DNA Analiza

Dragan Primorac i suradnici / ANALIZA DNA U SUDSKOJ MEDICINI I PRAVOSUU
MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB
MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB BIBLIOTEKA ZNANSTVENE MONOGRAFIJE Dragan Primorac i suradnici / ANALIZA DNA U SUDSKOJ MEDICINI I PRAVOSUU Urednici: prof. dr. sc. Dragan PRIMORAC doc. dr. sc. Damir MARJANOVI Recenzenti: akademik Stjepan GAMULIN, Hrvatska akademija znanosti i umjetnosti, Republika Hrvatska prof. dr. sc. Katja DROBNI, Sveuilite u Mariboru, Republika Slovenija prof. dr. sc. Rifat HADISELIMOVI, Univerzitet u Sarajevu, Bosna i Hercegovina prof. dr. sc. Floriana BULI-JAKU, Medicinski fakultet, Sveuilite u Zagrebu, Republika Hrvatska prof. dr. sc. Alan BOSNAR, Medicinski fakultet, Sveuilite u Rijeci, Republika Hrvatska prof. emeritus dr. sc. eljko HORVATI, Pravni fakultet, Sveuilite u Zagrebu, Republika Hrvatska prof. dr. sc. Dubravka HRABAR, Pravni fakultet, Sveuilite u Zagrebu, Republika Hrvatska prof. dr. sc. Tatjana JEREN, Medicinski fakultet, Sveuilite u Zagrebu, Republika Hrvatska prof. dr. sc. Mladen MARCIKI, Medicinski fakultet, Sveuilite u Osijeku, Republika Hrvatska prof. dr. sc. Davor STRINOVI, Medicinski fakultet, Sveuilite u Zagrebu, Republika Hrvatska Josip ULE, dipl. iur., Dravno odvjetnitvo Republike Hrvatske, Zagreb, Republika Hrvatska
CIP zapis dostupan u raunalnom katalogu Nacionalne i sveuiline knjinice u Zagrebu pod brojem 661109
ISBN 978-953-176-390-5
Sva prava pridrana. Ova je knjiga zatiena autorskim pravima i ne smije se ni djelomino reproducirati, pohraniti u sustavu za reproduciranje, fotokopirati niti prenositi u bilo kojem obliku i na bilo koji nain bez pismenoga doputenja autora i izdavaa.
Dragan Primorac
i suradnici
ANALIZA DNA U SUDSKOJ MEDICINI I PRAVOSUU

Urednici:
Dragan Primorac Damir Marjanovi
MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB, 2008.
Autori
prof. dr. sc. Dragan Primorac, dr. med., Medicinski fakultet, Sveuilite u Splitu; Medicinski fakultet, Sveuilite u Osijeku doc. dr. sc. Damir Marjanovi, dipl. biol., Institut za genetiko inenjerstvo i biotehnologiju, Univerzitet u Sarajevu, Bosna i Hercegovina; Institut za antropologiju, Zagreb prof. dr. sc. Gordan Lauc, dipl. ing. mol. biol., Medicinski fakultet, Sveuilite u Osijeku; Genos d.o.o. za vjetaenje i analize, Osijek Goran uri, dr. med., Medicinski fakultet, Sveuilite u Osijeku dr. sc. Ivan Gornik, dr. med., Kliniki bolniki centar Zagreb prof. dr. sc. imun Anelinovi, dr. med., Kliniki bolniki centar Split; Medicinski fakultet, Sveuilite u Splitu prof. dr. sc. Marija Definis-Gojanovi, dr. med., Kliniki bolniki centar, Split; Medicinski fakultet, Sveuilite u Splitu doc. dr. sc. Davorka Sutlovi, dipl. ing. kemije, Kliniki bolniki centar Split dr. sc. Damir Primorac, dipl. iur., sudac, upanijski sud u Splitu Tihana Pivac, dipl. iur., sutkinja, upanijski sud u Splitu Gordan Mri, dipl. ing., Centar za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, Ministarstvo unutarnjih poslova Republike Hrvatske, Zagreb mr. sc. Petra Uvodi, dipl. ing. mol. biol., Centar za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, Ministarstvo unutarnjih poslova Republike Hrvatske, Zagreb doc. dr. sc. Alemka Markoti, dr. med., Klinika za infektivne bolesti Dr. Fran Mihaljevi, Zagreb Professor James W. LeDuc, Ph.D., Institute for Human Infection and Immunity, University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA Assistant Professor Heather Miller Coyle, Ph.D., Connecticut Department of Public Safety, Connecticut State Police, Meriden, Connecticut, USA Timothy M. Palmbach, M.S., J.D., Connecticut Department of Public Safety, Connecticut State Police, Meriden, Connecticut, USA Chris Asplen, Esq, Gordon Thomas, Honeywell Governmental Affairs Washington, DC, USA
Prevoditeljica 10. poglavlja:

Antonija Redovnikovi, prof.
Prevoditeljica 11. poglavlja:

Belma Kalamuji, dipl. biolog, Institut za genetiko inenjerstvo i biotehnologiju, Univerzitet u Sarajevu, Bosna i Hercegovina
VI
Predgovor
Punih je sedam godina prolo od izdanja nae knjige Primjena analize DNA u sudskoj medicini i pravosuu, izdane od strane Nakladnoga zavoda Matice hrvatske. Iznenaujui interes za tu knjigu i stalni upiti irokog kruga strunjaka i znanstvenika na iji svakodnevni posao utjeu i spoznaje vezane uz ovu znanstvenu granu, doslovno su nas obvezali da pripremimo i objavimo nae novo izdanje. U ovako dinaminoj znanstvenoj disciplini kakva je danas forenzina genetika, zbivanja u tih sedam godina upozorila su nas da je pravo vrijeme za revidiranje, obnavljanje i osuvremenjivanje podataka i informacija koje smo ranije prezentirali. Osnovni ciljevi ove knjige ostali su isti. Prvi je cilj knjige upoznati kolege lijenike, pravnike, odvjetnike, suce, policajce, studente i sve zainteresirane, s najsuvremenijim dostignuima u podruju analize DNA u sudsko-medicinskim znanostima i pravosuu, te im istodobno omoguiti to potpuniji izvor informacija o ovoj temi. Drugi na cilj u osnovi mnogo tei i hrabriji! pokuaj je prijevoda znanosti na obian jezik. U trenutcima kad smo dvojili izmeu krajnjeg pojednostavljivanja eminentno znanstvenih tema, i cjelovita, poneto ipak kompleksnijega pristupa odabrali smo ovo drugo, jer nismo htjeli itatelju uskratiti informacije koje ne bi bez potekoa mogao pronai negdje drugdje. Postavljajui ovako zahtjevan cilj, najvanije je bilo okupiti eminentan meunarodni tim koji se sastoji od priznatih strunjaka raznih profila iz Hrvatske, Sjedinjenih Amerikih Drava te Bosne i Hercegovine, koji se bave ovom problematikom i koji o njoj imaju to rei, dakako, svaki sa svojega podruja djelovanja. Kroz knjigu detaljno opisujemo osnove biolokoga nasljeivanja, grau jezgrine i mitohondrijske DNA, obradbu tragova pronaenih na mjestu dogaaja, identifikaciju ljudskih ostataka, nove metode u analizi DNA, i to koritenjem ope prihvaenih molekularnih biljega, pravnu osnovu analize DNA u kaznenom postupku te primjenu analize DNA pri postupku utvrivanja ili osporavanja oinstva. Ova knjiga, uz proiren osnovni materijal iz izdanja koje joj je prethodilo, obogaena je i novim poglavljima gdje smo podrobno objasnili izuzetno aktualne teme poput bioterorizma, ulogu DNA-baze podataka, analizu DNA u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnog udorea, te analizu biljne i ivotinjske DNA. Upravo iz tih razloga neophodnim se nametnula potreba za proirenom ekipom recenzenata, eminentnih strunjaka iz irokog spektra znanstvenih podruja. O vanosti DNA-analize u sudskoj medicini i pravosuu ne treba mnogo govoriti. Danas ona odluuje o ljudskim sudbinama, zbog nje se davno zatvoreni sudski spisi ponovno otvaraju, osobe ve osuene na smrt oslobaaju, a i pri samoj pomisli da bi njihova DNA mogla biti analizirana poinitelji kaznenih djela ozbiljno strahuju. Ne emo pretjerati
VII
ako ustvrdimo da je DNA-analiza danas postala nezaobilazna procedura u gotovo svim procesima koji zahtijevaju obradu biolokih tragova. Posebice elim naglasiti golemu ulogu koju je DNA-analiza imala tijekom procesa identifikacija rtava Domovinskog rata u Hrvatskoj, a slino su iskustvo imali i nae kolege i suradnici u Bosni i Hercegovini i drugim dravama. Niz informacija obraenih u ovoj knjizi sinteza su spoznaja prikupljenih kroz etiri, sada ve tradicionalna, meunarodna znanstvena skupa koja su odrana od naega prvog izdanja, i to 2001. u Dubrovniku, 2003. u Zagrebu, 2005. u Dubrovniku i 2007. godine u Splitu. Kroz ove svjetski priznate manifestacije znanja, a organiziralo ih je Meunarodno udruenje primijenjenih biolokih znanosti (International Society of Applied Biological Sciences ISABS) prolo je na stotine vodeih svjetskih forenziara te drugih znanstvenika, ukljuujui i dobitnike Nobelove nagrade, koji su svojim predavanjima ili objavljenim radovima u asopisu Croatian Medical Journal, pruili priliku tisuama zainteresiranih da doznaju aktualnosti u podruju forenzine genetike, molekularne antropologije i medicinske genetike. Nadajui se da e ova knjiga ispuniti svoju svrhu, te pomoi svima koje zanima ova problematika, zahvaljujem svojim suradnicima, recenzentima i nakladniku jer su svi zasluni to se ona i pojavila. Unaprijed se radujem svakome odjeku ovoga, za nae prilike po mnogoemu pionirskoga posla, ponajvie pak onim buduim istraivanjima, a s njima i mojim starim i novim suradnicima. U Zagrebu, 25. travnja 2008. Dragan Primorac
VIII
Sadraj
1. Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Dragan Primorac, Damir Marjanovi 2. Analiza mitohondrijske DNA za potrebe sudsko-medicinskog vjetaenja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Ivan Gornik i Gordan Lauc 3. Mjesto dogaaja i analiza tragova naenih u kriminalistikoj obradbi . . . .73 imun Anelinovi, Marija Definis-Gojanovi, Davorka Sutlovi 4. Postupci i metode pri identifikaciji ljudskih ostataka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97 Marija Definis-Gojanovi 5. Primjena analize DNA u hrvatskome kaznenopravnom sustavu . . . . . . . . 110 Damir Primorac 6. Medicinska vjetaenja i primjena analize DNA u sudskom postupku radi utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 Tihana Pivac 7. DNA-analiza u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 Gordan Mri i Petra Uvodi 8. Bioterorizam i forenzina mikrobiologija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Alemka Markoti i James W. LeDuc 9. Forenzina analiza DNA ivotinjskoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Goran uri i Gordan Lauc 10. Forenzina botanika: biljke kao dokazi u kriminalistikim sluajevima . 199 Heather Miller Coyle, Timothy M. Palmbach 11. Meunarodna praksa glede DNA-baza podataka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 Chris Asplen Kazalo pojmova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
IX
1.
Sadraj poglavlja
1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 1.10. 1.11. 1.12.
Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

Dragan Primorac, Damir Marjanovi
1.13.
Uvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Kratak prikaz povijesti istraivanja DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Uvod u humanu genetiku . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Kromosomi i geni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 DNA (deoksiribonukleinska kiselina) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 Varijabilnost (raznolikost) DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 Struktura i nomenklatura STR-biljega . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 Analiza spolnih kromosoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Mitohondrijska DNA (mtDNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Primjena novih molekularnih biljega. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Potencijalni bioloki izvori DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Osnovni modeli i etape procesa forenzine DNA-analize. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.12.1. Prikupljanje i pohranjivanje uzoraka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.12.2. Metode izdvajanja DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.12.2.1. Izdvajanje DNA s pomou organskih otapala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.12.2.2. Izdvajanje DNA Chelex 100 metodom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.12.2.3. Izdvajanje DNA Qiagen metodom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.12.2.4. Ostale metode izdvajanja DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.12.3. Kvantificiranje DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.12.3.1. Spektrofotometrijsko odreivanje koliine DNA u uzorku. . . . . . . . 23 1.12.3.2. Metoda Yield gel ili produkt gel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.12.3.3. Hibridizacijska (slot-blot) metoda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.12.3.4. AluQuant Human DNA Quantitation System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.12.3.5. QRT-PCR-a kvantifikacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.12.4. Polimor fizam duljine restrikcijskog ulomka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.12.5. Lanana reakcija polimerazom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.12.6. AmpliType PM+DQA1 PCR Amplification and Typing Kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.12.7. AmpliFLP D1S80 PCR Amplification Kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1.12.8. Multipleksni STR-sustavi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.12.8.1. PowerPlex 16 System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 1.12.8.2. AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 1.12.9. Detekcija PCR-rezultata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Genetika i statistika pravila u forenzinoj genetici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 1.13.1. Mendelovo nasljeivanje. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 1.13.2. Pravila pri testiranju roditeljstva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 1.13.3. Hardy-Weinbergova ravnotea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 1.13.4. Uravnoteeno vezivanje. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 1.13.5. DNA-dokazni materijali u sudstvu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.14. 1.15. 1.16. 1.17.
Dokazivanje oinstva (roditeljstva) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Matematiki postupci i dokazivanje oinstva indeks oinstva ili kombinirani indeks oinstva. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.7.1. Vjerojatnost oinstva. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.7.2. Neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji (random man not excluded ili RMNE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.7.3. Bezmajinsko testiranje oinstva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.7.4. Utvrivanje majinstva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.7.5. Raunanje roditeljstva prema strukturi mijeanih populacija. . . . . 1.13.8. Identifikacija ljudskih ostataka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.8.1. Identifikacija rtve putem roditelja. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.8.2. Identifikacija rtve putem djece . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.9. Utvrivanje roditeljstva nasuprot forenzinoj identifikaciji. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.10. Forenzina identifikacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.13.10.1. Individualizacija i identifikacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Analiza mijeanih tragova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prezentacija rezultata dobivenih uporabom Y-STR sustava . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Forenzina analiza DNA biljnoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Forenzina analiza DNA ivotinjskoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.13.6. 1.13.7.
37 38 39 40 42 45 45 46 46 47 49 50 51 52 53 54 55
1.1.
Uvod
DNA (engl. Deoxyribonucleic Acid; hrv. deoksiribonukleinska kiselina) analiza danas nesumnjivo ima nezamjenjivu ulogu u forenzinim znanostima. Od 1985. godine, kada su Alec Jeffreys i suradnici pr vi put primijenili analizu DNA u rjeavanju forenzinih problema, do danas su irom svijeta upravo tom metodom rasvijetljeni brojni sudskomedicinski sluajevi [1,2]. Nedvojbeno je da je DNA-analiza postala novi oblik znanstvenog dokaza koji javnost i struka neprekidno procjenjuju. Sve vie sudova irom svijeta prihvaa rezultate koji se temelje na analizi DNA, a ve danas je ova tehnologija gotovo opeprihvaena u veini pravnih sustava. Nekoliko je glavnih primjena analize DNA u sudskoj medicini: istraivanje kriminalnih radnji, utvrivanje identiteta osoba i dokazivanje srodstva. Prema nekim spoznajama, samo se u Sjedinjenim Amerikim Dravama godinje uini vie od stotinu tisua DNA-analiza u svrhu razliitih vjetae-
nja. Podatak da se vie od 30% mukaraca koji su optueni kao mogui oevi iskljui upravo zahvaljujui DNA-tehnologiji najbolje govori o vanosti analize DNA. DNA innocence project, pokrenut u Sjedinjenim Amerikim Dravama radi oslobaanja pogrjeno optuenih osoba, upravo je zahvaljujui analizi DNA u proteklih desetak godina oslobodio stotinjak osoba, od kojih su neke bile osuene na smrtnu kaznu. Ta je metoda odigrala izuzetno bitnu ulogu i na naim prostorima u projektima identificiranja rtava rata, kako u Hr vatskoj, tako u njezinu najbliem susjedstvu. Primjenom ovog monog molekularnog orua vraena su imena tisuama posmrtnih ostataka, a njihovim obiteljima pruena je mogunost da barem dostojanstveno pokopaju svoje najblie. Premda je razvoj DNA-tipizacije u forenzinim znanostima bio iznimno brz, on jo uvijek nije zavren i danas smo svjedoci nove ere razvoja DNA-tehnologije koji ukljuuje automatizaciju i chip tehnologiju. U ovom poglavlju knjige bit e prikazana osnova grae
Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu
DNA, naela nasljeivanja genetike informacije, tehnoloka dostignua u analizi DNA, kao i uobiajene primjene matematikih postupaka u sudskomedicinskoj praksi.
1.2.
Kratak prikaz povijesti istraivanja DNA
Jo od vremena starih Grka postojala je potreba tumaenja nastanka bolesti koje su se kao po nekim jasnim obrascima ponavljale u pojedinim obiteljima. Naravno, osim iskustvenih spoznaja, koje su same po sebi vane, ali ipak nedostatne, principi tadanjeg razumijevanja genetike temeljili su se na opaanju. Tek pojavom austrijskoga sveenika Gregora Mendela, koji se esto naziva i ocem moderne genetike, postavljeni su temelji genetike kakvu poznajemo danas. Mendel je, radei s vrtnim grakom, postavio osnovne principe nasljeivanja, o kojima e biti vie rijei u daljnjem tekstu. Iako je pr ve rezultate objavio jo godine 1900., oni su bili potpuno zaboravljeni sve do 1890. go dine, kada su ih drugi znanstvenici ponovno potvrdili u trima razliitim laboratorijima. Sljedee vano otkrie uslijedilo je godine 1944., kada je Oswald Avery sa suradnicima pokazao da su geni graeni od osnovne nasljedne tvari DNA (engl. deoxyribonucleic acid; hrv. deoksiribonukleinska kiselina). Strukturu DNA prvi su prikazali nobelovci James Watson i Francis Crick, 1953. godine, i time postavili temelje razvoju moderne molekularne genetike [3]. Spoznaja o broju kromosoma u ovjeka uslijedila je godine 1956., kada je potvreno da je kompletan ljudski genetiki materijal smjeten u 23 para ili ukupno 46 kromosoma. Jo je 1980. godine David Botstein sa suradnicima pokazao da postoje male varijacije u nasljednom materijalu, koje se razlikuju od osobe do osobe, a Alec Jeffrey je 1985. pokazao da odreene re-
gije DNA sadravaju ponavljajue sekvencije koje se razlikuju od osobe do osobe. Upravo ta spoznaja bila je kljuna u rjeavanju pr voga forenzinog sluaja koritenjem analize DNA. Naime, nakon ubojstva dviju djevojaka, Lynde Mann i Dawn Ashworth, 1983. i 1986. godine policija je organizirala testiranje vie od 4 000 mukaraca i u konanici pronala ubojicu [4]. No, otkrie PCR (engl. polymerase chain reaction) postupka ili lanane reakcije polimerazom zasigurno je jo 1986. godine bitno odredilo budunost analize DNA i u klinikoj i u forenzinoj medicini. Naime, otkriem ove tehnologije postalo je mogue analizirati bioloke uzorke koji sadravaju minimalne koliine DNA. Svjedoci smo revolucionarnog otkria strukture ljudskoga genoma 2001. godine do kojega su dole dvije odvojene skupine istraivaa, pr va, Internacionalni konzorcij za sekvencioniranje humanoga genoma pod vodstvom Erica Landera, i druga pod vodstvom Craiga Ventera iz Celera Genomics. [5,6] Cilj obiju skupina bio je utvrditi potpuni slijed svih nukleotida ljudskoga genoma koji sadrava oko 3 109 parova baza. Pravo iznenaenje uslijedilo je kad se otkrilo da ljudski genom ima samo 20 000 do 25 000, a ne kako se prije predvialo 100 000 gena. No, prema svemu sudei, zbog alternativnog prekrajanja (alternative splicing) izvjesno je da pojedinani geni daju vie od jedne mRNA, to, prema nekim predvianjima, rezultira injenicom da navedeni broj gena kodira vie od 100 000 proteina. Ono to posebno iznenauje jest injenica da samo neto vie od 1% ukupne DNA sadrava sljedove koji kodiraju proteine [7]. U vremenu koje je pred nama, znanstvenike oekuje velik posao u otkrivanju funkcije brojnih gena i njihovih interakcija, kao i u razvoju mogue genske i stanine terapije. Sva nova otkria iz podruja molekularne genetike imat e vanu ulogu u razvoju novih tehnologija i metoda u forenzinoj DNA-analizi.
1.3.
Uvod u humanu genetiku
Sva iva bia, pa tako i ovjek, graena su od stanica, koje istodobno tvore najmanje strukturne i funkcijske jedinice naeg organizma. Bitna je razlika izmeu dviju postojeih skupina stanica: prokariotskih i eukariotskih. Prokariotske stanice nemaju jezgru, ni druge stanine organele, prosjene su veliine oko 1 m i sadravaju jednu krunu molekulu DNA. Prokariotske su stanice uglavnom bakterije i sadravaju tzv. ekstrakromosomalnu DNA (plazmidi), koja kod bakterija moe stvarati rezistenciju/otpornost na pojedine antibiotike. Eukariotske su stanice i do deset puta vee od prokariotskih stanica, imaju jezgru i niz staninih organela, a DNA im je najveim dijelom smjetena u vie linearnih tvorbi, tzv. kromosomima, lociranima u jezgri. Na osnovi takve stanine grae gljive, biljke, ivotinje i ljudi ubrajaju se u eukariotske organizme. Pretpostavlja se da je ljudski organizam graen od 200 razliitih vrsta stanica dok je ukupan broj stanica oko 100 trilijuna. Iako su ljudske stanice specijalizirane za razliite funkcije, po svojoj su strukturi uglavnom vrlo sline, i, u svojoj osnovi, graene su od jezgre, citoplazme i membrane. Osnovna genetika informacija smjetena je u jezgri, dok se u citoplazmi nalaze brojne stanine strukture koje odravaju stanicu na ivotu (sl. 1-1). Jedna od tih struktura, vana za proizvodnju stanine energije, jest mitohondrij. S forenzinoga stajalita mitohondriji su vani jer sadravaju mitohondrijsku DNA (mtDNA), koja se nasljeuje izravno putem majinske linije (o mtDNA bit e vie rijei u poglavlju posveenom toj temi). No, ukratko, mtDNA ne sadrava introne, ne podlijee klasinoj rekombinaciji, uestalost mutacija bitno je ea nego kod nuklearne DNA. Ljudska stanica sadrava oko 100 10 000 mitohondrija, pri emu svaka od njih posjeduje vie cirkularnih kopija mtDNA
koja pak sadrava 16 569 parova baza. Upravo ova injenica jedan je od osnovnih dokaza simbiogenetike teorije evolucije. Naime, mitohondriji i mtDNA imaju znatan broj znaajki koje se veu za prokariotske organizme i na taj nain upravo sugeriraju da je ova organela nastala od davno adsorbiranoga (endosimbiotskoga) prokariotskoga organizma, to je bio jedan od bitnih momenata za razvoj najprije jednostaninih, a zatim i viestaninih eukariotskih organizama. Iako veliina prosjene stanice odgovara otprilike 1/10 promjera dlake, pronalaenje biolokih tragova koji sadravaju dostatan broj stanica nedvojbeno moe biti presudno u rjeavanju sudskomedicinskog sluaja.
1.4.
Kromosomi i geni
S obzirom na injenicu da svaka osoba naslijedi polovinu genetikoga materijala od oca, a polovinu od majke (svakako ne raunajui njezinu mitohondrijsku DNA koja se nasljeuje iskljuivo majinskom linijom), DNA-testiranjem moe se utvrditi genetika povezanost izmeu ispitanih osoba. Sljedea vana osobina DNA jest da je izuzetno stabilna molekula i da se tijekom vremena, ako je pravilno pohranjena, u in vitro uvjetima redoslijed njezinih sastavnih jedinica ne mijenja, pa se pravilno pohranjen uzorak moe iskoristiti za usporedbu njegova DNA-profila s profilom nekoga drugog uzorka uzetog i nakon nekoliko godina. Zbog svega navedenog jasna je golema uloga analize DNA u sudskoj medicini, te e se stoga u daljnjem tekstu vie pozornosti posvetiti toj tzv. molekuli ivota i svemu onomu to je ini tako jedinstvenom. Kao to je ve reeno, jezgrina DNA genetiki je materijal koji nosi nasljednu poruku, zapisanu u genima. Drugim rijeima, geni su aktivni segmenti koji se nalaze na tono odreenim mjestima (lokusima) lanaca DNA uzvojni-
mitohondrij
mitohondrijska DNA
jezgra citoplazma kromosom
stanica DNA molekula DNA
parovi baza
Slika 1-1. Vrlo pojednostavnjen prikaz strukture eukariotske stanice koja sadrava jezgru i citoplazmu. U jezgri se nalazi osnovni nasljedni materijal, tzv. jezgrina ili nuklearna DNA. Isto tako u jezgri su prikazani kromosomi i osnovni genetiki materijal, dvostruka uzvojnica DNA. S druge strane u citoplazmi su smjetene brojne stanine organele vane za preivljavanje stanice. Meu tim su organelama i mitohondriji, koji sudjeluju u proizvodnji stanine energije. S forenzinoga stajalita mitohondriji su vani jer sadravaju mitohondrijsku DNA (mtDNA) koja se, prema dosadanjim spoznajama, nasljeuje iskljuivo preko majke, nalazi se u velikome broju kopija te se esto rabi pri identifikacijama osoba u sluajevima kada jezgrina DNA nije dostatna. Slikovito su prikazani mitohondrij i cirkularna molekula mtDNA.
ce. Zahvaljujui normalnom funkcioniranju gena, svaka jedinka ima odreene parametre rasta i razvoja organizma (npr. genetiki je odreeno da osoba ima 2 ruke i 2 noge), ali i neke druge parametre, kao npr. boju oiju, visinu itd. Na temelju navedenog oito je da je DNA sredinja molekula ivota koja, kao
primarni (osnovni) nosilac nasljedne informacije, kontrolira rast i razvoj svakoga ivog bia. Ukupna jezgrina DNA duga je vie od 1 m i smjetena je u strukturama koje se nazivaju kromosomima. Svaki kromosom prije replikacije sadrava po jednu molekulu DNA. Rije kromosom izvedenica je od dviju grkih rijei
chromos, to znai boja, i soma to znai tijelo. Od ukupno 46 kromosoma koji se nalaze u tjelesnim stanicama svakoga pojedinca, 23 je naslijeeno od majke, a 23 od oca. Tonije, pri stvaranju nove jedinke, 23 kromosoma dolaze iz jajne stanice, a 23 iz spermija. Kromosomi se u jezgri nalaze u parovima, te se u ovjeka nalazi ukupno 23 para kromosoma. Jedan od tih parova ine tzv. spolni kromosomi (X, Y) koji su vani u odreivanju spola svake jedinke i meusobno se razlikuju. Preostala 22 para nazivaju se autosomima a homologni su u oba spola. Iskljuujui mogue kromosomske anomalije, openito vrijedi pravilo da dva X-kromosoma (XX) odreuju enski, a kombinacija X i Y-kromosoma (XY) muki spol. Ovdje je vano napomenuti da sve tjelesne stanice (npr. kotane stanice, stanice koe, bijele kr vne stanice itd.) sadravaju po 46 kromosoma (23 para), dok spolne stanice (spermiji i jajace) sadravaju upola manje, tonije, 23 kromosoma. Velik broj znanstvenih istraivanja pokazao je da postoje i odreeni geni locirani u mitohondrijskoj DNA, te je ispitivanje njihove funkcije u posljednje vrijeme postalo veoma intenzivno
[8]. Fiziki poloaj gena na kromosomu naziva se lokus. Dva autosoma koji ine par odgovaraju jedan drugomu i po strukturi i po funkciji. Zato se takva dva kromosoma, koja su slina po grai i nose identine gene, nazivaju homolognim kromosomima. Nadalje, varijante gena koji na homolognim kromosomima zauzimaju isti poloaj ili lokus i koji na razliite naine odreuju isto genetiko svojstvo nazivaju se aleli. Aleli su, u biti, modaliteti istoga gena ili genetikog lokusa s razlikom u sekvenciji ili duini. Sljedei pojmovi koji se vrlo esto rabe u genetici, pa tako i u sudskoj medicini, jesu homozigot i heterozigot. Homozigot oznauje genotip (genski prikaz) koji ima identine alele, odnosno iste genske varijante na odreenom lokusu na paru homolognih kromosoma. Nasuprot tomu, heterozigot oznauje osobu ili genotip koji ima 2 razliita alela na odreenom lokusu na paru homolognih kromosoma (sl. 1-2.). Tipino, jedan alel ima DNA normalne grae, dok drugi ima odreenu mutaciju po kojoj se razlikuje od pr voga. No taj se izraz rabi i u sluajevima postojanja dvaju razliitih, ali funkcionalno normalnih alela.
A) C C
B) C C1
Slika 1-2. Pojednostavnjen prikaz para homolognih kromosoma, gdje se mogu uoiti 2 genotipa: A) homozigot (na paru homolognih kromosoma nalaze se dva identina alela prikazana crvenom bojom kao CC), i B) heterozigot (na paru homolognih kromosoma nalaze se dva razliita alela, i to alel C, prikazan crvenom bojom, i alel C1 prikazan plavom bojom.
1.5.
DNA (deoksiribonukleinska kiselina)
Molekula DNA graena je u obliku dvostruke uzvojnice i smjetena je u svih 46 kromosoma. DNA ine jedinice zvane nukleotidi i humani genom sadrava oko 3 109 takvih jedinica. Sam nukleotid sastavljen je od triju podjedinica: pet-ugljinog eera, fosfatne skupine i nukleotidnih baza koje sadravaju duik, a zovu se: adenin (A,) gvanin (G), citozin (C) i timin (T). Dobro je upamtiti da se u dvostrukom lancu adenin uvijek spaja s timinom (A-T), a citozin s gvaninom (C-G). U normalnim uvjetima nije mogue sparivanje baza po nekoj drugoj shemi. Upravo te vodikove veze izmeu adenina i timina (povezani dvostrukom vodikovom vezom) te gvanina i citozina (povezani trostrukom vodikovom vezom) odravaju dvostruke lance nukleotida u DNA zajedno (sl. 1-3.) i daju izuzetnu stabilnost ovoj molekuli. Svaki pojedinani kontakt izmeu navedenih jedinica naziva se par baza (pb), a cijeli ljudski genom ima oko 3 milijarde parova baza.. Izmjene navedenih baza ili razlika u broju ponavljanja parova baza koje imaju odreen redoslijed ine osnovu utvrivanja identiteta osobe. Poznato je da veina DNA sljedova ne sadrava gene, nego slui kao pomoni genetiki materijal. Takvi su sljedovi najee visokopolimorfni i odreeni su razliitim brojem ponavljajuih DNA-sekvencija. U takve ponavljajue sljedove svrstavaju se i promjenjivi
broj ponavljajueg niza ili VNTR (engl. variable number tandem repeats) [9-12]. Lokusi se meusobno mogu razlikovati po jednom ili vie takvih ponavljanja (VNTR). Jedna od metoda za analizu VNTR-a jest polimorfizam duljine umnoenih ulomaka ili AFLP (engl. amplified fragment length polymorphism) [13, 14], ali se mogu koristiti i druge metode koje e biti kasnije objanjene. Primjerice, kad odgovarajui slijed dug tri baze kodira neku aminokiselinu u proteinu, naziva se kodon. Kad je broj i redoslijed tih sljedova naruen, moe doi do poremeaja strukture, to je jedan od preduvjeta za razvoj genetike bolesti. Primjer dviju bolesti koje ukljuuju trinukleotidna ponavljanja jesu mentalna retardacija vezana uz kromosom X (fragilni X) i Huntingtonova bolest. Veina se VNTR-lokusa nalazi u dijelovima DNA koji ne kodiraju proteine ili u intronima nekodirajuim dijelovima gena. S obzirom na visoki stupanj molekularne raznolikosti VNTR-a lokusi su se dugo rabili u forenzinim analizama uzoraka, tijekom kojih se ispituje jedan ili vie takvih lokusa. Za veinu forenzinih DNA-testiranja rabili su se lokusi koji se nalaze na 44 autosoma. Ipak, relativno duga i skupa procedura, kao i sloenost prezentiranja krajnjih rezultata, uvjetovale su potiskivanje uporabe ovih biljega u podruju forenzine DNA-analize. Otkrie i primjena novih, molekularno manjih biljega, znatno su ubrzali taj proces. Rije je o tzv. kratkim tandemski ponavljajuim sekvencijama (short tandem repeats STR)
TACGTAAAT T
ATGCAT T TAA
Slika 1-3. Pojednostavnjen prikaz dvolanane molekule DNA i redoslijed sparivanja parova baza na odmotanom DNA-segmentu. Valja uoiti da se A uvijek vee za T, a G za C.
i o njima e biti neto vie rijei u iduim dijelovima ovoga poglavlja.
1.6.
Varijabilnost (raznolikost) DNA
Analiza DNA u sudskoj medicini temelji se na spoznaji da je samo 0,5% DNA razliito u svake osobe. No upravo taj mali dio DNA sadrava velik broj tzv. polimorfizama (gr. poly mnogo; morfoma oblik), odnosno razlika u DNA sekvenci meu pojedincima, pa zato moemo s gotovo potpunom sigurnou tvrditi da svatko od nas ima jedinstvenu genetiku grau, naravno, osim jednojajanih blizanaca. Upravo se na injenici da smo svi dovoljno genetiki razliiti zasniva analiza tragova pronaenih na mjestu dogaaja, identifikacija rtava, utvrivanje poinitelja silovanja ili rutinirano utvrivanje srodstva. Kod veine lokusa koji kodiraju proteine postoji samo jedan oblik gena. To je zbog toga to veina gena nije tolerantna spram mutacija. Oni geni koji toleriraju mutacije imaju vie od jednog oblika, tj. imaju svoje alele. Lokusi koji sadravaju alele koji se pojavljuju s relativno visokom uestalou nazivaju se polimorfnim lokusima. Genetika varijabilnost kod krvnih grupa, serumskih proteina i transplantacijskih antigena na razini proteina odraz je upravo tog polimorfizma, to jest varijabilnosti na razini DNA. Napredak u DNA-tehnologiji omoguio je
otkrivanje tih varijabilnosti (polimorfizama) kod specifinih DNA sljedova. Na slici 1-4., koja prikazuje primjere genskog polimorfizma, tonije, sekvencijski polimorfizam, prikazano je postojanje dvaju alela za jedan gen (izmjena jednog para baza je uokvirena). Drugi oblici polimorfizama jesu promjene u duljini DNA izmeu dvaju homolognih segmenata DNA (sl. 1-5. i 1-6.). Tijekom laboratorijskog rada potrebno je promjene unutar odreenih segmenata DNA prikazati jasnom i razumljivom metodom koja e pregledno pokazati razliku u duljini DNA izmeu dvaju mikrosatelitnih alela. Na slici 1-6. pojednostavnjeno je prikazana razlika u duljini DNA izdvojenoj iz dvaju promatranih uzoraka.
1.7.
Struktura i nomenklatura STR-biljega
Razvojem projekta ljudskoga genoma koji je oznaio poetak iscrpnog prouavanja i kartiranja humanih gena, nametnula se potreba za razvojem uputa o identifikaciji i oznaivanju novih gena te ukljuivanju starih, postojeih sustava. Zaetak svega jest ono to je danas poznato kao Meunarodni sustav za nomenklaturu gena (International System of Gene Nomenclature ili ISGN), (1987.) [15]. U meuvremenu su uslijedile i posebne preporuke DNA-komisije meunarodnoga drutva za
A TGCA T T T AA T ACGT AAA T T
A TGCAC T T AA T A CG T GAA T T
Slika 1-4. Primjer sekvencijskog polimorfizma (postoji promjena samo u jednom paru baza DNA), gdje je par baza T-A (lijevo u utom kvadratiu) zamijenjen novim baznim parom C-G (desno, u utom kvadratiu). Navedena mutacija ne mora imati nikakva utjecaja u smislu nastanka bolesti, no moe biti vrlo vana u forenzinoj analizi pri utvrivanju identiteta osobe.
M
1 2 3 4 5
AGA T TCTA
1
AGA T TCTA
2
AGA T TCTA
3
AGA T TCTA N
4
AGA T TCTA
5 6 7
AGA T TCTA
AGA T TCTA
AGA T TCTA
AGA T TCTA
AGA T TCTA
AGA T TCTA
AGA T TCTA
Slika 1-5. Primjer polimorfizma u duljini DNA (mikrosatelitna ponavljanja). DNA sekvencija M (crveno) sadrava 5 ponavljanja sekvencija AGAT, dok DNA sekvencija N (plavo) sadrava 7 AGAT ponavljanja. Zbog preglednosti i boljeg razumijevanja polimorfizma u duljini svaki analizirani DNA-ulomak (alel) prikazan je razliitom bojom. Ovdje prikazani DNA-ulomci (aleli) mogu se pratiti i na sljedeoj slici.
A)
AL
B)
Slika 1-6. Pojednostavnjeni prikaz razlike u duljini ulomaka DNA. A) Slika nakon gel elektroforeze, gdje se uoava razliita duljina ulomaka DNA M i N u odnosu na alelne ljestve (AL), (DNA za koju su nam poznate duljine pojedinanih ulomaka DNA i na osnovi kojih odreujemo duljine drugih ulomaka DNA koje treba analizirati). B) Histogram analize DNA nakon raunalne obradbe podataka, gdje se uouje prisutnost alela M (crveno) i N (plavo), iako se meusobno razlikuju u samo jednom ponavljajuem nizu sekvencija AGAT. Brojevi 5 i 7 oznauju broj ponavljajuih sekvencija. Radi preglednosti i boljeg razumijevanja polimorfizma u duljini analizirani ulomci DNA prikazani su razliitim bojama.
forenzinu humanu genetiku (DNA Commission of the International Society for Forensic Human Genetics) u vezi s uporabom, pr voprimjenjivanih polimorfizama duljine restrikcijskog ulomka (RFLP) i metodom lanane reakcije polimerazom (PCR) [16,17]. Tendencija masovne primjene STR-biljega uvjetovala je i njihovo jasno definiranje kao molekularnih polimorfizama koji se iroko primjenjuju u forenzinoj genetici. STR-
-biljezi sastoje se od sekvencija duljine 27 (a prema pojedinim izvorima od 1 do 10) baznih parova koje se na definiranom lokusu ponavljaju odreen broj puta (sl. 1-7). Broj ponavljanja razlikuje se od osobe do osobe. Ipak, nije neuobiajeno da dvije osobe imaju iste alelne varijante na promatranom STR-lokusu, pa ak i da se poklapaju i na dvama ili trima STR-lokusima, ali najmanja teorijska vjerojatnost da postoje dvije osobe s identinim alel-
A)
a)
9 mikrosatelitnih ponavljanja 9 mikrosatelitnih ponavljanja ATCC
b)
6 mikrosatelitnih ponavljanja
9 mikrosatelitnih ponavljanja ATCC B) a)

