (allele A i a) nie, czy będą gametami rodzicielskimi, czy po rekom
i B (allele B i b), oba z chromosomu 2 muszki owocowej. binacji. W rezultacie mejoza u tego rodzica w czasie
Istotną cechą testu jest genotyp każdego z rodziców: badania genotypów potomstwa jest „niewidoczna" co
oznacza, że jak pokazuje scenariusz 1 na rys. 2.13,
• Jeden z rodziców jest podwójną heterozygotą.
genotypy diploidalnego potomstwa można jednoznacz
Oznacza to, że u tego rodzica obecne są wszystkie
nie przyporządkować genotypom gamet od rodzica
cztery allele: jego genotyp to AB/ab. Podwójne
będącego podwójną heterozygotą. Krzyżówka testowa
heterozygoty otrzymuje się przez skrzyżowanie
umożliwia bezpośrednie przebadanie pojedynczej me-
dwóch linii czystych, na przykład AB/ABxab/ab
jozy, a zatem obliczenie częstości rekombinacji i zma-
(patrz ramka 2.1, s. 17).
powanie odległości dwóch genów.
• Drugi z rodziców jest pochodzącą z linii czystej
Należy rozważyć jeszcze jeden punkt. Jeśli, jak na
podwójną homozygotą. Obie kopie homologicz
rysunku 2.13 w scenariuszu 1, stosuje się markery
nych chromosomów 2 u tego rodzica są takie same:
genowe wyrażające dominację lub recesywność, rodzic
w przykładzie p r z e d s t a w i o n y m w scenariuszu
będący podwójną homozygotą musi mieć oba allele
1 obie mają allele a i b, więc genotyp ab/ab.
warunkujące fenotyp recesywny. Jeżeli jednak stosuje
Podwójne heterozygoty mają genotyp taki sam jak się kodominujące markery DNA, rodzic będący po
komórka, której mejozę prześledziliśmy na rysunku dwójną homozygotą może mieć jakąkolwiek kombina
2.11. Naszym celem jest wywnioskowanie, jakie były cję alieli homozygotycznych (tzn. AB/AB, Ab/Ab, aB/aB,
genotypy gamet wytworzonych przez tego rodzica ab/ab). P o w o d y ku temu pokazuje scenariusz 2 na
i obliczenie frakcji rekombinantów. Zauważ, że gamety rysunku 2.13.
Scenariusz I Scenariusz 2
A i B są markerami genetycznymi A i B są markerami genetycznymi
A i 6 są dominujące względem o i b A i 8 są kodominujące względem o i b
RODZICE RODZICE
1 x 2 krzyżówka testowa 1 x 2
AB/ab ab/ab AB/ab Ab/Ab
AB ab AB Ab
Ab ab Ab Ab
aB ab gamety aB Ab
ab ab ab Ab
Każdy fenotyp jest taki sam jak Genotyp gamet rodzica I identyfikuje
gemeta rodzica I się na podstawie wykrytych alieli:
Jeśli wykryto tylko A, gameta rodzica I
byłaA.
Jeśli wykryto A+a, to gameta rodzica I
była a itd.
W scenariuszu I - A i B są markerami genetycznymi o allelach A, o, B i b. Uzyskane p o t o m s t w o liczy się badając jego fenotypy. Ponieważ
rodzic będący podwójną homozygotą (rodzic 2) ma dwa allele recesywne, o i b, nic nie wnosi do fenotypów potomstwa. Fenotyp
każdego osobnika z pokolenia F 1 jest więc taki sam jak gamety od rodzica I, z której powstał dany osobnik. W scenariuszu 2 - A i B są
markerami D N A , których pary alieli są kodominujące. W t y m konkretnym przypadku rodzic będący podwójną homozygotą ma genotyp
Ab/Ab. Allele obecne u każdego osobnika z pokolenia F 1 w y k r y w a się bezpośrednio, na przykład techniką PCR. Kombinacje alieli
pozwalają wydedukować genotypy gamet rodzica I, z których powstał każdy osobnik
30 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Ramka 2.2: Krzyżówki wielopunktowe Ponieważ podwójna rekombinacja jest mniej prawdopodobna
niż pojedyncza, oddzielenie środkowego markera od pozo
Dokładność analizy sprzężeń jest większa, jeśli w jednej stałych będzie zachodzić stosunkowo rzadko. Przykład danych
krzyżówce śledzi się więcej niż dwa markery. Nie tylko otrzymanych z krzyżówki trzypunktowej pokazano w tabelce.
