Elekroforeza serumskih proteina Elektroforeza (EF) predstavlja kretanje naelektrisanih estica u elektrinom polju.

Kada se elektrino polje primeni na medijum koje sadri naelektrisane estice-jone, negativno naelektrisane estice kretae se ka pozitivnoj elektrodi (anodi) a pozitivno naelektrisane estice kretae se ka negativnoj elektrodi (katodi). Ovaj princip je naao primenu u razdvajanju pojedinih frakcija proteina. Proteini se sastoje od velikog broja razliitih aminokiselina (AK) koje su vezane peptidnim vezama. Neke od tih AK imaju u svojim bonim lancima pozitivno ili negativno naelektrisane grupe. U zavisnosti od sastava i sekvence AK, tip i koliina naelektrisanih grupa veoma varira od proteina do proteina. Negativno naelektrisane grupe mogu da potiu od karboksilne grupe, npr. asparaginske i glutaminske kiseline. U alkalnoj sredini karboksilna grupa bie negativno naelektrisana: R-COOH + OH- -------------- R-COO- + H2O Karboksilna grupa nije naelektrisana u kiseloj sredini, zbog toga to vezuje jedan proton: R-COO- + H+ --------------- R-COOH Pozitivno naelektrisane grupe u proteinskom molekulu potiu uglavnom od ostataka arginina, histidina i lizina. Ove AK imaju slobodnu amino grupu, koja u kiseloj sredini vezuje proton i postaje pozitivno naelektrisana: R-NH2 + H+ ---------------- R-NH3 U alkalnoj sredini ova grupa gubi proton a time i svoje naelektrisanje: R-NH3 + OH- -------------- R-NH2 + H2O Ukupno naelektrisanje proteina je zbir svih pozitivnih i negativnih naelektrisanja u molekulu proteina. Ona pH vrednost pri kojoj je ukupno naelektrisanje proteina ravno nuli, je izoelektrina taka (IT). Ukoliko je razlika izmeu pH sredine u kojoj se protein nalazi i IT vea, vee je i ukupno naelektrisanje proteina, a samim tim i brzina kretanja u elektrinom polju. Kretanje proteina prvenstveno e zavisiti od predznaka naelektrisanja. U elektroforetskom sistemu pH se obezbeuje pomou pufera, pri emu se obino koristi jedan (kontinuirani sistem), a moe se koristiti i vie razliitih pufera (diskontinuirani puferski sistem). U zavisnosti od IT proteina koji se razdvaja, bira se odreeni pufer za EF razdvajanje. Obino je to barbituratni (veronalni) pufer. Ovaj pufer ne precipitira niti denaturie proteine i u njemu su proteini uglavnom negativno naelektrisani pri pH 8.6. U elektrinom polju pri ovoj pH, negativno naelektrisani molekuli kreu se ka anodi. Osim barbituratnog pufera koristi se i TRIS-barbituratni pufer sa Ca-laktatom. Jonska jaina pufera obino iznosi 0.05-0.15. Po pravilu koncentrovaniji puferi daju otrije frakcije. Meutim ako je njihova provodljivost vea, vea je i jaina struje pa mora da se radi pri niem naponu da ne bi dolo do pregrevanja. Usled toga vreme razdvajanja je due nego sa puferima manje koncentracije. Provodljivost pufera zavisi od njegove jonske jaine. EF se izvodi na razliitim inertnim medijumima. Meutim veina tih materijala ima negativno naelektrisanje usled zeta potencijala koji postoji na dodirnoj povrini izmeu medijuma i pufera. Takoe neki od medijuma sadre jonizovane grupe, koje su negativno naelektrisane u alkalnim puferima. Npr. papir sadri izvestan broj karboksilnih grupa, a agar sulfatne grupe. Negativni joni imaju tendenciju da putuju prema anodi, ali je to u ovom sluaju nemogue posto se nalaze u vrstom stacionarnom potpornom medijumu. Da bi se uravnoteila sila stvorena na ovaj nain, pozitivno naelektrisani molekuli vode (H3O+) putuju katodno. Ova pojava se nazive elektroendoosmoza. Posledica katodnog kretanja vode je ta da se i elektroneutralni molekuli u izvesnoj meri pomeraju katodno, a svi anjoni su neto usporeni u svom kretanju prema anodi.