TH01
b)
TH01
6 9
Slika 1-7. A) Shematski prikaz tetranukleotidnoga STR-lokusa TH01. a) Ako je broj ponavljajuih nizova isti u objema alelnim varijantama, onda se radi o homozigotu koji se raunalno detektira samo s jednim zupcem; b) ako je broj ponavljajuih nizova razliit u objema varijantama, onda se radi o heterozigotu koji se raunalno detektira s dvama zupcima. B) Prikaz raunalno obraenih rezultata analize DNA a) homozigota b) heterozigota.
nim varijantama npr. na 15 STR-lokusa zastupljenih u PowerPlex 16 sustavu za kavkazoidno stanovnitvo iznosi 1/1,83 1017 [18]. No, prava vrijednost ovih biljega jest jednostavnost i brzina samoga procesa, kao i mogunost istodobnoga promatranja veega broja STR-biljega u takozvanim multipleksnim STR-sustavima, to je omoguilo izuzetno visok stupanj individualizacije pri identificiranju tragova. U posljedenje vrijeme ove sekvencije, osim svoje iroke primjene u forenzinoj DNA-analizi, postale su veoma privlane kao predmet genetikih istraivanja s medicinskoga aspekta, jer se pokazalo da su odreeni trinukleotidni STR-lokusi, u sluajevima njihove hiperekspanzije, povezani s izvjesnim genopatijama. Najbolje ispitivani i najee ukljuivani u analize individualne i populacijske razno-
likosti jesu tetranukleotidni STR-lokusi, tj. oni STR-biljezi u ijim se ponavljajuim sekvencijama nalaze etiri baze. No, svoju praktinu primjenu pronali su i pojedini trinukleotidni i pentanukleotidni sustavi. esto komercijalni multipleksni sustavi pruaju mogunost analize tetra i penta lokusa. Tako se dobivaju rezultati s visokom razinom indeksa iskljuivanja. Poeljne osobine jednog STR lokusa jesu: 1. izraena uestalost heterozigotnosti, 2. jasno definirani ponavljajui nizovi, 3. jasno odreene alelne varijante, 4. jednostavno i pouzdano umnaanje. Postoji vie tipova STR-lokusa [19]: 1. strukturno jednostavni (simple consisting) jedan tip ponavljajuega niza [D5S818, D13SS317, D16S539, TPOX (sl. 1-8.A), CSF1PO ],
10
A)
GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT
B)
9.3
TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCA
C)
10
11
12
13
14
15 15.2
TCTA TCTG TCTG TCTG TCTG TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TC
Slika 1-8. Shematski prikaz najeih tipova STR-lokusa koji se pojavljuju u standardnom CODIS-setu lokusa: A) strukturno jednostavni alelna varijanta 9 na TPOX lokusu; B) strukturno jednostavni uz prisutnost nekonzistentnih alelnih varijanti alelna varijanta 9.3 na TH01 lokusu; C) strukturno sloeni uz prisutnost nekonzistentnih alelnih varijanti alelna varijanta 15.2 na vWA lokusu. Sekvencije ponavljajuih motiva bazirane na osnovi podataka preuzetih s www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/images.
2. strukturno jednostavni uz prisutnost nekonzistentnih alelnih varijanti (simple with nonconsensus allels) jedan tip ponavljajuega niza [TH01 (sl. 1-8.B), D18S51, D7S820 ], 3. strukturno sloeni (compound consisting) s dva ili vie tipova ponavljajuega niza (GABRB15), 4. strukturno sloeni uz prisutnost nekonzistentnih alelnih varijanti (compound with nonconsensus allels) dva ili vie tipova ponavljajuega niza [D3S1358, D8S1179, FGA, vWA (sl. 1-8.C) ], 5. kompleksni (complex repeats) vie ponavljajuih nizova s prisutnim insercijskim DNA sekvencijama (D21S11), 6. hipervarijabilni (hypervariable repeats; SE33).
1 2 3 4 5
Na slici 1-8. prikazani su najei tipovi STR-lokusa koji su ukljueni u tzv. standardni CODIS (engl. Combined DNA Indexing System), set lokusa o kojemu e biti vie rijei u iduim odlomcima ovoga poglavlja. U listopadu 1993. godine DNA-komisija ISHF-a (International Society of Forensic Haemogenetics) preporuila je nomenklaturu STR-lokusa i alelnih varijanti koja je i danas u uporabi. U nazivu STR-lokusa sadran je broj kromosoma na kojemu je pronaen, tako npr. za nekodirajue dijelove DNA, npr. D21S11 znai da je rije o DNA-sekvenciji (D) smjetenoj na 21. kromosomu [21] koja je single copy ili slijed prisutan u samo jednoj kopiji, na samo jednom mjestu u genomu (S), i to je 11. otkriveni i kategorizirani biljeg na 21. kromosomu [11]. Umjesto slova
6 7 8 9 9.3
TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCA_
Slika 1-9. Shematski prikaz alelne varijante 9.3 na TH01 lokusu. Broj potpunih ponavljajuih nizova (TCAT) iznosi 9, dok je zadnji ponavljajui niz nekompletan (TCA_) i ukupni broj baza u njemu iznosi 3. Stoga se ova alelna varijanta oznauje s 9.3. Inae, ta alelna varijanta izuzetno je uestala u europskoj populaciji.
11
S, kada se slijed pojavljuje na samo jednom mjestu, slovo Z je oznaka ako se sljedovi pojavljuju na vie mjesta. Nomenklatura alelnih varijanti bazira se na broju ponavljajuih nizova sadranih u njoj. Ako alelna varijanta sadrava devet ponavljajuih nizova, onda se ona oznauje brojem 9. Ako alelna varijanta nema uobiajeni ponavljajui motiv, tj. ako je u njoj sadran matematiki cijeli broj, npr. 9 ponavljajuih nizova te jo jedan dio tog niza u obliku npr. 3 baze, onda se alelna varijanta brojano oznauje n.m, tj. 9.3, gdje je n [9] broj potpunih ponavljajuih nizova, a m [3] broj baza nekompletnoga ponavljajueg niza koji alelna varijanta sadrava (sl. 1-9). S obzirom na to da postoji odreeni broj STR-biljega koji su otkriveni i imenovani prije ovoga pravila, a da veina od njih ulaze u sustav pojedinih genskih kompleksa, postoji i princip uporabe naziva gena ili genskoga lokusa u oznaivanju samog biljega. Primjera radi jedan od izuzetno informativnih STR-biljega
A) Y-kromosom 112 bp
TH01 ime je dobio po genu u iji sustav ulazi: tyrosine-hidroxilaze gen, koji je pozicioniran na 11. kromosomu, to se iz njegova naziva ne vidi. Oznaka 01 nastala je zbog injenice da je ta regija pozicionirana u sklopu introna 1 ovoga gena. esto se u literaturi rabi njegovo nadopunjeni naziv s prefiksom HUM (dakle puni naziv HUMTH01) koji dodatno pojanjava da je rije o dijelu gena za humanu tirozin-hidroksilazu. Osim ovoga, postoji jo niz STR-biljega ije je imenovanje slijedilo logiki sustav ovoga tipa nomenklature.
1.8.
Analiza spolnih kromosoma
Analiza spolnih kromosoma vana je u sluaju potrebe odreivanja spola i ve u startu iskljuuje 50% populacije. Kod svih organizama s kromosomskim odreivanjem spola
Y
X X 106 bp X 106 bp X `enski spol Y mu{ki spol
B) X-kromosom
Slika 1-10. Razlika u grai amelogenina (AMEL-a) u mukarca i ene. Pri umnaanju AMEL-a u mukaraca dobiva se ulomak duljine 112 pb, dok se u ene dobije DNA ulomak duljine 106 pb. U sluaju A) odreen je muki spol s obzirom na postojanje X i Y kromosoma. Naime, u mukaraca pri umnaanju AMEL-a primjenom PCR-metode (lanana reakcija polimerazom) pojave se dva DNA-ulomka veliina 112 pb (zeleno) i 106 pb (plavo). Isto se vidi i nakon raunalne analize umnoenih DNA-ulomaka pojavljivanjem dvaju zubaca razliitih veliina. U sluaju B) postojanjem 2 X-kromosoma odreen je enski spol. U tom sluaju nakon PCR-umnaanja pojave se dva ulomka identine duljine (106 pb), to nakon raunalne obradbe umnoenih DNA-ulomaka rezultira pojavljivanjem jednog zupca. Radi preglednosti, na slici je zelenom bojom prikazan DNA-ulomak duljine 112 pb karakteristian za mukarce, a plavom bojom DNA-ulomak duljine 106 pb karakteristian za ene.
12
po modelu XY, opepoznato je da se pojam spolni kromosom odnosi na kromosomske entitete genoma neke individue i vrste, koji su odgovorni za kromosomsko odreivanje spola. Gen koji se najee analizira pri utvrivanju spola naziva se amelogenin (AMEL), a nakon umnaanja ciljanih dijelova navedenoga gena PCR-metodom mogue je pojavljivanje DNA-ulomaka razliitih duljina. Varijanta gena na X-kromosomu kraa je za 6 bp u odnosu na varijantu na Y-kromosomu (muki spol). Na slici 1-10. detaljno su prikazani principi utvrivanja spola ovom metodom. Suglasno kriterijima Denverske konvencije, humani Y-kromosom pripada skupini G, odnosno kategoriji najkraih kromosoma u humanoj garnituri, skupini u kojoj su jo i kromosomi 21. i 22. Sadrava oko 50 milijuna baznih parova, to ini oko 1,8% ukupnog humanoga genoma. Kromosom Y moe pruiti vane informacije ako je u pitanju odreivanje nasljednih linija nekog specifinog mukarca. To je mogue jer kromosom Y sadrava visoko polimorfne regije [20]. Ljudski kromosom Y prisutan je u normalnih mukaraca u jednoj kopiji, nasljeuje se po ocu, te 95% njegova kompleksa ne podlijee rekombinaciji. Samo 5% toga kromosoma potencijalno se moe rekombinirati s drugim spolnim X-kromosomom i ta se regija naziva pseudoautosomnom regijom X- i Y-kromosoma. U forenzinim analizama kromosom Y ima vanu ulogu u sluajevima silovanja, posebice u onima koja ukljuuju vie od jednog mukarca [21]. Ovi biljezi takoer mogu biti korisni u sluajevima dokazivanja roditeljstva, kada su djeca mukoga spola, te u procesu identifikacije, kad su prisutni srodnici samo s oeve strane. Osim toga, Y-kromosom sve se vie rabi u utvrivanju migracije pojedinih naroda tijekom prolosti, jer Y-kromosom ne podlijee rekombinaciji tijekom generacijskoga prenoenja genetikog materijala [22].
U posljednjih nekoliko godina zabiljeen je znatan priljev populacijskih podataka vezanih za nerekombinirajuu regiju Y-kromosoma [23], kako u svijetu, tako i u Europi. Osim toga to su neka od tih istraivanja ponudila izuzetno zanimljive modele i scenarije ljudske povijesti na naim prostorima [24,25], ona su promovirala i uporabnu vrijednost tzv. SNP-biljega (single nucleotide polymorphism), koji se zasnivaju na zamjeni, dodavanju ili isputanju samo jednoga baznog para. O tim biljezima bit e neto vie rijei u iduim dijelovima ovoga poglavlja. Nadalje, analiza Y-STR-a (kratkih ponavljajuih sljedova genomske DNA) ima vanu ulogu u dodue rijetkim, ali vanim sluajevima kada postoji pomanjkanje amelogenin gena u mukarca [26]. Sa stajalita sudske prakse bitno je naglasiti da utvrivanje i eventualno poklapanje Y-STR DNA profila dvaju tragova, bez obzira na to o koliko se analiziranih molekularnih biljega radilo, ne znai potpunu individualizaciju. Naime, Y-kromosom se nasljeuje po mukoj liniji, tj. s oca na sina, tako da identian profil imaju sve muke osobe povezane s oinskom rodbinskom linijom. Uvjet relativno maloga stupnja molekularne raznolikosti izmeu biljega lociranih na tome kromosomu potjee od odsutnosti rekombinacije gena na 95% njegove duljine te od mehanizma sluajnih mutacija kao jedinoga mogueg puta nastanka polimorfizama. Stoga najei stav pri interpretaciji rezultata na sudu, a u sluaju poklapanja Y-STR profila uzoraka, jest da se navedena osoba ne moe iskljuiti kao potencijalni bioloki izvor analiziranoga traga. Uz to se najee prilae relativna frekvencija pojavljivanja utvrenoga Y-STR profila, tj. haplotipa u konkretnoj, regionalnoj ili svjetskoj populaciji. Neki pak autori sugeriraju statistike metode koje su izuzetno sline onima koje se primjenjuju u prikazivanju rezultata analize mitohondrijske DNA.
13
Jedan od pokazatelja koliko je ozbiljno i bitno analiziranje Y-kromosoma u forenzinoj DNA-analizi jest i relativno velik broj komercijalnih multipleksnih sustava koji omoguuju istodobnu analizu vie od 10 STR-lokusa, kao to su: Y-PLEXTM (ReliaGene), PowerPlexY (Promega Corporation), AmpFLSTRYfiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) i drugi. Primjena humanog kromosoma X, i u populacijskoj i u forenzinoj genetici, dobila je na znaenju u proteklih nekoliko godina [27]. Za razliku od Y-kromosoma, ovakav pristup moe biti uinkovit u sluajevima ispitivanja oinstva enskih potomaka u uvjetima kada potencijalni otac nije prisutan te se testiranje realizira ispitivanjem njegove rodbine. Osim toga, odreeni se rezultati mogu ostvariti i u analizi majinstva, i to najuinkovitije u analizi veze majkasin, to uistinu jest rjee, ali se ipak i danas provodi u razliite svrhe. Uporaba ovoga biljega jo uvijek je relativno ograniena i poglavito se zasniva na kombiniranoj uporabi X-vezanih biljega s uobiajenim autosomnim lokusima [28]. Jedan od razloga ove ogranienosti bio je nedostatan broj ispitanih molekularnih biljega na ovom spolnom kromosomu, kao i nedoreenosti u populacijskim podatcima i izraunavanju forenzino-statistikih pokazatelja. Ipak, sve vei broj autora posvetio se ovomu problemu tako da je logino predvidjeti da e u vrlo kratkome razdoblju primjena toga intrigantnoga kromosoma postati znatno intenzivnija.
1.9.
Mitohondrijska DNA (mtDNA)
Mitohondrijska DNA (mtDNA) ili, kako je neki nazivaju, citoplazmatski kromosom, takoer je oblik DNA koji se analizira i rabi u forenzici i ini priblino 1% ukupne stanine DNA. O mtDNA bit e vie rijei
u sljedeem poglavlju, no ovdje emo kratko upozoriti na neke njezine najvanije karakteristike. MtDNA molekula duga je 16 569 pb, krunog je oblika i ne sadrava intronske sljedove. Dvije su nekodirajue visokopromjenjive regije posebno znaajne za forenzine analize: HV1 i HV2. Za razliku od jezgrine DNA, mitohondriji i njihova DNA potjeu od citoplazme jajne stanice koja je pridonijela nastanku zigote te stoga potjeu od majine strane. Prema tome, mtDNA nasljeuje se po majci i oznauje enske pretke nekog pojedinca. Suprotno od jezgrine DNA, mtDNA moe biti prisutna i u nekoliko tisua kopija. Budui da se molekule mtDNA repliciraju neovisno jedna o drugoj, za razliku od jezgrinih kromosoma kod kojih pr vo doe do replikacije DNA, a sparivanje homolognih kromosoma i rekombinacija gena nastaje u mejozi I, ne postoji mehanizam rekombinacije mtDNA. Mutacije koje mogu dovesti do promjene slijeda parova baza jedini su izvor varijabilnosti mtDNA. Budui da se mtDNA nasljeuje po majci, osoba ne moe biti heterozigot, a upravo je to korisno u odreivanju majinskih nasljednih linija unutar obitelji i populacija. MtDNA se ponajprije rabi u forenzinim sluajevima kad je potrebno analizirati dokazni materijal koji ne sadrava dostatnu jezgrinu DNA [29]. MtDNA takoer nalazimo u tkivima koja ne sadravaju jezgre, kao to je to sluaj s vlasi kose. No, jedan od velikih problema u radu s mtDNA iz kose jest prisutnost dviju ili vie subpopulacija mtDNA u jedne osobe (heteroplazma). Heteroplazma je najvjerojatnije rezultat uestalijih pogrjeaka, tj. mutacija tijekom replikacije mtDNA nego to se dogaa kod jezgrine DNA. Razlog je moda taj to se molekule mtDNA repliciraju neovisno jedna o drugoj i to nisu strogo vezane uz mejotiku ili mitotiku diobu stanice. Budui da svaka stanica sadrava populaciju mtDNA-molekula, poje-
14
dine stanice mogu sadravati neke molekule koje imaju odreenu mtDNA-mutaciju koju druge nemaju. Mogue je da je ovaj fenomen odgovoran za razliitu izraenost bolesti koje se nasljeuju preko mitohondrija. Meutim, mogue je i da se broj mutiranih mtDNA-molekula mijenja tijekom replikacijske segregacije, dok se stanice dijele i broj mitohondrija raste. Heteroplazma je vana za forenzine namjene jer moe pomoi pri forenzinom ispitivanju identiteta, ali isto tako moe analizu uiniti veoma sloenom. Ipak je nezaobilazna injenica da je heteroplazma novi stupanj varijabilnosti, koji u veini sluajeva moe poveati tonost mtDNA-testiranja. Dodatni podatci o ovoj problematici mogu se nai u odlinom lanku koji su napisali Holland i Parson [30]. MtDNA ima vanu ulogu u identifikaciji ljudskih ostataka, posebice skeletnih, kao i u sluajevima raspadnutih tijela. Jedan od najglasovitijih sluajeva rijeenih s pomou ove tehnologije identifikacije jest onaj cara Nikole II., kada je potvreno da je on nosio istu heteroplazmu kao i ostatci njegova brata Georgija Romanova, velikog vojvode Rusije [31]. Analiza mtDNA (sl. 1-11) danas se radi uobiajenom metodom sekvencioniranja,
gdje se usporeuju rezultati dobiveni nakon analize mtDNA odreenog uzorka s tzv. revidiranom Andersonovom sekvencijom [32]. Odnedavna je na raspolaganju i metoda SSOPA (engl. sequence specific oligonucleotides probe analysis), pri kojoj se umnoena mtDNA hibridizira s postojeim sondama nanesenima prije na najlonsku ili neku drugu membranu. Ovim nainom postupci analize velikoga broja uzoraka znatno se ubrzavaju [33]. Jedna od takvih analiza prikazana je i na slici 1-12. S obzirom na postojanje velikoga broja kopija mtDNA u stanici, pri neopreznom radu lako je mogue kontaminirati uzorak stranom mtDNA.
1.10.
Primjena novih molekularnih biljega
Forenzina genetika izuzetno je dinamina znanstvena disciplina i jedna od njezinih osnovnih odlika svakako jest gotovo svakodnevni napredak u smislu otkria novih procedura, molekularnih biljega ili usa-
T A A T C A T GG T C A T AG C T G T T T C C T G T G T GA A A T T G T T A T 100 110 120 130
Slika 1-11. Prikaz analize mtDNA automatskim sekvencioniranjem. Svaki je zubac radi lakega praenja prikazan razliitom bojom, a svaka boja oznauje razliitu bazu koja gradi DNA. Povie zubaca slovima A (adenin), G (gvanin), T (timin) i C (citozin) skraeno su prikazane pojedinane baze.
15
Slika 1-12. Prikaz analize mtDNA s pomou metode SSOPA (immobilized sequence specific oligonucleotide probe analysis). HV1 i HV2 je oznaka za hipervarijabilne regije mtDNA, a vidljive su vrpce nastale kao posljedica vezanja postojee sonde na najlonskoj membrani i specifinog DNA-ulomka nastalog nakon umnoavanja DNA izdvojene iz razliitih osoba. Bitno je uoiti postojanje vrpci razliita izgleda za svaku pojedinanu osobu. Vrpca koja se protee kroz sve analizirane uzorke oznauje pozitivnu kontrolu.
vravanja ve postojeih sustava, a sve radi unaprjeenja njihove uporabne vrijednosti. Jedan od najnovijih pristupa koji postupno pronalazi svoju primjenu u forenzinoj DNA-analizi jest uporaba polimorfizma jednog nukleotida (engl. single nucleotide polymorphism SNP) molekularnih biljega (sl. 1-13.). To su najuestaliji oblici DNA-polimorfizama koji se pojavljuju unutar ljudskoga genoma. U posljednjih nekoliko godina, posebice otkriem mogunosti primjene novih tehnika, ove znaajke nukleinskih kiselina doivjele su potpunu afirmaciju ne samo u populacijsko -genetikim istraivanjima, nego i u medicinskoj dijagnostici i testiranju identiteta. Kako je ve navedeno, ovaj se polimorfizam zasniva ponajprije na zamjeni samo jedne baze u standardnom redoslijedu promatrane sekvencije. Iako su, u biti, manje polimorfni u odnosu na danas iroko primjenjivane STRbiljege, njihovo pojavljivanje na gotovo svakih 1 000 pb ini ih izuzetno informativnima. Jedan od primarnih pravaca razvoja procedura testiranja ovih biljega usmjeren je k do-
datnoj analizi mitohondrijske DNA [34]. Naime, kako je ve nagovijeteno u prethod-
G C
G C
A T
G C
C G
G C
G C
A T
A T
C G
Slika 1-13. Polimorfizam jednog nukleotida (engl. single nucleotide polymorphism SNP), shematski prikaz zamjene jedne baze u uobiajenom slijedu nukleotida promatrane DNA-regije.
16
nim dijelovima ovoga poglavlja, mtDNA ima tri osnovne znaajke koje joj daju status izuzetno povoljne molekule za uporabu u DNAidentifikaciji: 1. uspjeno izdvajanje iz veoma degradiranih uzoraka, 2. znaajan stupanj informativnosti kad se kao referentni uzorci pojavljuju samo oni koji dolaze s majinske strane i 3. njezina aplikacija, kad mogunost uporabe nuklearnih molekularnih biljega uope ne postoji [35]. S druge strane, njezina uporaba nailazi na velik problem zbog njezine izuzetno male diskriminatorne moi. Pristup analizi velikoga broja SNP-biljega pozicioniranih ne samo na njezinoj hipervarijabilnoj regiji bitno e utjecati na uveanje njezine diskriminatorne znaajke, a samim tim, vrlo vjerojatno, dat e potpuno novu dimenziju primjeni mtDNA u forenzinoj genetici. Drugi novi pristup u ovom znanstvenom podruju ve daje izuzetno obeavajue rezultate. Ovdje nije rije o primjeni nekih novih molekularnih biljega, nego samo o drukijem pristupu analizi ve postojeih. Naime, tzv. miniSTR molekularni biljezi oznauju izmijenjenu verziju ve postojeih standardnih STR-DNA sekvencija, ija se modifikacija primarno zasniva na pomicanju, tj. pribliavanju poetnica ovih lokusa njihovu polimorfnome dijelu. Na taj se nain smanjuje ukupna molekularna masa, tj. veliina ovih biljega i otvara se velika mogunost njihove primjene u sluajevima kad se analizira iznimno degradirana DNA. Svoju primjenu ve su doivjeli u analizi i identificiranju rtava teroristikih napada na New York, tj. identificiranju rtava iz World Trade centra. Trenutano se radi na razvijanju i optimiziranju miniSTR multipleksnih sustava kojima se kani omoguiti simultana, istodobna analiza to veega broja ovih biljega, kao to su Bode Plex 1 i BodePlex 2 (Bode Technology), Minifiler (Applied Biosystems) i drugi [36].
1.11.
Potencijalni bioloki izvori DNA
U forenzine laboratorije dostavljaju se razliite vrste tragova radi ispitivanja. Tragovi koji se mogu ispitati primjenom neke od metoda DNA-analize (s izuzetkom mitohondrijske DNA) ogranieni su na one koji sadravaju staninu jezgru. U tom smislu iz sljedeih biolokih izvora mogue je uspjeno izdvojiti i analizirati DNA: 1. krv i kr vne stanice, 2. sperma i sjemene stanice, 3. tkiva i organi, 4. kosti i zubi, 5. kosa, prhut i nokti, 6. slina, mokraa, feces i druge tjelesne izluine, 7. epitelne stanice prisutne na odjevnim predmetima. Ostale vrste biolokih tragova, kao to je znoj (ako nema u primjesi epitelnih stanica), suze, serum, koji nemaju stanine jezgre ne mogu se ispitati standardnom analizom DNA. DNA je izolirana i iz materijala kao to su eluani sok i stanice fecesa (izmeta). Meutim, iz ovih je izvora katkad teko dobiti dovoljnu koliinu DNA u uzorcima za ispitivanje. Potrebno je, takoer, napomenuti da, premda se dobri rezultati analize DNA mogu dobiti iz nabrojenih tragova, u mnogim sluajevima kakvoa i/ili koliina uzorka pokae se nepogodnom za analizu DNA. Uspjenost detekcije DNA-profila analizom odreenog traga primarno ovisi o trima osnovnim uvjetima: a) koliini uzorka. Metode analize DNA, posebno PCR-om (lanana reakcija polimerazom) vrlo su osjetljive, ali i ta osjetljivost ima granice.
17
b) stupnju razgradnje DNA. Dugotrajno stajanje ak i velike kr vne mrlje u nepoUzorak
voljnim vanjskim uvjetima moe uzrokovati takvu razgradnju DNA ili kontami-
izdvajanje DNA (organska, Chelex, Qiagen, IQ)
kvantificiranje DNA (spektrofotometrija, hibridizacija, QRT-PCR)
multipleksni STR-sustav (PowerPlexTM 16 System, AmpFLSTR IdentifilerTM PCR Amplification Kit)
229_
100 8000 6000 4000 2000 0 150
Identifier_v1
D8S1179 205 D21S11 250 D7S820 300 CSF1PO
14 15 229_
D3S1358 100 8000 6000 4000 2000 0 150
30
10 12
10 11
Identifier_v1
TH01 205 D13S317 250 D2S1338 300 CSF1PO
17 18 229_
D19S433 100 8000 6000 4000 2000 0 150
8 9 Identifier_v1
vWA 205
11
11 12
17
22
TPOX 250
D18S51 300
13
15 17
8 10
10 11
229_
100 8000 6000 4000 2000 0 150
Identifier_v1
D8S1179 205 250 FGA 300
X Y
12 13
19
23.2
Slika 1-14. Prikaz osnovnih koraka u procesu generiranja DNA-profila: DNA-izdvajanje (primjenom metode organskih otapala ili nekom od drugih danas dostupnih metoda), kvantificiranje DNA (uporabom danas najee metode QTRT-PCR, ali veliki broj laboratorija u ove svrhe jo uvijek primjenjuje i hibridizacijsku, pa ak i gel-metodu), lanana reakcija polimerazom (PCR) koja u forenzinoj DNA-analizi podrazumijeva uporabu dostupnih multipleksnih STR-sustava, detekcija i generiranje DNA-profila, to je danas u potpunosti automatizirano.
18
naciju traga bakterijama da trag postane nepogodan za daljnje analize. c) istoi uzorka. Katkad neistoa, masti, neke boje u tkaninama i slini inhibitori pojedinih faza DNA-analize (uglavnom umnaanja) mogu ozbiljno ugroziti izvoenje analize DNA.
1.12.
Osnovni modeli i etape procesa forenzine DNA-analize
Proces forenzine DNA-analize zbiva se u nekoliko sukcesivnih, meusobno povezanih i ovisnih koraka, koji su pretoeni u jasno precizirane procedure. Na slici 1-14. prikazana je izuzetno pojednostavnjena shema ovih faza koje e podrobnije biti razjanjene u daljnjem tekstu.
1.12.1.
Prikupljanje i pohranjivanje uzoraka
Razvoj modernih metoda omoguio je analiziranje koliinski slabo zastupljene i veoma degradirane DNA u biolokim tragovima, ali je, s druge strane, i obvezao na izuzetne mjere opreza pri kontaktu i manipuliranju tim tragovima (zbog mogue kontaminacije). Prikupljanje, pohranjivanje i prijenos takvih biolokih tragova poetne su, ali najee i kljune faze uspjenog provoenja DNA- ekspertize. Ako dokazni materijal nije ispravno dokumentiran, prikupljen i pohranjen, on najvjerojatnije ne e biti prihvaen na sudu. Dokumentacija dokaznog materijala mora biti podrobna i moraju se slijediti sve odrednice za uporabu tog materijala u takve namjene. Svi pronaeni uzorci moraju sadravati karticu sa svojim brojem, datumom, vremenom, mjestom i imenom osobe koja je prikupila
uzorak. Ako je broj sluajeva odreen, taj se podatak takoer upisuje na karticu. Iscrpan opis naina prikupljanja i uvanja dokaznog materijala za DNA-testiranje moe se pronai u lanku Leeja i suradnika [37]. Stoga emo sada navesti samo nekoliko osnovnih pravila koja se moraju potivati pri prikupljanju biolokih tragova namijenjenih za analizu-DNA [38]. Svaki bioloki trag koji se nalazi u tekuem ili vlanom stanju najprije mora biti dobro osuen, pa tek onda upakiran i transportiran do mjesta njegove daljnje analize. Bioloki trag nikada ne smije trajno biti upakiran u plastini (PVC) omot (ambalau). Takav oblik pakiranja moe se primjenjivati samo za kratkotrajni transport traga do mjesta njegova suenja. Takav transport mora vrlo kratko trajati da bi se izbjeglo ubrzavanje procesa (neizbjene) degradacije (progresivna destrukcija) traga. U procesu prikupljanja biolokih tragova nuna je uporaba sterilnih (lateks, bez pudera) rukavica. Rukavice se moraju mijenjati u prikupljanju vie tragova po principu: jedan par rukavica jedan bioloki trag! Na taj se nain izbjegava mogua kontaminacija prikupljenoga biolokog materijala. Tijekom prikupljanja biolokih tragova preporuljivo je (nagovjetava se kao obvezno) noenje maske za lice, koja pokriva usta i nos. U pojedinim sluajevima nuno je i noenje jednodijelnog kombinezona i kape radi sprjeavanja potencijalne kontaminacije bilo kojim biolokim tragom (dlakom npr.), ali i osobne zatite kriminalistikih tehniara i forenziara od moguih izvora zaraze. U sluaju neposjedovanja maske (zbog objektivnih ili subjektivnih razloga), mo-
19
gua kontaminacija prikupljenih tragova moe se dobrano izbjei eliminacijom govora, pogotovu kaljanja, i udaljivanjem drugih (iako slubenih) osoba tijekom prikupljanja uzoraka. Pri prikupljanju veega broja biolokih tragova na jednoj lokaciji mora se voditi rauna o tome da se svaki trag obrauje individualno, tj. da se svaki od njih prikuplja posebnim, sterilnim materijalom i da se obvezno odvojeno pakira. Pri slanju biolokih tragova u laboratorij, poeljno je da se dostavi, ako je to mogue, i predmet (ili dio predmeta) s kojega je trag prikupljan (odjea, sitniji predmeti ). Ambalau u koju se upakira prikupljeni trag nuno je jasno i itljivo oznaiti razumljivim oznakama, koje e biti preciznije opisane i evidentirane u prateoj dokumentaciji. Oznake na ambalai i oznake u prateoj dokumentaciji moraju se meusobno poklapati! Tijekom prikupljanja uzoraka nuna je uporaba prirunoga kompleta za prikupljanje uzoraka. O prikupljanju, pakiranju i pohranjivanju ovih i ostalih biolokih tragova bit e vie rijei u iduim poglavljima.
1.12.2.
Metode izdvajanja DNA
oslobaa sadraj u kojem se nalaze molekule ugljikohidrata, proteina, masti i dr. S obzirom na to da se kemijske reakcije kao npr. PCR kojim e se umnoiti DNA, ne mogu zbivati u prisutnosti ovih molekula, njih je potrebno ukloniti posebnim tehnikama. Pri prekidu stanine cjelovitosti u svrhu izdvajanja, DNA se u poetku oslobaa iz jezgre i kromosoma i odmah se u sljedeem koraku oslobaa i od vee koliine proteina uporabom posebnih enzima. Danas se u rutinskom radu primjenjuje nekoliko metoda izdvajanja DNA, no prije navoenja tih metoda vano je upozoriti na neke vane injenice. Velik broj sluajeva koji dolaze u laboratorij na analizu sadrava minimalne koliine DNA i svaka nepotrebna manipulacija moe imati izravan utjecaj na kakvou i koliinu DNA. Sve osobe ukljuene u proces analize DNA moraju biti upoznate s mogunou kontaminacije postojee DNA s nekom drugom DNA. Neke od tvari koje se rabe pri izdvajanju DNA potencijalno su tetne za DNA ako se pravodobno i u potpunosti ne uklone. Uzorci ili izdvojena DNA moraju biti pohranjeni po strogo propisanim uvjetima, koji obuhvaaju i tehnike postupke i postupke osiguravanja tajnosti uzorka. Na slici 1-15. vidi se shematski prikaz nekih primjenjivanih metoda izdvajanja DNA u forenzinoj genetici.
1.12.2.1.
Nakon to se uzorak koji sadrava bioloke tragove dostavi u DNA-laboratorij, dokumentira, te pohrani, slijedi njegova priprema za analizu DNA. Pr vi korak u tom procesu jest izdvajanje DNA. DNA se u stanici ne nalazi u istom obliku, nego je udruena s brojnim drugim molekulama, kao to su npr. proteini, masti te mnoge druge kontaminirajue supstancije. Nakon pr vog koraka pri izdvajanju DNA, stanice se razbijaju te se
Izdvajanje DNA s pomou organskih otapala
U stanicama se, osim DNA, nalaze i brojne druge molekule od kojih mnoge mogu koiti postupke analize DNA kao npr. umnoavanje DNA tijekom lanane reakcije polimerazom. Ovom se metodom uklanja velika koliina proteina i ostalih molekula koje
20
Metode izdvajanja DNA u forenzi~noj genetici
A) izdvajanje DNA s pomo}u organskih otapala krvna mrlja SDS, EDTA proteinaza K
B) izdvajanje DNA Chelex 100 metodom krvna mrlja
C) izdvajanje DNA s pomo}u FTA-papira uzorak krvi osu{en na FTA-papiru izdvojen dio krvne mrlje
H2O
inkubacija 56 C centrifugiranje
inkubacija na sobnoj temperaturi centrifugiranje
fenol /kloroform/ izoamilni alkohol vorteksiranje centrifugiranje prijenos vodene faze u novu tubicu sterilna ddH2O koncentriranje uzoraka (amiconcetracon tubice ili precipitacija etanolom) centrifugiranje kvantificiranje DNA PCR
odbacivanje supernatanta 5% Chelex
ispiranje s ekstrakcijskim filtrom odbacivanje supernatanta dodavanje PCR-reagensa
inkubacija (56 C) inkubacija 100 C centrifugiranje
nije potrebna kvantifikacija DNA PCR kvantificiranje DNA PCR
pohranjivanje na 20 C kvantificiranje DNA PCR
Slika 1-15. Shematski prikaz osnovnih modela najee primjenjivanih metoda izdvajanja DNA: A) metoda organskih otapala; B) Chelex metoda; C) metoda ispiranja s FTA-papira. Prikazana shema je preuzeta iz Topi E, Primorac D, Jankovi S. Medicinskobiokemijska dijagnostika u klinikoj praksi. Medicinska naklada, Zagreb, 2004.
se oslobaaju pri izdvajanju DNA iz stanica. Izdvojena DNA ostaje sauvana u velikim komadima i ia je nego nakon drugih ekstrakcijskih metoda. Na kraju postupka, DNA se taloi ili koncentrira u za to posebno namijenjenim tubama. Ova je metoda dosegla najvii stupanj univerzalnosti, tj. moe se primijeniti na razli-
itim uzorcima. Sam protokol organske ekstrakcije moe biti modificiran u svim svojim fazama, ali se njegov kostur iznova ponavlja kroz svaku od tih varijanti. Naime, u prvoj fazi ovoga protokola dodaju se razliite koliine digestivnog pufera. Koliina dodanoga pufera ovisi o prirodi i koliini procesiranoga uzorka. Sastav digestivnoga pufera moe
21
varirati, ali se on ponajprije bazira na prisutnosti kemikalija poput TRIS-a, NaCl-a, SDS-a i EDTA. Molarnost i udio pojedinih komponenti u konanom sastavu toga pufera mogu varirati, ali to variranje nije znatnije izraeno. Uloga toga pufera, kao i svih drugih, svodi se na stvaranje uvjeta u kojima e, poslije dodana, proteinaza K moi djelovati, tj. obavljati svoju funkciju digestije proteina. Ovim putem dolazi do razgradnje membranskih kompleksa unutar stanica i cjelokupna genomska DNA slobodno pliva u novonastaloj suspenziji. Najprije centrifugiranjem, a zatim kombiniranim fenol-kloroformskim tretmanom dolazi se do solucije koja sadrava istu DNA. Poznato je da otopina fenolkloroform-izoamilalkohol zapravo obara proteine i masti, a nakon toga dodani kloroform obara viak fenola i ostalih prljavtina koje ostaju. Zatim se pristupa precipitaciji DNA. U ovisnosti o koliini, ali i oekivanoj kakvoi DNA, za korak precipitacije moe se primjenjivati alkoholna ili Centrikon metoda. Pr va se metoda bazira na izmjeninom ispiranju apsolutnim i 70%--tnim alkoholom (razliitih temperatura), a ponekad i na kratkoj inkubaciji na 20 C. Podobna je za velik broj uzoraka, ponajprije onih u kojima se oekuju dovoljne koliine relativno ouvane DNA. Druga se metoda pak bazira na ispiranju DNA otopine, nastale u fenol-kloroform fazi, kroz ultramembranu. Promjer pora te membrane takav je da na sebi zadrava DNA, a tekua faza prolazi kroz nju. Nakon toga, dodaje se ili TE-pufer ili obina destilirana voda na suprotnu stranu membrane. Na taj se nain DNA ispire u tubicu. Ova se metoda primjenjuje malo rjee i daje dobre rezultate kod uzoraka koji sadravaju male koliine, najee degradirane, DNA. Takoer, cijena centrikonki uvjetuje manju uestalost primjene ove metode. Nakon toga moe se pristupiti koncentriranju DNA. Ipak, i una-
to navedenim modifikacijama, openito gledano, ova metoda nije prikladna pri analizi biolokih uzoraka kod kojih postoji minimalna koliina DNA.
1.12.2.2.
Izdvajanje DNA Chelex 100 metodom
Ova je metoda vrlo uinkovita pri izdvajanju DNA iz uzoraka u kojima se oekuje postojanje minimalne koliine DNA, a temelji se na kuhanju uzorka u prisutnosti tvornikog pripravka pod nazivom Chelex 100. Nakon kuhanja, DNA se oslobaa, a Chelex 100 vee se za ione (npr. Mg++) koje se zajedno s DNA nalaze u stanici. U sljedeem koraku uklone se sve molekule vezane za Chelex 100 i preostane samo ista DNA. Tom se metodom rastavlja dvostruka DNA uzvojnica i metoda se moe primjenjivati ako se nakon nje radi umnoavanje DNA PCR-postupkom. Pri analizi DNA RFLP-metodom (o kojoj e biti vie rijei neto kasnije), koja zahtijeva dvostruku DNA uzvojnicu, spomenuta metoda nije dostatna.
1.12.2.3.
Izdvajanje DNA Qiagen metodom
Qiagen komplet je jedan od najpouzdanijih, ali i najjednostavnijih ekstrakcijskih kompleta. Proizvodi se u vie varijanti prilagoenih za razliite vrste uzoraka. Princip rada zasniva se na uporabi kemikalija dostavljenih u sastavu kompleta i svodi se na osnovne faze digestije uz prisutnost proteinaze K, transferiranje uzoraka na posebnu tzv. silika-membranu, proiavanje tako vezane DNA-molekule i na kraju njezino ispiranje u posebne tubice. Ono to je uistinu bitno napomenuti jest to da uz svaki kupljeni set kemikalija dolazi i knjiica procedura optimiziranih za veliki broj uzoraka. Te procedure, najee ni uz kakve ili pak neznatne izmjene daju izuzetno dobre rezultate na irokome spektru uzoraka, bez obzi-
22
ra na to radilo se o punoj kr vi, kr vnim mrljama, opucima, dlakama, tragovima sperme ili pak kostima.
1.12.2.4.
ne tzv. inhibitora PCR-reakcija. U daljnjem tekstu bit e vie rijei o metodama koje se primjenjuju pri kvantificiranju DNA.
1.12.3.1.
Ostale metode izdvajanja DNA
Postoji jo veliki broj metoda izdvajanja DNA, kako onih koje se baziraju na primjeni tipinih laboratorijskih procedura (isoljavanje, ispiranje), tako i onih zasnovanih na uporabi nekoga od mnogobrojnih komercijalnih DNA-izolacijskih kompleta. Jedna od najjednostavnijih i najbrih jest tzv. metoda ispiranja koja se primjenjuje pri analizi nespornih tragova (bukalne sluznice ili kr vne mrlje) prikupljenih na FTA kartici, a sastoji se od sukcesivnoga ispiranja vodom slobodnom od DNA, centrifugiranja i treskanja izdvojenih dijelova kartice. Jedna od osobitosti te izuzetno jeftine metode jest i njezina masovna uporaba pri analizi nespornih tragova primjenom neke od automatskih izolacijskih jedinica. Ovakav pristup omoguuje istodobnu obradbu velikoga broja uzoraka, to bitno utjee na uspjenu i brzu analizu tragova, ponajprije onih koji se pohranjuju u nacionalne baze podataka.
Spektrofotometrijsko odreivanje koliine DNA u uzorku
Vea koliina DNA malokad je dostupna za analizu uzoraka u sudskoj medicini te se standardna metoda spektrofotometrijskog odreivanja koliine DNA u uzorku vrlo rijetko primjenjuje. Ta se metoda temelji na mjerenju transmisije svjetla kroz tekuinu (pri valnim duljinama 260 i 280 nm; 1 nm = 109 m), na osnovi ega se moe utvrditi koncentracija postojee DNA. Mjerenjem apsorpcije na valnim duljinama od 260 i 280 nm moe se utvrditi i istoa DNA, dok ista ta mjerenja na valnim duljinama 230 nm utvruju postojanje peptida, fenola, karbohidrata i nekih drugih spojeva koji kontaminiraju DNA. Ipak, neselektivnost ove metode, tj. injenica da se na ovaj nain biljei ukupno prisutna DNA, bez obzira na njezino podrijetlo, odreuje ju kao izuzetno neprikladnu u procesu forenzine DNA analize.
1.12.3.2.
Metoda Yield gel ili produkt gel
1.12.3.
Kvantificiranje DNA
Ishod analize DNA uvelike ovisi o njezinoj kakvoi i koliini. U identifikaciji uzoraka analizom DNA, najea metoda koja se rabi je PCR. Budui da je za optimizaciju metode potrebna tono odreena koliina DNA, iznimno je vano metodama kvantificiranja utvrditi njezinu pravu koliinu, ali i podrijetlo, tj. potjee li pronaena DNA od ljudskoga izvora. Isto tako, jedan od kljunih parametara za uspjenu primjenu PCR-metode jest i istoa uzorka. Naime, uzorci koji stiu na obradbu vrlo su esto kontaminirani bakterijskom DNA ili sadravaju vee kolii-
U sluaju postojanja vee koliine DNA, moe se rabiti i ova metoda kojom se prvo izdvojena DNA nacijepi na, najee agarozni, gel te se usporedi s DNA poznate koncentracije. Ta metoda nije precizna i samo okvirno moe pomoi u odreivanju raspoloive DNA izdvojene iz nekog uzorka (sl. 1-16. A), pa je stoga njezina primjena u forenzinoj DNA-analizi izuzetno limitirana i prevladana.
1.12.3.3.
Hibridizacijska (slot-blot) metoda
Trenutano jedna od najrairenijih metoda kvantificiranja izdvojene DNA jest komercijalna metoda koja se bazira na hibridizaciji
23
sonde koja sadri ulomke ljudske DNA, s ljudskom DNA potencijalno prisutnoj u biolokom tragu, tj. u uzorku. Tom se metodom (najee kemiluminiscencijska ili kolorimetrijska metoda) mogu utvrditi iznimno male koliine DNA. DNA izdvojena iz uzorka najprije se prebaci i imobilizira na membrani te se nakon toga vee s DNA--probom duljine od oko 40 bp specifinom za ljudsku DNA, ali i za DNA viih primata (impanzi i gorila). Dobiveni rezultati usporeuju se s pozitivnom kontrolom za koju postoje poznate koncentracije DNA. Trenutano najkoriteniji komercijalni komplet jest QuantiBlot Human DNA Quantitation Kit (Applied Biosystem slika 1-16. B) koji se koristi sekvencijom sa 17. ljudskog kromosoma kao DNAsondom. Izuzetno je osjetljiv i uspjeno detektira koliine DNA i do 150 pg (pikograma = 1012 grama). S druge strane, sam je postupak izuzetno sloen, oduzima mnogo vremena i bitno ovisi o sposobnosti analitiara koji ga izvodi. Takoer, dokazano je da katkad uzorci koji nisu kvantificirani u ovom tipu reakcija budu uspjeno analizirani. Ta injenica sugerira potrebu kvantifikacije radi optimizacije idue faze amplifikacije, a ne odluivanja o nastavku ili prekidu samoga procesa.
1.12.3.4.
koja iznosi od 0,1 do 50 ng (1 ng = 109 g) [39].