pozwala to szybciej uzyskać częstość rekombinacji, ale także, Krzyżówkę przeprowadzono między potrójną heterozygotą
przez prostą analizę danych, umożliwia ustalenie względnego (ABC/abc) i potrójną homozygotą (abcłabc). Najliczniejszą
porządku markerów na chromosomie. Dzieje się tak dlatego, klasę stanowi p o t o m s t w o mające jeden z d w ó c h genotypów
że aby w zestawie trzech markerów środkowy oddzielić od rodzicielskich pochodzące ż przypadków braku rekombinacji
dwóch markerów zewnętrznych, potrzeba dwóch zdarzeń w obszarze zawierającym markery A, B i C. D w i e następne
rekombinacyjnych. A dwa zewnętrzne markery można roz klasy potomstwa są stosunkowo częste (51 i 63 osobniki
dzielić przez tylko jedną rekombinację. w niniejszym przykładzie). Każda z nich powstała z pojedyn
czej rekombinacji. Analiza ich genotypów wskazuje, że w pier
wszej z tych d w ó c h klas marker A został rozprzęgnięty od
pojedynczy crossing-over
m a r k e r ó w B i C, a w klasie drugiej marker B został rozprzęg
nięty od A i C. Wnioskiem jest, że A i B są markerami
D £ F d E F
zewnętrznymi. Potwierdza to liczba potomstwa, u którego
marker C został rozprzęgnięty od A i B. Jest ich tylko dwoje,
co wskazuje, że do powstania tego genotypu potrzebna jest
podwójna rekombinacja. Marker C znajduje się więc między
AiB.
Mapowanie genów przez analizę rodowodów żyją, przez przekreślenie symbolu, j e d n a k nie uzys
u człowieka kamy żadnych dalszych wiadomości o ich genotypach.
Oczywiście u ludzi niemożliwy jest dobór genotypów Naszym celem jest z m a p o w a n i e pozycji genu od
rodziców i przeprowadzenie krzyżówki zaprojektowa powiedzialnego za chorobę genetyczną i w tym celu
nej specjalnie tak, aby była użyteczna w m a p o w a n i u . prześledzimy jej sprzężenie z mikrosatelitarnym mar
Zamiast tego, dane do obliczenia częstości rekombinacji kerem M, którego cztery allele - M1 M2, M3 i M4 są
trzeba uzyskać przez badanie genotypów kolejnych obecne u żyjących członków rodziny. Pytanie brzmi:
pokoleń istniejących rodzin. Wynika z tego, że dostęp jak wiele dzieci jest rekombinantami?
ne d a n e są ograniczone, a ich interpretacja trudna. Jeśli spojrzymy na genotypy sześciorga dzieci, zoba
Ludzkie małżeństwa rzadko stanowią odpowiednią czymy, że 1, 3 i 4 mają allele odpowiedzialne za
krzyżówkę testową, a genotypów jednego lub większej chorobę i mikrosatelitarne allele M 1 . Natomiast 2 i 5 ma
liczby członków rodziny często nie m o ż n a zbadać ją allel odpowiadający z d r o w i u i M?. M o ż e m y więc
z p o w o d u ich śmierci lub niechęci do współpracy. postawić dwie alternatywne hipotezy. Pierwsza: dwie
Problem obrazuje rysunek 2.74. W tym przykładzie kopie c h r o m o s o m ó w homologicznych matki mają
badamy chorobę dziedziczną obecną w rodzinie zło genotyp choroba-M 1 i zdrowie-M 2 , w wyniku czego
żonej z dwojga rodziców i sześciorga dzieci. Choroby dzieci 1, 2, 3, 4 i 5 mają genotypy rodzicielskie, a szóste
genetyczne są często stosowanymi markerami gene dziecko jest jedynym rekombinantem (rys. 2.14B).