Potporni medijumi dele se u dve grupe. Prva grupa obuhvata: papir, celuloza acetat i agarozni gel, a druga grupa: skrobni i poliakrilamidni gel. Potporni medijumi prve grupe omoguavaju separaciju molekula samo na osnovu naelektrisanja, a potporni medijumi druge grupe osim razdvajanja na osnovu naelektrisanja pokazuju i efekat molekularnog prosejavanja za komponente koje treba razdvojiti. Gel je porozni medijum ija je veliina pora istog reda veliine kao i veliina molekula proteina. Mo razdvajanja ovih potpornih medijuma je mnogo vea tako da se sa prvom grupom dobija pet frakcija, a sa drugom 25 ili vie traka serumskih proteina. Papir kao potporni medijum je od istorijskog znaaja, iako je ranije esto korien za razdvajanje serumskih proteina i enzima. Danas se retko koristi i uglavnom se zamenjuje sa celuloza acetatom, zbog niza loih osobina. Papir nije potpuno homogen medijum u pogledu veliine pora, a zbog izvesne koliine karboksilnih grupa poseduje izraen efekat elektroendoosmoze. Osim toga papir apsorbuje razne supstance, pre svega proteine, to dovodi do razvlaenja razdvojenih frakcija. Celuloza acetat je najbolji medijum za jednostavno i brzo, svakodnevno ispitivanje uzoraka koji sadre proteine, npr. serum. Metoda je brza i osetljiva. Koristi se acetilovana celuloza, koja je homogena u pogledu veliine pora. Adsorpcija proteina je minimalna pa ne dolazi do razvlaenja zona. Agar gel je bolji od papira, ali nije tako dobar kao skrobni gel ili poliakrilamidni gel. Agar je polisaharid koji se dobija iz morskih algi, a sastoji se od ostataka D i l galaktoze koji su vezani 1.3 glikozidnim vezama i sadre sulfatne i karboksilne grupe. prirodni agar se sastoji od dve vrste polisaharida: agaroze koja je skoro neutralna i amilopektina koji je naelektrisan. Usled prisustva negativno naelektrisanih grupa, u gelu agara je veoma izraen efekat elektroendoosmoze a ponekad dolazi i do izvesne adsorpcije proteina. Zato se danas koristi preiena agaroza koja sadri znatno manji broj jonizovanih grupa, to zavisi od stepena istoe. Na ovaj nain se elektroendoosmoza znatno smanjuje. Gel agara ili agaroze ima relativno velike pore, ali je mehaniki vrst. Zbog jednostavne aparature i izvoenja, ova metoda je pogodna za svakodnevni rad. Celuloza acetat i agaroza obino se koriste u kliniko-biohemijskim laboratorijama i oba ova medijuma se proizvode komercijalno. Daju sline rezultate, ali se agaroza vie koristi zbog konstantnosti uslova izvoenja i jednostavnosti. Gelovi sadre 10 g/L agaroze u barbituratnom puferu, pH 8.6, a debljina agarozne ploe je obino 0.05 mm. Skrob se sastoji od granula, koje su izgraene od dva polimera: amiloze i amilopektina. EF na skrobnom gelu radi se sa tzv. parcijalno hidrolizovanim skrobom. Posebnom obradom granula, postie se razdvajanje amiloze od amilopektina. Kada se suspenzija preparata u puferu zagreje do kljuanja i ohladi, formira se relativno vrst gel. Proteini se kreu kroz trodimenzionalnu mreu amilopektina. Kako su dimenzije pora skrobnog gela iste veliine kao i proteinski molekuli dolazi do efekta tzv. molekularnog prosejavanja, pa se kod ove tehnike proteini ne razdvajaju samo na osnovu naelektrisanja ve i na osnovu veliine i oblika molekula. Kao rezultat toga, razdvajanje je mnogo efikasnije pa se EF na skrobnom gelu dobija vei broj frakcija. Kako je skrob prirodni proizvod, njegov sastav moe znatno da varira, pa se zato za svaku seriju hidrolizovanog skroba mora odrediti i optimalna koncentracija. EF na skrobnom gelu nala je najveu primenu u istraivanjima polimorfizma proteina i izoenzima. Poliakrilamid gel nastaje polimerizacijom monomera akrilamida i komonomera metilenbisakrilamida (BIS) koji stvara ukrtene veze. Razliite pore gela dobijaju se menjanjem koncentracija akrilamida (duina lanaca) ili menjanjem odnosa BIS i akrilamida (broj ukrtenih veza). Polimerizacija akrilamida odvija se u prisustvu slobodnih radikala koji mogu da se stvaraju hemijskom ili fotohemijskom metodom. Kod hemijske polimerizacije, kao katalizator koristi se amonijum persulfat u prisustvu TEMED kao akceleratora. Fotohemijska polimerizacija izvodi se pomou riboflavina, koji prilikom osvetljavanja UV