1.12.3.5.
QRT-PCR-a kvantifikacija
AluQuant Human DNA Quantitation System
Uporabom kvantitativne PCR-reakcije u realnom vremenu (engl. Quantitative Real time PCR, QRT-PCR), uspjeno se kvantificira ljudska DNA, a ujedno je mogue odrediti prisutnost inhibitora i stupanj inhibicije (sl. 1-16. C). Princip mjerenja zasniva se na detekciji i kvantifikaciji fluorescentno obiljeenog reportera, iji signal raste u izravnoj ovisnosti o poveanju broja kopija produkta u PCR-reakcijskoj smjesi [40]. Ova je metoda izuzetno jednostavna i relativno kratkotrajna, te kao takva pronalazi sve veu primjenu u forenzinoj DNA-analizi. Trenutano najkoriteniji komercijalni kompleti jesu: QuantifilerTM Human DNA Identification Kit i QuantifilerTM Y Male Human DNA Identification Kit, oba od Applied Biosystems. Pr vi slui za kvantifikaciju ljudske DNA neovisno o spolu (proba je the human telomerase reverse transcriptase hTERT lokus) dok drugi odreuje koliinu iskljuivo muke ljudske DNA (proba je SRY lokus) i pronaao je iroku primjenu u procesiranju uzoraka vezanih uz seksualne zloine. Vano je rei da se ovim sustavom moe kvantificirati koliina DNA i od 0,023 ng/L.
Ovo je jo jedna metoda za utvrivanje koncentracije DNA prije PCR-umnoavanja. Posebno napravljene sonde veu se na visoko ponavljajue sljedove sekvencija koje su specifine za ljudsku DNA, ali nakon to se DNA denaturira. Metoda je pouzdana, jer ne mjeri postojanje nekih stranih DNA (npr. bakterijskih DNA). Koliina DNA utvruje se posredno preko koliine izmjerene svjetlosti koja nastaje oslobaanjem iz energijom bogatih spojeva. Prema pr vim rezultatima, tom se metodom uspjeno moe utvrditi koliina DNA
1.12.4.
Polimorfizam duljine restrikcijskog ulomka
Pr va metoda koja je primijenjena u forenzinoj DNA-analizi bila je analiza polimorfizma duljine restrikcijskog ulomka (engl. restriction fragment length polymorphism, RFLP). U njoj se dvolanana DNA cijepa u prisutnosti restrikcijskih endonukleaza, nakon ega se DNA-ulomci odvajaju s po-
24
A)
B)
St 1 (10 ng) St 2 (5 ng) St 3 (2,5 ng) St 4 (1,2 ng) St 5 (0,6 ng) St 6 (0,3) ng C1 2,5 ng C2 0,3 ng
C)
1.0e+001
2
1.0e+000
3
1.0e+001
1.0e+002
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
broj ciklusa
Slika 1-16. Prikaz razliitih metoda kvantificiranja DNA. A) Metoda produkt-gela. Na primjeru je prikazana najjednostavnija metoda po kojoj je u stupcu 11 postavljen biljeg, tj. uzorak poznate koncentracije. Na osnovi razliitoga stupnja fluorescencije, a u usporedbi sa stupnjem fluorescencije biljeg-uzorka iz stupca 1 mogue je odrediti koliinu DNA zastupljenu u svim ostalim uzorcima. B) metoda hibridizacije. Uzorci St 1St 6 oznauju standarde poznatih koncentracija (od 10 ng do 0,3 ng) upotrebljavane u procesu hibridizacije. Na osnovi usporedbe intenziteta obojenosti opaenih kod uzoraka C1 i C2 jasno se moe zakljuiti koja je mogua koliina DNA prisutna u tim uzorcima. C) QRT-PCR. Krivulje tijeka umnoavanja 1 ljudske DNA, 2 interne kontrole, 3 prijelazni prag.
25
mou elektroforeze na agaroznom gelu. Posebnim tehnikama DNA-ulomci prenose se na najlonsku membranu i na kraju detektiraju s pomou radioaktivne ili kemiluminiscentne sonde koja se specifino vee na tono odreene segmente genomske DNA [1, 2, 41]. Restrikcijski enzimi obino su bakterijski proizvodi koji mogu isijecati sve bakteriji strane molekule DNA. Danas se ti enzimi naveliko primjenjuju i u dijagnostici i u sudskomedicinskome radu. Vano je istaknuti da svaki od tih brojnih enzima sijee DNA na tono zadanom mjestu koje je odreeno specifinom sekvencijom. Tako npr. enzim Hae III sijee DNA uvijek kad postoji redoslijed baza GGCC unutar DNA. U ljudskom genomu postoji otprilike 12 000 000 mjesta gdje postoji taj redoslijed baza i na svakom od navedenih mjesta isjei e se DNA. S pomou RFLP-tehnologije prouavaju se dvije osnovne vrste DNA-polimorfizama: promjene koje ukljuuju pojedinane baze i minisatelitski VNTR (engl. variable number tandem repeat) lokusi, koji ukljuuju razliit broj ponavljanja odreene DNA-sekvencije. Analize polimorfizama koje ukljuuju pojedinane baze imaju ogranienu primjenu u forenzinoj DNA-identifikaciji, budui da kod takvih promjena postoji ogranien broj alela i ogranien broj korisnih lokusa. No, od sredine osamdesetih godina najee primjenjivana metoda forenzine DNA-analize bila je RFLP-analiza minisatelitskih VNTR-lokusa. Ti se lokusi razlikuju po duljini zbog razliita broja ponavljajuih DNA-sljedova na pojedinom lokusu. Primjenjivani VNTR-lokusi imaju ponavljajue sljedove duljine od 15 do 70 parova baza. Standardizacija sustava za testiranje u forenzinim znanostima bila je dovela do uporabe dvaju restrikcijskih enzima: Hae III u Sjedinjenim Dravama i HinfI u Europi, dok se ostatak zemalja koristio jednim od ovih dvaju enzima. No, za ovu tehniku bi-
la je potrebna relativno velika koliina DNA, postupak je bio izuzetno dugotrajan i zahtijevao je dosta rada, a katkad i uporabu radioaktivnih materijala. Drugi problem u primjeni ove metode jest i injenica da je uzorak morao sadravati DNA koja nije degradirana (razbijena u manje ulomke), a to je otprilike broj od 100 000 stanica, to odgovara veliini kovanice od 1 kune. Za usporedbu, metoda analize DNA PCR-om zahtijeva 10 do 10 000 puta manje DNA nego navedeno RFLP-testiranje. irok, sada ve povijesni, pregled mogunosti primjene RFLP-tehnologije i njezine forenzine namjene moe se pronai u radu Wayea [42].
1.12.5.
Lanana reakcija polimerazom
Lanana reakcija polimerazom, polimerazna lanana reakcija, lanana sinteza polimerazom, samo su neki od naina da se prevede izvorni naziv tehnike engl. polymerase chain reaction (PCR) koja je doslovno izazvala revoluciju na polju molekularne genetike i biologije uope. Polazna koliina DNA, koja je desetljeima bila ograniavajui imbenik u istraivanjima, svela se na potrebu postojanja samo jedne dobro ouvane molekule, a mukotrpne procedure izdvajanja i proiivanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraivaima su se naglo otvorile nove mogunosti. Osim toga, gotovo da ne postoji drutvena djelatnost koju ova tehnika nije izravno ili posredno dotaknula i zauvijek izmijenila. Glavni krivci za ovakvo stanje su Kary Mullis i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U asopisu Science objavljen je godine 1985. znanstveni rad autora R. Saiki, K. Mullis i H. Erlich, u kojem se pr vi put opisuje tehnika specifinog umnoavanja ulomaka DNA
26
in vitro uz katalizu enzima DNA-polimeraze izdvojene iz bakterije Escherichia coli [43]. Godine 1988. isti tim znanstvenika publicira rad u kojemu umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNA-polimerazu I izdvojenu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq) [44]. Unato brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lanane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. i 1988., nisu se znatnije izmijenile. Osnovne premise na kojima se zasniva PCR jesu: u nativnome stanju DNA je dvostruki heliks koji se sastoji od dvaju antiparalelnih polinukleotidnih lanaca meusobno povezanih vodikovim vezama: nukleotidi jednoga polinukleotidnog lanca meusobno su povezani kovalentnom vezom izmeu deoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne skupine susjednog nukleotida, a vodikove veze koje odravaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se formiraju izmeu komplementarnih baza, tj. A-adenin uvijek se vee za T-timin, a C-citozin za G -gvanin. Vodikove su veze energijski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se odravaju, a hlaenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza izmeu komplementarnih baza (renaturacija). Na osnovi navedenoga kreiran je osnovni model PCR-reakcije koji se sastoji od triju osnovnih koraka: denaturacije (razdvajanje polinukleotidnih lanaca uvjetovano visokom temperaturom od 95 C), hibridizacije (povezivanje umjetno sintetiziranih i fluorescentno oznaenih DNA-poetnica koje jasno lociraju mjesta, tj. DNA-ulomke koji e biti umnoeni) i produljivanja lanca (vezivanje komplementarnih baza na slobodna mjesta, uvjetovano prisutnou denaturirane matrice, DNA-poetnica i aktivnou Taq-polimeraze). Ovaj model u idealnim uvjetima (koji
svakako ne postoje u prirodi) teorijski omoguuje da se samo od jedne kopije, kroz 32 ciklusa u kojima bi se sukcesivno smjenjivale nabrojene faze, dobije 1,07 109 kopija [45]. Dakle, lanana reakcija polimerazom metoda je s pomou koje se umnoava (amplificira) odreeni ulomak DNA, pri emu se proizvodi milijarde DNA-kopija (ovisno o broju ciklusa reakcije) koje su potpuno istovjetne odabranom DNA ulomku (sl. 1-17). Ova tehnika ima nekoliko kljunih prednosti u odnosu na RFLP: potrebna je manja koliina DNA, brza je (rezultati se dobiju za nekoliko sati) i pri radu nisu potrebni radioaktivni izotopi [41,42]. No, postoje i dva osnovna nedostatka pri uporabi ove metode: pr vi je da zbog iznimne osjetljivosti postoji sklonost kontaminaciji, a drugi je injenica da mnogi PCR-om analizirani lokusi, poglavito STR-molekularni biljezi, imaju manje alela nego minisatelitski VNTR-lokusi koji se analiziraju metodom RFLP. Ipak, ta dva problema mogu se relativno lako prevladati realizacijom ove metode u strogo kontroliranim uvjetima kao i primjenom multipleksnog STR-sustava koji, primjera radi, danas omoguuju istodobnu analizu i po 16 STR-lokusa.
1.12.6.
AmpliType PM+DQA1 PCR Amplification and Typing Kit
Pr vi PCR-sustav primjenjivan u forenzici analizirao je lokus HLA-DQA1, koji je poznati dio ljudskoga histokompatibilnog sustava. Cetus korporacija (Emeryville, CA, SAD) razvila je komplet za analizu koji prodaje Applied Biosystems korporacija (Nor walk, CT, SAD) i koji je ak i danas dostupan na tritu. Amplitype DQA1 bio je sustav za tipizaciju koji sadrava sonde s pomou kojih se otkriva varijabilnost DNA-slijeda koja se prije detektirala s pomou protutijela. Izvorni je sustav u poetku sadravao est alela. Pri
27
vezivanje DNA po~etnica
sinteza drugoga lanca
denaturacija
u 32 ciklusa za 100% efikasnosti kreira se 1,07 milijardi kopija ciljanoga DNA-podru~ja
prvi ciklus
drugi ciklus
Slika 1-17. Prikaz procesa lanane reakcije polimerazom. Polazne molekule DNA najprije se griju na temperaturi od priblino 95 C, to je dovoljno da se dvostruka uzvojnica DNA rastavi u dva odvojena lanca. U sljedeem koraku DNA se hladi kako bi se DNA-poetnice mogle vezati za specifina mjesta unutar molekula DNA. S dvije DNA poetnice definira se duljina DNA-ulomka koji se eli umnoiti. Nakon toga temperatura se ponovno povisuje kako bi se pokrenula sinteza drugog lanca. U svakom sljedeem ciklusu sve molekule koje su do tada sintetizirane slue kao kalup te se stoga u svakom iduem ciklusu udvostrui broj DNA molekula.
testiranju dokaznog materijala, u priblino 16% sluajeva dvije su osobe imale isti genotip, pa je bilo potrebno razviti nove PCR-sustave za tipizaciju. Sljedei sustav koji se razvio na slinom principu dot blot analize bio je Amplitype Poly-marker. Ovom je metodom bio dodatno povean broj analiziranih gena, a najvei joj je doprinos zapravo to to je poveala snagu iskljuivanja(discrimination power) pri testiranju.
1.12.7.
AmpliFLP D1S80 PCR Amplification Kit
Ovaj sustav, obino zvan D1S80, oznaivao je analizu genetiki vrlo polimorfnog VNTR-lokusa D1S80. Osnovna ponavljajua sekvencija koja se nalazi pri analizi lokusa D1S80 duga je 16 pb, a broj takvih ponavljajuih sekvencija varira od 14 sve do 41 (od 350 do 1 000 pb). Prikaz alela takoer ovisi
28
o njihovu broju. Tako se osoba koja ima 18 i 22 ponavljanja prikazivala kao osoba 18, 22. Kao i kod RFLP-raznolikosti, i ovdje e kod razliitih osoba postojati razliite duljine DNA-ulomaka. S obzirom na to da se u ovom sustavu analizira samo jedan genski lokus, snaga iskljuivanja (discrimination power) nije bila velika, no taj se sustav u kombinaciji s drugima pokazivao kao dosta dobar. Obino se pri uporabi ove metode rabilo bojenje gela srebrnim nitratom.
1.12.8.
Multipleksni STR-sustavi
Poput RFLP-sustava, pr vi su testovi analize DNA u sudskoj medicini bili utemeljeni na varijabilnosti sljedova DNA (sekvencijski polimorfizam). Istraivai su ubrzo pronali jo jednu klasu lokusa bogatu polimorfizmima, ali s kratkim ponavljanjima (od 2 do 9 ponavljanja). Ta klasa lokusa naziva se kratkim ponavljajuim sljedovima (STR, engl. short tandem repeats) i predstavlja mikrosatelite nasuprot PCR-tipizirajuih sustava koji se nazivaju dugim ponavljajuim jedinicama (LTRs) (engl. long tandem repeats) ili minisatelitima. O ovim molekularnim biljezima ve je bilo rijei i prije i kao jedna od osnovnih prednosti navedena je i mogunost relativno jednostavnoga, brzoga i istodobnoga procesiranja vie od 10 STR-lokusa. Gotovo svi sustavi koji se primjenjuju u forenzinim ispitivanjima imaju ponavljanja duljine 4 pb (tetranukleotidi) ili 5 pb (pentanukleotidi), koja se pojavljuju od 5 do priblino 50 puta, ovisno o lokusu [46, 47]. Ova vrsta molekularnih biljega vrlo je kratka (100 do 400 pb) i vrlo korisna u analizi degradirane DNA, za razliku od RFLP-ulomaka ija duljina moe varirati od 500 do 12 000 pb. Prednost tih sustava jest i u injenici da je pojavljivanje tzv. stutter-ulomaka iznimno ri-
jetko. Pojam stutter rabi se pri pojavljivanju DNA-ulomaka koje su za jedan ponavljajui slijed krae od oekivane vrpce. Stutter se pojavljuje relativno esto kod tetranukleotidnih ponavljajuih sekvencija, kao ulomak za jedan ponavljajui slijed kraa od oekivanog ulomka upravo za jednu ponavljajuu jedinicu od 4 baze. Problem stuttera posebno je velik pri analizi mijeanih tragova, kad se treba utvrditi je li ulomak koji se pojavljuje stutter ili pripada nekom drugom izvoru. Prema rezultatima mnogih analiza sustava koji omoguuju analizu pentanukleotidnih ponavljanja (npr. PowerPlex 16), pojava stuttera znatno je rjea [48]. U SAD-u je izabrano 13 STR (engl. short tandem repeat) lokusa za nacionalnu bazu podataka o osuivanim prijestupnicima [49]. Ta se baza podataka naziva Kombiniranim DNA indeksnim sustavom (engl. Combined DNA Indexing System CODIS). Taj je sustav u poetku bio ogranien na osuene silovatelje, no poslije je proiren u druge svrhe. Trinaest CODIS-lokusa izabrano je tako da se poklapaju s drugim lokusima koje je izabrao Ser vis za forenzine znanosti (Forensic Science Services) u Velikoj Britaniji za njihovu nacionalnu bazu podataka i za organizacije poput INTERPOL-a. Novi STR-sustavi za tipizaciju imaju nekoliko prednosti u odnosu na stare. Pr va, ve navedena, prednost jest ta da se vie lokusa amplificira istodobno (multipleksne reakcije). Druga je prednost ta da je mogua izravna detekcija ovih sustava za testiranje te da nije potrebna uporaba sondi. Po jedna poetnica od svakoga para ima fluorescentnu oznaku tako da je mogue razlikovati PCR-multiplekse prema razliitim valnim duljinama svjetlosti. Zahvaljujui tomu mogua je istodobna elektroforeza i odreivanje veega broja lokusa [50]. Nadalje, automatizirana detekcija omoguena je zahvaljujui uporabi fluorescencije. Danas su dostupni industrijski proizvedeni kompleti
29
reagensa koji se primjenjuju za razliite automatizirane sustave za detekciju. Najei STR-sustavi koji se danas primjenjuju u rutinskom forenzinom radu ukljuuju: PowerPlex 16 System (Promega, Madison, VI, SAD), AmpFLSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD), AmpFLSTR Profiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD), AmpFLSTR Cofiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD), AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD), AmpFLSTR SGM Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD). Naravno da, osim navedenih, postoje jo brojni drugi STR-sustavi koji se uporabljuju u svakodnevnom radu. Podroban pregled osnovne PCR-tehnologije, STR-PCR-tehnologije i njihove primjene u forenzinim ispitivanjima moe se pronai u dopunskoj literaturi [49,51,52]. Ovdje emo se osvrnuti samo na dva, danas najkoritenija multipleksna STR-sustava.
1.12.8.1.
PowerPlex 16 System
PowerPlex 16 System dvokomponentni je komplet reagensa koji se sastoji od ovih cjelina: preamplifikacijska komponenta: Gold Star 10x pufera PowerPlex16 10x Primer Pair Mix DNA uzorak koji slui kao pozitivna kontrola postamplifikacijske komponente: PowerPlex16 Allelic Ladder Mix Internal Lane standard (ILS) 600 Blue Dextran Loading Solution (opcijski). PowerPlexTM 16 doputa koamplifikaciju i trobojnu detekciju 16 lokusa (15 STR-loku-
sa i amelogenin). Svaki od tih lokusa jasno je lociran u genomu i odreena mu je repetitivna jedinica. Ukljueno je 13 STR-tetranukleotidnih (tzv. standardnih CODIS-lokusa) i 2 pentanukleotidna lokusa. PP16 sustav zasniva se na postojanju triju kompleksa poetnica: a) poetnice za lokuse Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, markiran fluoresceinom (FL plava boja), b) poetnice za lokuse FGA, TPOX, D8S1179, VWA, Amelogenin, obiljeen karboksi-tetrametilrodaminom (TMR uta boja), c) poetnice za lokuse Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, obiljeen 6-karboksi-4,5-dikloro -2,7dimetoksi-fluorescein. (JOE zelena boja). Pri spravljanju pojedinanih DNA-reakcija primjenjuje se propisana receptura koja preporuuje ukupan volumen reakcije od 25 L, od ega oko 10% otpada na volumen DNA uzorka dobivenog u procesu izdvajanja. U postamplifikacijskom dijelu ovoga kompleta sadrane su sve kemikalije koje su nune za automatsku detekciju i analizu dobivenih rezultata. Internal Lane Standard (ILS) nuan je za analizu veliina DNA-sekvencija (sizing-analiza). Sastoji se od 22 umjetno sintetizirana DNA ulomaka rangirana u duljini 60600 pb. Svaki je ulomak oznaen karboksi-x-rodaminom i detektira se cr venom bojom. Uporabom toga standarda relativna migracijska pozicija svakoga ulomka ovisi samo o duljini ulomka, a ne i o njegovoj sekvenciji. PowerPlex16 Allelic Ladder Mix (alelna ljestvica) sadrava umnoene alelne varijante koje su bile otkrivene u kakvazoidnoj populaciji u prijanjim ispitivanjima. Kombinira-
30
B50012B-T
D3S1358 105 TH01 175 D21S11 245 D1S351 315 385 Penta_E 455
1800 1200 600 0 16 18 B50012B-T

D5S818 105 D13S317 175 D7S820 245 D16S539 315 CSF1PO 385 Penta_D 455
8 9
28 29
12 14
12
5700 3800 1900 0 11 12 14 B50012B-T