tycznymi u ludzi. Stan choroby jest j e d n y m allelem, Sugerowałoby to, że gen warunkujący chorobę i mik-
a zdrowia drugim. R o d o w ó d na rysunku 2.14A poka rosatelita są względnie blisko sprzężone i rekombinacja
zuje, że matka jest chora tak jak i czworo jej dzieci. między nimi zachodzi rzadko. W hipotezie alternatyw
Wiemy z wywiadu rodzinnego, że babka ze strony nej zakłada się, że chromosomy matczyne mają geno
matki również cierpiała na tę chorobę, ale z a r ó w n o typy zdrowie-M, i choroba-M 2 , dzieci 1-5 są rekom
ona, jak i jej mąż - dziadek ze strony matki nie żyją. binantami, a n u m e r sześć t y p e m rodzicielskim, co by
Możemy włączyć ich do r o d o w o d u zaznaczając, że nie oznaczało, że g e n y są położone na chromosomie
2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 3 I
(A) Rodowód
CHROMOSOMY MATKI
hipoteza I hipoteza 2
choroba M1 zdrowie M1
zdrowie M2 choroba M2
częstość
1/6 = 6,7% 5/6 = 83,3%
rekombinacji
LEGENDA
zdrowa kobieta chora kobieta zdrowy mężczyzna chory mężczyzna zmarły
(A) Rodowód przedstawia dziedziczenie choroby genetycznej w rodzinie: dwojga żyjących rodziców i sześciorga dzieci oraz według
informacji o babce ze strony matki - z wywiadu rodzinnego. Allel warunkujący chorobę (pełne symbole) dominuje nad allelem
p r a w i d ł o w y m (puste symbole). Naszym zadaniem jest ustalenie stopnia sprzężenia między genem warunkującym chorobę
a mikrosatelitą M przez typowanie alleli tego mikrosatelity ( M ( , M2, itd.) u żyjących członków rodziny. (B) Rodowód można
zinterpretować na dwa różne sposoby. Hipoteza I zakłada małą częstość rekombinacji i wskazuje, że gen odpowiedzialny za chorobę
jest blisko sprzężony z mikrosatelitą M. Hipoteza 2 sugeruje, że gen i mikrosatelita są znacznie słabiej sprzężone. W (C) problem zostaje
rozwiązany przez ponowne pojawienie się babki ze strony matki; genotyp mikrosatelity babki jest zgodny wyłącznie z hipotezą I. Więcej
szczegółów w tekście
32 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
względnie daleko od siebie. Nie m o ż e m y ustalić, która ogólnemu zaskoczeniu pojawia się p o n o w n i e w chwili
z hipotez jest prawidłowa: d a n e są frustrująco niejed odpowiedniej, by uratować wciąż malejącą oglądal
noznaczne. ność. Okazuje się, że jej genotyp pod względem
Najbardziej satysfakcjonującym rozwiązaniem prob mikrosatelity M to M 1 M 5 (rys. 2.14C). To oznacza, że
lemu postawionego przez r o d o w ó d na rysunku 2.14 allel odpowiedzialny za chorobę i M 1 znajdują się
byłaby znajomość genotypu babki. Załóżmy na chwilę, blisko siebie, na tym samym chromosomie. Teraz
że jesteśmy w serialu telewizyjnym w rodzaju „Dynas z pewnością m o ż e m y stwierdzić, że prawidłowa jest
tii" i babka w rzeczywistości nie umarła, natomiast ku hipoteza 1 i tylko dziecko 6 jest rekombinantem.
Zmartwychwstanie kluczowych osobników zwykle
nie jest opcją dostępną dla prawdziwego genetyka,
(A) Koniugacja chociaż DNA m o ż n a uzyskać nawet ze zwłok lub kości
ludzi nieżyjących. Niepełne r o d o w o d y analizuje się
statystycznie stosując miarę zwaną lod score (Morton,
1995). Nazwa pochodzi od logarytmu prawdopodobień
stwa (ang. logarithm of the odds), że geny są sprzężone.
Miary tej używa się na początku do ustalenia, czy
badane markery leżą na j e d n y m chromosomie, innymi
słowy - czy geny są sprzężone, czy nie. Jeśli analiza lod
nukleoid
score ustali sprzężenie, m o ż n a następnie określić miarę
najbardziej p r a w d o p o d o b n e j częstości rekombinacji.