lampom stvara slobodne radikale potrebne za poetak polimerizacije. Jedna od vanih prednosti poliakrilamida kao sintetikog polimera, nad prirodnim proizvodom (skrob, agar itd) je mogunost reproducibilnog pripremanja gela iz istih hemikalija, koje se nee razlikovati od serije do serije, kao to se deava sa skrobom. Kako poliakrilamid praktino nema naelektrisanih grupa u svojoj strukturi, efekat elektroendoosmoze je takorei zanemarljiv. S obzirom da se EF razdvajanjem na poliakrilamidnom gelu dobija veliki broj frakcija koje je teko protumaiti, ova tehnika se ne koristi za rutinske analize. Ona je nala primenu u izuavanje specifinih proteina. EF razdvajanje moe da se izvodi pri konstantnom naponu ili konstantnoj jaini struje. Optimalna jaina struje i napon ne mogu teoretski da se predvide, ve ih je potrebno empirijski utvrditi. Kod razliitih tehnika napon se kree od 100 1000V, a struja od 1mA do 1A. Za rutinsku EF na agaroznom gelu koristi se konstantan napon. Poto se EF izvodi 30 min na 90 ili 100 V, promene u struji i temperaturi nisu ozbiljan problem. U praksi je poeljno da imamo brzu separaciju proteina kako bi razdvojene trake bile to otrije. to EF traje due utoliko je vea radijalna difuzija i frakcije su razvuene. Vreme se moe smanjiti skraenjem potpornog medijuma ili povienjem napona. Sa povienjem napona, poveava se i jaina struje, ali u tom sluaju zagrevanje je limitirajui faktor koji dovodi do denaturacije proteina, jedan od naina da se sprei zagrevanje je da se snizi jonska jaina pufera. Bojenje proteina posle EF razdvajanja, a nakon toga denzitometriranje uobiajeni je postupak kvantitativnog odreivanja individualnih proteina. Razdvojene proteinske frakcije se detektuju na tri naina: bojenjem organskim bojama, fluorogenom detekcijom i bojenjem srebrom. Od organskih boja u upotrebi su: amido crno, brom fenol plavo, Poceau S, Coomasie Brilliant Blue, itd. Amido crno se koristi za agarozni gel, a Ponceau S za celuloza acetat. Najosetljivije su Coomassie boje poto pomou njih moe da se detektuje 0,5 g/cm proteina. Za bojenje elektroforegrama na poliakrilamidu najee se koristi boja Coomassie brilliant (CB)plavo R-250, koja zahteva kiselu sredinu za elektrostatsku reakciju izmeu molekula boje i amino grupe proteina. Relativno visok intenzitet bojenja proteina CB bojama u odnosu na druge organske boje posledica je i stvaranja sekundarnih veza izmeu molekula boje. Viak boje vezuje se za boju koja je ve vezana za proteine. Pored CB plavog R-250 koristi se i CB plavo G-250 koji je manje rastvoran i primenjuje se u vidu koloidne disperzije. Prednost ove boje je to se vezuje samo za protein, a ne i pozadinu gela. Ovim je olakan i ubrzan postupak bojenja. Bojenje srebrom je 20-200 pura osetljivije od bojenja organskim bojama tako da otkriva 0.05-0.1 ng proteina. Najveu primenu ovo bojenje je nalo kod EF proteina likvora. EF serumskih proteina na agarozi ili celuloza acetatu dobija se 5 frakcija: albumin, 1, 2, i globulini, pri emu se njihova EF pokretljivost smanjuje od albumina ka gama frakciji. EF je osnovna tehnika screening-a koja ukazuje na kvalitativne i kvantitativne promene u profilu serumskih proteina. Denzitometriranje slui za grubo kvantitativno odreivanje proteina, a patoloke promene u elektroforegramu vide se i vizuelno, tako da je uz svaku plou potrebno postaviti i jedan normalan uzorak seruma radi poreenja. Poremeaj u odnosu pojedinih proteinskih frakcija ili pojava neke patoloke frakcije na elektroferogramu, zahteva dalje tumaenje ovih promena, primenom imunohemijskih metoda kvalitativnog ili kvantitativnog odreivanja specifinih proteina. Za kvantitativno odreivanje specifinih proteina koriste se: nefelometrijski i turbidimetrijski postupak kao i tehnika radijalne imunodifuzije (RID). Kvalitativno odreivanje podrazumeva primenu imunoelektroforeze. Na slici 1 prikazan je elektroferogram serumskih proteina zdrave osobe, na kojoj se vidi 5 frakcija, a ukoliko je serum sve i pufer sadri Ca+2 , moe se videti i esta traka (2) koja potie od C3 komplementa. Pojedini proteini ne mogu se videti jasno na elektroforegramu, jer imaju suvie nisku koncentraciju ili su maskirani sa proteinima vee