vWA 105 175 D8S1179 245 TPOX 315 FGA 385 455
10 11
9 12
9 11
9 11
3300 2200 1100 0 X Y 15 17 12 15 11 24 25
Slika 1-18. Prikaz raunalno obraenih rezultata analize DNA (elektroferogram) nakon primjene PowerPlex 16 sustava.
nom uporabom ILS-a i alelnih ljestava (allelic laddera), te primjenom odgovarajuih softvera, svaka alelna varijanta dobiva automatski svoj naziv, tj. brojnu oznaku. Blue Dextran Loading Solution je kemikalija koja se rabi pri detekciji na starijim genetikim analizatorima koji podrazumijevaju analizu na vertikalnom poliakrilamidnom gelu i upotrebljavala se za vizualizaciju uzorka pri postavljanju na gel te pojaavanje viskoznosti DNA, to odrava DNA u jaici prije poetka elektroforeze i tako pomae pravovremenom nesmetanom prolasku uzorka kroz gel.
Ve je prije spomenuto, ali nije zgorega ponoviti, da vjerojatnost da postoje dvije nesrodne osobe s identinim alelnim varijantama na 15 STR-lokusa (sl. 1-18), zastupljenih u PowerPlex 16 kompletu za kavkazoidno stanovnitvo iznosi 1,83 1017 [18]. To dovoljno govori o stupnju diskriminacije i individualizacije koju prua primjena ovog kompleksa reagensa.
1.12.8.2.
AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit
AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit takoer je DNA-identifikacijski kom-
31
plet kojim se istodobno moe analizirati 15 STR-lokusa, no, za razliku od prethodnoga kompleta reagensa, svi su lokusi tetranukleotidi (sl. 1-19.). Sadrava takoer svih 13 CODIS, ali i dva dodatna lokusa (D2S1338 i
D19S433). Ovaj sustav bazira se na postojanju etiriju kompleksa poetnica: a) lokusi D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO obiljeeni su plavom bojom 6-FAM,
229_
100 8000 6000 4000 2000 0 150
Identifier_v1
D8S1179 205 D21S11 250 D7S820 300 CSF1PO
14 15 229_
D3S1358 100 8000 6000 4000 2000 0 150
30
10 12
10 11
Identifier_v1
TH01 205 D13S317 250 D2S1338 300 CSF1PO
17 18 229_
D19S433 100 8000 6000 4000 2000 0 150
8 9 Identifier_v1
vWA 205
11
11 12
17
22
TPOX 250
D18S51 300
13
15 17
8 10
10 11
229_
100 8000 6000 4000 2000 0 150
Identifier_v1
D8S1179 205 250 FGA 300
X Y
12 13
19
23.2
Slika 1-19. Prikaz raunalno obraenih rezultata analize DNA (elektroferogram) nakon uporabe AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification sustava.
32
b) lokusi D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338 obiljeeni su zelenom bojom VIC, c) lokusi D19S433, TPOX, vWA, D18S51 obiljeeni su utom/crnom bojom NED, d) amelogenin, D5S818, FGA obiljeeni su cr venom bojom PET. U odnosu na prethodne komplete reagencija, osim toga to se rabe nove boje, Identifileru je dodana i peta, naranasta boja LIZ kojom je obiljeen Size Standard koji se sastoji od ulomaka duljine do 500 pb. Vjerojatnost da postoje dvije nesrodne osobe s identinim alelnim varijantama na 15 STR-lokusa, zastupljenih u Identifiler kompletu npr. za kavkazoidno stanovnitvo u SAD-u iznosi 5,01 1019 [53], to jasno govori o stupnju razluivanja i individualizacije koju prua primjena ovog kompleksa reagensa.
1.12.9.
Detekcija PCR-rezultata
Nakon amplifikacije slijedi faza detekcije koja se zbiva na nekom od analitikih strojeva, te se uporabom razliitih softvera, u odreenim fazama procesa, generiraju konani genetiki profili. Detekcija, kao finalna faza procesa utvrivanja genetikoga identiteta osobe ili biolokoga traga, automatizirana je procedura koja je najvie podlona promjenama i uestalim inovacijama. Te promjene u biti prate trendove napretka u informatikoj tehnologiji i tenju k potpunoj automatizaciji procesa. Radi komparativnosti rezultata, kao i certifikacije laboratorija nuno je, u skladu s materijalnim mogunostima, pratiti taj razvoj. Aktualni trend na ovom podruju jest potpuna zamjena gel-DNA--analitikih strojeva (ABI 377) s novim jednokapilarnim, ali i viekapilarnim sustavima (ABI 310, ABI 3100, ABI 3130, ABI 3130XL). Pretpostavka je da e se potpuna smjena generacija tih
strojeva zavriti u iduih nekoliko godina. Svi laboratoriji koji se u tom, iduem razdoblju ne preorijentiraju na kapilarne instrumente mogli bi imati velike probleme sa skupom nabavom kemikalija i poveanjem trokova procesa. Inae, DNA sekvenciranje je proces utvrivanja redoslijeda baza unutar lanca DNA i ini jednu od osnovnih metoda na kojima poiva genetiko inenjerstvo. Poznavanje DNA-sekvencije preduvjet je bilo kakvoj manipulaciji ciljanim segmentom nasljednoga materijala. Primjera radi, raunalno pretraivanje sekvenci svih poznatih restrikcijskih (endonukleaznih) mjesta, moe rezultirati stvaranjem cjelovite i precizne restrikcijske mape. Postoji vie tehnika sekvenciranja koje se meusobno razlikuju po svojim osnovnim principima [54]: a) Maxam-Gilbertova (M-G) metoda, b) Sangerova metoda, c) automatsko sekvenciranje. Jednostavnost, brzina i irok spektar primjenjivosti promovirali su metodu automatskog sekvenciranja u trenutano najprimjenjivaniju metodu analize DNA-sekvencija. Manualno sekvenciranje DNA-ulomaka predstavljeno pr vim dvama pristupima (MG i Sanger), podrazumijeva etiri odvojene reakcije, separirane u etiri odvojene staze poglavito na agaroznom gelu i autoradiografsko detektiranje. To oznauje ove metode kao izuzetno duge, komplicirane i zahtjevne sa stajalita potrebe forenzine DNA-analize da obradi to vei broj uzoraka u to kraem razdoblju. Sanger je za svoje otkrie dobio Nobelovu nagradu. Ukratko, Sangerova metoda sekvencioniranja zasniva se na zaustavljanju enzimske sinteze lanca DNA ugradnjom dideoksiribonukleozid-trifosfata. Polazni preduvjet za uspjeno automatsko sekvenciranje jest simultanost detekcije
33
obiljeenih ulomaka i procesa elektroforeze. Prednost pri automatskoj detekciji imaju fluorescentni u odnosu na radioaktivne ili neke druge biljege. Ipak, bez obzira na to o kojoj se generaciji automatskog sekvenciranja radilo, osnove svake od njih poivaju na Sangerovoj metodi. U pr voj generaciji fluorescentni su biljezi bili vezani za poetnice. Vezanjem etiriju razliitih fluorescentnih boja za poetnicu, a koje se razlikuju u spektrima fluorescencije, mogue je analizirati produkte elektroforeze svih etiriju zaustavljanja replikacije na lancu zbog ugradnje dd nukleotida u samo jednoj stazi. DNA ulomci detektirali su se na osnovi njihove fluorescencije tijekom prolaska kroz polje djelovanja detektora. Horizontalnim skeniranjem detektora mogue je simultano detektirati vie separiranih sekvencija, jedna sekvencija po liniji. Druga, naprednija generacija fluorescentne tehnike zasniva se na uporabi fluorescentnih biljega vezanih za chain terminator-nukleotid i to podrazumijeva razliito bojenje svake od baza (C, G, T, A). Svaki od ovih etiriju nukleotida fluorescira u razliitom spektru. Biljeg je inkorporiran u DNA-molekulu s pomou Taq polimeraze i obavlja dvije funkcije u jednom koraku: zaustavlja daljnu sintezu DNA-lanca i vee fluor na kraj molekule. Osnovna prednost ove metode jest to to se reakcija ne mora odvajati u etiri tubice. I kod te metode krajnja se detekcija zbiva tijekom elektroforeze, pri prolasku obiljeene sekvencije kroz polje djelovanja detektora. Ono to je bitno napomenuti jest injenica da se ovaj pristup testiranju nasljednoga materijala u forenzinoj DNA-analizi ponajprije primjenjuje u procesu ispitivanja mtDNA i njezinih hiper varijabilnih regija (sl. 1-11). S druge strane, analiza STR-molekularnih biljega ne zasniva se na utvrivanju redoslijeda baza unutar odabrane DNA-sekven-
cije. Sljedovi baza u ovim molekularnim biljezima dobro su poznati i nema potrebe da se pri svakoj analizi iznova potvruju, pa stoga analiza ovih biljega podrazumijeva utvrivanje broja ponavljanja odreene, prije opisane, kratke tandemski ponavljajue jedinice. Zbog toga se obiljeivanje ne radi diferencijalnim bojenjem svake baze, nego se to ini s cijelom poetnicom za odabrani STR-lokus. Alelna varijanta, zastupljena na danom lokusu pobuena laserom, fluorescira i tu fluorescenciju detektira sloena kamera analitikoga instrumenta. Za distinkciju pojedinih alelnih varijanti na jednom ili vie lokusa, danas se, premda neto rjee, mogu rabiti radioaktivni biljezi srebrne boje ili, bitno ee uporabljena, metoda fluorescentne detekcije tijekom elektroforetike separacije. Na osnovi ranije generiranog standarda (najee opisanoga kao alelne ljestve), matriksa i odreenog biljega koji se analizira usporedo s konkretnim uzorcima. Standard sadrava sve poznate alelne varijante u kavkazoidnoj populaciji na danom lokusu i omoguuje detekciju te analizu konkretne alelne varijante. U veini sluajeva radi se s vie STR-lokusa, od kojih se neki poklapaju po veliini i po zauzetoj poziciji na gelu. Da bi se izbjegle nedoumice, rabe se etiri, a u novije vrijeme i pet boja kojima se obiljeuju odabrani biljezi. Istom se bojom obiljeuju dovoljno udaljeni lokusi, tj. oni lokusi kod kojih je zbog velike razlike u njihovoj molekularnoj masi iskljueno preklapanje, a razliitim se bojama analiziraju lokusi iste veliine tako da je, i unato istom vremenu prolaska kroz detekcijski sustav, mogua njihova distinkcija zahvaljujui raznobojnom fluoresciranju alelnih varijanti podrijetlom iz razliitih lokusa. Dakle, zupci nakon raunalne obradbe, nisu pojedinane baze, nego alelne varijante, koje su pokazatelji koliko se puta poznata repetitivna jedinina sekvencija ponavlja. Samim
34
tim rije sekvenciranje, koja se esto u laboratorijskom argonu rabi za ovaj postupak, nije toliko prikladna kao izrazi detekcija ili, jo bolje, profiliranje.
1.13.2.
Pravila pri testiranju roditeljstva
1.13.
Genetika i statistika pravila u forenzinoj genetici
Razdioba (segregacija) roditeljskih genotipova u potomaka ovisi o kombinaciji alela u roditelja.
1.13.1.
Mendelovo nasljeivanje
Na temelju Mendelovih zakona sastavljena su etiri pravila za testiranje roditeljstva: 1. Dijete, osim ako se ne radi o mutaciji, ne moe imati biljeg (alel) koji nije prisutan kod jednog od roditelja. 2. Dijete mora naslijediti po jedan biljeg (alel) iz para genetikih biljega od svakog roditelja. 3. Dijete ne moe imati par istih genetikih biljega, osim u sluaju da oba roditelja imaju isti biljeg. 4. Dijete mora imati genetiki biljeg koji je prisutan kao istovjetan par u oba roditelja.
1.13.3.
Mendelovi zakoni nasljeivanja odreuju oekivanu razdiobu alela kod potomaka u razliitim sluajevima sparivanja. Mendelovo nasljeivanje sastoji se od triju zakona. Monohibridno krianje: ako se genetiki materijal oca koji je homozigot AA kria s genetikim materijalom takoer homozigotne majke koja je homozigot BB, svi e potomci biti heterozigoti, tj. AB. Razdvajanje/segregacija: u sluaju sparivanja dvaju heterozigotnih A1A2 roditelja, mogui su sljedei genotipovi: A1A1; A1A2 i A2A2 u omjeru 1 : 2 : 1. Ovaj primjer pokazuje da dolazi do razdvajanja (segregacije) lanova genskih parova tijekom mejoze, tako da 50% gameta nosi alel A1, dok drugih 50% gameta nosi alel A2. Neovisna segregacija: kada pojedinci koji se sparuju imaju vie od jednog lokusa koji podlijee segregaciji, onda su lokusi genetiki nevezani, tj. svaki se lokus odvaja neovisno o drugim lokusima. Prema tom zakonu, razdvajanje alela jednog lokusa neovisno je o razdvajanju alela drugih lokusa tijekom mejoze.
Hardy-Weinbergova ravnotea
Gregor Mendel opisao je ponaanje alela pri sparivanju. Slino tomu su Hardy i Weinberg 1908., neovisno jedan o drugome, opisali ponaanje alela u populaciji. HardyWeinbergov zakon opisuje oekivani odnos izmeu uestalosti alela i uestalosti genotipa na pojedinom lokusu [55], koji se dobije ekspanzijom binoma (p + q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1,00 p + q = 1,00 gdje su: p2 udio populacije homozigota za A1; q2 udio populacije homozigota za A2; 2pq udio heterozigota; p = relativna uestalost alela A1, q = relativna uestalost alela A2. Stoga je npr. zbroj () uestalosti triju alela (z1, z2 i z3) jednako: = z1z1 z2 z2 z3 z3 2 z1z2 2 z1z3 2 z2z3 = z12 z22 z32 2 z1z2 2 z1z3 2 z2z3 Primjerice, ako pretpostavimo da aleli Z1, Z2 i Z3 imaju uestalosti z1 z2 i z3, onda su ue-
35
stalosti homozigotnih genotipova Z1,Z1; Z2 Z2 i Z3Z3 jednake z1 z1, z2 z2, z3 z3, a uestalosti heterozigotnih genotipova Z1Z2, Z1Z3, i Z2Z3 jednake su 2 z1 z2, 2 z1 z3, i 2 z2 z3. Ako je Hardy-Weinbergova ravnotea ispravna, onda je uestalost alela na nekom lokusu u populaciji konstantna tijekom vremena. No, odstupanja od Hardy-Weinbergove ravnotee mogu nastati zbog nekoliko razloga, a ti su: 1. nesluajno formiranje reproduktivnih parova eliminira polazne uvjete za odravanje modela genetike ravnotee. U ljudskim populacijama se najee izraava kao inbreeeding (sparivanje genetiki bliskih jedinki) i outbreeding (sparivanje genetiki udaljenijih jedinki). 2. sroivanje (engl. inbreeding) zbog meusobne srodnosti roditelja koja moe dovesti do smanjenja heterozigotnosti; nasuprot tome, outbreeding poveava heterozigotnost matine populacije. 3. migracija gena iz jedne u drugu populaciju koja mijenja uestalosti i utjee na Hardy-Weinbergovu ravnoteu sve dok se ne postigne nova ravnotea; 4. mutacija ili promjena kod naslijeenih alela, koja moe utjecati na uestalosti alela; 5. prirodna selekcija koja moe dovesti do poveanja uestalosti nekog alela tijekom vremena. Djeca s takvim alelom imaju veu vjerojatnost za opstanak nego djeca s drugim alelima. Primjeri navedenog jesu deficijencija G6PD ili talasemija u malarinim podrujima; 6. izolacija zbog koje moe doi do remeenja oekivane uestalosti pojedinih alelnih varijanata sve zbog ograniena broja partnera koji sudjeluju u reprodukciji, tj. u formiranju genskoga fonda idue, generacije potomaka.
7. genetiko odstupanje (engl. drift), to oznauje sluajne promjene u genskoj uestalosti unutar neke, obino manje populacije, a javlja se u sluajevima kad u formiranju genskog fonda sljedeeg narataja ne sudjeluje kompletna matina populacija nego samo jedan njezin dio. Pod odreenim uvjetima pojedini aleli mogu u cijelosti nestati (gubitak alela) ili biti prisutni u svakog pojedinca unutar te populacije (fiksacija).
1.13.4.
Uravnoteeno vezivanje
Uravnoteeno vezivanje koncept je prema kojem e se, u sluaju kada se promatra vie lokusa, aleli na neovisnim lokusima raspodijeliti u populaciji prema zakonitostima Hardy-Weinbergove ravnotee. Kad su lokusi smjeteni u blizini na istome kromosomu, onda se nalaze u genskoj ravnotei. Premda populacije u kojima dolazi do mijeanja mogu dosei Hardy-Weinbergovu ravnoteu, geni smjeteni na istome kromosomu postiu ravnoteu s obzirom na gensku udaljenost i stupanj rekombinacije izmeu lokusa. S druge strane, u sluaju dviju populacija s razliitim lokusima iji aleli imaju znatno razliite uestalosti, za alele koji nisu genski vezani smatra se da su u statistikoj neravnotei vezivanja. Na populacijskoj je razini u praksi teko pokazati ovaj sluaj neravnotee. No, to je mogue pokazati kod specifinih pojedinaca koji su nedavno postali dijelom populacije.
1.13.5.
DNA-dokazni materijali u sudstvu
Prikaz znanstvenog dokaza u veini zemalja pripada podruju svjedoenja strunjaka (sudskog vjetaka). No injenica da je strunjak obavio testiranje ne znai da e takav
36
dokaz biti automatski prihvaen. U normalnim okolnostima mora se pruiti dokaz da je prikazani dokazni materijal pouzdan i da prua uporabljive informacije. Vijee Europe, odnosno Vijee ministara, izdalo je 10. veljae 1992., tijekom svog 470. sastanka, Preporuku br. 92 o uporabi DNA-analiza u okviru sudskog sustava [56]. Neke od najvanijih preporuka jesu sljedee: 1. Uzorci koji su prikupljeni za DNA-analizu i podatci dobiveni iz takve analize koja je provedena radi sudskog postupka protiv poinitelja kaznenih djela ne smiju se uporabiti za druge namjene. No, ako pojedinac od kojeg je uzet uzorak eli doznati rezultate DNA-testiranja, takvi mu se podatci mogu dati. 2. Uzorci koji su prikupljeni od ivuih pojedinaca za DNA-analize zbog medicinskih razloga i podatci dobiveni iz tih uzoraka ne smiju se rabiti za potrebe istrage i suenja za kaznena djela, osim u sluajevima koji su odreeni unutarnjim zakonodavstvom. 3. Bioloki uzorci i druga tjelesna tkiva, koji su uzeti za DNA-analize ne smiju se uvati nakon zavrne odluke u sluaju za ije su potrebe iskoriteni, osim ako je to potrebno za namjene koje su u izravnoj vezi s onima za koje su prikupljeni. U daljnjim poglavljima ove knjige primjena analize DNA u kaznenom i parninom postupku bit e detaljno prikazana.
1.13.6.
Dokazivanje oinstva (roditeljstva)
Potreba utvrivanja identiteta osoba ili oinstva postoji jo od biblijskih dana. I Salomon se susreo s tim problemom, kad su pred njega dole dvije ene s jednim djetetom, svaka tvrdei da je ona prava majka toga djeteta, i
traile ga da presudi. Uvidjevi da iz njihovih rijei nikad ne e razluiti koja govori istinu i pouzdajui se u injenicu da e prava majka uiniti sve da spasi svoje dijete, Salomon je predloio da se dijete rasijee napola te da se svakoj majci dade jedna polovica. U eni koja se estoko suprotstavila toj odluci Salomon je prepoznao pravu majku i dodijelio joj dijete [57]. Danas, u suvremeno opremljenim sudskomedicinskim laboratorijima utvrivanje oinstva provodi se mnogo bezbolnijim i uinkovitijim metodama zahvaljujui upravo razvoju DNA-tehnologije. Originalnost i vrijednost metode analize DNA usporeuje se s analizom otiska prsta (engl. finger-printing), zato to je i ovdje rije o jedinstvenom, genetikom otisku (profilu), koji je specifian za svakoga od nas. Osnovna je funkcija svih forenzinih testova, bez obzira na to je li rije o dokazivanju roditeljstva ili o identifikaciji, iskljuiti to je mogue vei broj pojedinaca. Pri testiranju roditeljstva to se ini tako da se odredi obvezni alel pa se testira nosi li navodni ili pretpostavljeni otac taj alel (za potrebe rjeavanja takvih sluajeva oevi koji se testiraju nazivat e se pretpostavljeni oevi) (58). Obvezni alel jest onaj alel koji vue podrijetlo od biolokog oca. Primjerice, ako pretpostavimo da je majka AA, a dijete AB, onda je djetetov B alel morao potei od biolokog oca. Uvijek se pretpostavlja da je majka uistinu majka djeteta, osim ako se pri testiranju pokae neslaganje s Mendelovim zakonima nasljeivanja. Ako navodni otac ima B alel u obliku homozigota (2 B alela) ili heterozigota (jedan B alel), on se ne moe iskljuiti. Ako navodni otac nije nositelj B alela, tj. dijete ga nije moglo od njega naslijediti, on moe biti iskljuen. Iznimka navedenog jest sluaj kad postoji relativno esta mutacija A u B. Zbog toga je opeprihvaeno da se tek u sluaju nepostojanja triju obvezatnih alela u oca, a koji se nalaze
37
kod djeteta, pretpostavljeni otac automatski iskljuuje kao bioloki otac djeteta. Ako su i majka i dijete AB, onda su obvezatni aleli A i B, te su oba alela, i A i B mogla doi od biolokog oca. Oito je da u ovom sluaju postoje dva obvezna alela. Svaki pretpostavljeni otac koji je nositelj A ili B alela ne moe biti iskljuen. No, ako je navodni otac CC ili bilo koji drugi ne-A ili ne-B genotip, moe ga se iskljuiti.
g(ih) alela. Stoga e PI biti ili 1/p ili 0,5/p, ovisno o broju obveznih alela koje nosi pretpostavljeni otac. Ako su prema genotipovima majke i djeteta odreena dva obvezna alela, p e se raunati prema sljedeoj formuli p = p1 + p2, a indeks oinstva ili PI e biti: PI = 1/(p1 + p2) ili PI = 0,5/(p1 + p2).
1.13.7.
Matematiki postupci i dokazivanje oinstva indeks oinstva ili kombinirani indeks oinstva
Ako pretpostavljeni otac nije iskljuen kao mogui bioloki otac, vrijednost dokaza jednaka je relativnoj vjerojatnosti da je navodni otac prenio na dijete obvezni alel u odnosu na nekog nesrodnog pojedinca iz populacije. Relativna vjerojatnost da je navodni otac prenio obvezni alel naspram vjerojatnosti da je obvezni alel prenio neki nesrodni pojedinac iz populacije naziva se indeksom oinstva (engl. paternity index ili PI). Indeks oinstva jest omjer vjerojatnosti, tj. omjer vjerojatnosti da je pretpostavljeni otac, a ne neki drugi pojedinac iz populacije, prenio obvezni alel. Mendelovi zakoni odreuju vjerojatnost ili mogunost da pretpostavljeni otac moe prenijeti gen. Ako je otac homozigot za obvezni alel ili ima oba obvezna alela, onda je vjerojatnost da je on prenio obvezni alel jednaka 1,0 (2/2). Ako otac ima samo jednu kopiju obveznog alela ili ako sadrava jedan od dvaju obveznih alela, onda je vjerojatnost da je on prenio obvezni(e) alel(e) jednaka 0,5 (1/2). Vrijednost PI za odreeni lokus jednaka je vjerojatnosti da pretpostavljeni otac moe prenijeti alel, podijeljenom s uestalou obvezno-
PI se rauna za svaki lokus koji se testira. Pravila teorije vjerojatnosti odreuju nain kombiniranja vie PI-ja kako bi se odredila kombinirana vjerojatnost oinstva. Ovaj izraz naziva se kombiniranim indeksom oinstva (engl. combined paternity index CPI). Kombinirani indeks oinstva jest omjer vjerojatnosti, tj. omjer vjerojatnosti da je pretpostavljeni otac, a ne neki drugi pojedinac iz populacije, prenio obvezne alele sa svih ispitivanih lokusa. Pravila za kombiniranje vjerojatnosti prilino su jednostavna. Ako elimo saznati kombiniranu vjerojatnost karakteristika A i B i C, onda je potrebno pomnoiti pojedinane vjerojatnosti A i B i C. Stoga je vjerojatnost da je pretpostavljeni otac prenio lokuse 1*A, 2*C i lokus 3*E na dijete jednaka umnoku vjerojatnosti 1*A2*C3*E. Jednostavno reeno, bez obzira na to koliko lokusa rabimo za analizu prijepornoga oinstva vrijednost ukupnoga indeksa oinstva (CPI) utvruje se mnoenjem svih izraunanih PIja, tj. izraunanih indeksa oinstva za svaki od promatranih lokusa. U poetku, kada se rabio relativno mali broj lokusa u ove svrhe (35 lokusa), vrijednost CPI koja je bila prihvatljiva, recimo za njemako pravosue bila je 1 000, dok je u Sjedinjenim Amerikim Dravama ta vrijednost mogla biti manja ak i od 100. Drugim rijeima u tim sluajevima CPI izraava injenicu da je pretpostavljeni otac 1000 ili 100 puta vjerojatnije bioloki otac nego neki drugi nesrodni mukarac iz iste populacije. U dananje vrijeme, pri uporabi, recimo, 15 STR-lokusa zastupljenih u najpoznatijim komercijalnim
38
kompletima reagensa (PowerPlex 16 ili Identifiler) nije nita neuobiajeno da se vrijednost CPI, u testiranju standardnoga oinstva (majka-dijete-potencijalni otac) kree u intervalu od nekoliko stotina tisua pa i do nekoliko milijuna, dok je u testiranju bezmajinskoga oinstva ova vrijednost neto nia. Bitno je napomenuti da fluktuacija ove vrijednosti ponajprije ovisi o uestalosti alela koje je bioloki otac prenio na sina. Budui da mnogi imaju tekoe s razumijevanjem i interpretacijom omjera vjerojatnosti, predloen je i alternativni nain pokazivanja podataka koji se zasniva na pretvaranju omjera vjerojatnosti u vjerojatnost oinstva.
1.13.7.1.
Vjerojatnost oinstva
U 18. stoljeu matematiar Bayes razvio je teorem kako bi procijenio vjerojatnost da se neki dogaaj zbio ak i tada kada nije mogue izravno izmjeriti taj dogaaj. Ovo je temelj Bayesove matematike koja ima iroku primjenu, posebice u podruju kao to je genetiko savjetovanje za procjenu opasnosti od obolijevanja djeteta. Bayesova formula za procjenu mogunosti da se odigra neki dogaaj jest: Hp H p + Y (1p) gdje je H vjerojatnost da e se neki dogaaj zbiti, Y je vjerojatnost da se ne e zbiti, p je prethodna vjerojatnost da e se H zbiti, a 1p je prethodna vjerojatnost da se ne e zbiti. Postoji nekoliko ogranienja Bayesove formule. Formula je sveobuhvatna, tj. ukljuuje sve mogunosti u prostoru. U sluaju testiranja oinstva, H je kombinirana vjerojatnost da je pretpostavljeni otac prenio sve obvezne alele i sastoji se od umnoka svih 0,5 i 1,0 vrijednosti za svaki lokus, a y je kombinirana vjerojatnost da je neki nesrodni pojedinac u populaciji bioloki otac i umnoak uestalosti svih obveznih alela. Prethodna
vjerojatnost jest vjerojatnost da se taj dogaaj mogao dogoditi bez poznavanja trenutanog rezultata. U ovom sluaju to je vjerojatnost da je pretpostavljeni otac bioloki otac prije nego to su gotovi laboratorijski rezultati. Postoje razliiti naini da se izrauna prethodna vjerojatnost da je pretpostavljeni otac ujedno i bioloki otac. Moe se pretpostaviti se da je to laboratorijska stopa ukljuenja koja je priblino 70%. Takoer se moe pretpostaviti da je to broj svih mukaraca koji se mogu uzeti u obzir unutar podruja gdje se dogodila oplodnja ili, tonije, mukaraca iz tog podruja, ali koji su u reproduktivnoj dobi. Uobiajeno je pretpostaviti da je ista vjerojatnost da pretpostavljeni otac jest ili nije bioloki otac. Ovo je tzv. neutralna prethodna vjerojatnost. Stoga je prethodna vjerojatnost jednaka 0,5. Neki statistiari tvrde da bi se prethodna vjerojatnost trebala raunati tako da se podijeli eljeni rezultat s ukupnim brojem moguih rezultata, npr. prethodna vjerojatnost da pri bacanju kocke dobijemo jedinicu (polovica para kocki) jednaka je 1/6, dok je poetna vjerojatnost da dobijemo glavu pri bacanju novia jednaka 1/2. Prigodom testiranja oinstva mogua su samo dva nalaza on jest ili nije bioloki otac poetna je vjerojatnost jednaka 1 za dvije mogunosti ili 0,5, to znai da je mogue da je neutralna poetna vjerojatnost mogua ispravna poetna vjerojatnost. Ako je vrijednost od 0,5 izabrana kao poetna vjerojatnost, formula se reducira na onu u kojoj se rabi CPI. Vjerojatnost prijenosa oinstva (engl. probability of paternity) (p = 0,5) = PP = 1/1 + (1/CPI) Kada se ova formula matematiki sredi i jednostavnije prikae dobiva se obrazac PP = CPI/(CPI + 1). Svim tuiteljima, sucima i odvjetnicima koji proitaju ovu formulu bit e jasno zato
39
onda nije mogue dobiti rezultat od 100%. Naime, bez obzira na to koliko velik bio broj CPI, uvijek se mora podijeliti s brojem koji je vei od njega za 1 i nikada taj kolinik ne e moi dati broj jedan, a samim tim u postotnom izraavanju vjerojatnosti oinstva nikada ne e moi dati 100%. Stoga, kada se dobije rezultat od, recimo, 99,999999678998% poprilino je nesuvislo pitanje, koje se, na alost, esto zna postaviti DNA-ekspertu: jeste li vi 100% sigurni da je dotina osoba bioloki otac djeteta? Dakle, vjerojatnost oinstva jest vjerojatnost da je pretpostavljeni otac bioloki otac djeteta. Stoga, ako je CPI hipotetiki jednak, recimo, 6 477 698, onda je vjerojatnost da je pretpostavljeni otac bioloki otac 0,999999846, ili 99,9999846% [6 477 698 / (6 477 698 + 1)]. Suprotno tomu, vjerojatnost da pretpostavljeni otac nije bioloki otac jest 0,000000154 ili 0,0000154%. Logino pitanje koje se moe postaviti jest, koja je najnia vrijednost vjerojatnosti oinstva pa da se ono moe u potpunosti prihvatiti. Uopena pravila upuuju na to da je u standardnom testiranju, kada je i majka prisutna, poeljno dobiti najmanje pet znamenki 9 nakon decimalnoga zareza, tj. 0,99999 ili, kada prikazujemo u postotcima, onda je minimalan uvjet 99,999%. U sluajevima bezmajinskoga oinstva, zbog gubljenja odreenoga dijela informacija, broj mora biti vei od 0,9999, tj. 99,99%. Ovako veliki postotak vjerojatnosti uvjetovan je primjenom veega broja molekularnih biljega, koji se u dananje vrijeme malokad sputa ispod broja 13. Veliki broj laboratorija, bez obzira na to je li utvreno poklapanje alelnih varijanti oca s obveznim alelima na svim ispitivanim lokusima, u sluaju kada ne dobiju ovakve vrijednosti sugeriraju analizu dodatnih molekularnih biljega.
1.13.7.2.
Neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji (random man not excluded ili RMNE)
Indeks oinstva (PI) i vjerojatnost oinstva (PP) imaju zajedniku pretpostavku s Mendelovom vjerojatnou da je pretpostavljeni otac ujedno bioloki otac djeteta. Da bi se na drukiji nain procijenio isti podatak, mogue je zapitati se kolika je koliina genetike informacije prisutna u paru majka-dijete, tj. kolika je mogunost testa pri prevenciji pogrjenog ukljuenja pretpostavljenog oca. Ovo je slino pojmu snaga testa u statistici. U idealnoj situaciji test bi trebao biti i snaan i praktian te bi trebao iskljuiti sve lano optuene pretpostavljene oeve. Danas se u svijetu metodom analize DNA, stalno iskljuuje oko 30% optuenih pretpostavljenih oeva [59]. Snaga testa oinstva moe se odrediti s pomou tzv. neiskljuenosti sluajne osobe u opoj populaciji (engl. random man not excluded RMNE). Ovaj statistiki test se moe usporediti s raunanjem uestalosti u populaciji, koje se primjenjuje u forenzinim identifikacijama (v. dalje u tekstu). RMNE je udio populacije koji moe dati sve obvezne alele te ne moe biti iskljuen. Ovaj se termin rabi kako bi se izrazila uestalost osoba koje ne mogu biti iskljuene kao mogui davatelji genetikog materijala. Formula za RMNE za jedan lokus jest: p2 + 2p(1p) ili, pojednostavnjeno, 1(1p)2. Kombinirana neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji (engl. combined random man not excluded ili CRMNE) analogna je CPI-u, tj. jednaka je umnoku pojedinanih vrijednosti. Vrijednost CRMNE obino je vrlo niska. Ipak, jednostavnije je upotrebljavati recipronu vrijednost izraza (1CRMNE), za koju se obino rabi termin vjerojatnost iskljuenja. No, budui da je mogue pomijeati pojam vjerojatnost iskljuenja s pojmom vjerojatnost oinstva, rabi se manje zbunjujui
40
pojam snaga iskljuenja (engl. exclusionary power (EP) ili power of exclusion (PE)). EP ili PE je vjerojatnost iskljuenja lano optuenog mukarca (1CRMNE). U sluaju da se upotrebljava a priori vjerojatnost 0,5, PE je jednak Bayesovoj vjerojatnosti oinstva u tzv. modelu neiskljuenja. Da bi se izbjeglo mijeanje s pojmomvjerojatnost oinstva koji proizlazi iz modela nasljeivanja, treba se koristiti pojmom neiskljuena vjerojatnost oinstva ili Weinerova vjerojatnost oinstva po znanstveniku koji je pr vi predloio taj pojam 1976. godine [60]. Pojam neiskljuena vjerojatnost oinstva ima neke prednosti u odnosu na standardnu vjerojatnost oinstva [61]. Najvea prednost ove metode jest ta da se ona uvijek poveava poveanjem broja izvrenih testiranja i potpuno je analogna pojmu populacijska uestalost, koji se rabi u forenzinim identifikacijama. Vjerojatnost oinstva (pojam koji se tradicionalno rabi za vjerojatnost oinstva s obzirom na prijenos alela) moe se smanjiti ako je pretpostavljeni otac heterozigot, a majka i dijete nose isti heterozigotni genotip koji sadrava dva uobiajena alela, gdje je p1 + p2 vei od 0,5. Tablica 1-1. prikazuje ope obrasce koji se rabe u utvrivanju oinstva, dok tablica 1-
2. prikazuje konkretan primjer utvrivanja. etvrti stupac u tablici 1-2. prikazuje sve obvezne alele kod pretpostavljenog oca. Stupac p oznauje uestalost svakoga pojedinog alela koja je temeljena na hr vatskoj bazi podataka [62]. RMNE se rauna po prije navedenoj formuli. X oznauje vjerojatnost da pretpostavljeni otac (engl. alledged father) moe prenijeti obvezatni alel, a odreuje se prema oevom tipu alela (ako otac ima samo jednu kopiju obveznog alela ili ako sadrava jedan od dvaju obveznih alela onda je vjerojatnost (X) da je prenio obvezni alel jednaka 0,5). PI se rauna kao X/p ili u sluaju kad se radi o dva obvezatna alela na istome lokusu kao X/(p1 + p2). Iz zajednikih vrijednosti prikazanih na donjem dijelu tablice vidljivo je da je vjerojatnost navodnog oca gotovo 790 milijuna puta vea od nekoga drugog nesrodnog mukarca u uzorku hr vatske populacije. Ta se vrijednost oznauje kao vjerojatnost od 99,99999987% utvrenog oinstva. RMNE pokazuje da vjerojatnost da se iskljui krivo optueni otac iznosi 99,99999973%. Stoga je, u ovom sluaju, vjerojatnost utvrivanja oinstva temeljena na prijenosu alela, priblina vjerojatnosti temeljenoj na metodi neiskljuivanja.
Tablica 1-1. Formule za raunanje indeksa oinstva (detaljnije na www.DNA-view.com) Aleli djeteta AA AB AA AB AA AA AB AB AB Aleli majke AB BC ili BB AA BB ili BC AB AA AB AB AB Aleli oca AA AA AA AC ili AB AB ili AC AB AB AA AC PI 1/a 1/a 1/a 1/2a 1/2a 1/2a 1/(a+b) 1/(a+b) 1/2(a+b)
A ,B, C aleli; a, b, c uestalost alela A, B, C
41
Tablica 1-2. Primjer potpuna utvrivanja oinstva STR-lokusi D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1P0 D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 VWA TPOX D18S51 D5S818 FGA Amelogenin Zajedniki (combined) Snaga 1CRMNE iskljuivanja Vjerojatnost 1/CRMNE (likelihood) Vjerojatnost CPI/ oinstva CPI+1 Majka 13, 14 30, 32.2 10, 12 12, 12 15, 15 6, 9.3 8, 10 9, 11 17, 18 14.2, 16 15, 16 8, 9 16, 17 11, 12 20, 21 XX Dijete 11, 13 Obvezni Pretpostap(Y) alel vljeni otac 11 11, 13 30,.2 31 9, 9 10, 12 15, 18 6, 8 11, 11 9, 13 23, 25 12, 13 17, 17 8, 9 14, 15 11, 12 20, 25 XY 2,67 109 99,9999997% 374 531 835 99,99999973% 99,99999987% 790 169 857 0,0564 0,0590 0,1795 0,2538 0,1487 0,1308 0,3308 0,1718 0,1026 0,2128 0,2256 0,0846 0,1359 0,3256 0,1000 RMNE 0,1096 0,1145 0,3268 0,4432 0,2753 0,2445 0,5522 0,3141 0,1947 0,3803 0,4003 0,1620 0,2533 0,5452 0,1900 X
PI
0,5 8,8652 0,5 8,4746 1 5,5710
31, 32.2 31 9, 10 10 ,12 15, 18 6, 8 10, 11 11, 13 17, 23 13, 16 16, 17 9, 9 15, 17 11, 11 20, 25 XY 9 10 18 8 11 13 23 13 17 9 15 11 25
0,5 1,9701 0,5 3,3625 0,5 3,8226 1 3,0230
0,5 2,9104 0,5 4,8733 0,5 2,3496 1 4,4326
0,5 5,9102 0,5 3,6792 0,5 1,5356 0,5 5,0000
p(Y) uestalost alela za svaki pojedini alel ili obvezni alel temeljen na hrvatskoj bazi podataka [62] RMNE neiskljuenost sluajno odabrane osobe iz ope populacije X vjerojatnost da pretpostavljeni otac moe prenijeti obvezni alel PI indeks oinstva
1.13.7.3.
Bezmajinsko testiranje oinstva

makoj se to oznauje kao bezmajinski ili deficijentni test (engl. deficient test) jer nisu
Povremeno je potrebno utvrditi oinstvo, a da majka nije dostupna za analizu. U Nje-
42
prisutne sve stranke. U tom sluaju dolazi do znatnoga gubitka informacija. Formula koja se rabi za raunanje uestalosti moguih oeva u danoj populaciji jest sljedea: RMNE = p2+q2+2pq+2p(1-p-q)+2q(1-p-q) = (p+q)2+2(p+q)(1-p -q). Sukladno tomu, PI se razliito rauna. Ako jedan od roditelja nedostaje, rabi se posebna formula za svaki pojedinani fenotip navodnog roditelja. Formule preuzete od Brennera [63] i dodatno proirene na osnovi podataka s www.DNA-view.com prikazane su u tablici 1-3. Da bismo pokazali gubitak informacija, kao i razlike u rezultatima, sluaj utvrivanja oinstva prikazan u tablici 1-2. ponovno je raunan bez podataka o majci koristei se pri tome primjerenim formulama iz tablice 1-3. Rezultati su prikazani u tablici 1-4. Pr vo to se moe zamijetiti jest da snaga iskljuivanja pada priblino 20 525 puta, dok CPI pada samo oko 760 puta, to dovoljno ilustrativno upuuje na razlike izmeu dviju metoda za raunanje vjerojatnosti utvrivanja roditeljstva. Znatno manji gubitak informacija u sluajevima, koji bitno dobiva na znaenju poveanjem broja molekularnih biljega, koji se rabe u analizi, jedan je od najvanijih razloga zato se mnogo ee primjenjuje CPI od
RMNE pristupa. Osim toga, prednost ovoga pristupa jest izuzetno jednostavna prezentacija rezultata koja se zbog izbjegavanja kompliciranih statistikih pojanjavanja na sudu, lako moe u potpunosti jasno prezentirati i pojasniti ak i osobama koje nemaju veliko znanje iz populacijske genetike i statistike. Jedno od otvorenih, ali vrlo bitnih pitanja jest i potencijalno pojavljivanje mutacija, koje uvjetuju da na jednom, ali katkada ak i na dvama molekularnim biljezima dolazi do nepoklapanja DNA-profila potencijalnoga oca, s utvrenim kompletom obveznih alela. To upuuje na injenicu da se, ako je od npr. testiranih 15 molekularnih biljega na jednom od njih opaeno neuklapanje alelnih varijanti, oinstvo/majinstvo ne moe automatski odbaciti. Tada se primjenjuju komplicirani statistiki obrasci (o kojima se vie moe doznati na www.DNA-view.com) koji uzimaju u obzir uestalost pojavljivanja mutacija na konkretnome lokusu. Nakon toga rauna se vjerojatnost oinstva koja, prema iskustvu najveega broja laboratorija, u sluajevima standardnoga testiranja oinstva, kako je ve navedeno, treba prelaziti vrijednost od 99,999%, dok u sluajevima bezmajinskoga testiranja oinstva treba prelaziti 99,99%. Kada se to ne dogodi, a postoji vjerojatnost da
Tablica 1-3. Formule za raunanje indeksa oinstva ili majinstva u odsutnosti drugog roditelja (detaljnije na www.DNA-view.com) Aleli djeteta AA AB AA AB AB
A, B, C aleli; a, b, c uestalost alela A, B, C
Aleli testiranoga roditelja AA AA AB AB AC
PI 1/a 1/2a 1/2a a+b/4ab 1/4a
43
Tablica 1-4. Primjer bezmajinskoga utvrivanja oinstva STR-lokusi D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1P0 D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 VWA TPOX D18S51 D5S818 FGA Amelogenin Zajedniki (combined) Snaga iskljuivanja Vjerojatnost (likelihood) Vjerojatnost oinstva 1CRMNE 1/CRMNE CPI/CPI+1 Dijete 11, 13 31, 32.2 9, 10 10, 12 15, 18 6, 8 10, 11 11, 13 17, 23 13, 16 16, 17 9, 9 15,17 11, 11 20, 25 XY Pretpostavljeni Zajedniki aleli p(Y) otac 11, 13 30.2, 31 9, 9 10, 12 15, 18 6, 8 11, 11 9, 13 23, 25 12, 13 17, 17 8, 9 14, 15 11, 12 20, 25 XY 1,61 104 99,9839% 6170 99,983795% 99,9997808% 11, 13 31 9 10, 12 15, 18 6, 8 11 13 23 13 17 9 15 11 20, 25 0,0564 0,3487 0,0590 0,1128 0,1795 0,2590 0,2538 0,3538 0,1487 0,2538 0,1308 0,2641 0,3308 0,0615 0,1718 0,2795 0,1026 0,2154 0,2128 0,0641 0,2256 0,2205 0,0846 0,0846 0,1359 0,0897 0,3256 0,3256 0,1000 0,1231 RMNE 0,6461 0,3141 0,6847 0,8460 0,6430 0,6338 0,6307 0,6990 0,5348 0,4772 0,6932 0,3097 0,4003 0,8784 0,3965 PI 5,1496 4,2373 2,7855 1,6916 2,6663 2,8580 1,5115 1,4552 2,4366 1,1748 2,2163 5,9102 1,8396 1,5356 2,5000
826 693
p(Y) uestalost alela za svaki pojedini alel ili obvezni alel temeljen na hrvatskoj bazi podataka [62] RMNE neiskljuenost sluajno odabrane osobe iz ope populacije PI indeks oinstva
44
je rije o mutacijama, uobiajeno je zatraiti dodatno testiranje na Y ili X (u ovisnosti o spolu djeteta) vezanim biljezima. Bitno je napomenuti da se poveanjem broja biljega koji se rabe u ovim analizama poveava i vjerojatnost da se neka od mutacija na njima ustanovi. Ipak, ovakvi sluajevi nisu previe esti i u razliitim zemljama ih razliito tretiraju. U veini sluajeva dovoljna su vie od dva takva nepoklapanja pa da se testirana osoba automatski iskljui kao bioloki roditelj djeteta (engl. two exclusion rule) [52].
1.13.7.4.
Utvrivanje majinstva
poklapajueg rezultata. 1/CRMNE ujedno je i Bayesova vjerojatnost utvrivanja majinstva. Nasuprot tomu, mogue je izraunati indeks majinstva temeljen na prijenosu alela, slino kao prije prikazan PI, te ga pretvoriti u Bayesovu vjerojatnost. Dakle, u sluaju nedostatka informacija o ocu, indeks majinstva se rauna po formulama prikazanima u tablici 1-3., a princip je u potpunosti identian principu iz tablice 1-4., samo se utvrene alelne varijante u djetetovu DNA-profilu usporeuju s alelnim varijantama u majinskome DNA profilu.
1.13.7.5.
Kadto se postavlja pitanje tko je majka naputenog ili preminulog djeteta. U ovom sluaju, za razliku od utvrivanja oinstva, nema spoznaje o roditeljima djeteta. Stoga je, kao kod drugih forenzinih dokaza, genetiki profil djeteta dokaz. Ako je dijete na odreenom lokusu heterozigot, tada postoje dva obvezna alela. Nasuprot tomu, kada je dijete homozigot, postoji samo jedan obvezan alel. Formula koja se rabi za raunanje RFNE, to oznauje pojam neiskljuenost sluajno odabrane ene iz ope populacije (engl. random female not excluded RFNE) ista je onoj za raunanje RMNE ako nema informacija o majci. Majka se iskljuuje iz daljnje analize ako nema ni jedan od dvaju alela koje ima dijete. No majka se ne moe iskljuiti ako ima samo jedan od dvaju djetetovih alela. Ukoliko se ovaj rezultat pokae za sve lokuse, navodna se majka ne moe iskljuiti. Kombinirana neiskljuenost sluajno odabrane ene iz ope populacije (engl. combined random female not excluded CRFNE) jest umnoak svih pojedinanih RFNE i prikazuje postotak ena u populaciji koje ne mogu biti nasumino iskljuene ili mogu biti lano ukljuene. Suprotno je 1/CRMNE koji prikazuje broj ena koje moraju biti testirane kako bi se dolo do
Raunanje roditeljstva prema strukturi mijeanih populacija
Za raunanje indeksa roditeljstva uobiajeno je koristiti se uestalostima pretpostavljenih oeva ili majki u nekoj populaciji. Ako pretpostavljeni otac ili majka vuku podrijetlo iz dviju mijeanih populacija, npr. hr vatske i subsaharske Afrike, tada bi p-vrijednost, ukoliko je mogue, trebala oznaivati njihovu prosjenu uestalost. S druge strane, ako je pretpostavljeni roditelj Talijan, a jedina dostupna baza podataka jest ona u Hr vatskoj, to ne e drastino utjecati na rezultate. Ovisno o konkretnom sluaju, rauna se RMNE ili RFNE. U stvarnosti, gotovo su sve ljudske populacije u odreenoj mjeri mijeane. Aleli specifini za srednju Aziju, sjevernu Aziju i Afriku mogu se nai i u europskim populacijama zbog gena koje su tijekom povijesti donijeli Mongoli i Avari, kao i zbog mnogobrojnih afrikih robova. Za takve povijesne dogaaje nije potrebno raditi nikakve posebne prilagodbe jer e oni biti vidljivi u samom uzorku neke ispitivane populacije. Ako je osoba koju testiramo turist, npr. iz Portorika, bilo bi vrlo poeljno, ako je mogue, koristiti se bazom
45
podataka iz te zemlje. No, ako specifina baza podataka nije dostupna, tijekom analize moe doi do odreene pogrjeke. Ukoliko je poznata struktura istraivane populacije, uestalost se moe raunati primjenom proporcionalno korigirane uestalosti pripadajuih subpopulacija. Upravo zbog tih razloga, danas asopisi poput Forensic Science International, Journal of Forensic Science, Internal Journal of Legal Medicine, ali i Croatian Medical Journal esto objavljuju populacijske podatke za veliki broj svjetskih populacija. Ovakav pristup omoguuje da se usporednom analizom ustanovi postoje li statistiki znaajne razlike izmeu ispitivanih populacija, te da se omogui to preciznije izraunavanje pojedinih forenzino -genetikih parametara.
1.13.8.
Identifikacija ljudskih ostataka
Za identifikaciju ljudskih ostataka dostupne su razliite metode. Ovisno o okolnostima, kao i o stanju ljudskih ostataka, najee se primjenjuje izravno prepoznavanje rtve od bliskog roaka, ili se rtva identificira s pomou oiljaka ili nekih drugih tjelesnih znakova (tetovae), otisaka prstiju (ako postoje), zuba te DNA-analize. Tijekom rata identifikacija rtava je oteana, jer je esto velik broj tijela pokopan u zajednikim grobnicama, a i prae mortem podatci nisu uvijek dostupni [64]. Razvoj novih tehnologija analize genomske (kako autosomne, tako i spolne) i mitohondrijske DNA pruio je forenziarima novo orue za identifikaciju. tovie, DNA-analiza je postala metoda koja se rabi kao potvrda/opovrgnue dobivenih rezultata prethodnih analiza, ak i u sluajevima kada je stupanj prepoznatljivosti i mogunosti identificiranja tijela relativno dobar.
Prije same DNA analize najee se odreuje starost uzorka koritenjem radioaktivnih izotopa ugljika, tzv. 14C metoda datiranja. Zbog brzog raspadanja mnogih tijela pronaenih u ratu ili u masovnim katastrofama forenziari se za identifikaciju rtava sve ee slue analizom DNA iz kotanih ili zubnih ostataka [65]. Uzorci kostiju dulje e se odrati zbog svoje trajnosti. Nekoliko autora naglauje kako su za vei postotak uspjene identifikacije od velike vanosti metode izdvajanja DNA koje prethode samoj amplifikaciji DNA [6669]. Nadalje, istie se kako je analiza mtDNA najbolji izbor ako se radi s veoma degradiranim materijalom. Meutim, primjenom izmijenjenih standardnih postupaka izdvajanja DNA te proiavajui izoliranu DNA (repurification) s NAOH ili nekim drugim kemikalijama, utvreno je da uspjenost identifikacije putem genomske DNA moe dosei vrijednosti vie od 96% [70-74]. Takoer je zamijeeno da analize zubnih ostataka u usporedbi s rezultatima analiza dugakih kostiju daju bolje rezultate u 20 do 30% svih analiziranih sluajeva [71].
1.13.8.1.
Identifikacija rtve putem roditelja
U prethodnom dijelu teksta govorili smo o identifikaciji oca ili majke ive osobe. Sad emo govoriti o identifikaciji ostataka, koja je takoer mogua ako su ili roditelji ili djeca pretpostavljene rtve dostupni za testiranje. Katkad je, da bi se utvrdio identitet rtve, nuna rekonstrukcija. U pr vome sluaju imamo nestalu osobu za koju se pretpostavlja da je mrtva, no tijelo jo nije pronaeno (npr. u neijem su stanu pronaeni tragovi kr vi, osoba je nestala, a tijelo nije pronaeno). Pripadaju li tragovi kr vi pronaeni na pretpostavljenom mjestu zloina osobi koja je tamo ivjela i iji su nam roditelji dostupni? U drugom sluaju imamo pronaene ljudske ostatke, zbog uboj-
46
stva ili iz masovne grobnice, koji se ne mogu identificirati ni na koji drugi nain, osim putem genetikih analiza. U postupku identifikacije ostataka raunanje je neto drukije od onog pri utvrivanju oinstva. U ovom je sluaju umjesto utvrivanja uestalosti jednog obveznog alela u populaciji moguih oeva ili majki (RMNE ili RFNE) nuno odrediti uestalost jednog zajednikog alela kod svakog od roditelja. Ako se vratimo natrag do pravila o zbrajanju vjerojatnosti, vjerojatnost pronalaska jednog roditelja s alelom A i drugog s alelom B, jest uestalost moguih roditelja s alelom A pomnoena s uestalou moguih roditelja s alelom B. U praksi, to se dobiva tako da se prikupe RMNE/RFNE za svaki pojedini alel, to se zatim pomnoi s odreenim RMNE za pr vi alel, pomnoenim s RFNE za drugi alel kako bi se dobila vjerojatnost za dva roditelja koji imaju te iste alele. Takva se metoda naziva neiskljuenost sluajno odabranih roditelja iz ope populacije (engl. random parents not excluded RPNE). Stoga formula za raunanje RPNE za bilo koja dva alela, neovisno o tome jesu li slini ili razliiti, glasi (p2 + 2p[1 p])(q2+2q[1q]). Na primjer, koristei se lokusom D3S1358 te uzorkom tipa D3S1358 15,17 s uestalou od 0,2425 i 0,1875 za svaki alel, vjerojatnost pronalaska dvaju roditelja, i to jednog s alelom D3S1358*15, a drugog s alelom D3S1358*17 iznosila bi: (0,24252 + 2 0,2425 0,7575) (0,18752 + 2 0,1875 0,8125) = = 0,4262 0,3398 = 0,1448. Prema tome, 14,5% roditelja u Hr vatskoj ne bi bilo iskljueno kao mogui oevi. S druge strane, 85,5% roditelja u Hrvatskoj bilo bi iskljueno ovim jednostavnim testom. Mnoenjem svih RPNE neke osobe, stvaraju se kombinirani RPNE ili CRPNE (engl. combined parents not excluded) generirajui tako relativnu ue-
stalost ili postotak populacije moguih roditelja. Slino tomu, vjerojatnost roditelja koji nisu iskljueni iz analize jest 1/CRPNE. Bayesova vjerojatnost roditeljstva, koristei se metodom neiskljuivanja i a priori odreenom vjerojatnou od 0,5, iznosi 1CRPNE. Identifikacije ostataka pronaenih u Hrvatskoj i Bosni realizirane su i prije nego su STR-tehnike postale dostupne [72]. U tom se sluaju populacija moguih roditelja raunala za svaki pojedini alel, to znai da su aleli prikazani u koloni RMNE meusobno pomnoeni i na taj se nain dobio RPNE za svaki lokus. Tadanji su se podatci temeljili na analizi DQA1 i Polymarkera koji su manje informativni od STR-a [61,73,75,76], pa su i vrijednosti nie od onih prikazanih na prethodnim tablicama. U ovom sluaju, samo 0,4% parova u Hr vatskoj mogu biti mogui roditelji pronaenih rtava, odnosno 99,62% parova bilo bi iskljueno iz daljnje analize. To znai da je vjerojatnost otprilike 260 prema 1 da su neki od parova roditelji pronaenih rtava, odnosno da postoji 99,62% vjerojatnosti za utvrivanje roditelja metodom neiskljuivanja.
1.13.8.2.
Identifikacija rtve putem djece
Ako je nestala osoba otac ija su djeca dostupna, identifikacija se obino provodi prema gore navedenom postupku. U tablici 1-5. prikazani su podatci identifikacije NN za kojeg se pretpostavlja da je otac djeteta. Okolnosti su mnogo pogodnije kada je dostupna i majka. Testiranje majke i djeteta pokazuje da bi 99,9969% mukaraca u Hrvatskoj bilo iskljueno iz analize, ali pronaeni ostatci NN nisu bili iskljueni. Raunanje SI i PI upuuje na to da je za NN otprilike 45 000 puta vjerojatnije da jest otac djeaka od nekoga drugog mukarca, tonije, vjerojatnost da je rije o djeakovu ocu iznosi 99,9978%. Metodom neiskljuivanja utvreno je da je vjerojatnost
47
Tablica 1-5. Identifikacija rtve putem djeteta Lokusi Supruga Dijete Obvezni Ostatci p(Y) alel NN RMNE X PI
D3S1358
TH01
16, 17 9, 9.3
15, 17 15 7, 9 7
15, 18 6, 7
0,280 0,110
0,4816 0,2079 0,4598 0,3838 0,2256 0,0494 0,1444 0,2344 0,5644 0,5710 0,3680 0,3680 0,5710 0,8151 0,2860
0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 1 1 1
1,7857 4,5455 1,8868 4,6512 4,1667 20,0000 6,6667 4,0000 1,4706 2,8985 2,4390 2,4390 2,8985 1,7544 6,4516
D21S11
D18S51 PENTA E D5S818 D13S317 D7S820
29, 32.3 29, 29 29