W sytuacji idealnej d a n e będą pochodzić z więcej niż
jednego r o d o w o d u , podnosząc wiarygodność wyniku.
Analiza jest mniej niejednoznaczna dla rodzin z większą
liczbą dzieci i, jak widzieliśmy na rysunku 2.14, istotna
plazmidy jest możliwość genotypowania przynajmniej trzech
pokoleń. Z tego p o w o d u stworzono kolekcje rodzin,
dawca biorca takie jak zebrana przez Centre d'Etudes du Polymorphi-
sme H u m a i n e (CEPH) w Paryżu (Dausset i wsp., 1990).
(B) Transdukcja Kolekcja CEPH zawiera h o d o w l a n e linie komórkowe
z rodzin, w których można przebadać wszystkich
DNA bakterii bakteriofag
czworo dziadków, jak też co najmniej ośmioro dzieci
z drugiego pokolenia. Kolekcja jest dostępna do mapo
wania markerów DNA dla każdego badacza, który
zgadza się dostarczyć uzyskane dane do centralnej bazy
danych CEPH (patrz Badania i odkrycia 2.1).
Mapę oparto na 5264 mikrosatelitach (sekcja 2.2.2) typu obejmują pozycje 7000 mikrosatelitów obecnych na mapie
AC/TG: genetycznej, umożliwiając integrację obu typów map w jedną
obszerną mapę genomu człowieka.
5' - ACACACACACAC - 3'
3' - TGTGTGTGTGTG - 5'
Były dwie przyczyny, dla których wybrano mikrosatelity
o tej konkretnej sekwencji. Po pierwsze są one częste
w genomie, po kilka na każdy Mb DNA, co zapewnia
stopień pokrycia odpowiedni do mapowania o dużej gęstości.
Po drugie, ten typ mikrosatelity jest bardzo zmienny, wy
stępuje po kilka alleli każdego z nich w całej populacji.
W praktyce oznacza to, że wykazują dużą heterozygo-
tyczność, czyli wysokie prawdopodobieństwo, że przypad
kowo wybrana z populacji osoba będzie heterozygotą pod
względem tego konkretnego mikrosatelity. Średnia hete-
rozygotyczność wszystkich markerów użytych do badania
wynosiła 0,7 (prawdopodobieństwo 7 na 10, że osobnik
będzie heterozygotą), a tylko 7% markerów miało hete-
rozygotyczność mniejszą niż 0,5.
Do wykonania większości mapowania użyto materiału
pochodzącego od ośmiu rodzin z kolekcji CEPH. Rodziny te
obejmowały 134 osoby i pozwalały na prześledzenie 186
mejoz. Uzyskane dane wykorzystano do stworzenia map
chromosomów od I do 22. Aby zmapować chromosom X,
włączono jeszcze 12 rodzin (170 osób, o 105 mejoz więcej).
Dodatkowe dane były potrzebne, ponieważ przypadki rekom
binacji pomiędzy markerami sprzężonymi z X są w rodowo
dach rzadsze, gdyż mężczyźni mają tylko jeden chromosom X.
Mapa
Analiza sprzężeń pozwoliła przypisać 5264 markery do 2335
pozycji chromosomowych. Liczba pozycji jest mniejsza niż
liczba markerów, ponieważ niektóre mikrosatelity leżą zbyt
blisko siebie, by je rozdzielić; dlatego zostały zmapowane
w tej samej pozycji. Średnia gęstość dla całej mapy wyniosła
jeden marker na 599 kb, sięgając od jednego na 495 kb dla
chromosomu 17 do jednego markera na 767 kb dla chromo
somu 9. Tylko w trzech miejscach w genomie najbliższe
siebie markery wydawały się odległe o więcej niż 4 Mb DNA.