koncentracije. Tako je npr. ceruloplazmin maskiran sa 2-makroglobulinom i haptoglobinom. Neki proteini se nevide dobro jer slabije vezuju boju zbog velikog procenta lipoproteina ili ugljenih hidrata (npr. 1-kiseli glikoprotein).

Slika 1. Elektroferogram serumskih proteina i izgled nakon dezitometriranja EF razdvajanje dobija se 5 frakcija serumskih proteina koji imaju odreenu proteinsku strukturu, molekulsku masu i fizioloku ulogu. Shodno ulozi koju imaju u organizmu njihova koncentracija se menja u raznim patolokim stanjima. Albumin je serumski protein koji se nalazi u najveoj koncentraciji u poreenju sa ostalim proteinima (od ukupne mase proteina pola otpada na albumin). Stvara se u jetri a poluivot mu je 5 do 19 dana. Kliniki znaaj albumina 1. Hiperalbuminemija je retka i bez klinikog znaaja. 2. Hipoalbuminemija je posledica poveanog gubitka albumina (nefrotski sindrom) i smanjene sinteze (malnutricija, malresorpcija, oteenje jetre). 3. Analbuminemija je retko genetsko oboljenje a manifestuje se izostankom albuminske frakcije. 4. Bisalbuminemija je genetsko oboljenje (postoje dva gena koja sintetiu dve vrste albumina), pa se nakon EF javljaju dve trake istog intenziteta (slika 2). 1 frakcija sadri: 1. 1 lipoprotein HDL 2. 1 antitripsin (1 AT). 1 AT je inhibitor koji se vezuje i inaktivira tripsin. Deficijencija u 1- AT dovodi do destrukcije zida alveola i ukazuje na

deficijenciju plua. To je protein akutne faze i poveava se u akutnim infekcijama i kod oteenja tkiva. 3. 1- kiseli glikoprotein (orosomukoid) protein akutne faze 4. 1-anti-hromotripsin protein akutne 5. 1-fetoprotein (AFP). AFP je fetalni protein i obino se koristi za skrining abnormalnosti kod fetusa (defekat neuralne tube) i kao tumor marker kod malignih promena na jetri. 2-frakcija sadri: 1. 1-makroglobulin, protein velike molekulske mase (729 kDa). Sintetie se u jetri a poveana mu je koncentracija u nefrozi jer je veliki protein i teko prelazi u urin. S obzirom da je tada poveano izluivanje drugih manjih proteina (npr. albumina) on preuzima njihovu ulogu pa mu je poveana sinteza u jetri. On nije protein akutne faze. 2. 1-haptoglobin sintetie se u jetri, a ima ulogu u vezivanju i uvanju hemoglobina. Niske su mu vrednosti kod intravaskularne hemolize, a poviene u akutnoj fazi. -frakcija sadri: 1. transferin sa molekulskom masom od 77 kDa. To je protein koji transportuje Fe i moe da vee bakar. Poviene vrednosti su kod nedostatka Fe, u trudnoi i u terapiji estrogenima. On je negativan reaktant akutne faze pa je snien u akutnoj inflamaciji. 2. 1-lipoprotein LDL. Zbog velike molekulske mase (2750 kDa) povien je u nefrozi i u tipu II hiperholesterolemije. 3. C3 i C4 takoe migriraju u beta frakciji. Oni su snieni kod genetske deficijencije, a povieni u inflamaciji. C3 je kasni protein akutne faze, a ukoliko se uzorak uva na sobnoj temperaturi razlae se i tada se ne detektuje. 4. IgA -frakcija sadri: imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgD and IgE). Pojava jednog otrog pika ukazuje na prisustvo paraproteina i vezana je za monoklonalnu gamapatiju. 1. IgG migriraju u i regionima i povieni su u infekcijama, autoimunim bolestima i bolestima jetre. 2. IgM migriraju u regionu 3. IgA migriraju u 2, i regionu. 4. CRP je najosetljiviji indikator reakcije akutne faze. Kvalitativne promene elektroforegrama ispoljavaju se u vie razliitih sluajeva, a one su posledica genetskih varijacija ili patolokih promena: 1. Na elektroforegramu mogu se javiti intenzivno obojene trake u predelu od do oblasti koje se lako uoavaju i golim okom. To su monoklonalni imunoglobuloni (Ig), paraproteini ili M proteini koji su posledica malignog bujanja imunocita. Monoklonalna reakcija tj. paraproteini javljaju se kod multiplog mijeloma ili plazmocitoma, makroglobulinemija, bolesti tekih lanaca, kod pojave Bence Jones proteina. 2. Na elektoforegramu uoavaju se multiple trake, razliita mobilnost traka ili potpuno odsustvo pojedinih frakcija. Ove pojave posledica su genetskih varijacija jer je poznato da neki od serumskih proteina pokazuju genetski polimorfizam kao to su: haptoglobin, 1-antitripsin, transferin i albumin koji pokazuje bisalbuminemiju (slika 2). Neke od ovih promena nemaju kliniki znaaj, ali zato su kod nekih znak tekog poremeaja (npr. pojava Z