11, 13 7, 14 13, 14 14
29, 31.2 0,265 14, 14 11, 14 9, 12 8, 13 9, 12 11, 12 12, 12 12, 16 16, 17 13, 13 8, 8 21, 21
XY
0,215 0,120 0,025 0,075 0,125 0,340 0,345 0,205 0,205 0,345 0,570 0,155
11, 14 11 9, 11 9
11, 14 11, 12 10, 10 9, 14 11, 12 12, 14 14, 17 12, 14 11, 11 22, 24
12, 13 13 10, 12 12 9, 11 11
D16S539 CSF1P0 PENTA D VWA D8S1179 TPOX FGA
12, 12 12 12, 12 12 14, 16 16 12, 13 13 8, 11 8
21, 24 21 XX
Amelogenin X X
Zajedniki (combined)
3,87 108
1-CRMNE
131 684 602
Snaga iskljuivanja Vjerojatnost (likelihood) Vjerojatnost oinstva
99,9999961%
1/CRMNE
25 839 793
CPI/CPI+1
99,99999613%
99,99999924%
p(Y) uestalost alela za svaki pojedini alel ili obvezni alel temeljen na bosanskoherceovakoj bazi podataka [78] RMNE neiskljuenost sluajno odabrane osobe iz ope populacije X vjerojatnost da pretpostavljeni otac moe prenijeti obvezni alel PI indeks oinstva
48
gotovo 32 000 prema 1, odnosno vjerojatnost za utvreno oinstvo je 99,998%. Dvije se metode meusobno podudaraju i prilino je sigurno da su pronaeni ostatci djeakova oca. Lako se moe primijetiti da je ova tablica bazirana na uporabi samo 9 STR-lokusa i frekvencijama koje nisu u potpunosti dobar prikaz stanja na terenu. Takav je pristup namjerno osmiljen da pokae koliko su se jaki rezultati, i unato svim nedostatcima, koji su bili rjeavani u hodu, dobivali tijekom proteklih gotovo 15 godina u projektu DNA-identifikacije, te da upozori na to da ak i kad se dobije parcijalni rezultat (jer nije neuobiajeno da se od ukupno 15 ispitivanih lokusa skeletni ostatak moe isprofilirati na samo 910 lokusa) statistiki zadovoljavajua identifikacija moe se realizirati. Identifikacija rtava Domovinskoga rata u Hr vatskoj bio je jedan od najveih znanstvenih izazova, ne samo za hr vatske nego i svjetske forenziare. Iskustva steena u ovome projektu, kao i u slinome projektu koji je realiziran u Bosni i Hercegovini, pod koordinacijom Internacionalne komisije za nestale osobe, nala su svoju primjenu irom planeta. Jedan od vrlo zanimljivih projekata ija je prva faza zavrena bila je i identifikacija rtava iz masovne grobnice u Sloveniji nastale na kraju Drugoga svjetskoga rata [77]. Uspjenost tih analiza budi nadu da e u skoroj budunosti ova metoda donijeti identitet mnogim rtvama tog sukoba koje su stradale u ratnim, ali i u poratnim godinama toga svjetskoga rata.
1.13.9.
Utvrivanje roditeljstva nasuprot forenzinoj identifikaciji
U utvrivanju roditeljstva uestalost moguih roditelja odreena je uestalou RMNE ili populacijom moguih davatelja alela. U forenzinoj identifikaciji odgovarajua je populacijska statistika uestalost moguih davatelja fenotipova (genotipova) [58]. U tablici 1-6. prikazana je usporedba rezultata utvrivanja roditeljstva (RMNE = (p + q)2 + 2(p + q)(1 p q)) i rezultata forenzine identifikacije (2pq). U tom je sluaju populacija davatelja (RMNE) priblino sedam puta vea od uestalosti dobivene forenzinom identifikacijom. Dakle, na jednom je lokusu gotovo itav red veliine razlike izmeu dvaju naina identifikacije. Procjene u tablici 1-6. temelje se na heterozigotnom fenotipu. Da su rezultati homozigotni za procjenu Hardy-Weinbergove ravnotee sluio bi p2, pod pretpostavkom da nema znatnog odstupanja od Hardy-Weinbergove ravnotee zbog substrukturiranja populacije ili nekih drugih dogaaja. U SAD-u, National Research Council preporuuje da se substruktuirajua korekcija dodaje svim populacijama kako bi se ouvala, pa ak i onima kod kojih substrukturiranje nije primijeeno, kao npr. u Hr vatskoj. U tom sluaju, za procjenu Hardy-Weinbergove ravnotee rabi se p2 + p(1p) (0,01). Na primjeru u tablici
Tablica 1-6. Usporedba raunanja populacijskih frekvencija u sluaju utvrivanja oinstva nasuprot forenzinim identifikacijama na lokusu RMNE (oinstvo) Alel Uestalost 15, 17 (p+q)2+2(p+q)(1pq) 0,6751 p(15) = 0,2425, q(17) = 0,1875 Forenzini dokazi 15, 17 2pq 0,0909
49
1-6., ako se radi o materijalu D3S1358 15, procjena za Hardy-Weinbergovu ravnoteu bila bi 0,242552 + 0,2425 0,7575 0,01 = 0,0606. RMNE za homozigotnu osobu iznosi p2 + 2p(1p). U primjeru na tablici 1-6. RMNE je 0,24252 + 2 0,2425 0,7575 = 0,4262. No, kako je ve navedeno, ova se korekcija rjee primjenjuje u relativno malim i nestrukturiranim populacijama, kakva je hrvatska. Vidljivo je da je mnogo lake individualizirati pojedini dokaz nego roditelja. Posljednji je korak ujediniti sve individualne mjere kako bi se dobila uestalost multigenotipske vrste ili profila. To se postie mnoenjem uestalosti genotipa svakoga pojedinog lokusa.
1.13.10.
Forenzina identifikacija
Cilj je forenzine identifikacije usporediti trag (krv, tjelesna tekuina ili tkivo) sa rtvom ili osumnjienom osobom. Unutar odreene populacije svaka osoba ima jedinstven genetiki zapis i, osim u sluajevima identinih blizanaca (identini blizanci prema dananjim spoznajama imaju u velikom dijelu genoma potpuno identinu DNA), DNA uvijek nedvojbeno povezuje pronaeni trag i osumnjienika. Kada se dokazni materijal i mogui davalac podudaraju, rauna se i vjerojatnost podudaranja kako bi se dobila dodatna teina dokaznog materijala. Primjerice, neko se u sluajevima spolnog zlostavljanja rabio AB0 sustav krvnih grupa. Ako rtva ima krvnu grupu 0, a dokazni materijal pripada krvnoj grupi A, tada i osumnjieni mora imati krvnu grupu A. Ako dotina osoba doista ima krvnu grupu A, tada ne moe biti iskljuena iz popisa osumnjienih. Je li ta informacija korisna i slui li u pravnome smislu kao dokaz? S obzirom na to da priblino 40% pripadnika europskih populacija pripada kr vnoj grupi A, takva informacija i nije previe korisna. Kada je rije o DNA-analizama,
samo se maleni dio populacije moe sluajno podudarati. Pri utvrivanju srodstva uestalost davatelja alela znaajna je vrijednost. Pri identifikaciji se rabi statistika koja se zasniva na oekivanoj uestalosti genotipa. Kao to je ve spomenuto, oekivane uestalosti genotipa odreene su Hardy-Weinbergovom ravnoteom. U forenzinoj identifikaciji mogu se primjenjivati dva osnovna pristupa u priopivanju rezultata: pr vi podrazumijeva priopivanje rezultata u formi prikazivanja uestalosti utvrenoga DNA-profila u konkretnoj populaciji [52]. Tako se u krajnjoj formulaciji moe pojaviti podatak da je frekvencija utvrenoga DNA-profila unutar hr vatske populacije npr. 1,33 109. Ovakva formulacija jasno i uistinu precizno moe prikazati rezultate u matematikome smislu, no na sudovima se mnogo ee rabi pojam vjerojatnosti. On se oznauje brojem koji podrazumijeva koliko je puta vea mogunost da trag potjee od ispitivane osobe nego da potjee od bilo koga drugoga. Na taj se nain usporeuje najee stajalite optube (trag potjee od osumnjienog) ija vjerojatnost iznosi 1, i stajalite obrane (trag potjee od nekoga drugoga) ija vjerojatnost za homozigote iznosi p2, a za heterozigote 2pq. U forenzino -genetikoj statistici ovaj je pojam poznat pod nazivom likelihood ratio LR [52]. Tako se dolazi do obrasca da za jedan, recimo, heterozigotni lokus, LR = 1/2pq. Na kraju, u sluaju poklapanja DNA profila pronaenoga traga i ispitivane osobe, dobiva se formulacija da vjerojatnost da analizirani trag potjee od ispitivane osobe iznosi 1 od 751 879 699. U tablici 1-7. prikazano je utvrivanje vjerojatnosti da sporni (prijeporni) trag kr vi pripada ispitanoj osumnjienoj osobi. Rezultat je pokazao da vjerojatnost da analizirani prijeporni trag pripada osumnjienoj osobi iznosi 1 u 143 681 443 milijarde, to daleko premauje ukupan broj svih ljudi koji ive na
50
Tablica 1-7. Primjer forenzine identifikacije prijepornoga traga krvi analizom 15 STR-lokusa STR-LOKUS D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 PENTA E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1P0 PENTA D VWA D8S1179 TPOX FGA Amelogenin Nesporni trag Sporni trag osumnjiene p krvi osobe 16, 18 6, 9.3 28, 32.2 12, 17 7, 13 12, 12 12, 13 10, 11 11, 12 11, 12 9, 9 16, 19 12, 15 8, 8 21, 22 XY 16, 18 6, 9.3 28, 32.2 12, 17 7, 13 12, 12 12, 13 10, 11 11, 12 11, 12 9, 9 16, 19 12, 15 8, 8 21, 22 XY 0,265 0,225 0,165 0,080 0,190 0,340 0,270 0,290 0,340 0,245 0,245 0,205 0,165 0,570 0,155 ///// q 0,155 0,330 0,085 0,100 0,155 0,340 0,075 0,185 0,280 0,345 0,245 0,065 0,080 0,570 0,190 ///// Formula 2pq 2pq 2pq 2pq 2pq p2 2pq 2pq 2pq 2pq p2 2pq 2pq p2 2pq ///// Uestalost 0,1352 0,1485 0,0281 0,0160 0,0589 0,1156 0,0405 0,1073 0,1904 0,1691 0,0600 0,0267 0,0264 0,3249 0,0589 ///// 6,9598 1018 143 681 443 246 475 686
Zajednika uestalost (ZU) Vjerojatnost (likelihood) 1/ZU

p, q uestalost alelnih varijanti u bosanskohercegovakoj populaciji [78]
planetu Zemlji. Taj podatak dovoljno govori o snazi ovoga dokaza.

1.13.10.1.
Individualizacija i identifikacija
Individualizacija oznauje stajalite u kojem genetika informacija oznauje odreenu osobu. Takvo se stajalite iskazuje u identifikaciji putem otisaka prstiju, gdje se tono moe tvrditi da pojedini otisak potjee od odreene osobe. ak i jednojajani blizanci nemaju identine otiske prstiju, iako uvijek nose istu
gensku strukturu. Danas je, s dostupnim brojem biljega, mogue postii praktino bilo koji stupanj individualizacije. Stupanj individualizacije potreban za identifikaciju, ako ne postoji meunarodna suglasnost, mora se odrediti na lokalnoj razini. Pri njegovu odreivanju bitno je jasno utvrditi uestalost variranja alelnih varijanti unutar ispitivane populacije, kao i njezinu ukupnu veliinu. Dobivena vjerojatnost iz tablice 1-7. vie je nego dovoljna kako za bosanskohercegovaku tako i za hrvatsku populaciju, ali ak i bitno manje vrijed-
51
nosti dobivene DNA profiliranjem osobe na manjem broju STR-lokusa u pojedinim sluajevima mogu biti dostatne za hr vatsku populaciju. Naime, vjerojatnost sluajnoga poklapanja od npr. 1 prema 23 milijarde Hr vata ili populacije graana Bosne i Hercegovine, dovoljno je vrst dokaz da uzorak potjee od zajednikog izvora.
1.14.
Analiza mijeanih tragova
Jedna od bitnih karakteristika DNA-analize svakako je i mogunost utvrivanja DNA-profila mijeanih tragova, te mogunost njihove analize. Takvo to nije bilo mogue ni jednom prije primjenjivanom metodom. Mijeani su tragovi oni u kojima se dvije ili vie individua pojavljuju kao mogui donori, tj. bioloki izvori toga traga [52]. Za razliku DNA-profila uobiajenih biolokih tragova DNA-profili mijeanih tragova najee podrazumijevaju pojavljivanje vie od dvaju zubaca na analiziranim lokusima, i/ili pak oit nesklad unutar onih lokusa koji imaju dva zupca ili samo jedan. Prema Claytonu [79], postoji est osnovnih koraka u interpretaciji rezultata DNA-analize mijeanih tragova: 1. identificiranje prisutnosti mijeanoga traga, 2. precizno utvrivanje svih alelnih varijanti prisutnih u mjeavini, 3. utvrivanje broja moguih donora traga, 4. utvrivanje kvantitativnog omjera zastupljenosti pojedinanih biolokih tragova svakoga od donora koji tvore mjeavinu, 5. utvrivanje svih moguih genotipskih kombinacija i 6. usporedba s referentnim nespornim uzorcima. Mijeani tragovi nisu rijetka pojava u forenzici, posebice u sluajevima silovanja kada je kod velikoga broja tragova (vaginalni obrisak, tragovi sperme na donjem rublju, tragovi sperme s tijela rtve itd.) rije o mijeanim tragovima s poiniteljem kao jednim i rtvom kao drugim donorom (kontributorom).
Analiza tih tragova podrazumijeva dodatne statistike analize kojima se ponajprije pokuava jasno razluiti svaki pojedini trag koji sudjeluje u mjeavini. Takvu analizu olakava situacija kad je broj kontributora u mjeavini najmanji mogui (dva kontributora), kad je njihova koliinska zastupljenost razliita, tj. kada se jasno moe razdvojiti dominirajua i slabije zastupljena frakcija i kada konributori imaju to vei broj nepoklapajuih alelnih varijanti na jednome lokusu. Naime, kad je rije o dvama kontributorima koji su na istome lokusu heterozigoti s nepoklapajuim alelnim varijantama (sl. 1-20), i ako se jo radi o koliinski razliito zastupljenim frakcijama, onda je analiza mijeanih tragova, ponajprije na osnovi analize tzv. podruja zubaca (engl. peak area) relativno jednostavna [80]. S druge strane, ako ima vie frakcija i ako su sve one, manje-vie, podjednako zastupljene, analiza takvoga traga bitno je kompliciranija. Pri interpretaciji rezultata mogu se jasno razluiti dva osnovna principa. Pr vi od njih je usmjeren k uopenom zakljuku da se ispitanik ne moe iskljuiti kao potencijalni kontributor. Takav se pristup najee primjenjuje u sluajevima kada su frakcije podjednako zastupljene i kada se ne moe jasno odrediti svaki pojedinani kontributor. Tada se na osnovi usporedbe DNA-profila ispitanika i DNA-profila mjeavine najee moe govoriti samo o (ne)mogunosti iskljuivanja ispitanika. Drugi je eg zaktniji i daje statistiki jae rezultate, a primjenjuje se u sluajevima kada se frakcije u smjesi kvantitativno jasno mogu razluiti, tj. kad se s visokim stupnjem sigurnosti moe potvrditi koje odreene alelne varijante pripadaju kojem kontributoru. Tada se mogu primijeniti razliiti statistiki pristupi kojima se raunaju razliite razine vjerojatnosti koje, kao krajnji rezultat, daju broj kojim se pokazuje kolika je vjerojatnost da je ispitanik jedan od kontributora mjeavine ili kolika je vjerojatnost da on to nije.
52
11_uzorak 4
b)
11_uzorak 4
d)
a)
c)
Slika 1-20. Prikaz raunalno obraenih rezultata analize DNA mijeanoga traga s dva nejednako zastupljena kontributora nakon uporabe PowerPlex 16 sustava: a) oba kontributora imaju heterozigote s nepoklapajuim alelnim varijantama (16,19 dominirajua frakcija i 17,18 slabije zastupljena frakcija), to je uvjetovalo detektiranje etiriju zubaca; b) jedan kontributor ima heterozigot (7,11 dominirajua frakcija), a drugi kontributor ima homozigot (10,10 slabije zastupljena frakcija), to uvjetuje detektiranje triju zubaca na ovom lokusu; c) oba kontributora imaju istovjetne heterozigotne kombinacije (8,11 i 8,11), to uvjetuje pojavljivanje dvaju zubaca na danom lokusu; d) oba kontributora imaju istovjetnu homozigotnu kombinaciju (13,13), to uvjetuje detektiranje jednog zupca na danom lokusu.
1.15.
Prezentacija rezultata dobivenih uporabom Y-STR sustava
Kako je ve navedeno, molekularni biljezi pozicionirani na Y-kromosomu, uz svoje znanstveno znaenje u populacijskoj genetici, mogu dati iznimno bitne rezultate i u primijenjenoj forenzinoj genetici. Njihova je primjena naila na veliko odobravanje i prihvaanje ire forenzine javnosti. Ipak, jedan od nerijeenih parametara njihove primjene jest statistiko prikazivanje ostvarenih rezultata. Naime, a ve je i prije reeno, ovi biljezi mogu posluiti tzv. djelominoj identifikaciji i individualizaciji, i to
zbog svoje prirode nasljeivanja iskljuivo mukom linijom i visokoga stupnja konzer vativnosti. U odsutnosti mutacije Y-STR, profil je identian po mukoj liniji kroz generacije, tj. s oca se identino nasljeuje na sve sinove, sa sinova na njihovu muku djecu itd. Upravo ta znaajka ini osnovni limit uporabe ovih biljega na sudu. Jedna od najire prihvaenih metoda prikazivanja rezultata jest odreivanje uestalosti odreenoga haplotipa unutar konkretne populacije. S tim u vezi unutar forenzino -genetike zajednice utvren je tzv. minimalni haplotip (minHt) koji se sastoji od 7 single copy Y-STR lokusa i jednog multi copy lokusa, no danas se rabe sustavi sa znatno poveanim brojem Y-STR lokusa, npr. PowerPlex Y
53
(Promega Corporation) s jedanaest lokusa (10 tzv. single copy lokusa i jedan polimorfni multi copy lokus) i Yfiler (Applied Biosystems) sa 16 lokusa (15 tzv. single copy lokusa i jedan polimorfni multi copy lokus). Kada se Y-STR profili ispitivanih tragova ne poklapaju, onda se moe zakljuiti da oni ne potjeu od istoga traga, i tada statistiki prikaz, najee nije potreban, no u situacijama kada se Y-STR profili tragova poklapaju, onda se preporuuje uporaba podataka s najvee svjetske online Y baze podataka www.yhrd.org, koja je, primjera radi, u posljednjem pristupu pri pisanju ovoga poglavlja (na dan 16. 7. 2007.) imala 51 253 haplotipa iz 447 populacija. Najjednostavniji pristup jest unoenje odreenoga haplotipa u bazu podataka i utvrivanje njegove uestalosti u svjetskoj i lokalnoj populaciji na osnovi formule p = X/N, gdje je p uestalost haplotipa, X ukupan broj ponavljanja analiziranoga haplotipa u populaciji, a N ukupan broj svih pohranjenih haplotipova, tj. individua u danoj populacijskoj bazi [52]. Ipak, statistiki korektniji pristup jest onaj kada se uzima u obzir injenica da se u bazi podataka nalazi samo odreeni uzorak promatrane populacije i kad se navedena formula korigira u oblik p = X/N + 1,96 [(p)(1p)/N]1/2. Ovom korekcijom utvruje se gornja granica intervala pouzdanosti rezultata (engl. upper bound confidence interval) i njenom primjenom uzima se u obzir injenicu da odreeni broj rijetkih haplotipova nije ukljuen u bazu podataka. Primjera radi, ako se neki haplotip pojavljuje samo 5 puta u YHRD bazi podataka, njegova oekivana uestalost u svjetskoj populaciji iznosila bi p = 5/51 253 + 1,96 [(5/51 253)(1 5/51 253)/51 253]1/2, to je kad se izrauna, 0,00018305304, tj. 0,018305304%. Svakako, taj se broj poveava smanjenjem populacije, tj. kad se u kalkulaciju uzimaju podatci za regionalne subpopulacije, no on je
i dalje, posebice ako se rabi u kombinaciji s rezultatima standardnoga DNA-profiliranja, vie nego dovoljan.
1.16.
Forenzina analiza DNA biljnoga podrijetla
Analiza DNA izdvojene iz biljaka ima primarnu ulogu u povezivanju pojedinaca s mjestom zloina ili povezivanjem dokaznog materijala s odreenim geografskim lokacijama, a odnedavna je mogue i pratiti kretanje odreenih sojeva droga od mjesta uzgajanja sve do mjesta uporabe. Pr vi sluaj analize DNA iz bilja u forenzici, ijim e se kratkim opisom pokazati vrijednost te metode, dogodio se jo 1992. godine. Te je godine u Arizoni pronaeno mrtvo ensko tijelo, a neposredno pokraj tijela dojavljiva (pager), za koji se pretpostavljalo da se zna komu pripada. Zatim je tijekom istrage u kamionu osumnjienog pronaeno nekoliko sjemenki bilja te je policija slubeno zatraila da se DNA sjemenki pronaenih na mjestu zloina usporedi s DNA izdvojenom iz bilja pronaenom na kamionu. Laboratorijskom analizom DNA potvreno je da su DNA identine i da imaju veliku specifinost u usporedbi s ostalim biljkama pronaenima u okolini. Ova je injenica bila vana u proglaavanju osumnjienoga krivim. Nadalje, upravo zbog postojanja vrlo jedinstvene genetike strukture sjemena marihuane danas je mogue pratiti distribuciju sjemena te istodobno povezivati i putove distribucije droge, kao i dilera droge [81]. Sigurno da e u skoroj budunosti biti potrebno provesti brojna populacijska istraivanja razliitog bilja kako bi se tono utvrdilo pojavljivanje odreenih gena za pojedine vrste bilja unutar odreenoga geografskog podruja, to e u konanici imati velikog utjecaja na prihvaanje rezultata DNA-analize dotinog bilja na sudu [82]. Ta je tema toliko aktualna da je zasebno
54
obraena potanje u jednom od iduih poglavlja ove knjige.
1.17.
Forenzina analiza DNA ivotinjskoga podrijetla
U brojnim istraivanjima jasno je pokazano da ivotinjska DNA ima jedinstveni genetiki kod, tako da je mogue razlikovati pojedine
ivotinje ak i unutar iste populacije. esto je potrebno utvrditi podrijetlo ivotinjske dlake pronaene na mjestu zloina ili na odjei rtve ili osumnjienog. Najee je rije o dlakama psa ili make ili nekih drugih kunih ljubimaca. Do sada je provedeno vie istraivanja kojima je nedvojbeno utvrena specifinost ili jezgrene DNA ili mtDNA pronaenih kod raznih tragova ivotinjskog podrijetla [83-86], no i ova e tema biti podrobnije obraena u sklopu iduih poglavlja.
Literatura
1. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. Hyper variable minisatelite regions in human DNA. Nature 1985;314:67-73. 2. Jeffreys AJ, Thein SL, Wilson V. Individual specific fingerprints of human DNA. Nature 1985;316:76-9. 3. Zergollern LJ i suradnici. Medicinska genetika, II. dio. Zagreb, kolska knjiga, 1994. 4. Wambaugh J. The Blooding. New York, Bantam Books, 1989. 5. International Humane Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921. 6. Venter JC and 273 others. The sequence of the human genome. Science 2001; 291:1304-51. 7. Cooper GM, Hausman RE. The Cell: A Molecular Approach 3rd edition. ASM Press. Washington DC. 2004. 8. The Report of the Committee on the Human Mitochondrial Genome, www.mitomap.org/report; accesed 07.07.2007. 9. Inman K, Rudin N, editors. An Introduction to Forensic DNA Analysis. New York (NY): CRC Press; 1997. 10. Budowle B, Monson KL, Guisti AL, Brown BL. The assessment of frequency estimates of Hae-III generated VNTR profiles in various reference databases. J Forensic Sci 1994:39:319-52. 11. Federal Bureau of Investigation. The Application of Forensic DNA Testing to Solve Violent Crimes. Washington, DC: US Department of Justice; 1990. 12. Budowle B, Chakraborty R, Guisti AM, Eisenberg AJ, Alen RC. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high resolution PAGE. Am J Hum Genet 1991; 48:137-44. Latorra D, Stero MC, Schanfield SM. Characterization of human AFLP systems apolipoprotein B, phenylalanine hydroxylase and D1S80. Genome Research 1994;3:351-8. Budowle B, Baechtel FS, Comey CT. Some considerations for use of AMP-FLPs for identity testing. In: Ritter C, Schneider PM, editors. Advances in Forensic Haemogenetics. New York (NY): Springer Verlag; 1992. p. 11-7. Shows TB, McAlpine PJ, Bouchix C. Guidelines for human gene nomenclature. An international system for human gene nomenclature (ISGN, 1987). Cytogenet Cell Genet 1987;46:11-28. 1991 Report concerning recommendations of the DNA Commission of the International Society for Forensic Haemogenetics relating to the use of DNA polymorphism. Vox Sanguinis 1992;63:70-3. Mayr WR. Recommendations of the DNA Commission of the International Society for Forensic Haemogenetics relating to the use of PCR-based polymorphisms. Vox Sanguinis 1993;64:124-6. Sprecher C, Krenke B, Amiott B, Rabbach D, Grooms K. The PowerPlexTM 16 System. Profiles in DNA 2000; 4: 3-6. Urquhart A, Kimpton CP, Downes TJ, Gill P. Variation in short tandem repeat sequences a sur vey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers. Int J Leg Med 1994;107:13-20. Jobling MA, Heyer E, Dieltjes P, de Knijff P. Y chromosome-specific microsatellite mutation rates re -exa mined using a mini satel li te, MSY1 Hum Mol Gen 1999;8:2117 -2120.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
55
21. Prinz M. Experience with using Y chromosome specific STRs in forensic casework. Proceedings of the 10th Int erna tio nal Sympo sium on Human Identi fi ca tion; 1999 Sep 29 Oct 2; Or lan do, Florida. Madison, USA: Promega Corporation; 1999. 22. Semino O, Passarino G, Oefner JP, Lin AA, Arbuzova S, Beckman EL, De Benedictis G, Francalacci P, Kouvatsi A, Limborska S, Marcikic M, Mika A, Mika B, Primorac D, Santachiara--Benerecetti AS, Cavalli-Sforza IX, Underhill AP. The Genetic Legacy of Paleolithic Homo sapiens sapiens in Extant Europeans: A Y Chromosome Perspective. Science 2000;290:1155-9. 23. Y Chromosome Consortium. A nomenclature system for the tree of human Y chromosomal binary haplogroups. Genome Res. 2002;12:339-48. 24. Bara L, Perii M, Klari IM, Janiijevic B., Parik J, Rootsi S. & Rudan P. Y chromosomal heritage of Croatian population and its island isolates. Eur J Hum Genet 2003;11:535-42. 25. Marjanovi D, Fomarino S, Montagna S, Primorac D, Hadiselimovi R, Vidovi S, Pojski N, Battaglia V, Achilli A, Katja D, Anelinovic S, Torroni A, Santachiara-Benerecetti S, Semino O. The peopling of modern Bosnia-Herzegovina: Y chromosome haplogroups in the three main ethnic groups. Annals of Human Genetics 2005;69:757-63. 26. Prinz M, Sansone M. Y chromosome-specific short tandem repeats in forensic casework. Croat Med J 2001;42:288-91. 27. Szibor R, Krawczak M, Hering S, Edelmann J, Kuhlisch E, Krause D. Use of X-linked markers for forensic purpose. Int J Legal Med 2003;117:67-74. 28. Pereira R, Gomes I, Amorim A, Gusmo L. Genetic diversity of 10 X chromosome STRs in northern Portugal. Int J Legal Med 2007;121:192-197. 29. Holland MM, Fisher DL, Mitchell LG, Rodriguez WC, Canik JJ, Merril CR, et al. Mitochondrial DNA sequen ce ana lysis of human skeletal remains: identification of remains from the Vietnam War. J Forensic Sci 1993:38:542-53. 30. Holland MM, Parsons TJ. Mitochondrial DNA sequence analysis validation and use for forensic ca sework. Forensic Sci Rev 1999;11:22-50. 31. Ivanov PL, Wad hams MJ, Roby RK, Hol land MM, Wee dn VW, Parsons T. Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the Grand Duke of Russia Georgij Romanov, establishes the authentici ty of the remains of Tzar Nic ho las II. Nat Genet 1996;12:417 -20. 32. Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. Reanalysis and
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40. 41.
42.
43.
44.
revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nature Genetics 1999;23:147. Gabriel NM, Calloway DC, Rebecca LR, Anelinovi , Primorac D. Population variation of human mi tochondrial DNA hyper variable re gions I and II in 105 Croatian in di vi dua ls dem onstra ted by immo bi li zed sequen ce spe ci fic oli go nuc leo ti de pro be ana lysis. Croat Med J 2001;42:328-35. Parsons TJ, Coble MD. Increasing the forensic discrimination of mitochondrial DNA testing through analysis of the entire mitochondrial DNA genome. Croat Med J 2001;42:304309. Coble MD, Just RS, OCallaghan JE, Letmanyi IH, Peterson CT, Irwin JD, Parsons TJ. Single nucleotide polymorphisms over the entire mtDNA genome that increase the power of forensic testing in Caucasians. Int J Legal Med 2004;118:137-46. Coble MD, Butler JM. Characterization of new miniSTR loci to aid analysis of degraded DNA. J Forensic Sci 2005;50:43-53. Lee HC, Ladd C, Scherczinger CA, Bourke MT. Forensic applications of DNA typing. Part 2: Collection and preser vation of evidence. Am J Forensic Med Path 1998;19:10-8. Marjanovi D, Dobraa I, Drobni K. Prikupljanje, prezer vacija i transport uzoraka za DNA analizu, Sarajevo: INGEB; 2005. Man dre kar NM, Eric kson MA, Ko pp K, Krenke EB, Man dre kar VP, Nel son R, Pe ter son K,Shultz J, Tereba A, Westphal N. Development of a human DNA quantitation system. Croat Med J 2001;42:336-9. QuantifilerTM Human DNA Quantification Kit, Users Manual, 2003. National Research Council, National Academy of Sciences. The Evaluation of Forensic DNA evidence. Washington (DC): National Academy Press; 1996. Waye J. DNA: RFLP. In: Siegel JA, Saukko PJ, Knupfer GC, editors. Encyclopedia of Forensic Scien ces. Lon don: Aca demic Pre ss. 2000. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 1988;239:487-491. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplication of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.
56
45. Durmi A. Polimeraza lanana reakcija. u: Uvod u genetiko inenjerstvo i biotehnologiju. Sarajevo: INGEB; 2005. 46. Hammond HA, Jin L, Hong Y, Caskey CT, Chakraborty R. Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification applications. Am J Hum Genet 1994;55:175-89. 47. Alford RL, Hammond HA, Cotn I, Caskey CT. Rapid and efficient resolution of parentage by ampli fi ca tion of sho rt tan dem re pea ts. Am J Hum Genet 1994;55:190 -5. 48. Primorac D. Validation of PP16 System on teeth and bone samples. Proceedings of the Promegas STR Edu ca tio nal Fo rum. June 5 -June 6; Zagreb, Croa tia: Pro me ga Cor po ra tion; 2001. 49. Mcewen JE. Forensic DNA data banking by state crime laboratories. Am J Hum Genet 1995;56:1487-92. 50. Buel E, Schwartz MB, LaFountain MJ. Capillary electrophoresis STR analysis: comparison to gelbased systems. J Forensic Sci 1998;43:164-70. 51. Schanfield, M. DNA: PCR-STR. In: Siegel JA, Saukko PJ, Knupfer GC, editors. Encyclopedia of Fo rensic Scien ces. Lon don: Aca demic Pre ss. 2000. 52. Butler JM. Forensic DNA Typing: Biology, Technology and Genetics of STR Markers (2nd edition). London: Elsevier Academic Press; 2005. 53. Applied Biosystems. AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit Users Manual. Applied Biosystems; 2005. 54. Marjanovi D. Sekvencioniranje DNA fragmenata. U: Uvod u genetiko inenjerstvo i biotehnologiju. Sarajevo: INGEB;2005. 55. Weir BS. Population genetics of DNA profiles. J Forensic Sci 1993;33:218-25. 56. Council of Europe. Committee of Ministers. Recommendation No. R (92) 1 on the use of analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) within the framework of the criminal justice system. 470th meeting of the Ministers Deputies (1992). 57. Katelan J, Duda B, urednici. Biblija, stari i novi zavjet. Zagreb: Kranska sadanjost. 1987 str. 272-273. 58. Schanfield M. DNA: parentage testing. In: Siegel JA, Saukko PJ, Knupfer GC, editors. Encyclopedia of Fo rensic Sciences. Lon don: Aca demic Pre ss. In pre ss 2001. 59. Allen R, editor. AABB Annual Meeting. Paternity testing, specialist interested group. Annual report. San Francisco (CA): AABB; 1999. 60. Weiner AS. Likelihood of parentage. In: Sussman LN, editor. Paternity testing in blood grouping.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
Springfield -VA): Charles C. Thomas; 1976. p. 124-31. Li CC, Chakravarti A. An expository review of two methods of calculating a paternity probability. Am J Hum Genet 1988;43:197-205. Proji P, karo V, amija I, Pojski N, DurmiPasi A, Kovaevi L, Bakal N, Primorac D, Marjanovi D. Allele frequencies for 15 short tandem repeat loci in representative sample of Croatian population. Croat. Med. 2007;48:473-475. Brenner C. A note on paternity computation in cases lacking a mother. Transfusion 1993;33:51-4. Gunby P. Medical team seeks to identify human remains from mass graves of war in former Yugoslavia. JAMA 1994;272:1804-6. Gaensslen RE, Lee CH. Genetic markers in human bone tissue. Forensic Sci Rev 1990;2:12646. Fisher DL, Holland MM, Mitchell L, Sledzik PS, Wilcox AW, Wadhetms M, et al. Extraction, evaluation and amplification of DNA from decalcified and un-decalcified United States civil war bone. J Forensic Sci 1993;38:60-8. Ortner DJ, Tuross N, Stix AI. New approachs to the study of disease in archeological New World populations. Hum Biol 1992;64:337-60. Hochmeister MN, Budowle B, Borer UV, Eggmann U, Comey CT, Dirnhofer R. Typing of deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from compact bone from human remains. J Forensic Sci 1991;36:1649-61. Burgi SB, editor. First European-American Intensive Course in PCR Based Clinical and Forensic Testing. Laboratory manual; 1997 Sep 23Oct 3; Split, Croatia: Laboratory for clinical and forensic genetics; 1997. Andjelinovi S, Sutilovi D, Erceg Ivkosi I, karo V, Ivkoi A, Pai F, Rezi B, Definis-Gojanovi M, Primorac D. Twelve-year experience in identification of skeletal remains from mass graves. Croat Med J 2005;46:530-9. Primorac D. Identification of human remains from mass graves found in Croatia and Bosnia and Herzegovina. Proceedings of the 10th International Symposium on Human Identification; 1999 Sep 29Oct 2; Orlando, Florida. Madison, USA; Promega Corporation, 1999. Primorac D, Anelinovi S, Definis-Gojanovi M, Drmi I, Rezi B, Schanfieid MS, et al. Identification of war victims from mass graves in Croatia, Bosnia and Herzegovina by the
57
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
use of standard forensic methods and DNA typing. J Forensic Sci 1996;41:891-4. Keys KM, Budowle B, Anelinovi S, Definis Gojanovi M, Drmi I, Marciki M, Primorac D. Nor thern and Southern Croatian population data on se ven PCR-ba sed lo ci. Forensic Sci Int1996;81:191-9. Alonso A, Anelinovi S, Martin P, Sutlovi D, Erceg I, Huffine E, de Simon LF, Albarran C, Definis-Gojanovi M, Fernandez Rodriguez A, Garcia P, Drmi I, Rezi B, Kuret S, Sancho M, Primorac D. DNA typing from skeletal remains: evaluation of multiplex and megaplex STR systems on DNA isolated from bone and teeth samples. Croat Med J 2001;42:260-6. Gill P, Evett I. Population genetics of short tandem repeat (STR) loci. In: Weir B, editor. Human Identification: the Use of DNA Markers. Dordrecht: Kluwer Publ; 1995. p. 69-87. Budowle B, Moretti TR, Baumstark AL, Defebaugh DA, Keys KM. Population data on the thirteen CODIS core short tandem repeat loci in African Americans, U.S. Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J Forensic Sci 1999; 44:1277-86. Marjanovi D, Durmi-Pai A, Bakal N, Haveri S, Kalamuji B, Kovacevi L, Rami J, Pojski N, karo V, Proji P, Bajrovi K, Hadiselimovi R, Drobni K, Huffine E, Davoren J, Primorac D. DNA identification of skeletal remains from the Second World War mass graves uncovered in Slovenia Croat. Med. 2007;48:513-9. Marjanovi D, Bakal N, Pojski N, Kapur L, Drobni K, Primorac D, Bajrovi K, Hadiselimovi R. Allele frequencies for 15 short tandem repeat loci in a representative sample of Bosnians and Herzegovinians. Forensic Science International 2006;156: 79-81. Clayton TM, Gill P, Sparkes R, and Whitaker JP. Analysis and interpretation of mixed stains using DNA STR profiling. Forensic Science International 1998;91:55-70.
80. Evett IW, Weir BS. Interpreting DNA Evidence: Statistical Genetics for Forensic Scientists. Sunderland MA: Sinaure Associates Inc. 1998. 81. Miller Coyle H, Ladd C, Palmbach T, Lee DH. The Green Revolution: Botanical contributions to forensics and drug enforcement. Croat Med J 2001;42:340-345. 82. Zeller M, Wehner DH, Hemleben V. DNA fingerprinting of plants. In: Primorac D, Erceg I, Ivkoi A, editors. Proceedings of The Second European-American Intensive Course in Clinical and Forensic Genetics; 2001 Sep 314; Dubrovnik, Croatia. Zagreb, Croatia: Studio HRG; 2001. 83. Savolainen P, Ar vestad L, Lundeberg J. A novel method for forensic DNA investigations: repeat-type sequence ana lysis of tandemly repeated mtDNA in domestic dogs. J Forensic Sci 2000:45:990-9. 84. Fridez F, Rochat S, Coquoz R. Individual identification of cats and dogs using mitochondrial DNA tandem repeats? Sci Justice 1999;39:167-71. 85. Padar Z, Egyed B, Kontadakis K, Furedi S, Woller J, Zoldag L, Fekete S. An importance of canine identification in Hungarian forensic practice. In: Primorac D, Erceg I, Ivkoi A, editors. Pro cee dings of The Se cond EuropeanAmerican Intensive Course in Clinical and Forensic Genetics; 2001 Sep 314; Dubrovnik, Croatia. Zagreb, Croatia: Studio HRG; 2001. 86. Roney C, Spriggs A, Tsang C, Wetton J. A DNA test for the identification of tiger bone. In: Primorac D, Erceg I, Ivkoi A, editors. Proceedings of The Second European-American Intensive Course in Clinical and Forensic Genetics; 2001 Sep 314; Dubrovnik, Croatia. Zagreb, Croatia: Studio HRG; 2001.
58
2.
Analiza mitohondrijske DNA za potrebe sudsko-medicinskog vjetaenja