Mapa mikrosatelitów w genomie człowieka
Podejrzewa się, że te przerwy w rzeczywistości nie są tak
wielkie, jak się wydają, prawdopodobnie w związku z gorą Każda czerwona kreska oznacza jedną z 2335 pozycji, w których
cymi punktami rekombinacji (patrz s. 27). Dwa markery po zostaty zmapowane markery mikrosatelitarne. Przedrukowano za zgodą
z: Dib C et al., Nature, 380, 152-154. Copyright 1996 Macmillan
przeciwnych stronach takiego miejsca będą wydawać się Magazines Limited
bardziej oddalone, niż są w rzeczywistości, z powodu dużej
częstości rekombinacji zachodzącej między nimi. Literatura cytowana
Krótko po publikacji mapy genetycznej ukończono mapę
Dib C, Fuare S, Fizames C, et al. (1996) A comprehensive genetic
fizyczną o gęstości markerów sięgającej jeden na 100 kb. map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380,
(Patrz Badania i odkrycia 3.1, s. 56). Ta i inne mapy fizyczne 152-154.
34 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
dawca biorca
Powyższy rysunek pokazuje transfer funkcjonalnego genu odpowiedzialnego za syntezę tryptofanu z dzikiej bakterii (o genotypie
opisywanym jako trp+) do biorcy, któremu brakuje działającej kopii tego genu (trp~). Biorcę nazywa się auksotrofem tryptofanowym
(słowo używane do opisania zmutowanej bakterii, która może przeżyć tylko wówczas, gdy dostarczy się jej odpowiedniego składnika
odżywczego - w t y m przypadku tryptofanu, który nie jest konieczny dla typu dzikiego, patrz sekcja 13.1.2). Po transferze potrzebna jest
podwójna rekombinacja, by przeniesiony gen włączył się do chromosomu k o m ó r k i biorcy, zmieniając fenotyp biorcy z trp- na trp+.
(A) W czasie koniugacji D N A przenoszony jest z dawcy do biorcy w taki sposób, jak przeciąga się strunę przez rurkę. Względne pozycje
markerów w cząsteczce D N A można zmapować ustalając czas, po którym markery pojawiają się w komórce biorcy. W pokazanym
przykładzie markery A, B i C są przenoszone odpowiednio po 8, 20 i 30 minutach od rozpoczęcia koniugacji. Przeniesienie całego
genomu £. coli zajmuje około 100 minut. (B) Aby zostać wspólnie przeniesione w czasie transdukcji lub transformacji, dwa markery (lub
więcej) muszą być ściśle sprzężone, ponieważ zwykle procesy te umożliwiają przeniesienie z dawcy do biorcy mniej niż 50 kb D N A .
Mapowanie z użyciem transdukcji i transformacji stosuje się do ustalenia względnych pozycji m a r k e r ó w położonych zbyt blisko siebie,
aby zmapować je precyzyjnie stosując koniugację. Dalsze szczegóły - patrz Freifelder (1987)
2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 35
jednej z trzech istniejących metod przenoszenia frag Tutaj też używa się markerów biochemicznych,
m e n t ó w DNA z jednej bakterii do drugiej (rys. 2.15): fenotypem dominującym lub typu dzikiego jest p e w n a
cecha biochemiczna (np. zdolność syntezy tryptofanu;
1) Koniugacja, w czasie której dwie bakterie zbliżają
wrażliwość na antybiotyk *), a fenotypem recesywnym
się fizycznie i jedna z nich (dawca) przekazuje
- cecha przeciwna (np. brak zdolności syntezy tryptofa
DNA drugiej bakterii (biorcy). Przeniesiony DNA
nu, oporność na antybiotyk). Transfer genu przeważnie
może być kopią części lub, jeśli to możliwe, całości
przeprowadza się między dawcą mającym allele dzikie
chromosomu komórki dawcy, albo też segmentem
a biorcą o allelach recesywnych. Przeniesienie do
chromosomowego DNA długości do 1 Mb, włączo
szczepu biorcy śledzi się poszukując pojawienia się
nym do plazmidu (sekcja 1.2.2). Ten drugi przypa
u biorcy funkcji biochemicznych określanych przez
dek nazywa się transferem episomu.
badane geny (rys. 2.16B). Szczegóły procedury mapo
2) Transdukcja, która obejmuje przeniesienie małych wania zależą od używanego typu transferu genów.