homozigota 1-antitripsina to ukazuje na pulmonalno oboljenje i cirozu jetre).

Slika 2. Izgled elektroferograma nakon denzitometriranja kod osobe sa bisalbuminemijom

3.

4.

Drugi uzroci promene pokretljivosti pojedinih traka, kao to je anodno pomeranje albumina nastaje usled vezivanja lekova kao sto su salicilati i penicilin ili vee koncentracije bilirubina i masnih kiselina. Smanjena mobilnost se javlja kod 1-antitripsina usled vezivanja tiol grupe ili BenceJones-ovih proteina. Pojava traka koje se normalno ne vide kao to je sluaj kod: a. povienih vrednost fetoproteina tako da se javlja traka izmeu albumina i regije b. u sluaju poveanja c-reaktivnog proteina javlja se nova traka u predelu regije to je sluaj u akutnoj fazi c. pojava lizozima u monocitnoj leukemiji to se manifestuje post trakom.

Kvantitativne promene na elektroforegramu kod pojedinih bolesti manifestuju se promenjenim odnosom pojedinih proteinskih frakcija. Tako se nefrotski sindrom odlikuje poveanom koncentracijom proteina vee molekulske mase jer se proteini male molekulske mase kao to su prealbumin, albumin, 1-glikoprotein, 1-antitripsin, i transferin izluuju urinom. Jasno se vidi smanjenje albuminske i frakcije dok se 2 globulini poveavaju (2makroglobulin, haptoglobin, lipoprotein, IgM) i ovo je slika selektivne proteinurije. U zapaljenskim procesima dolazi do poveanja proteina akutne faze u koje spadaju: 1-antitripsin, 1-kiseli glikoprotein, haptoglobin, C-reaktivni protein to se odraava na elektroforegramu u vidu povienja 1 i 2 frakcije. Vrednost -1 frakcije se poveava u sluaju nedostatka Fe, jer se tada poveava koncentracija transferina. 1 frakcija se poveava kod hroninog hepatitisa, terapije estrogenima, u trudnoi. 2 frakcija je poveana kod reumatoidnog artritisa i bolesti imunih kompleksa Fuzija i frakcija javlja se kod poveanih vrednosti IgA koja se javlja kod ciroze, respiratorne i kone infekcije i reumatoidnog artritisa. Poveana frakcija moe se javiti usled poliklonalnog globulinskog rasta vezanog za imunoreakciju, hronina inflamatorna oboljenja, oboljenja jetre i neoplazme. Poveana frakcija moe se javiti i u vidu oligoklonalnih traka koje se javljaju kod hroninog hepatitisa i hroninih virusnih infekcija. Nedostatak frakcije javlja se kod imunodeficijencije koja je kongenitalna ili steena. Na slici 3 prikazani su elektroferogrami nakon denzitometriranja seruma osoba sa razliitim patolokim poremeajima.

Slika 3. Elektroferogrami nakon denzitometriranja seruma osoba sa razliitim patolokim poremeajima.