Ivan Gornik i Gordan Lauc
Sadraj poglavlja
2.1. Mitohondrijska DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1. Nasljeivanje mitohondrijske DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2. Znaenje analize mtDNA u sudskoj medicini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Interpretacija rezultata analize mtDNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1. Genetika varijabilnost populacije. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2. Znaajnost podudarnosti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Heteroplazma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 61 62 64 64 65 68
2.2.
2.3.
2.1.
Mitohondrijska DNA
Molekule deoksiribonukleinske kiseline (DNA) koje se nalaze unutar jezgre nisu jedine molekule DNA u eukariotskoj stanici. Osim njih, postoje i molekule DNA u mitohondrijima, staninim organelima s dvostrukom membranom koji se u citoplazmi nalaze u velikome broju. Osnovna funkcija mitohondrija jest proizvodnja energije (sinteza molekula ATP-a) putem oksidativne fosforilacije, ali se u njima zbivaju i drugi biokemijski procesi bitni za ivot stanice. Danas je opeprihvaena endosimbiotska teorija [1] o nastanku mitohondrija, prema kojoj dananji mitohondriji potjeu od bakterijskih stanica koje
su prije vie stotina milijuna godina ivjele u simbiotskom odnosu sa preeukariotskim stanicama i tijekom evolucije izgubile sposobnost funkcioniranja izvan eukariotske stanice. Mitohondrijska DNA (mtDNA), dakle, evolucijski potjee od DNA tih endosimbiotskih bakterija te su mnoge osobine mitohondrijske DNA u skladu s time. Unutar jedne eukariotske stanice nalazi se razliito velik broj mitohondrija (ovisno o potrebi stanice za energijom), a u njima velik broj istovjetnih kopija mtDNA. Procjenjuje se da normalna oocita sadrava oko 100 000 kopija mtDNA [2, 3]. Somatske stanice, ovisno o tipu stanice i tkiva, sadravaju od dvjestotinjak do vie od 1 700 kopija mtDNA [4, 5]. Velika
59
mnoina molekula mtDNA u pojedinoj eukariotskoj stanici poveava vjerojatnost izdvajanja cjelovitih molekula mtDNA iz uzoraka u kojima se DNA zbog nepovoljnih uvjeta u okoliu najee s vremenom raspada. Tijekom evolucije uloga mitohondrijskog genoma umnogome je izgubila na znaenju: veina mitohondrijskih proteina dananjih eukariotskih stanica kodirana je u jezgrinoj DNA [6]. Humani mitohondriji sadravaju cirkularni genom od 16 569 parova baza. ShetRNA
16 024
matski prikaz mitohondrijske DNA prikazan je na slici 2-1. Funkcija, mutacije, populacijska varijabilnost i nasljedni poremeaji mitohondrijskog genoma detaljno su istraeni i poznate su specifine delecije, udvostruenja i brojne tokaste mutacije koje dovode do razliitih specifinih patofiziolokih sindroma. Nakupljanje somatskih mutacija (steenih za vrijeme ivota) smatra se jednim od uzroka degenerativnih promjena stanica, tkiva i organa starenjem [7, 8].
HV2 tRNA
340 576
HV1
16 365 1 73
D Loop
tRNA Pro tRNA Thr P OH tRNA Phe 12S LSP
Cyt b
tRNA Glu Gen ND6 Cyt b ND6
12S Val rRNA

tRNA Val
16S
16S rRNA
Len tRNA Leu
ND5
tRNA Leu tRNA Ser tRNA His Ser His
ND5 mtDNA 16 659 bp ND
mtDNA 16 569 bp
ND2 OL W Cox 1 Cox 2 K
ND4 Arg Gly ND3 Cox 3
Ile Gen tRNA Ile Mef tRNA Gln tRNA Mef
ND1
ND4 ND4L
tRNA Arg
ND2
tRNA Trp tRNA Ala
ND3
tRNA Gly
COX3
ATP6 ATP8 COX2

tRNA Lys
COX1
tRNA Ser tRNA Asp
tRNA Asn
OL
tRNA Cys tRNA Tyr
Slika 2-1. Shema mitohondrijskoga genoma u ovjeka. Uveana je kontrolna regija s dvije hipervarijabilne regije (HV1 i HV2). Oznaeni su poloaji gena za 12S i 16S rRNK, podjedinice NADH koenzim Q-reduktaza kompleksa (ND 16), podjedinice citokrom c-oksidaza kompleksa (Cox 13), citokrom b (Cyt b) i 22 tRNA (oznaeni troslovnim kraticama za aminokiseline). Ishodite tekog lanca (OH) i lakog lanca (OL). Uveano je podruje D-petlje (D loop) s hipervarijabilnim podrujima (HV1 i HV2).
60
Slijed nukleotida u humanoj mitohondrijskoj DNA odreen je godine 1981. [9], a potanje informacije o mitohondrijskom genomu dostupne su na internetu u mnogim bazama podataka. Dva komplementarna lanca bitno se razlikuju u sastavu: teki lanac bogat je purinskim, a laki pirimidinskim bazama. Unutar sekvencije je 37 kodirajuih regija: dvadeset i dva gena kodiraju transportnu RNA (tRNA), dva kodiraju ribosomsku RNA (12S i 16S rRNA), a 16 kodiraju glasniku RNA (mRNA) za enzime ukljuene u proces oksidativne fosforilacije i proizvodnje adenozintrifosfata (ATP) [9, 10]. Osim kodirajuih regija mtDNA, znaajna je samo jedna nekodirajua regija, nazvana kontrolnom regijom (engl. control region, CR), katkad zvana i D-petljom jer za vrijeme replikacije DNA stvara strukturu vidljivu elektronskim mikroskopom. Kontrolna regija duga je oko 1 125 parova baza, a unutar nje se nalaze promotorske regije za transkripciju gena za policistronske RNA tekog i lakog lanca. U kontrolnoj regiji nalazi se i ishodino mjesto za replikaciju. U sustavu mapiranja mitohondrijskoga genoma standardne referentne sekvencije (Cambridge Reference Sequence CRS) [9] poetni se poloaj nalazi otprilike u sredini kontrolne regije. Zbog toga kontrolna regija poinje 16 024. bazom, nastavlja se do posljednje, 16 569., te se nastavlja od 1. do 576. baze. Za razliku od kodirajuih dijelova mtDNA, dijelovi kontrolne regije vrlo su varijabilni unutar populacije, ponajprije zbog smanjena evolucijskoga pritiska na nekodirajuoj regiji. Postoje dva hiper varijabilna mjesta unutar kontrolne regije u kojima je frekvencija mutacija razmjerno velika: hiper varijabilna regija 1 (HV1) od pozicije 16 024 do 16 365 i hiper varijabilna regija 2 (HV2) od pozicije 73 do 340 [11]. Granice hiper vari-
jabilnih regija nisu tono definirane i ovise o pojedinom laboratoriju ili istraivanju. Zbog visoke varijabilnosti HV1 i HV2 regije, sekvenciranje ovih dvaju segmenata mtDNA najvie se upotrebljava u sudskoj medicini i kriminalistici. No, pojedini aleli obiju regija relativno su esti u pojedinim populacijama, a diskriminativnost metode bitno se smanjuje ako su u ispitivanom uzorku prisutni frekventni aleli. Zbog toga se sve vie ispituju tokaste mutacije kodirajueg i nekodirajueg dijela mtDNA (engl. single nucleotide polymorphisms SNP). Na pojedinim se mjestima tokaste mutacije pojavljuju uestalije, a vei broj SNP-lokusa analiziran odjednom moe umnogome poveati diskriminativnost [1215]. Baze podataka o SNP mutacijama takoer su dostupne na internetu [16].
2.1.1.
Nasljeivanje mitohondrijske DNA
Osnovna znaajka nasljeivanja mitohondrijske DNA jest nasljeivanje po majinoj liniji: sva braa i sestre imaju slijed nukleotida mtDNA istovjetan onomu njihovih majki. Razlog za takvu vrstu nasljeivanja na pr vi je pogled prilino jednostavan: jajna stanica ima nekoliko tisua mitohondrija i stotine tisua kopija mtDNA, a spermij samo nekoliko mitohondrija [17]. Spajanjem citoplazmi spermija i jajne stanice oito dolazi do dominacije mitohondrijskih DNA-molekula majina podrijetla u zigoti. Takoer, ini se da postoje i neki specifini mehanizmi koji prepoznaju i uklanjaju tih nekoliko kopija oinske mtDNA ako dospiju u citoplazmu zigote. U jednom od pokusa koji to potvruje mitohondriji iz spermija uneseni su u somatske stanice bez mitohondrijske DNA. Odmah nakon uvoenja 1020% stanica imalo
61
je funkcionalne mitohondrije, ali je samo svaka desettisuita stanica preivjela dulje od 48 sati [18]. Kad su u somatske stanice uvedeni mitohondriji iz drugih somatskih stanica, dolo je do brze zamjene endogene mtDNA novom [19]. Pokus potvruje postojanje mehanizma koji specifino iz stanica uklanja samo mtDNA podrijetlom iz mukih spolnih stanica. Eliminacija oinske mitohondrijske DNA iz oploene stanice specifina je i za vrstu. U pokusima koje su na ivotinjama izveli Sutovsky i suradnici [20], Gyllensten i suradnici [21], te Kaneda i suradnici [22], pokazano je da se iz zigote nakon oplodnje mnogo uinkovitije uklanjaju molekule mitohondrijske DNA podrijetlom iz spolnih stanica mujaka iste vrste. Iako mehanizmi koji su odgovorni za uklanjanje oinske mtDNA iz zigote i embrija nisu do kraja poznati niti objanjeni, niti je poznato kolika je zapravo uinkovitost tih mehanizama in vivo, s obzirom na to da su ostatci oinske mtDNA u stanicama izuzetno rijetki, za praktinu primjenu analize mitohondrijske DNA u sudskoj medicini ispravno je koristiti se pravilom da se mitohondrijska DNA nasljeuje po majinskoj liniji. Ova je pretpostavka potvrena nizom eksperimenata koji su pokazali da se primjenom metoda koje se rabe u rutinskoj obradbi uzoraka ne moe dokazati postojanje oinske mtDNA u stanicama djece [23].
2.1.2.
Znaenje analize mtDNA u sudskoj medicini
Analiza jezgrine DNA kao sudskomedicinska metoda za utvrivanje identiteta, dokazivanje oinstva i dr., ve je opeprihvaena. Uvoenjem analize mitohondrijske DNA sudska je medicina obogaena novom, iako
donekle slinom, metodom kojoj je takoer osnovna primjena identifikacija osoba, bilo da su one rtve nesrea ili prirodnih katastrofa, rtve zloina ili ratnih djelovanja bilo da je rije o identifikaciji zloinaca [24, 25]. Postoje odreene prednosti zbog kojih je analiza mitohondrijske DNA uvedena kao metoda u praksu, iako se analiza STR-sekvencija (danas osnovna metoda analize jezgrine DNA) ve bila pokazala uspjenom i tonom [25]. Jedna od glavnih prednosti analize mtDNA jest sama priroda mtDNA. Kao to je u uvodu istaknuto, u svakoj somatskoj stanici koja ima aerobni metabolizam nalazi se vie stotina kopija mitohondrijske DNA. Osim toga, dijelovi mtDNA koji se ispituju dugi su samo tristotinjak parova baza, to poveava vjerojatnost preivljenja ciljnog dijela molekule u uvjetima kojima mogu biti izloeni uzorci koji trebaju biti analizirani. U odnosu na jezgrinu DNA, dakle, poveana je vjerojatnost izdvajanja dovoljne koliine sauvanih ulomaka DNA-molekula iz uzorka. Druga osobina mitohondrijske DNA koja je katkad presudna u odabiru metode identifikacije jest nain nasljeivanja. Budui da se DNA nasljeuje samo po majinskoj liniji, mogue je pri identifikaciji posmrtnih ostataka kao referentni uzorak iskoristiti i srodnike koji su u obiteljskom stablu relativno daleko od osobe iji se identitet eli utvrditi, bilo horizontalno (roaci koji imaju zajedniku baku ili ak prabaku) bilo vertikalno (baka, majina braa ili sestre, ). Pri identifikaciji osoba s pomou jezgrine DNA zbog segregacije homolognih gena nije mogue ukljuiti roake izvan pr voga nasljednog reda (roditelji i djeca). Svakako da metoda analize mtDNA omoguuje proirenje kruga osoba koje mogu dati referentni uzorak za analizu. Iako je u ovome trenutku analiza mtDNA znatno sloenija i skuplja od analize STR-sekvencija u jezgrinoj DNA, razvoj novih metoda
62
mogao bi je u vrlo skoroj budunosti uiniti bitno pristupanijom i jednostavnijom [26]. Osnovni nedostatak mtDNA metode pri identifikaciji jest ograniena mogunost pozitivne identifikacije. Analizom samo hiper varijabilnih regija moe se u sluaju podudarnosti teko sa sigurnou utvrditi pozitivnu identifikaciju, najvia vjerojatnost koja se postie kree se oko 0,995. Razlog tomu jest injenica da, iako je varijabilnost ovih regija velika, rije je o vezanim genima te se sve mutacije nasljeuju zajedno kao jedan lokus. Novija mogunost poveavanja diskriminativnosti i vjerojatnosti pozitivnog nalaza jest analiza veega broja polimorfizama pojedinih nukleotida (SNP) [12, 14, 15]. Sekvenciranjem itavoga mitohondrijskoga genoma dovodi se mogunost razluivanja i vjerojatnost podudarnosti do maksimuma [15], no zbog velike sloenosti i, za sada, visoke cijene ova metoda jo uvijek nije uvedena u praksu. Razvijeni su brojni komercijalni sustavi za PCR-analizu mtDNA koji olakavaju i ubrzavaju postupak. Najvie su u uporabi oni koji omoguuju sekvenciranje HV1 i HV2 regija, a sve je vie multipleksnih sustava koji omoguuju analizu i nekoliko desetaka SNP-lokusa. Pojavili su se i mikroipovi za analizu SNP-lokusa koji dodatno pojednostavnjuju postupak i poveavaju kakvou i pouzdanost analize [27]. U sluaju nepodudarnosti, osobu se kao potencijalni izvor uzorka moe odbaciti s potpunom sigurnou. Analiza ponavljajuih sljedova (engl. short tandem repeat STR) zbog veega broja analiziranih lokusa daje mnogo veu vjerojatnost pozitivne identifikacije, iako je varijabilnost na svakome pojedinom lokusu viestruko manja od varijabilnosti mtDNA. Poveanjem broja analiziranih uzoraka i stvaranjem meunarodne standardne baze podataka o ljudskoj mtDNA [28] bit e mogue
tonije raunati vjerojatnosti pozitivne identifikacije u sluaju podudarnosti, iako se izraunavane vrijednosti vjerojatno ne e bitno poveavati. Zbog velike osjetljivosti pri umnoavanju mtDNA uzorka PCR-metodom, metoda analize mitohondrijske DNA mnogo je osjetljivija na kontaminaciju uzorka. Ovo je jo jedan praktini nedostatak metode koji se striktnim potovanjem laboratorijskih protokola moe umanjiti, ali nikada potpuno ukloniti. Uzorci koji se mogu ispitivati primjenom analize mtDNA naelno su isti kao i uzorci za druge analize DNA, odnosno, uz rijetke iznimke, svi bioloki uzorci. Pri identifikaciji neidentificiranih posmrtnih ostataka, ovisno o vremenu koje je proteklo od smrti, i u kojem su na tijelo djelovali imbenici koji djeluju na degradaciju DNA, i o intenzitetu tih imbenika, mogue je upotrijebiti razliita tkiva. S vrlo svjeih trupala mogue je teoretski uzeti bilo koje tkivo kao uzorak. Ipak, vrijednost mtDNA analize najvie dolazi do izraaja kod posmrtnih ostataka u kojima je DNA vrlo degradirana, te je nemogue izolirati kvalitetan genetiki materijal za analizu jezgrine DNA. S mjesta zloina ili s tijela rtve uzimaju se i analiziraju svi uzorci ljudskoga podrijetla koji mogu potjecati od poinitelja. Rije je esto o uobiajenim uzorcima kao to je sjemena tekuina, krv, dlake, uzorak ispod rtvinih noktiju, ali kadto i o uzorcima kao to su prhut, otisak prsta i slino. Postupci u analizi mitohondrijske DNA u pr vih su nekoliko koraka istovjetni kao i u drugim analizama DNA u sudskoj medicini. Shematski prikaz postupaka analize mtDNA prikazan je na slici 2-2. Svi postupci s uzorcima posmrtnih ostataka ili s uzorcima koji su dokazni materijal trebali bi se obaviti u laboratoriju neovisno o analizi referentnih uzoraka, a koji bi po mogunosti trebali biti analizirani tek nakon zavretka analize dokaznih uzoraka.
63
obradba uzorka nepoznata podrijetla (N)
obradba referentnog uzorka (R) (po mogu}nosti nakon zavr{ene obradbe nepoznatog) izdvajanje DNA iz uzorka R, PCR
izdvajanje DNA iz uzorka N, PCR
odre|ivanje sekvencije HV1 i HV2 regija potvrda sekvencije usporedbom obaju lanaca usporedba N sekvencije sa standardnom sekvencijom
odre|ivanje sekvencije HV1 i HV2 regija potvrda sekvencije usporedbom obaju lanaca usporedba R sekvencije sa standardnom sekvencijom
usporedba sekvencija uzoraka N i R podudarnost mogu}e je da je osoba izvor uzorka N ra~unanje vjerojatnosti (zna~ajnost podudarnosti) nema podudarnosti osoba, zasigurno, nije izvor uzorka N
Slika 2-2. Shematski prikaz identifikacije analizom mitohondrijske DNA.
Takav postupak slui smanjenju opasnosti od kontaminacije ispitivanih uzoraka mitohondrijskom DNA iz referentnog uzorka. Nakon potvrivanja utvrene sekvencije analizom obaju lanaca DNA, sekvencija se usporeuje sa standardnom referentnom (Anderson) sekvencijom i utvruju se razlike. Tek se nakon toga usporeuju analizirani uzroci. U sluaju nepodudaranja alela mtDNA, osoba koja je izvor referentnog uzorka odbacuje se kao mogui izvor upitnog uzorka, odnosno srodnik neidentificirane osobe. U sluaju podudaranja, potrebno je provjeriti nalazi li se sekvencirani alel u bazi podataka, te izraunati znaajnost te podudarnosti.
2.2.
Interpretacija rezultata analize mtDNA

Genetika varijabilnost populacije
2.2.1.
Za ispravnu identifikaciju rezultata analize mtDNA u sudskoj medicini potrebno je poznavati varijabilnost lokusa mtDNA u populaciji. Do sada je u regiji HV1 identificirano nekoliko tisua razliitih sekvencija (alela), a u regiji HV2 oko tisuu alela [29]. Budui da su izvori informacija o varijabilnosti mtDNA mnogobrojni i da su ispitiva-
64
ne populacije razliite, u sudskomedicinskoj praksi nemogue je primjenjivati ukupne svjetske podatke. Postoji vie baza podataka koje su komercijalno dostupne za forenzine laboratorije, a takoer nekoliko znanstvenih baza podataka koje su uglavnom besplatno dostupne [16, 30]. Glavno ogranienje komercijalnih baza podataka jest ograniena populacija koja je istraivana pri kreiranju baze. Iako se takvim bazama mogu koristiti i forenzini i istraivaki laboratoriji koji istrauju populacije koje nisu identine, jasno je ogranienje ovakvoga pristupa. Stoga je potrebno da se pojedini laboratoriji koriste bazama podataka populacije kojom se bave, a ako je populacija rasno i etniki nehomogena, potrebno je izraditi posebne baze podataka za svaku etniku skupinu. Dodatni razlog za koritenje vlastitim bazama podataka jest i nepostojanje univerzalne provjere kvalitete za laboratorije koji ispituju mtDNA, pa je nemogue utvrditi vrijednost rezultata koji potjeu iz razliitih laboratorija. Jedan od najboljih primjera ovako ureenih baza podataka jest baza kojom se koriste Oruane snage Sjedinjenih Amerikih Drava i FBI. Takvom bazom koriste se i drugi laboratoriji u svijetu koji nemaju razvijene vlastite baze, iako to nije sasvim primjereno s gledita populacijske genetike. Baza sadrava sekvencije HV1 i HV2 regija, podijeljeno prema etnikim skupinama. Budui da se mtDNA nasljeuje po majinskoj liniji i svi srodnici po toj liniji imaju identinu mtDNA, jasno je da mtDNA ne moe biti definitivni identifikacijski test. Osim toga, pojedine osobe, iako nisu oiti srodnici, imaju iste alele mtDNA koje su naslijedile od zajednikoga dalekoga enskog pretka ili su molekule mtDNA identino mutirale. Potrebno je stoga poznavati pojavnost pojedinih mtDNA alela u obraenoj populaciji prije donoenja zakljuaka o znaajnosti podudarnosti mtDNA sekvencija osobe i uzorka.
Sve istraivane svjetske populacije pokazuju neke zajednike osobine: postoji vrlo malen broj sekvencija (alela) koje se pojavljuju ee, dok je velik broj alela koji se u bazi pojavljuju samo jednom ili dva puta. U bazi podataka amerikih bijelaca (604 osobe) najei alel pojavljuje se 26 puta (4,3%), dok je ak 390 alela koji se u bazi pojavljuju samo jednom. U bazi za Afroamerikance (149 osoba) najuestaliji alel pojavljuje se u samo 2,7% osoba, a alela sa samo jednim pojavljivanjem ima ak 118. Izmeu tih dviju baza postoji samo jedan sluaj podudarnosti u sekvenciji, to je, osim razliite varijabilnosti, vrlo dobar razlog za uspostavljanje i primjenu zasebnih baza za razliite etnike skupine. Veliina baza podataka glavni je ograniavajui imbenik u raunanju frekvencije pojedinog alela, posebno za alele kojima je pojavnost vrlo niska. Za alele koji se u bazi pojavljuju samo jedanput izraunana uestalost moe biti vrlo precijenjena. Jednostavan pokus dokazuje ovu tvrdnju: poveanjem broja osoba u bazi podataka vrlo se malo sekvencija (alela) ponovi, dok se broj novootkrivenih sekvencija poveava gotovo razmjerno poveanju baze. U jednom takvom pokusu [24] poveanjem broja osoba u bazi podataka sa 700 na 800 ponovilo se samo est alela koji su prethodno zabiljeeni, dok je dobiveno 66 novih sekvencija (alela). Samo za est se alela poveanjem baze poveala izraunana uestalost dok se za ostalih 445 (jo uvijek) jedinstvenih alela uestalost smanjila. Oito je potrebno mnogostruko poveati broj osoba u bazama da bi se moglo barem donekle pouzdano zakljuivati o stvarnim uestalostima odreenih mtDNA alela u populacijama.
2.2.2.
Znaajnost podudarnosti
Primjenom sekvenciranja mitohondrijske DNA u sudskoj bi medicini trebalo biti
65
mogue odgovoriti na dva osnovna, meusobno povezana pitanja: je li mogue odreenu osobu iskljuiti kao mogui izvor uzorka koji se ispituje? i ako nije mogue iskljuiti osobu kao mogui izvor uzorka, kolika je pouzdanost tvrdnje da je ba ta osoba izvor uzorka?. Oita je znaajnost pozitivnog odgovora na pr vo pitanje. Svaka analiza DNA, pa tako i analiza mitohondrijske DNA u sluaju iskljuivanja osobe potpuno je pouzdana. Ako osobu ne moemo iskljuiti kao mogui izvor, potrebno je postaviti drugo pitanje. Ako pak nije mogue objektivno i nedvosmisleno izraziti vjerojatnost da je ba ta osoba izvor upitnog uzorka, svrstavanje osobe u skupinu moguih (podudarnost) ne znai nita. Postoje mnogi naini izraavanja znaajnosti podudarnosti, a do sada u sudskomedicinskoj praksi ni jedan nije konano prihvaen. ini se da mali broj sudskih sporova u kojima se kao dokazi iznose rezultati analize mitohondrijske DNA nije dovoljan da se postigne standard u prezentaciji rezultata. Ipak, pri izraavanju znaajnosti podudarnosti bitno je da je rezultat prikazan na znanstveno opravdan nain i matematiki ispravno. Dok god je pristup prikazu rezultata osnovan na tim premisama, s poznavanjem mogunosti i ogranienja odreene statistike metode, sudskim je medicinarima preputeno na volju koju e metodu izabrati. Znaajnost podudarnosti u rezultatu analize mtDNA ovisi o specifinom sluaju, kao i o upitnom mtDNA alelu. Nedvojben i konaan rezultat identifikacije mogu je samo ako je ispitivana populacija zatvorena, ako je suena na tono odreenu skupinu pojedinaca, npr. prometna nesrea u kojoj je dovoljno dokazati koje je od pronaenih tijela koje, unutar skupine ljudi za koje se zna da su sudjelovali u nesrei. Ako se usporedbom referentnog uzorka mtDNA (od srodnika po
majinoj liniji) utvrdi da se referentni uzorak podudara samo s jednom osobom u skupini poginulih, ta se osoba moe smatrati pozitivno identificiranom. U takvom se sluaju pozitivna identifikacija ne temelji na izraunavanju apsolutne vjerojatnosti na temelju DNA-statistike, nego na sigurnosti u injenicu da je upitni uzorak mogao potjecati samo od ogranienoga broja osoba. esto je ipak sluaj da nije rije o zatvorenoj skupini osoba koje dolaze u obzir kao mogui izvori uzorka, nego je potrebno kao mogui izvor pretpostaviti cijelu populaciju. U tom sluaju nije mogue podudarnost u nalazu mtDNA-analize tumaiti kao konani nalaz, nego je potrebno izraziti relativno znaenje takve podudarnosti. Za svaku populaciju u kojoj je poznata uestalost pojedinih alela mogue je izraziti opu znaajnost bilo kojeg rezultata, raunanjem vjerojatnosti da e dvije sluajno izabrane osobe unutar baze imati isti alel. Primjerice, usporeujui meusobno sve osobe (N = 604) unutar baze za amerike bijelce, dobiveno je 669 podudarnosti. Ukupan broj usporeenih parova bio je 182 106, pa dakle vjerojatnost da u toj populaciji dvije nasumino odabrane osobe imaju identian CR-genotip iznosi 0,36%, odnosno 1 : 272. Ovaj je podatak vrijedan u smislu procjene ope znaajnosti mtDNA-testiranja za odreenu populaciju, ali ne moe odrediti znaajnost podudarnosti za pojedini sluaj. Toniji pokazatelj za interpretaciju pojedinoga sluaja poiva na poznavanju relativne rijetkosti (uestalosti) odreenog alela, kojom moemo utvrditi koja je vjerojatnost da nasumino izabrana osoba ima upravo taj alel. Najjednostavniji nain na koji se utvruje relativna rijetkost odreenog alela mtDNA jest tzv. metoda brojenja. Tom se metodom izraava samo koliko je puta odreeni alel mtDNA naen u razliitim bazama po-
66
dataka. Za razliku od uobiajenog raunanja uestalosti na osnovi brojenja [31] u sudskoj praksi Sjedinjenih Drava ne iznose se uestalosti koje bi bile izraunane na taj nain, nego se iznose samo brojevi. Razlog za to jest slaba vrijednost metode brojenja za utvrivanje uestalosti kod vrlo rijetkih alela. Postoje dvojbe o prihvatljivosti ove pseudometode brojenja u sudskoj praksi, ponajprije zbog toga to je neusporediva s uobiajenim principima statistike i populacijske genetike [32]. Za relativno uestale alele u populaciji moe se prilino tono pretpostaviti stvarna uestalost. Najei alel u populaciji amerikih bijelaca (263G, 315.1C) pojavljuje se 26 puta u bazi od 604 osobe. Izraunana uestalost tog alela je 0,043. Pretpostavivi normalnu raspodjelu, mogue je izraziti inter val u kojem se s 95%-tnom pouzdanou stvarno nalazi uestalost tog alela u populaciji prema formuli: p = p' 1,96 (p q/n)1/2 p'= frekvencija alela u bazi podataka, q = 1p', n = broj osoba u bazi podataka Za spomenuti alel frekvencija se nalazi u inter valu 0,027 0,059 (0,0430,016). Dakle, najvia frekvencija (s 95% pouzdanosti) je 0,059, te s 95%-tnom pouzdanou moemo iskljuiti 94,1% populacije iz skupine moguih donora. S druge strane, otprilike svaka 17. osoba (5,9%) imat e taj alel mtDNA. Za rijetke mtDNA alele, ukljuujui i nove sekvencije koje nisu prisutne u bazi nije mogue na opisani nain raunati najviu moguu uestalost. Zbog velikoga broja vrlo rijetkih alela u populaciji ak ni velike baze podataka nisu dovoljne da bi se utvrdila prava uestalost, a izraunana uestalost najee je precijenjena u odnosu na stvarnu. Za niske uestalosti (broj pojavljivanja u bazi najmanje 2) mogue je raunati inter val pouzdanosti logaritama uestalosti, te nakon izraunavanja
ponovno preraunati fuestalost. Razlog za to jest neprimjenjivost aproksimacije normalnosti u sluaju da uestalost nije bliska 0,5, to je najee sluaj ak i za ee alele. Za novootkrivene alele (one koji ne postoje u bazi) nije mogue ni priblino raunati uestalost pojavljivanja u bazi. U takvim se sluajevima primjenjuje izraunavanje tzv. granice pouzdanosti iz nulte proporcije: p = 1 1/N N = veliina baze, = 1 razina pouzdanosti (za 95%-tnu razinu pouzdanosti = 0,05). Vrijednost izraunana za novi alel u bazi podataka za amerike bijelce iznosi 0,005, to znai da se s 95%-tnom pouzdanou moe iskljuiti 99,5% populacije kao mogui izvor uzorka, odnosno moramo ukljuiti jednu od 200 osoba iz populacije. Jo jedan pristup izraavanju znaajnosti podudarnosti jest izraavanje odnosa ansi [33, 34]. Odnos ansi je relativna vrijednost mtDNA-dokaza identiteta u odnosu na druge, suprotne hipoteze. Tipian je primjer sudski proces u kojemu su suprotstavljene hipoteze tuiteljstva (da je optuenik doista izvor analiziranog uzorka) i obrane (da je mogue da je izvor uzorka neka druga, nepoznata osoba iz populacije). Vrijednost odnosa ansi vea od jedan sugerira veu vjerojatnost da je identitet utvren mtDNA-metodom stvaran. to je vrijednost vea od jedan, vjerojatnost je vea. U jednostavnom primjeru podudarnosti, bez heteroplazme, vrijednost dokaza da je osoba izvor uzorka iznosi 1,0 (pretpostavlja se potpuna podudarnost ako je osoba doista izvor). Vrijednost dokaza da je rije o nepoznatoj osobi iz populacije zapravo je vjerojatnost pojave odreenog mtDNA alela u populaciji. U ovakvom sluaju odnos ansi zapravo je obrnuta vrijednost uestalosti upitnog alela. Konzer vativnim pristupom u raun bi uvijek trebalo ukljuiti najviu moguu uestalost
67
alela, dakle za prije raunani novootkriveni alel odnos ansi bio bi 1 : 200, dok bi za najuestaliji alel u bazi za amerike bijelce vrijednost bila 1 : 17. Prednost izraunavanja odnosa ansi jest u tome to vjerojatnost da je osoba izvor uzorka moe biti razliita od 1,0, to omoguuje uzimanje u obzir uinaka heteroplazme i mutacija. Slian pristup raunanju odnosa ansi primjena je Bayesova teorema koji uzima u prethodnu ansu, odnosno vjerojatnost svih ostalih ne-mtDNA-dokaza da je osoba izvor uzorka [33, 34]. Praktini problem u primjeni ove metode jest nemogunost brojanog izraavanja vrijednosti veine dokaza. U sudskoj praksi sudskom je vijeu ili poroti preputeno da odreuje vrijednost takvih dokaza. Zadatak je analize mtDNA samo da predstavi imbenik kojim mtDNA-dokaz pojaava bilo kakve prethodne dokaze, bez uputanja u njihovu vrijednost ili znaenje. S obzirom na relativno malu snagu dokaza, koju u nekim sluajevima ima analiza mtDNA, potrebno je katkad osloniti se na prethodne dokaze, jer esto dokaz s pomou mtDNA nije sam za sebe dostatan.
2.3.
Heteroplazma
Heteroplazma je pojava vie od jedne sekvencije mitohondrijske DNA u stanici ili organizmu. Razlika moe biti u sekvenciji, ali i u duljini. Molekule mtDNA u stanicama repliciraju se neovisno jedna o drugoj, a ta je replikacija neovisna o mejotikoj ili mitotikoj diobi stanice. Uz to, mtDNA ima mnogo vii stupanj pogrjeke pri replikaciji od jezgrine DNA [35]. Zbog toga postoji mogunost da se unutar stanice, odnosno organizma nalazi vie razliitih sekvencija mtDNA koje se repliciraju i segregiraju neovisno. Ako bi se razliite sekvencije koje nastaju u stanicama pre-
nosile nekontrolirano na potomstvo, koncept majinskog, ili zapravo bilo kakvog nasljeivanja mtDNA ne bi mogao doi u obzir. Ipak, empirijsko iskustvo pokazuje da je taj koncept ispravan i da najee zaista sva djeca od majke nasljeuju istovjetnu sekvenciju mtDNA. Pojava vie subpopulacija mitohondrijske DNA u organizmu (heteroplazma), katkad se, ipak pojavljuje u ljudi. Uestalost pojave heteroplazme koja je dosadanjim metodama utvrena nije velika (28% u razliitim istraivanjima i populacijama), a kada se utvrdi postojanje heteroplazme u pojedinom sluaju, ono moe biti problem, ali i poveati vjerojatnost identifikacije mtDNA-metodom. U mnogim starijim istraivanjima koja su namjerno tragala za heteroplazmom u tkivima za koja se pretpostavljalo da su podlonija oteenju genoma, npr. ronica [3638], otkriveno je iznenaujue malo varijacija. Mnoga istraivanja koja su analizirala mtDNA pod pretpostavkom homoplazme nisu nale bitne dokaze o postojanju heteroplazme. Jedan je od razloga tumaenje signala koje daje razliita sekvencija kao um, ili artefakt metode, jer se sekvencije ne pojavljuju u jednakim koliinama u tkivima, odnosno stanicama. Novija istraivanja koja su se koristila naprednijom tehnologijom, pokazala su ipak postojanje heteroplazme u odreenom broju sluajeva. Jedan od pr vih, a i najpoznatijih sluajeva u kojima je potvrena heteroplazma jest identifikacija ruske carske obitelji, kada su identificirani skeletni ostatci cara Nikole II. [39, 40]. Mnogi radovi nakon toga potvrdili su postojanje heteroplazme [4143]. Kako je regija koja se rutinski sekvencira u analizi mtDNA relativno mala u odnosu na punu duljinu mtDNA, nemogue je procijeniti stvarnu uestalost heteroplazme na cijelom mitohondrijskom genomu. Druge metode poput denaturirajue visokotlane tekuinske kromatografije (DHPLC) [20] denatu-
68
rirajue gradijent gel-elektoforeze (DGGE) [44, 45] mogu se primijeniti za utvrivanje heteroplazme na cijeloj molekuli mtDNA. Uporabom denaturirajue gradijent-gel elektroforeze u jednom je istraivanju utvrena uestalost heteroplazme od ~14% na uzorku od 253 osobe. Ovako visoka uestalost posljedica je visoke osjetljivosti metode koja moe detektirati komponentu koja ini manje od 1% mjeavine. Metoda sekvenciranja cijele mtDNA moe otkriti heteroplazmu ako je manje zastupljena komponenta mjeavine prisutna u najmanje 1015% [46]. Oito je pri izraavanju suda o homoplazmi ili heteroplazmi odreenog u zorka potrebno naglasiti i osjetljivost metode. Vjerojatno su, ako se uzme u obzir golema mnoina mtDNA molekula u organizmu, svi organizmi heteroplazmini na vrlo niskome stupnju, ali je to najee u praktinoj primjeni analize mtDNA zanemarivo. U mtDNA sekvenciji nemaju sva mjesta jednaki potencijal za heteroplazmu. DGGE istraivanja pokazala su dva vrua mjesta koja su odgovorna za vie od polovine sluajeva heteroplazme: pozicija 16 093 (34% heteroplazmi) i pozicija 16 129 (17% heteroplazmi). Ova vrua mjesta odgovaraju mjestima koja su najodgovornija za raznolikost mtDNA-sekvencija u ljudskoj populaciji i oito je da je heteroplazma dio jednoga jedinstvenog procesa mutiranja mtDNA ija je posljedica dananja varijabilnost. Budui da se u znatnijoj mjeri pojavljuje samo na nekoliko mjesta u mtDNA-sekvenciji, heteroplazma moe dodatno ojaati vrijednost metode analize mtDNA u identifikaciji ljudi. Pojava heteroplazme u ispitivanom uzorku i odgovarajuih sekvencija u referentnom uzorku dodatno moe suziti broj moguih izvora uzorka. Takav nalaz treba uskladiti s modelima po kojima se heteroplazma nasljeuje izmeu generacija, a takoer
po kojima heteroplazma segregira tijekom razvoja organizma. Ovi procesi ukljuuju jedno ili nekoliko genetikih uskih grla koja stvaraju razlike u omjerima sekvencija koje sudjeluju u heteroplazmi u razliitim tkivima, a takoer razlike izmeu srodnika. Najekstremniji sluaj bio bi kada dva srodnika ili dva razliita tkiva naizgled uope ne bi imali heteroplazmu, nego homoplazmu. Teorija o genetikome uskom grlu pretpostavljena je nakon istraivanja segregacije razliitih sekvencija u Hollstein-goveda [47, 48]. Prema toj teoriji, broj razliitih sekvencija mtDNA smanjuje se tijekom jedne od faza razvoja spolnih stanica. Samo mali dio molekula mtDNA prolazi kroz usko grlo da bi se njihovom replikacijom stvorilo 100 000 molekula mtDNA u zreloj jajnoj stanici. Tijekom razvoja ljudske oocite takoer dolazi do djelovanja genetikoga uskog grla. Istraivanjem na 180 parova blizanaca [49] otkrivena je heteroplazma kontrolne regije u etiri sluaja. Procijenjena irina genetikog uskoga grla kree se u rasponu od 3 do 20 molekula mtDNA. ini se takoer da irina grla nije konstantna, nego da se mijenja ak u iste osobe [50]. Heteroplazma otkrivena u uzorku moe biti vrlo koristan nalaz, no isto tako moe i znatno zakomplicirati utvrivanje podrijetla uzorka. Ve je spomenuto da, ako ispitivani i referentni uzorak imaju heteroplazmu istih sekvencija mtDNA, pri raunanju znaajnosti takve podudarnosti mnogostruko raste vjerojatnost da ispitivani uzorak zaista potjee od osobe davatelja referentnog uzorka. Mogue je takoer da djelovanjem genetikih uskih grla doe do razdvajanja heteroplazme tijekom razvoja razliitih tkiva ili tijekom nasljeivanja. Primjer moe biti sluaj identifikacije posmrtnih ostataka u kojima analizom kosti nije naena heteroplazma koja postoji u srodnika. Ekstremni primjer bio bi da je segre-
69
gacija dovela do potpuno razliitih homoplazmi u dvaju srodnika. Takvi sluajevi, naravno, ne mogu biti pozitivno identificirani ovom metodom. Mogue je takoer da razliita tkiva, primjerice krv kao referentni uzorak i dlaka s mjesta zloina zbog razliita djelovanja uskih grla imaju razliite sekvencije. Identifikacija je i u ovom sluaju nemogua. Heteroplazma u referentnom uzorku koja ima visoki udio (npr. 90 : 10) jedne sekvencije ne mora iskljuiti osobu kao mogui izvor uzorka ak i ako je u uzorku prisutna samo sekvencija manje zastupljena u heteroplazmi. Ovakvo neiskljuivanje, s druge strane, ne daje nikakvu mogunost izraunavanja vjerojatnosti da je ispitivana osoba izvor uzorka. O utjecaju genetikih uskih grla potrebno
je razmiljati i u kontekstu mjesta na kojem se razlika pojavljuje. Ako je rije o uzorcima koji pokazuju heteroplazmu na tipinome mjestu, a, osim te jedne razlike, imaju istovjetnu sekvenciju koja je, uz to, vrlo rijetka ili novootkrivena, s velikom vjerojatnou moe se sumnjati da je rije o heteroplazmi koja je razdvojena djelovanjem uskih grla. Ako je pak rije o sekvencijama koje se razlikuju na mjestu na kojem dotad uope nije bila zapaena mutacija, a zajedniki dio sekvencije pripada jednoj od najeih sekvencija u populaciji, nemogue je iskljuiti osobu kao izvor, ali je ta mogunost mnogo manje vjerojatna nego u prethodnom sluaju. Prezentacija znaajnosti podudarnosti u takvim sluajevima trebala bi se oslanjati na odnos ansi.
Literatura
1. Gray MW., The endosymbiont hypothesis revisited. Int Rev Cytol 1992;141:233357. 2. Michaels GS, Hauswirth WW. and Laipis PJ. Mitochondrial DNA copy number in bovine oocytes and somatic cells. Dev Biol 1982;94(1): 24651. 3. Piko L. and Matsumoto L. Number of mitochondria and some properties of mitochondrial DNA in the mouse egg. Dev Biol 1976;49(1):110. 4. Bogenhagen D. and Clayton DA. The number of mitochondrial deoxyribonucleic acid genomes in mouse L and human HeLa cells. Quantitative isolation of mitochondrial deoxyribonucleic acid. J Biol Chem 1974;249(24):79915. 5. Robin ED. and Wong R. Mitochondrial DNA molecules and virtual number of mitochondria per cell in mammalian cells. J Cell Physiol 1988;136(3):50713. 6. Langb BF. et al. An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature, 1997;387(6632):4937. 7. Arnheim N. and Cortopassi G. Deleterious mitochondrial DNA mutations accumulate in aging human tissues. Mutat Res 1992;275(36):15767. 8. Wallace DC. Mitochondrial genetics: a paradigm for aging and degenerative diseases? Science, 1992; 256(5057):62832. 9. Anderson, S. et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 1981;290(5806):45765. 10. Wallace DC. et al. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. Annu Rev Genet, 2005;39(3):359407. 11. Parson W. et al. Population data for 101 Austrian Caucasian mitochondrial DNA D-loop sequences: application of mtDNA sequence analysis to a forensic case. Int J Legal Med 1998;111(3):12432. 12. Coble MD. et al. Effective strategies for forensic analysis in the mitochondrial DNA coding region characterization of new miniSTR loci to aid analysis of degraded DNA a multiplex allele-specific primer extension assay for forensically informative SNPs distributed throughout the mitochondrial genome. Int J Legal Med 2006;120(1):2732. Epub 2005 Oct 28.
70
13. Chuang LY. et al. V-MitoSNP: visualization of human mitochondrial SNPs. BMC Bioinformatics 2006;7:379. 14. Coble MD. et al. Effective strategies for forensic analysis in the mitochondrial DNA coding region a multiplex allele-specific primer extension assay for forensically informative SNPs distributed throughout the mitochondrial genome. Int J Legal Med 2006;120(1):2732. Epub 2005 Oct 28. 15. Parsons TJ. and Coble MD. Increasing the forensic discrimination of mitochondrial DNA testing through analysis of the entire mitochondrial DNA genome. Croat Med J 2001;42(3):3049. 16. Attimonelli M. et al. MitBASE: a comprehensive and integrated mitochondrial DNA database. Nucleic Acids Res 1999;27(1):12833. 17. Chen X. et al. Rearranged mitochondrial genomes are present in human oocytes. Am J Hum Genet 1995;57(2):23947. 18. Manfredi G. et al. The fate of human sperm-derived mtDNA in somatic cells. Am J Hum Genet 1997;61(4):95360. 19. King MP. and Attardi G. Injection of mitochondria into human cells leads to a rapid replacement of the endogenous mitochondrial DNA. Cell 1988;52(6):8119. 20. Underhill PA. et al. Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing high-performance liquid chromatography. Genome Res 1997;7(10):9961005. 21. Gyllensten U. et al. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice. Nature, 1991;352(6332): 2557. 22. Kaneda H. et al. Elimination of paternal mitochondrial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(10):45426. 23. Parsons TJ. et al. A high obser ved substitution rate in the human mitochondrial DNA control region. Nat Genet 1997;15(4):3638. 24. Melton T, Nelson K. Forensic mitochondrial DNA analysis: two years of commercial casework experience in the United States. Croat Med J, 2001;42(3):298303. 25. Primorac D, Schanfield MS. Application of forensic DNA testing in the legal system. Croat Med J 2000;41(1):3246. 26. Gabriel MN. et al. Population variation of human mitochondrial DNA hyper variable regions I and II in 105 Croatian individuals demonstrated by immobilized sequence-specific oligonucleotide probe analysis. Croat Med J 2001;42(3):32835.
27. Divne AM, Allen M. A DNA microarray system for forensic SNP analysis. Forensic Sci Int. 2005;154(23):11121. Epub 2004 Dec 2. 28. Miller KW, Budowle B. A compendium of human mitochondrial DNA control region: development of an international standard forensic database. Croat Med J 2001;42(3):31527. 29. Handt O, Meyer S, von Haeseler A. Compilation of human mtDNA control region sequences. Nucleic Acids Res, 1998;26(1):1269. 30. Ruiz-Pesini E. et al. An enhanced MITOMAP with a global mtDNA mutational phylogeny. Nucleic Acids Res 2007;35(Database issue):D823-8. Epub 2006 Dec 18. 31. Council N. DNA Technology in Forensic Science. 1991: National Academy Press. 32. Eaton OH Jr, C.J., Florida vs. James Edward Cron. Order determining scientific evidence does not meet frye standard. 1998. 33. Council N. The Evaluation of Forensic DNA Evidence. 1996: National Academy Press. 34. Evett I, Wier BS. Interpreting DNA Evidence. 1998, Sunderland, MA: Sinauer Associates. 35. Kunkel TA, Loeb LA. Fidelity of mammalian DNA polymerases. Science 1981;213(4509):765 7. 36. Bodenteich A, Mitchell LG, Merril CR. A lifetime of retinal light exposure does not appear to increase mitochondrial mutations. Gene 1991;108(2):305 9. 37. Monnat RJ Jr., Loeb LA. Nucleotide sequence preser vation of human mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82(9):28959. 38. Monnat RJ Jr., Reay DT. Nucleotide sequence identity of mitochondrial DNA from different human tissues. Gene 1986;43(3):20511. 39. Gill P. et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nat Genet 1994;6(2):1305. 40. Ivanov PL. et al. Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the Grand Duke of Russia Georgij Romanov establishes the authenticity of the remains of Tsar Nicholas II. Nat Genet 1996;12(4):41720. 41. Comas D, Paabo S, Bertranpetit J. Heteroplasmy in the control region of human mitochondrial DNA. Genome Res 1995;5(1):8990. 42. Howell N, Kubacka I, Mackey DA. How rapidly does the human mitochondrial genome evolve? Am J Hum Genet 1996;59(3):5019. 43. Mumm S. et al. mtDNA analysis shows common ancestry in two kindreds with X-linked recessive hypoparathyroidism and reveals a heteroplasmic si-
71
lent mutation. Am J Hum Genet 1997;60(1):153 9. 44. Hanekamp JS, Thilly WG, Chaudhry MA. Screening for human mitochondrial DNA polymorphisms with denaturing gradient gel electrophoresis. Hum Genet 1996;98(2):2435. 45. Steighner RJ, Holland M. Amplification and sequencing of mitochondrial DNA in forensic casework. Methods Mol Biol 1998;98:21323. 46. Wilson MR. et al. Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts. Biotechniques 1995;18(4):6629.
47. Hauswirth WW, Laipis PJ. Mitochondrial DNA polymorphism in a maternal lineage of Holstein cows. Proc Natl Acad Sci USA 1982;79(15): 468690. 48. Hauswirth WW. et al. Heterogeneous mitochondrial DNA D-loop sequences in bovine tissue. Cell 1984;37(3):10017. 49. Bendall KE. et al. Heteroplasmic point mutations in the human mtDNA control region. Am J Hum Genet 1996;59(6):127687. 50. Dunbar DR. et al. Different cellular backgrounds confer a marked advantage to either mutant or wild-type mitochondrial genomes. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(14):65626.
72
3.
Mjesto dogaaja i analiza tragova naenih u kriminalistikoj obradbi