(do ok. 50 kb) segmentów DNA z dawcy do biorcy W m a p o w a n i u koniugacyjnym DNA dawcy jest prze
za pośrednictwem bakteriofaga. noszony do biorcy jako ciągła nitka, a pozycje genów
3) Transformacja, gdy komórka biorcy pobiera ze mapuje się przez oznaczenie czasu wejścia alleli dzikich
środowiska fragmenty DNA pochodzące z komórki do biorcy. Mapowanie z zastosowaniem transdukcji
dawcy, rzadko dłuższe niż 50 kb. i transformacji umożliwia z m a p o w a n i e genów położo
Po przeniesieniu musi zajść podwójna rekombinacja, nych stosunkowo blisko siebie, ponieważ przenoszony
tak aby DNA z bakterii dawcy włączył się do chromo segment DNA jest krótki (50 kb), a prawdopodobieńst
somu komórki biorcy (rys. 2.16A). Jeśli to się nie wo, że dwa geny zostaną przeniesione wspólnie, zależy
zdarzy, przeniesiony DNA jest gubiony w czasie od ich bliskości na chromosomie bakteryjnym.
podziału komórki biorcy. Jedynym wyjątkiem jest
transfer episomu, gdyż plazmidy mogą się namnażać * Wrażliwość na antybiotyki jest cechą dziką, na ogól
niezależnie od chromosomu gospodarza. recesywną (przyj), tłum.)
LITERATURA CYTOWANA
Collins FS, Guyer MS and C h a k r a v a r t i A (1997) Variations on a theme: cataloging human D N A sequence variation. Science, 2 7 8 ,
1580-1581.
Dausset J, Cann H, C o h e n D, et al. (1990) Program description: Centre d'Etude du Polymorphisme Humain - collaborative genetic
mapping of the human genome. Genomics, 6, 575-577.
Freifelder D (1987) Microbiol Genetics. Jones & Bartlett, Boston.
Mori M, B e a t t y PG, Graves M, Boucher KM and Milford EL (1997) HLA gene and haplotype frequencies in the N o r t h American
population. Transplantation, 65, U I.
M o r t o n NE (1955) Sequential tests for the detection of linkage. Am. J. Hum. Genet., 7, 277-3 18.
O r e l V (1995) Gregor Mendel: The First Geneticist. O x f o r d University Press, O x f o r d .
Pennisi E (1998) Sifting through and making sense of genome sequences. Science, 280, 1692-1693.
Ramsay G (1998) D N A chips: state of the art. Nature Biotechnol, 16, 4 0 - 4 4 .
S t u r t e v a n t AH (1913) The linear arrangement of six sex-linked factors in Drosophila as shown by mode of association. J. Exp. Zoo/.,
14, 39-45.
V e n t e r JC, A d a m s M D , Sutton G G , Kerlavage AR, Smith HO and Hunkapiller M (1998) Shotgun sequencing of the human
genome. Science, 2 8 0 , 1540-1542.
W a n g D G , Fan J-B, Siao C-J, et al. (1998) Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in
the human genome. Science, 280, 1077-1082.
Y a m a m o t o F, Clausen H, W h i t e T, M a r k e n J and H a k a m o r i S (1990) Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system.
Nature, 3 4 5 , 229-233.
LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and W a t s o n JD (1994) Molecular Biology of the Cell. 3rd edition. Garland Publishing,
NewYork. - Zawiera wszystkie szczegóły mitozy i mejozy.
Fincham JRS, D a y PR and Radford A ( 1979) Fungal Genetics, 4th edition. Blackwell, London. - „Biblia" mapowania genów
mikroorganizmów eukariotycznych.
Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki D T , Lewontin RC and G e l b a r t WM (1996) An Introduction to Genetic Analysis, 6th edition. W. H.
Freeman, NewYork. - Rozdziały 5 i 6 szczególnie dobrze opisują mapowanie genów za pomocą krzyżówek eksperymentalnych.
Rozdział 10 dotyczy mapowania u bakterii.
Strachan T and Read AP (1996) Human Molecular Genetics. BIOS Scientific Publishers, O x f o r d . - Rozdział 12 obejmuje mapowanie
genetyczne człowieka.
S t u r t e v a n t AH (1965) A History of Genetics. Harper and Row, N e w York. - Opisuje wczesne prace nad mapowaniem genów
przeprowadzone przez Morgana i jego współpracowników.