imun Anelinovi, Marija Definis-Gojanovi, Davorka Sutlovi
Sadraj poglavlja
3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. Postupci na mjestu dogaaja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 3.1.1. Obdukcija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Openito o tragovima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Bioloki tragovi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 Prikupljanje i pohrana biolokih tragova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Tragovi ljudskoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.5.1. Krv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.5.1.1. Analiza tragova krvi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.5.1.2. Prikupljanje tragova krvi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 3.5.2. Sperma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 3.5.2.1. Analiza tragova sperme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.5.2.2. Prikupljanje tragova sperme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.5.3. Ostale tjelesne izluine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3.5.3.1. Prikupljanje tragova. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3.5.4. Tkiva, organi i kosti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.5.5. Dlake i kosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.5.5.1. Analiza tragova dlaka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.5.5.2. Prikupljanje tragova dlaka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Tragovi ivotinjskoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Tragovi biljnoga, mineralnoga i sintetikoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 Primjeri iz prakse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.6. 3.7. 3.8.
3.1.
Postupci na mjestu dogaaja
Mjesto dogaaja (engl. crime scene) obino je definirano kao mjesto na kojemu se dogodio kriminalni in. Pod tim pojmom razumijeva se u makroskopskome smislu cijela regija, a
ne samo odreena lokacija; tako tijelo rtve i svaki dio sredstva kojim je poinjen zloin takoer ini mjesto dogaaja. Nadalje, svako drugo mjesto i osoba ukljueni u zloin ulaze u kontinuitet mjesta dogaaja. Mjesto na kojemu je poinjen zloin naziva se primarnim mjestom, a u sluaju naknadnoga prijenosa tijela ili sred-
73
73
stva poinjenja zloina novo mjesto naziva se sekundarnim. U mikroskopskome smislu svaki objekt ili dio materijala povezan s mjestom zloina smatra se dijelom mjesta dogaaja. Za pravilno rjeenje svakoga pojedinog sluaja potrebne su makroskopska i mikroskopska analiza mjesta dogaaja te dovoenje u loginu vezu sa rtvom ili s poiniteljem zloina [1]. Mjesto dogaaja u pravilu je velika povrina s brojnim tragovima i predmetima. Stoga je potrebno da istraiva mjesta dogaaja ima sposobnost inicijalnog odreivanja broja mjesta dogaaja, osobitosti svakoga mjesta te granice i stanje svakoga mjesta dogaaja. Dakle, bt cijeloga procesa pretraivanja mjesta dogaaja ima za svrhu utvrivanje i prikupljanje samo vanih dokaza i tragova koji mogu dovesti do rjeavanja zloina i otkrivanja poinitelja. Stoga su iskustvo i strunost dvije najvanije odrednice tima za oevid [25]. Oevid je postupovna radnja kojom se vane injenice vezane uz mjesto poinjenja kaznenoga djela prikupljaju neposrednim opaanjem. Neposrednost u uoavanju vanih injenica jest neposredno znanje tijelima koji provodi postupak, to oevidu daje dodatnu teinu i vanost. Oevid se moe definirati kao niz taktiko-tehnikih mjera koje se provode na mjestu dogaaja. Kao rezultat oevida istrani sudac ili policijski strunjaci sastavljaju zapisnik o oevidu koji slui kao dokaz o provedenom oevidu kojim se biljee najvanije injenice kako bi se mogle obraditi, a cjelokupna radnja oevida podvrgnuti analizi. Obino se, uz zapisnik o oevidu, izrauje i skica mjesta dogaaja i fotoelaborat o oevidu [25]. Svaki se oevid sastoji od statinog i dinaminog dijela, iako se ova dva naina preg leda mjesta dogaaja meusobno preklapaju. U pr vom dijelu oevida prevladava statini nain pregleda bez micanja predmeta. U sta-
tinom dijelu oevida potrebno je poduzeti sljedee radnje: osiguranje mjesta dogaaja opis mjesta dogaaja i obiljeivanje tragova fotografiranje i videozapis izradba skice mjesta dogaaja u mjerilu. U dinaminom dijelu oevida pr vi put se pomiu predmeti i tragovi, i to ovim redom: prikupljanje fizikalnih, kemijskih i biolokih tragova s mjesta dogaaja, njihovo pakiranje, oznaivanje i priprema za transport u sudskomedicinski laboratorij, zapisivanje vanih injenica koje se nau pri okretanju predmeta ili pregledom tijela. Svaki bi oevid trebao poeti osiguravanjem mjesta dogaaja. Potrebno je odrediti slubenu osobu za oznaivanje mjesta dogaaja, sa svrhom kontrole ulaska drugih osoba. Voditelj tima za oevid dolazi na mjesto dogaaja i, nita ne dirajui (s rukama u depovima!), opisuje mjesto dogaaja: datum, vrijeme, vremenske prilike, nazone, meusobne udaljenosti predmeta. Dobar zapisnik o oevidu treba odgovoriti na pitanja: tko, to, gdje, kada, zato i kako?. Nakon ovog opisa voditelj tima imenuje osobu koja e prikupljati tragove, fotografirati tragove i uzimati otiske prstiju i sl. [6]. Fotografiranjem i videozapisom treba zabiljeiti poziciju tragova i predmeta i njihov meusobni odnos na mjestu dogaaja. Ope pravilo fotografiranja treba biti da se slike rade od opih kadrova prema specifinima, kako bi se izbjegla zbrka, a svi predmeti i dokazi moraju biti oznaeni specifinim oznakama i brojevima koji se daju pri oevidu. Skica mjesta dogaaja radi se prije pomicanja i uzimanja tragova, odreuju se strane svijeta na mjestu dogaaja, a predmeti se lociraju na skici mjerenjem udaljenosti od fiksne mjerne toke i njihovih meusobnih udaljenosti [1].
74
3.1.1.
Obdukcija
Sudski medicinari, kao istraitelji smrti, obavljajui obdukciju (sekciju ili razudbu) mrtvoga tijela, pregledom svih njegovih vanjskih i unutarnjih dijelova, postiu da se utvrdi to je smrti prethodilo. Obdukcija je vrsta dijagnostike metode kojoj je svrha utvrivanje uzroka, mehanizma, naina i vremena smrti, te utvrivanje postojanja i vrsta ozljeda, vremena i mehanizma njihova nastanka, kao i njihove mogue povezanosti sa smru. Osim toga, obdukcijom se utvruje i sve druge okolnosti i imbenike koji mogu biti ukljueni u nastupanje smrti. Konano, ovime se razluuje prirodna od neprirodne nasilne smrti, ime se zatiuju nedune osobe u sluajevima sumnjivih i naprasnih smrti, te smrti nepoznata uzroka [7]. Rezultat obdukcije jest injenino, objektivno sudskomedicinsko izvjee koje slui sucima, tuiteljima i obrani u daljnjemu sudskom procesu. Zakon o kaznenom postupku regulira sluajeve u kojima je potrebno obavljanje sudskomedicinske obdukcije. To su sluajevi kad postoji sumnja ili je oito da je smrt prouzroena kaznenim djelom ili je u vezi s izvrenjem kaznenoga djela. Ako je tijelo ve pokopano, obavit e se njegova ekshumacija (iskopavanje) i potom obdukcija. Prije obdukcije obvezno je utvrditi identitet pokojnika (l. 258.262. ZKP RH) [8]. Cjelovita sudskomedicinska obdukcija ili poslijesmrtna pretraga ukljuuje sljedee postupke: 1. pretragu mjesta dogaaja, 2. identifikaciju tijela, 3. prikupljanje materijalnih tragova s tijela i odjee, 4. vanjski i unutarnji pregled tijela, uz mikroskopsku analizu isjeaka tkiva i organa,
5. toksikoloku pretragu tjelesnih tekuina i organa. Sudska obdukcija zahtijeva medicinskokriminalistiki pristup te je, u pravilu, obavlja vjetak specijalist sudske medicine u nazonosti istraitelja i kriminalistikog tehniara. Pri tome je njihov zadatak da, u meusobnoj suradnji, pravilno uoavaju, fiksiraju, prikupljaju, pohranjuju i tumae najrazliitije materijalne tragove, pa tako i one biolokog podrijetla, koji se mogu nai na odjei i na mrtvome tijelu. Ako izuzimanje, pakiranje i obiljeivanje dokaza u obliku tragova nije obavljeno po svim pravilima struke (kriminalistike tehnike i drugih znanosti) dovodi se u pitanje njihov identitet istovjetnost i integ ritet nepovrjedivost, a time i njihova dokazna valjanost.
3.2.
Openito o tragovima
Trag se moe definirati kao svaka materijalna promjena nastala u vezi s kaznenim djelom. Tragovi upuuju na postojanje kaznenoga djela, te na nain i sredstvo izvrenja. Oni su dokaz koji moe neovisno i objektivno povezati osumnjienog, odnosno rtvu s objektom ili mjestom kriminalnog dogaaja ili pak povezati osumnjienog sa rtvom. Osim toga, upuuju na motiv izvrenja kaznenoga djela, kao i na identitet nepoznatog poinitelja ili rtve, a mogu pridonijeti utvrivanju je li mjesto dogaaja zaista ono mjesto na kojemu se kriminalno djelo i dogodilo. Ovo, posljednje vano je zbog injenice to tragovi mogu nastati na dva naina: neposrednim kontaktom s tijelom ili odjeom osobe, predmetom ili mjestom dogaaja, te posredno prenoenjem na rtvu, poinitelja, svjedoka, predmet ili mjesto dogaaja (tzv. sekundarni prijenos) [25]. Na licu mjesta poinjenja kaznenoga djela forenziari su esto u dvojbi
Mjesto dogaaja i analiza tragova na enih u kri mi na lis tikoj obrad bi
75
koji trag izuzeti pr vi. Je li to otisak prsta ili su to bioloki tragovi za DNA-analizu, to prije to je poznato da pojedini daktiloskopski reagensi bitno utjeu na kvalitetu i koliinu DNA, a isto tako etkica za nanoenje reagensa moe prenijeti bioloke mikrotragove s jednoga mjesta na drugo (sl. 3-1). Pri tome treba imati na umu da se materijalni tragovi pojavljuju u dvama oblicima [6]: u kvantitativnom obliku koliina: mikrotragovi (nisu vidljivi okom) i makrotragovi (oku vidljivi) u kvalitativnom obliku vrsta: bioloki, kemijski, fizikalni i ostali (tabl. 3-1). Postoje brojne klasifikacije tragova, od one prema vrsti kaznenoga djela, vrsti materijala, nainu nastanka te do klasifikacije prema njihovu podrijetlu. Ova posljednja klasifikacija ima veliku vrijednost kao podsjetnik pri izboru najpogodnijih metoda za prikupljanje i uvanje
dokaznog materijala. U toj skupini razlikuju se bioloki (primjerice krv, sperma, slina), kemijski (vlakna, zemlja, droge), fizikalni (otisci prstiju i stopala, tragovi vatrenog oruja i orua) i ostali tragovi (poligraf, snimka glasa) [1].
3.3.
Bioloki tragovi
Bioloki tragovi u iremu smislu oznauju materijalne promjene na svim ivim biima, biljkama, ivotinjama, ljudima i one koji potjeu od njih, dok bioloki tragovi u uemu smislu oznauju tragove koji su ljudskog podrijetla. U novije se vrijeme sve ee daje vanost pronalasku biolokih tragova koji su u vezi s poiniteljem kaznenoga djela kao to su dlake kunih ljubimaca ili neke specifine biljke. Bioloki tragovi ljudskoga podrijetla (u uemu smislu) mogu se podijeliti s
Slika 3-1. Otisak prsta s daktiloskopskim prahom i krvi.
76
Tablica 3-1. Podjela tragova Bioloki krv sperma slina ostale izluine kosa biljni tragovi kosti tkivo Kemijski vlakna kemikalije staklo zemlja barut metal minerali droga Fizikalni otisci prstiju oruje rukopis crte otisci Ostali marka odjee analiza glasa poligraf fotografije
obzirom na to sadravaju li DNA ili ne [1]. Nuklearna (jezgrina) DNA moe se uspjeno izolirati iz: 1. kr vi i kr vnih mrlja, 2. sperme, 3. kose s korijenima, 4. sline, 5. mokrae i stolice, 6. tkiva i stanica, 7. kosti i organa. Ljudske izluine i tragovi iz kojih se ne moe dobiti DNA, jer nemaju stanica s jezgrom, jesu: 1. serum (tekui dio kr vi bez stanica), 2. suze, 3. znoj i slino. Postupci prikupljanja i uvanja tragova mogu znatno utjecati na uspjenost analize DNA pa je potrebno udovoljiti trima temeljnim uvjetima. Prvi je koliina uzorka, zbog ega je potrebno prikupiti to je mogue veu koliinu traga kako bi se osigurala dovoljna koliina DNA za daljnju analizu. Drugo je kakvoa, odnosno stanje traga. Poradi mogunosti
razgradnje ili oneienja bakterijama zbog dugotrajnijega stajanja potrebno je prikupljeni trag to hitnije dostaviti u laboratorij, a do zapoinjanja rada trag uvati na hladnom i suhom mjestu. Trei je imbenik istoa uzorka. Stoga je bitno izbjegavati uzimanje prljavtina i masnoa iz okruenja traga, jer je znano da ove neistoe sprjeavaju proces analize DNA [1, 9]. Bioloki se tragovi mogu na dva naina prenijeti na osobe i predmete: izravno (primarno) ili posredno (sekundarno). ak i iz materijala kao to je eluani sok ili stanice izmeta mogue je izolirati DNA, ali je tekoa u dobivanju njihove dostatne koliine potrebne za analizu DNA [10]. Izravni prijenos biolokih tragova, kao to su krv, sperma i slino, na osobe ili njihovu odjeu ili na objekte i mjesta dogaaja podrazumijeva izravni rasap ovih uzoraka pri kaznenom djelu. Posredni ili sekundarni prijenos podrazumijeva da npr. osoba pokupi kosu rtve sa sjedala automobila i prenese je u drugi automobil. Ovo treba imati na umu zato da pogrjenu osobu ne bismo doveli u izravnu vezu s poinjenjem zloina [1].
77
3.4.
Prikupljanje i pohrana biolokih tragova
Uspjenost DNA-analize na biolokim tragovima s mjesta dogaaja ovisi o vrsti dobivenog uzorka, kao i o njegovoj ouvanosti. Da bi se rezultati DNA-analize uope mogli iskoristiti na sudu kao dokaz, uzorak mora biti pravilno opisan u zapisniku o oevidu, pravilno preuzet s mjesta dogaaja, zapakiran i spremljen te transportiran do sudskomedicinskog laboratorija, gdje e biti adekvatno obraen po standardiziranoj i prihvaenoj metodi. Loa pohrana uzoraka moe dovesti do njegove deg radacije i neupotrebljivosti. Zbog toga se treba drati uputa za prikupljanje biolokih tragova [1, 9, 11]. Bioloki su tragovi specifini, jer mogu biti zarazni te se prenijeti na osobu koja prikuplja bioloke tragove. Nadalje, potrebno je izbjei svako sekundarno oneienje biolokih tragova ili stanicama koje sadravaju DNA sakupljaa tragova (stanice povrinskog dijela koe i slino) ili kontaminacijom uzorak-uzorak. Primjer za to moe biti neadekvatna pohrana dvaju uzoraka zajedno u jednoj vrei. Na taj je nain logino oekivati da e provedena osjetljiva DNA-analiza i njeni rezultati biti upitni. Preporuljivo je da sakuplja biolokih tragova nosi dvostruke sterilne rukavice. Donje rukavice slue kao njegova zatita od kontakta sa zaraznim materijalom, a gornje se mijenjaju pri uzimanju biolokog uzorka po pravilu jedan uzorak i jedan par rukavica. Nadalje, potrebno je striktno pridravanje uputa za prikupljanje biolokih tragova, a koje se mogu podijeliti na upute na mjestu dogaaja i na upute u sudskomedicinskom laboratoriju [1]. Pri radu na mjestu dogaaja prigodom prikupljanja tragova potrebno je napraviti sljedee: 1. obiljeene tragove fotografirati,
2. napraviti videozapis tragova i njihova poloaja na mjestu dogaaja, 3. zapisati mjesto i stanje uzorka, 4. napraviti skicu i ucrtati mjesto uzorka i njegov odnos s drugim uzorcima i okolnim predmetima. Prigodom primanja biolokoga traga u forenzinom laboratoriju treba napraviti sljedee [1, 9]: 1. prikupiti svaki pojedinani komad materijala uporabom istoga pribora, 2. zasebno pakirati svaki pojedinani komad prikupljenog materijala 3. opisati i skicirati zaprimljeni materijal, 4. biljeiti nain pakiranja i njegov broj, 5. dati uzorku novi laboratorijski broj s datumom, 6. provjeriti broj pod kojim je uzorak poslan i usporediti ga sa zapisnikom o oevidu, 7. opisati uzorak, njegovo stanje i fotografirati ga s laboratorijskim brojem i brojem pod kojim je poslan u laboratorij, 8. provjeriti opis uzorka s njegovim stanjem da bismo se uvjerili je li rije upravo o tom uzorku i je li pri transportu oteen, 9. pohraniti uzorke na odgovarajua mjesta (temperatura, svjetlost itd.). Tijelo dopremljeno radi pregleda i obdukcije moe se razodjenuti iz plahte tek u prisutnosti lijenika vjetaka/istraitelja. Dopustiti da se mrtvo tijelo dopremljeno s mjesta dogaaja svue i opere prije vanjskoga pregleda isto je to i dopustiti da se mjesto dogaaja oisti prije poetka oevida. S kriminalistikoga stajalita to znai unitenje tragova. Prije skidanja odjevnih predmeta treba detaljno opisati vidljive tragove, oteenja i promjene na odjei, obui i nepokrivenim dijelovima tijela, bez obzira na to to je to uinjeno i na mjestu dogaaja, osobito u dinaminoj fazi oevida
78
[6]. Tijekom kriminalistike obradbe treba potovati i integritet traga. Pravilnim prikupljanjem i pakiranjem, te odgovarajuim uvanjem i transportom sprjeavaju se kvalitativne i kvantitativne, sluajne ili namjerne promjene traga. Prigodom prikupljanja bilo koje vrste biolokog materijala potrebno je drati se opih mjera opreza koje vrijede pri rukovanju kr vlju i tjelesnim izluinama, a to ukljuuje izbjegavanje neposrednog kontakta i zabranu pijenja, jedenja i puenja tijekom obavljanja poslova u vezi s biolokim uzorcima. Pri tome treba raditi u zatitnim rukavicama i u odgovarajuoj zatitnoj odjei i obui, a sva oprema za prikupljanje tragova mora biti potpuno ista. Za svaki uzeti uzorak potrebno je u zapisnik unijeti to je i odakle uzeto, kako je pakirano i oznaeno, te tko je uzorak preuzeo [1]. Mogunost uspjeha analize DNA znatno ovisi o vrsti prikupljenih biolokih tragova i o nainu njihova izuzimanja i osiguravanja. Ako se nepravilno prikupljaju i pakiraju, mogu se kontaminirati, a ako se ispravno ne uvaju, mogu se razgraditi. Bioloki trag nastao neposrednim kontaktom ili posrednim prijenosom ostaje na podlozi zbog upijanja (ako je u tekuemu stanju) ili prianjanja (ako je sasuen). Izbor metode prikupljanja uglavnom ovisi o stanju traga i o vrsti podloge [1, 9]. Vano je drati se pravila da se odjea skida, a samo iznimno ree po avovima. Suhi odjevni predmeti pojedinano se pakiraju i oznauju, dok se vlani odjevni predmeti prethodno sue na zraku. Nakon skidanja sve odjee, plahta u koju je le bio umotan i na kojoj je svuen, slae se tako da u njoj ostanu eventualno otpali tragovi, te se i ona posebno pakira. Odjea i obua obvezno se pohranjuju u papirnate vree. Prikupljene tragove, kao i pokojnikovu odjeu i obuu, treba hitno dostaviti u labora-
torij za DNA-analizu, a do zapoinjanja rada treba ih uvati na hladnom i suhom mjestu.
3.5.
Tragovi ljudskoga podrijetla

Krv
3.5.1.
Forenzina hematologija bavi se odreivanjem kr vnih osobina, bilo da je rije o svjeoj kr vi bilo o tragovima kr vi, na mrtvim ili ivim osobama, a za potrebe identifikacije u kaznenim i graanskim postupcima. Tragovi kr vi susreu se u mnogim kaznenim djelima i mogu biti vaan dokazni materijal koji povezuje poinitelja, dotino djelo i rtvu [7]. Tragovi kr vi nastaju na tri naina: slijevanjem niz tijelo, pri emu nastaju pruge, a krv se upije u odjeu ili nakupi na podlozi u obliku lokve, padanjem na podlogu jednostavnim kapanjem s visine zbog sile tee, pri emu nastaju kapi, ili prskanjem aktivnom silom, pri emu nastaju prskotine, te prenoenjem dodirom na drugi predmet, pri emu nastaju otisci ili brisotine [6].
3.5.1.1.
Analiza tragova krvi
a) Identifikacija kr vi potjee li mrlja od krvi? Svjei trag kr vi relativno je jednostavno prepoznati. No, ovisno o eventualnom ispiranju, starosti mrlje, podlozi i djelovanju vanjskih imbenika, tragovi mogu izmijeniti svoju osnovnu boju i vie ne nalikovati na krv [1, 9, 11]. Postoje i tragovi nalik na krv, kao to su mrlje od okolade, voa, vina, boje i slino. Zbog toga se, u nekim sluajevima, a radi pravilnijeg i breg usmjerivanja istrage, primjenjuju jednostavne orijentacijske meto-
79
de koje nemaju dokaznu vrijednost, ali mogu s odreenim stupnjem vjerojatnosti pokazati potjee li ispitivana mrlja od kr vi. Ovakve se probe temelje na reakciji sastojaka hemoglobina u kemijskim reagensima. Pretrage koje se mogu izvesti jesu: benzidinska proba uporabom filtrirnog papira kojim se protrlja sumnjiva mrlja, a potom na mjesto dodira s mrljom kapne otopina benzidina i nakon toga peroksida. Ako mrlja potjee od krvi, na filtrirnom e se papiru pojaviti intenzivna tamnoplava boja. Sangur-test uporabom tvorniki pripremljene testne-trake koja se ovlai destiliranom vodom, pritisne na sumnjivo mjesto, te nakon nekoliko sekunda odigne od mrlje. Intenzivno obojenje trake dokaz je pozitivne reakcije. luminolna proba uporabom otopine luminola koja se raspruje po veim povrinama na kojima su tragovi isprani. U prisutnosti kr vi povrina e svijetliti svijetlo ljubiastim sjajem. Postupak se mora izvoditi u potpunom mraku. fenolftaleinska proba (Kastle-Mayerov reagens) uporabom vatenoga tapia navlaenog fiziolokom otopinom koji se protrlja po sumnjivoj mrlji. Zatim se na vatu kapne fenolftalein, a potom kap 3%-tna vodikova peroksida. Kod pozitivne reakcije, tijekom 15 sekunda, dolazi do promjene boje vate u ruiastu do cr venu. leukomalahitska proba (LMG) koja se provodi na isti nain kao fenolftaleinska, a pozitivna reakcija jest gotovo trenutana pojava zelenkastoplavog obojenja. Pozitivna reakcija koja se dobije uporabom bilo koje od opisanih metoda samo upuuje na prisutnost kr vi i ne upozorava na njezino podrijetlo. Zbog toga se svakako moraju izvesti i potvrdne probe koje se provode u laboratoriju. Ako je koliina traga mala, po-
trebno je u laboratorij dostaviti itavu mrlju bez izvoenja prethodnih proba. b) Odreivanje podrijetla krvi je li posrijedi ljudska krv? Analizom treba dokazati specifine ljudske proteine. U tu se svrhu izvodi imunoloki precipitinski test pri kojemu antihumani serum daje s odreenim bjelanevinama iz ljudske kr vi uoljivu reakciju taloenja, koja izostaje ako je rije o ivotinjskoj kr vi. Na ovaj je nain mogue odrediti krv i bilo koje ivotinjske vrste ako se prirede odgovarajui precipitinski serumi. c) Odreivanje genetikih biljega Ovo ukljuuje odreivanje antigena cr venih kr vnih stanica, izoenzima, serumskih bjelanevina, vrsta hemoglobina, sustava ljudskih leukocitnih antigena (HLA), te DNA analizu. d) Odreivanje biljega koji nisu nasljedni Ovo ukljuuje odreivanje starosti kr vne mrlje, menstrualne kr vi (nalaz stanica iz maternice), spola (razlikovanje izgleda bijelih kr vnih stanica), dobi (odreivanje fetalnog hemoglobina) i rase. Takoer, moe se odrediti ima li u tragovima kr vi primjesa i nekih drugih tkiva (koe, dlaka i sl.).
3.5.1.2.
Prikupljanje tragova krvi [1, 9, 11]
a) Odjea: osuiti na zraku na sobnoj temperaturi ne izlagati neposrednoj Sunevoj svjetlosti svaki odjevni predmet pakirati u zasebnu papirnatu vreicu nikad ne rabiti plastine vreice ili hermetiki zatvorenu ambalau jer e ubrzani proces truljenja degradirati bioloki materijal
80
pakirati tako da se sprijei protresanje ili trenje pravilno oznaiti i pohraniti (na suhom, hladnom i tamnom mjestu do dostavljanja u laboratorij).
b) Tekui uzorci: 5 mL kr vi prikupiti u vakuumsku epruvetu s etilendiaminotetraacetatnom kiselinom (EDTA) koja slui kao antikoagulans. Ako treba provesti i druge analize (seroloke, alkohola, droga, otrova i sl.), potrebno je uzeti dodatne uzorke krvi, pri emu se uzorcima za seroloka ispitivanja i analize na otrove ne dodaju sredstva za konzer viranje, dok epruvete za analizu na alkohol i/ili droge trebaju sadravati natrijev fluorid (NaF) koji slui kao antikoagulans i konzer vans; pravilno oznaiti, pohraniti u hladnjak na +4 C i to prije dostaviti u laboratorij; ako se uzorak za DNA-analizu ne moe dostaviti unutar nekoliko dana, potrebno ga je zamrznuti na 20 C i zamrznutog dostaviti na analizu, dok se ostali uzorci ne smiju zamrzivati; alternativna metoda: komadi istoga pamunog zavoja umoiti u tekuu krv, osuiti na zraku i omotati papirom ili kapnuti nekoliko kapi na filtrirni papir (FTA-kartica). c) Tragovi na ljudskom tijelu: sve podrobno dokumentirati i opisati (poloaj, dimenzije, koliinu i oblik traga); trag prikupiti tako da se izuzme to je mogue manje epitelnoga tkiva koe, a to se obavlja prikupljanjem s pomou ljepljive vrpce ili s pomou tampona vate (tapi za uzimanje obriska) navlaenog destiliranom vodom ili fiziolokom otopinom; tragovi ispod noktiju prikupljaju se s pomou iste akalice, a sami nokti rezanjem
istim noicama; svaki nokat i svaku akalicu treba pakirati zasebno; pravilno oznaiti i pohraniti. d) Sasuene mrlje: dokumentirati i opisati; ako je mogue, itav predmet s tragovima kr vi dostaviti u laboratorij; u suprotnome dio s tragovima izrezati i zapakirati; ako su mrlje na vrstoj, neupijajuoj podlozi, mogue ih je sastrugati na list papira, izuzeti s pomou ljepljive vrpce ili trljanjem s pomou navlaenog tampona vate koji se potom na zraku osui. Mogue je trag i razrijediti dokapavanjem destilirane vode, te ga s pomou pipete prenijeti u suhu boicu ili epruvetu; svaki izrezani komad s tragom ili izuzeti trag zasebno pakirati, propisno oznaiti i pohraniti. Slike (3-13. do 3-15.). prikazuju preuzimanje uzoraka za DNA analizu: tragovi kr vi na nou i komadima stakla.
3.5.2.
Sperma
Tragovi sperme uobiajeno su povezani sa spolnim nasiljem, iako mogu biti vaan dokaz i u drugim kaznenim djelima te u sluajevima dokazivanja oinstva. Sperma je tjelesna tekuina, a sadrava stanine sastojke sjemene stanice (spermije) koji se stvaraju u spolnim lijezdama (testisima) i tekue sastojke koje stvaraju pomone lijezde, kao to su prostata i sjemeni mjehurii. Sperma se moe traiti u rodnici ive ili mrtve ene, na tijelu rtve, na odjei i na mjestu izvrenja kaznenoga djela, kao i na poinitelju. U rodnici ive ene spermiji se mogu dokazivati oko 34 sata nakon snoaja, a pri visokom stupnju istoe rodnice (rodnica s fiziolokom florom, bez upale i sl.) i do 42 sata. U rodnici mrtve ene mogu se nai 23 dana nakon smrti, a iznimno i dulje [7].
81
3.5.2.1.
Analiza tragova sperme
Ukljuuje identifikacijske testove kojima je svrha utvrditi prisutnost sperme ili sjemene tekuine, te individualizacijske testove koji ukljuuju genetiko tipiziranje, kako odreivanjem konvencionalnih biljega, tako i DNA-profila [1, 9, 11, 12]. Identifikacijom se provjerava rtvin iskaz o poinjenom seksualnom nasilju, iako odsutnost sperme ne znai potvrdu odsutnosti seksualne aktivnosti. Genetiko testiranje u pravilu se obavlja radi prepoznavanja poinitelja. U velikome broju sluajeva rtva poznaje osumnjienu osobu i u takvim sluajevima genetike se analize obavljaju zbog toga to osumnjieni negira bilo kakav kontakt sa rtvom. a) Makroskopski pregled Mrlja sperme je ljuskava, bjelkasto-sivkasta ili ukasta. Pod ultraljubiastim svjetlom fluorescira plavoljubiasto. No, ovaj nalaz nema nekadanju vrijednost zbog sve vee uporabe detergenata i umjetnih vlakana koji takoer intenzivno fluoresciraju, a slinu reakciju daju i neki drugi bioloki materijali, kao to su mokraa i vaginalni sekret. b) Kemijske probe reakcija dokazivanja enzima kisele fosfataze koja se u spermi nalazi u velikoj koncentraciji probe za otkrivanje drugih sastojaka sjemene tekuine, kao to su spermin ili kolin. c) Potvrdne probe mikroskopski pregled traenje spermija tako da se uzorak sumnjive mrlje ili obrisak ekstrahira s fiziolokom otopinom te ekstrakt ispituje pod mikroskopom ut vrivanje prisutnosti bjelane vina sjemene tekuine imunolokim metodama. Provodi se samo u sluajevima kada se u uzorku ne pronau spermiji.
odreivanje genetikih biljega, to ukljuuje odreivanje kr vnih grupa (potekoe proizlaze iz oskudnosti materijala i injenice da su mrlje sperme pomijeane i s drugim izluinama), izoenzima, serumskih proteina i analizu DNA.
3.5.2.2.
Prikupljanje tragova sperme [1, 9, 11, 12]
a) Odjea: osuiti na zraku na sobnoj temperaturi svaki odjevni predmet pakirati u zasebnu papirnatu vreicu pravilno oznaiti i pohraniti (na suhom, hladnom i tamnom mjestu do dostavljanja u laboratorij). b) Tekui uzorci: 1. uporabom iste price ili pipete prenijeti spermu u istu, sterilnu epruvetu, propisno je oznaiti, pohraniti u hladnjak i to prije dostaviti u laboratorij 2. alternativno, uzorak se moe prikupiti s pomou tampona vate ili iste tkanine koja se potom osui na zraku, pakira, oznauje i pohranjuje. c) Tragovi na ljudskom tijelu: Za prikupljanje uzoraka s tijela rtve spolnog nasilja rabe se standardni kompleti opreme, oblikovani tako da pojednostave skupljanje tragova sa rtve. Dostupni su razliiti komercijalni kompleti, a neki ukljuuju i prikupljanje rtvinih odjevnih predmeta. Uvijek je potrebno slijediti u naputku podrobno opisani redoslijed. Prikupljaju se: neprijeporni uzorci: uzorak kr vi, sline, stidne dlake i iupane vlasi kose tragovi sa rtve: obrisci i razmazi sa stidnice i iz rodnice, obrisci i razmazi iz anusa, obrisci oko spolnih organa, obrisci i razmazi iz usne upljine, obrisak nosne sluznice, stidne dlake eljanjem i upkanjem,
82
mikrotra govi ispod noktiju, odre zani nokti, sasuene izluine. Uzorke je potrebno izuzeti to prije, svaki pakirati zasebno, propisno zatvoriti i oznaiti, te do dostave u laboratorij uvati u hladnjaku. Svaki uzorak koji sadrava tekuinu potrebno je prije pakiranja osuiti na sobnoj temperaturi. Valja napomenuti da tragove sperme s tijela rtve obvezno uzima medicinsko osoblje. Prije zapoinjanja prikupljanja tragova obavlja se lijeniki pregled kojim se trae i dokumentiraju znakovi genitalne traume, kao i sve ostale negenitalne ozljede, ugrizi i sl., to moe upuivati na seksualno nasilje. d) Sasuene mrlje: ako su na predmetima koji se mogu rezati (a ne mogu se dostaviti u cijelosti), istim skalpelom povrinu s mrljom izrezati na isti papir, omotati, zapakirati, propisno oznaiti i pohraniti ako su na nepokretnim predmetima, istim skalpelom sastrugati mrlju na komad istog papira i omotati, izuzeti s pomou ljepljive vrpce ili uzeti obrisak s pomou tampona vate. Svaki omot zapakirati zasebno, propisno oznaiti i pohraniti.
3.5.3.
Za identifikaciju sline u tragu primjenjuje se metoda odreivanja prisutnosti enzima amilaze. Identifikacija mokrae i izmeta temelji se na njihovoj karakteristinoj boji i mirisu, te na prisutnosti odreenih kemijskih sastojaka kao to su kreatinin ili urea, odnosno urobilinogen.
3.5.3.1.
Prikupljanje tragova
Ostale tjelesne izluine
Tjelesne izluine kao to su slina, mokraa, vaginalni iscjedak, znoj, iscjedak iz nosa, mlijeko, eluani sok ili povraeni sadraj i izmet takoer se pronalaze na mjestu dogaaja, na odjei, rtvi i/ili poinitelju kaznenoga djela [1, 9, 11]. U laboratoriju se te tekuine mogu identificirati, odrediti krvna grupa, izoenzimi i DNA-profil, a dobiveni rezultati slue za ukljuivanje ili iskljuivanje neke osobe kao mogueg ostavitelja traga. Mrlje pljuvake najee se ispituju na opucima cigareta. Zahtjevi za vjetaenjem znoja iznimni su, a za ostale navedene izluine jo i rjei.
a) Odjea: osuiti na zraku na sobnoj temperaturi pakirati u zasebne papirnate vreice ili omotati papirom pravilno oznaiti i pohraniti. b) Tekui uzorci: prenijeti u istu sterilnu staklenku, posudu zatvoriti, oznaiti i pohraniti u hladnjak. c) Tragovi na ljudskom tijelu: neprijeporni uzorci sline: nakon ispiranja vodom ostataka hrane iz usne upljine, uzimaju se na isti papir, gdje se olovkom ocrtaju obrisi mrlje. Uzorak se sui na zraku, pakira u papirnatu omotnicu, propisno oznauje i pohranjuje. Kad se pronae trag ugriza, uzima se obrisak destiliranom vodom navlaenim sterilnim komadom vate, i to s ruba traga ugriza i iz sredita ugriza. Vatu je potom potrebno osuiti na zraku, omotati u isti papir, propisno oznaiti i pohraniti. Obrisak je takoer potrebno uzeti i s drugoga slinog podruja na kojem nema tragova ugriza, a to slui kao kontrolni uzorak. mokraa i izmet prikupljaju se u iste posude, oznauju i pohranjuju u hladnjak vaginalni iscjedak uzima se prema protokolu iz kompleta opreme za uzimanje obrisaka kod spolnog nasilja, a sve tekue uzorke potrebno je prethodno osuiti na zraku
83
iscjedak iz nosa obino se nalazi na tkaninama (rupiu, odjevnom predmetu) pa je te stvari potrebno osuiti, omotati u isti papir, propisno oznaiti i pohraniti; ako se trag nalazi na tijelu, uzima se obrisak, a daljnji je postupak isti kao i prethodno navedeni. d) Sasuene mrlje: mogu se prikupiti izuzimanjem itavog predmeta ili pak struganjem ili izrezivanjem, pakirati u iste omote, propisno oznaiti i pohraniti u hladnjaku.
3.5.4.
3.5.5.
Dlake i kosa
Tkiva, organi i kosti
Bilo koji dio tijela moe biti predmet sudskomedicinskog i biolokog ispitivanja u kriminalistike svrhe [1, 9, 11]. Najee su to kosti s analizom kojih se mogu odrediti spol i dob osobe, priblino vrijeme smrti, ozljede ili ak uzrok smrti, te obaviti identifikacija nepoznatog lea. a) Svjei dijelovi tijela: svaki uzorak opisati i dokumentirati, te prikupiti istom pincetom ili rukom zatienom rukavicom, svaki uzorak zasebno pohraniti u istu posudu bez dodavanja sredstava za uvrivanje, propisno zatvoriti, oznaiti i pohraniti u hladnjak. b) Stari dijelovi tijela: svaki trag opisati i dokumentirati, te izuzeti istom pincetom ili rukom zatienom rukavicom; tragove koji su jo uvijek fiziki povezani treba prikupiti zajedno, paziti da se jedan trag ne kontaminira drugim; svaki uzorak zasebno pohraniti u istu posudu, propisno zatvoriti, oznaiti i pohraniti u hladnjak.
Trag dlake jedan je od najeih materijalnih tragova i moe se pronai u velikome broju sluajeva, kako na rtvi i njenoj odjei, tako i na predmetima, mjestu dogaaja i poinitelju [1, 9, 11]. U praksi su najee predmet pretrage u sluajevima seksualnog nasilja. Do puberteta, a u ena i kasnije, vei je dio tijela pokriven paperjem (maljama). To su njene i tanke dlaice, bijeloga vrka, dok je ostali dio stabljike vie ili manje pigmentiran. Kad u pubertetu otpadnu, na njihovu se mjestu pojavljuju dlake, koje su vre, due i sloenije grae. S obzirom na njihovu duljinu i izgled, mogue je priblino odrediti s kojeg dijela tijela potjeu. Tako su one krae, duljine do 3 cm, a istroena vrka podrijetlom s trupa i udova, dok su one savinute i s otrim vrkom obr ve i trepavice. Due dlake, ako su kovrave, potjeu s donjeg dijela trbuha, nepravilno valovite su dlake s monji i stidnice, a one obloene masnim slojem jesu dlake ispod pazuha. Kosa se razvija od paperja u 8. mjesecu trudnoe. Tijekom pr ve godine ivota potpuno se izmijeni, a puni razvoj dostie u pubertetu. Starenjem se pigment zamjenjuje mjehuriima zraka, zbog ega kosa posivi. Vlasi kose priblino su jednake debljine u cijeloj duljini (ne deblje od 0,14 mm i ne tanje od 0,02 mm), prilino jednakog, okruglastog ili jajolikog presjeka, s tankom sri (medulom). Boja kose ovisi o koliini i vrsti pigmenta koji je du vlasi jednoliko razdijeljen. Nabrojene znaajke razlikuju ovjeju kosu od ivotinjske dlake.
3.5.5.1.
Analiza tragova dlaka
Ukljuuje makrometrijska i makroskopska, te mikroskopska odreivanja, kao i razliite fizikalno-kemijske pretrage. Ekspertizom dlake obavljaju se:
84
a) identifikacija dlake, b) odreivanje podrijetla dlake, c) mikroskopsko ispitivanje i usporedba. Ovim ispitivanjem ne dobivaju se podatci za individualizaciju, nego samo podatci kojima se neka osoba moe iskljuiti kao izvor traga dlake. Pri tome se promatraju izgled i graa dlake (kutikula vanjski sloj dlake, medula, kora, korijen i vrh), njezin promjer, presjek i pigmentacija, duljina, boja, prozirnost, te specijalne znaajke kao to su oteenost ili bolest. d) Odreivanje genetikih biljega ukljuuje odreivanje spola, AB0 sustava, izoenzima i DNA-analizu.
3.5.5.2.
povrina s koje e se uzeti uzorci prethodno se ielja da bi se odstranile otpale dlake, a one se takoer prikupljaju, pakiraju i oznauju; dodatne se dlake upaju zajedno s korijenom. Vlasi kose upaju se s razliitih dijelova vlasita (s prednje strane, tjemena, bono i sa stranje strane), i to 45 dlaka sa svakog podruja; ako je uzorak mokar ili vlaan prethodno ga je potrebno posuiti na zraku, a zatim sve zasebno pakirati u papirnate omotnice, pravilno oznaiti i pohraniti.
3.6.
Prikupljanje tragova dlaka
Tragovi ivotinjskoga podrijetla
a) Sporni (prijeporni, dvojbeni) uzorci poje dinane dla ke mo gu se prikupljati zatienim prstima ili pincetom, pri emu treba paziti da se ne otete i da se ne dodiruje korijen. Mogue je upotrijebiti ljepljivu vrpcu ili usisava; staviti na list papira, a svaku skupinu dlaka ili pojedinane dlake zasebno pakirati u papirnate omotnice, pravilno oznaiti i pohraniti; dlake izmijeane s krvlju, tkivom ili tjelesnim izluinama paljivo prikupiti sa svim dodatcima, staviti u iste posude i propisno oznaiti; ako su dlake izmijeane s vlanim tjelesnim izluinama, potrebno ih je najprije osuiti na zraku. b) Nesporni (neprijeporni) uzorci Prikupljanje tragova poznatog podrijetla vano je radi usporedbe s onima nepoznata podrijetla. Pri tomu je potrebno voditi rauna o nainu na koji je konkretni prijeporni uzorak nastao pa na takav nain treba izuzeti i usporedni uzorak:
Tragovi ivotinjskoga podrijetla mogu biti predmet ispitivanja zbog sumnje da prijeporni materijal potjee od ovjeka ili je potrebno utvrditi vrstu ivotinje od koje tragovi potjeu [1, 9, 13]. Pri tomu se mogu analizirati krv, tkiva, dlake i perje. ivotinjsku krv lako je razlikovati od ljudske (v. poglavlje: Tragovi ljudskoga podrijetla krv). Mogue je razlikovati razliite ivotinjske vrste, a individualna je identifikacija nemogua. Dijelovi tkiva mogu se ispitati onako kako se ispituju mrlje krvi, pa je tako mogue dokazati podrijetlo proteina u ispitivanom uzorku. ivotinjska se dlaka po svojim morfolokim znaajkama jasno razlikuje od ljudske. Ona je esto deblja od 0,14 mm ili tanja od 0,02 mm, razliito pigmentirana u svojoj duljini, iroke medule i presjeka koji se mijenja od ovalnoga, bikonkavnoga ili drugaijega oblika. No, razlike u grai dlaka pojedinih vrsta ivotinja nisu tolike da bi se lako moglo utvrditi kojoj vrsti ivotinje dlaka pripada. Razliitost u grai perja doputa mogunost utvrivanja njegova podrijetla, a esto
85
je mogue i razlikovanje spola te utvrivanje starosti ptice s koje uzorak potjee. Za prikupljanje i pakiranje ivotinjskih tragova vrijede ista pravila kao i za prikupljanje i pakiranje tragova ljudskoga podrijetla. Posebno znaenje, osobito u posljednje vrijeme, ima analiza kukaca. Oni se nalaze gotovo svagdje i tijekom cijele godine, te su zbog toga od forenzinog interesa u brojnim situacijama: utvrivanja vremena smrti, odreivanja mjesta smrti i mogueg pomicanja tijela na druge lokacije, a mogu upuivati i na vrstu, odnosno na uzrok smrti. DNA-analiza kukaca omoguuje odgovarajuu identifikaciju vrsta, a sami insekti mogu biti izvori neinsektne, odnosno ljudske DNA koja potjee od organizama na kojima su se hranili. Prikupljanje kukaca i njihovih razvojnih faza postaje sastavnim dijelom prikupljanja ostalih tragova. Pri tome se rabe iste staklenke s perforiranim poklopcima radi ventilacije, koje se pravilno oznauju te pohranjuju na sobnoj temperaturi ili u hladnjak.
Slika 3-2. Grana masline koja se moe iskoristiti kao polazni uzorak u forenzinoj genetici.
3.7.
Tragovi biljnoga, mineralnoga i sintetikoga podrijetla
U kriminalistikoj praksi takvim se tragovima posveuje premalo panje, a rezultati analiza mogu biti iznimno korisni [1, 9]. Ispitivanja vrsta i izgleda biljaka mogu pomoi pri utvrivanju mjesta i vremena poinjenja kaznenoga djela, vremena smrti rtve, identifikaciji tragova na odjei i obui poinitelja itd. Zbog toga je pri obdukciji potrebno odjeu i tijelo rtve pregledati i radi pronalaska tragova trava, lia, granica, korijenja i sl., a pronaeno izuzeti i dostaviti u laboratorij na bioloka ispitivanja. Intenzivnija primjena botanike u kriminalistici tek slijedi u budu-
nosti. Posebno znaenje ima analiza tragova vlakana koja se uobiajeno susreu kao mikrotragovi i kontaktni tragovi. Potjeu od tvari koje se nalaze u prirodi, a ukljuuju biljna vlakna (pamuk, vuna, svila) i mineralna vlakna (primjerice azbest). Osim toga, tu su i sintetina (umjetna) vlakna, te preraena prirodna vlakna. Postupci prikupljanja, uvanja i ispitivanja tragova vlakana gotovo su istovjetni onima koji se primjenjuju s tragovima dlaka i kose. Posebno se radujemo injenici to se u posljednje vrijeme brzo i snano razvija posebna disciplina forenzina botanika te je sve vie radova o analizi raznih biljnih vrsta iz tog podruja, a koji mogu rasvijetliti vane elemente u otkrivanju poinitelja kaznenoga djela (sl. 3-2).
3.8.
Primjeri iz prakse
Primjer 1 (sl. 3-3. do 3-9.)

Rije je o ubojstvu iz runoga vatrenog oruja u kojem je pokojnog P. H. ubio njegov sin s 3 prostrijelne i 3 ustrijelne rane s lea i trbuha uz oteenje organa. Nakon to je P. H. pao na pod licem okrenut prema tlu i dajui
86
znakove ivota, njegov drugi sin nije napustio mjesto dogaaja, nego je u strahu da bi P. H. mogao ostati iv uzeo sjekiru te ga tupim dijelom sjekire snano udario u lijevi donji zatiljni dio glave, zbog ega je dolo do impresivne frakture lubanje i nag njeenja mozga, a te su ozljede bile dodatni uzrok smrti. P. H. je umro pri dolasku na bolniki Hitni kirurki prijam. No, policija pri oevidu na mjestu dogaaja nije nala sjekiru koja je bila skrivena u otvoru slijepoga nekoritenog bunara tako da je prva verzija dogaaja bila da je rije o strijelnim ranama. Tijekom obdukcije, zatiljno lije vo, nae-
ne su rane u obliku slova L, nagnjeenih rubova. Na temelju takvog nalaza posumnjalo se da je rije o nekom mehanikom sredstvu slinom sjekiri ili ekiu. Policija je napravila ponovni oevid te je u bunaru nala spomenutu sjekiru. S donjega desnog ruba sjekire uzeti su mikrotragovi za analizu DNA te je, kad su usporeeni s uzorcima krvi, utvreno da je rije o mikrotragovima s tijela P. H. U kasnijemu dijelu suenja obrana je pokuavala iskoristiti injenicu da je pri transportu P. H. pao iz nosila Hitne pomoi te tada udario o podlogu. Pitanje je bilo je li ozljeda za-
Slika 3-3. Mjesto dogaaja makroplan.
Slika 3-4. Mjesto dogaaja s tragovima krvi.
87
Slika 3-5. Tijelo rtve s lea.
Slika 3-6. Tipine strijelne rane.
Slika 3-7. Rana zatiljno lijevo, nagnjeenih rubova.
88
Slika 3-8. Otvor bunara s naenom sjekirom.
Slika 3-9. Detalj desnoga ruba sjekire s otiskom kose i masnoe.
tiljno lijevo mogla nastati tako. DNA-analiza potvrdila je da je takav mehanizam nastanka ozljede iskljuen te da je ozljeda nastala udarcem upravo spomenutim dijelom sjekire.
Primjer 2. (sl. 3-10. do 3-12.)

Ovaj primjer pokazuje vanost DNA-analize kod biolokih tragova koji su bili izloeni visokoj temperaturi i drugim imbenicima degradacije. Rije je o eksploziji u skladitu Hr vatske vojske u Dubokom jarku kod Sesveta, koji se zbio 1994. godine. Prema naredbi
istranog suca, asnici Vojne policije obavili su oevid, a prigodom prikupljanja biolokih tragova angairani su sudskomedicinski vjetaci iz Klinike bolnice Split i s Medicinskog fakulteta u Zagrebu. Mjesto dogaaja bilo je jo uvijek vrlo opasno zbog prisutnosti velikoga broja eksplozivnih naprava koje su se nalazile razbacane unaokolo. Pri eksploziji je nestalo 6 osoba, a oevidom je naeno 48 uzoraka ljudskoga podrijetla. Samo je 20 uzoraka bilo prikladno za izdvajanje i analizu DNA. Analizom je utvren identitet 5 osoba, a jed-
89
Slika 3-10. Makroskopski prikaz mjesta dogaaja s djelatnicima Vojne policije i sudskomedicinskim vjetakom te s tragovima razorenih skladita i unitenoga viliara.
Slika 3-11. Komad spaljenoga i oteenoga miinoga tkiva s oznakom DJ 5/94 i brojem 12.
90
Slika 3-12. Skica mjesta dogaaja s poloajem broja 12 sa slike 3-11. kao sastavni dio zapisnika o oevidu.
na je osoba koja je bila upravo u sreditu eksplozije ostala neidentificirana. Analiza posmrtnih ostataka DNA-identifikacijom prvi je put u nas primijenjena u masovnoj katastrofi upravo na ovome primjeru.
Primjer 3.
Mladi, u dobi od 16 godina, iz sreene obitelji i u vrlo dobrim odnosima s okolinom, naen je mrtav u svojoj spavaoj sobi. Nepoznati je poinitelj u prostorijama stana izvrio premetainu radi pronalaska vrijednih pred-
meta, novca i zlatnine. Brojni tragovi kr vi naeni su u spavaoj sobi, kao i po cijelome stanu, te na stubitu stambene zgrade. Obdukcijom je utvrena nasilna smrt, nastala kao posljedica kotano-modane traume glave uzrokovane viestrukim udarcima tupim i tvrdim predmetom. Znaajke ozljeda glave upuivale su na uporabu ekia. Osim toga, utvrene su mnogostruke ubodne rane u prsite, kao i brazda davljenja od elektrinog kabela koji je bio omotan oko pokojnikova vrata. Tijekom
91
Slike 3-13. do 3-15. Preuzimanje uzoraka za DNA-analizu: tragovi krvi na nou i komadima stakla.
92
oevida, kao i tijekom vanjskoga pregleda i obdukcije tijela, prikupljeni su tragovi kr vi, kose, tekstilnih vlakana, potom izuzeta odjea i obua pokojnika, te elektrini kabel, kao i rukavice i noevi naeni u stanu. Naknadno je pronaeno odbaeno nekoliko odjevnih predmeta i eki, a i oni su takoer dostavljeni na vjetaenje. Od osumnjienika, inae prijatelja pokojnog mladia, izuzet je uzorak kr vi, kose i odjea. Analizom DNA dostavljenog materijala upravo je ta osoba identificirana kao poinitelj, a identificirana su i sredstva izvrenja: eki i noevi. Utvreno je da krv naena na odjei i obui poinitelja potjee od rtve. Iz epitelnih stanica s ruku izuzetih iz rukavica izolirana je DNA koja se podudarala s DNA poinitelja. Iz tragova krvi na odbaenom ekiu i noevima naenima u stanu tipizirana je DNA koja se podudarala s DNA rtve (sl. 13.15.). Osim toga, i DNA iz epitelnih stanica s ruku, naenih na rukohvatu drke ekia, odgovarala je poiniteljevoj DNA.
guste, kratke, crtaste og rebotine, podrijetla ivotinjskih pandi. Na grmlju i travi oko lea pronaen je vei broj dlaka duljine 3 do 15 cm. One su prikupljene i s pokojnikove odjee, kao i s podruja glave, vrata i prsnoga koa. Morfolokom je pretragom utvreno da pripadaju ivotinji iz porodice pasa, i to kako je utvreno DNA-analizom mukoga spola. Uz to, usporedbom rezultata DNA-analize prijepornih tragova kr vi naenih na mjestu dogaaja i neprijepornih uzoraka pokojnikove krvi utvreno je da je rije o istoj osobi. Analiza krvi na alkohol pokazala je da je oteeni u trenutku smrti bio u pijanome stanju. Rekonstruirajui dogaaj, zakljueno je da je biciklist, vozei pod utjecajem alkohola tehniki neispravan bicikl, iznenada izgubio stabilnost, pao i udario glavom o kameniti teren, zbog ega je na licu mjesta preminuo. Tijekom noi tijelo su izjele ivotinje, vjerojatno divlji psi, a oni se na tom podruju viaju kako lutaju u potrazi za hranom.
Primjer 4.
Unakaeno mrtvo tijelo mukarca, u dobi od 67 godina, naeno je u ranim jutarnjim satima na kamenitu zemljitu ispod mosta, oko 2 m nie od razine kolnika kojim se on, prema iskazima oevidaca, biciklom kretao u sumrak prethodnog dana. Oevidom i prometnim vjetaenjem utvreno je da je, vozei stari i neopremljeni bicikl, doavi na dio ceste u zavoju i usponu, udario upravljaem bicikla o ogradni zid mosta, izgubio ravnoteu i pao na teren ispod mosta. Obdukcijom pokojnikova tijela utvrena je nasilna smrt, nastala zbog nag njeenja mozga uzrokovana padom. Pokojnikova je glava u cijelosti bila ogoljela, bez oiju, nosa i uiju, a u podruju vrata naena je opsena ugrizna rana tako da je vrat gotovo u potpunosti, sa svim pripadajuim strukturama, nedostajao. Na rubovima ostataka vratne koe, kao i po prsnome kou, naene su
Primjer 5. (sl. 3-16. do 3-21.)

U Vukmanima pokraj Otiia, u Dalmatinskoj zagori, dogodila se nesrea u kojoj je smrtno stradao mlai mukarac jer mu je pri obaranju stabla grana pala na glavu. Imenovani je bio u drutvu vie svojih prijatelja koji su zajedno, u umi, nedoputeno sjekli dr va. U tijeku oevida i istrage, kao i kasnijeg suenja, trebalo je utvrditi je li rije o nesretnom sluaju ili o ubojstvu. Provedena je obdukcija te je provedeno DNA-vjetaenje biolokih tragova izuzetih s mjesta dogaaja radi rekonstrukcije. Nakon provedene analize genskih lokusa utvreno je da svi uzorci kr vi pripadaju preminulom mukarcu. Iz rasporeda kr vnih tragova na licu mjesta, kao i naina njihova nastanka mogla se porei ili potvrditi okrivljenikova obrana.
93
Slika 3-16. Suha grana s tragovima tekuine nalik na krv. Grana je duljine 95 cm, na jednom kraju vide se dva roga u obliku slova V te se na tom dijelu u podnoju nalazi krvna mrlja crvenkaste boje, duljine do 7 cm, irine do 2,5 cm. Radi se o obrisotini.
Slika 3-17. Dio grane stabla na kojem se uoavaju tragovi nalik na krv u obliku prskotine. Inae radi se o grani duljine 135 cm, koja je na kraju prelomljena, a na suprotnom kraju odrezana pilom.
Slika 3-18. Suhi list listopadnog drveta koji na jednom dijelu ima sasuenu tekuinu crvenkaste boje, nalik na krv.
94
Slika 3-19. Motorna pila marke Stihl, model MS 290, Na vanjskoj oplati motorne pile i nou uouju se tragovi nalik na krv.
Slika 3-20. Noktovina s desne ruke.
95
Slika 3- 21. Gornji dio trenirke marke ADIDAS, plave boje. Na gornjem rubu ovratnika lijevo, a dijelom i desno vidi se crvenkasta mrlja (brisotina ili upijanje) veliine 7 3 cm.
Literatura
1. Zeevi D i sur., Sudska medicina, 3. izd. Jumena, Zagreb, 1989. 2. Modly D. Objanjenje trileme ubojstvo, samoubojstvo, nesretni sluaj. MUP RH, Zagreb, 1994. 3. Zakon o kaznenom postupku. Narodne novine, zbirka propisa 381, br. 110/97, Zagreb, 1997. 4. Gorki S. Medicinska kriminalistika. Privredna tampa, Beograd, 1981. 5. Krajina J. Bioloki tragovi. MUP RH, Zagreb, 1998. 6. Lee HC. Materijalni tragovi. MUP RH, Zagreb, 1998. 7. Gaensslen RE, Lee HC. Sexual Assault Evidence National Assessment and Guidebook. National Institute of Justice, Department of Justice, Washington DC, 1996. 8. Geberth VJ. Practical Homicide Investigation: Tactics, Procedures, and Forensic Techniques, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, 1993. 9. Lee HC, Ladd C, Scherczinger CA, Bourke MT. Collection and preser vation of DNA evidence. In: Burgi SB, editor. First European-American Intensive Course in PCR Based Clinical and Forensic Testing. Laboratory manual; 1997 Sep 23-Oct 3; Split, Croatia: Laboratory for clinical and forensic genetics; 1997. 10. De Forest PR, Gaensslen RE, Lee HC. Forensic Science An Introduction to Criminalistics. McGraw-Hill, Inc., New York, 1983. 11. Vanezis P, Busuttil A. Suspicious Death Scene Investigation. Oxford University Press, Inc., NewYork, 1996. 12. Byrd JH, Castner JL. Forensic Entomology The Utility of Arthropods in Legal Investigations. CRC Press, Boca Raton, 2000. 13. Brinkmann B, Wiegand P. DNA Analysen. Kriminalistik 1993;47 (3):191-5. 14. Coyle HM, Forensic Botany: Principles and Applications to Criminal Casework. CRC Press, West Haven, Connecticut, 2005. 15. tambuk S, Sutlovi D, Bakari P, Petrievi S, Anelinovi . Forensic Botany: Potential Usefulness of Microsatellite-based Genotyping of Croatian Olive (Olea europaea L.) in Forensic Casework. Croat Med J 2007;48: 556-62. 16. Coyle HM, Palmbach T, Juliano N, Ladd C, Lee HC. An over view of DNA methods for the identification and individualization of marijuana Croat Med J 2003;44:315-321. 17. Uvodi P, Magistarski rad, Zagreb, 2007.
96
4.
Sadraj poglavlja
4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5.
Postupci i metode pri identifikaciji ljudskih ostataka

Marija Definis-Gojanovi
Openito o identifikaciji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Postupak i metode ekshumacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Postupak i metode identifikacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 Zakljuak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 Primjeri iz prakse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
4.1.
Openito o identifikaciji
Identifikacija oznauje utvrivanje istinitosti osoba, dijelova tijela, tragova i predmeta u svrhu otkrivanja pojedinih obiljeja koja omoguuju nesumnjivo i neporecivo prepoznavanje [1]. Proces identifikacije temelji se na dvama osnovnim postupcima: pr vi je traenje i biljeenje karakteristinih osobina objekta ispitivanja, a drugi je usporeivanje utvrenih znaajki s ve prije poznatim podatcima o objektu za koji se identitet pretpostavlja. Opi pojam identifikacije osobe, kao in iza kojega stoji cijeli niz pravnih radnji, ovisno o vrsti predmeta u pravnom postupku, oduvijek je bio vrlo vana injenica. U pojedinanim sluajevima identifikacija umrlih/poginulih ima jo vee znaenje uz odgovoran etiki in, a kad je rije o identifikaciji poginulih u masovnim nesreama, posebice u ratu, taj zadatak postaje jo sloeniji [2].
Utvrivanje identiteta ivih osoba malokad je vei problem, dok kod mrtvih osoba, ovisno o stanju u kojem se tijela nalaze i nizu okolnosti, to moe biti vrlo teak i dugotrajan proces, katkad i s negativnim konanim rezultatom. Identifikacija je znatno oteana u sluajevima velikog broja mrtvih tijela, kao pri masovnim prometnim nesreama (pad zrakoplova, sudar vlakova, potapanje broda) i prirodnim katastrofama (potresi, poplave, poari), kad se pojavljuje i dodatni problem znatno izmijenjenih tijela, bilo zbog utjecaja vanjskih imbenika bilo zbog poslijesmrtnih promjena (problem zapaljenih, iznakaenih, raskomadanih i trulih tijela). U ratu i nakon njega proces identifikacije viestruko je sloeniji zbog znatnih migracija civilnoga stanovnitva (protjerivanja, iseljavanja, preseljavanja) i vojne pokretljivosti, prekida evidencije stanovnitva, istovjetne vojne odjee i obue, namjernog unitavanja osobnih dokumenata,
97
masovnih pogibija, velikoga broja mrtvih u zajednikim grobnicama, neodgovarajueg pokapanja (i iskapanja), premjetanja tijela iz jednog u drugo ukopno mjesto (tzv. sekundarne grobnice), dugog razdoblja od trenutka smrti do iskapanja sa znatnom trulenom izmijenjenou tijela ili skeletizacijom, kad su mnogi identifikacijski pokazatelji nepouzdani ili potpuno neupotrebljivi, postojanja samo pojedinih dijelova tijela (bez glave i zuba) ili samo fragmenata kostiju, te, to je moda najvanije, nepostojanja zaivotnih podataka [14]. Smrt nije samo kraj biolokog ivota nego istodobno i pravni pojam, kao dogaaj kojim prestaje pravna sposobnost ili pravni subjektivitet fizike osobe, te injenica koja za sobom povlai niz pravnih posljedica iz obiteljskog i nasljednog prava. Upravo zbog toga drutvo ima poseban interes upisati smrt svake osobe, iji je identitet neporecivo utvren, u Matinu knjigu umrlih. U mirnodobnim se uvjetima obino bez veih tekoa odreuju vrijeme i mjesto smrti, obavlja identifikacija nepoznatog lea i utvruje uzrok smrti, na to obvezuje Pravilnik o utvrivanju uzroka
smrti, na temelju ega se ispunjavaju vitalno statistiki obrasci: Prijava smrti i Potvrda o smrti, a potom obavlja upis u Matinu knjigu umrlih. Na to obvezuje i Zakon o kaznenom postupku u sluajevima sumnje ili oitosti da je smrtni sluaj proizaao iz pravno kanjivog djela. Ako je le ve zakopan, predviena je ekshumacija radi pregleda i obdukcije uz izriito nalaganje potvrivanja identiteta lea [5]. Identifikacije mrtvih osoba ili ljudskih ostataka obavljaju se u razliitim situacijama (tablica 4-1.). Mnogo je moguih zakonskih razloga zbog kojih se poduzima daljnja istraga: arheoloka ispitivanja, traenje dokaza kriminalnoga djela, sudska istraivanja i drugo. Kulturoloke, obiajne, politike i meuljudske specifinosti mogu varirati, ali osnovni cilj mora ostati kao temeljno naelo: iskazivanje potovanja prema preminulima na nain da ih se vrati njihovim obiteljima, ime se podupiru ljudska prava, i ivih i umrlih. Pri tome posebno znaenje imaju ekshumacije i identifikacije te sudskomedicinska obradba rtava rata. Osim ve prethodno reenog, potrebno je upozoriti i na sljedee razloge: voenje tone statistike evidencije broja stradalih i naina
Tablica 4-1. Situacije koje zahtijevaju sudskomedicinsku identifikaciju mrtvih osoba ili njihovih ostataka [8] masovne nesree zbog prirodnih katastrofa (potresi, poplave, poari) masovne civilne ili vojne prometne nesree (zrakoplovne, automobilske, eljeznike i brodske) identifikacija ljudskih ostataka nakon jakih poara ili eksplozija identifikacija rtava rata identifikacija pronaenih ljudskih ostataka za koje se pretpostavlja da pripadaju nestalim osobama kazneni predmeti u kojima sakaenje ili jako unitenje tijela prati smrtni ishod ili je povezano sa smrtnim ishodom sluajevi u kojima uznapredovale trulene promjene onemoguuju utvrivanje identiteta sluajevi pronalaska kotanih fragmenata
98
njihova stradavanja, te struno dokumentiranje dogaaja uz odreivanje postojanja i vrste zaivotnog ili poslijesmrtnog nasilja, a zbog moguih buduih sudskih sporova i dokazivanja ratnih zloina. Ono to je jo vanije, ve i prema enevskim konvencijama za zatitu rtava rata, pravo je obitelji da dozna sudbinu svojih lanova, kao i pravo da im se na zahtjev vrate posmrtni ostatci umrlih osoba i njihove stvari. S obzirom na injenicu krenja odredbi Konvencije od 12. kolovoza 1949., kao i dopunskih protokola o obavljanju lijenikoga pregleda lea radi utvrivanja smrti i identiteta, sastavljanju odgovarajueg izvjea, spaljivanju ili pokopu tijela uz potovanje vjerskih propisa i obiaja, zatiti i oznaivanju grobova i njihovoj evidenciji, potreba ekshumacija i identifikacija rtava rata postavlja se kao neupitna obveza zajednice. Osim toga, znaajna administrativna i sudska pitanja, a koja se tiu statusa nestalih osoba i njihovih obitelji, zahtijevaju svoje rjeenje [6, 7].
4.2.
Postupak i metode ekshumacija
Ako postoji razlog vjerovati kako su otkriveni ljudski ostatci ili je planirano arheoloko istraivanje, moraju se prethodno kontaktirati odgovarajue slube. U mnogim sudskim sluajevima, policija i sudski medicinari trebaju biti odmah o tome obavijeteni te su odgovorni za procjenjivanje okolnosti i odluivanje o nainu daljnjeg rada. Prije ekshumacije potrebno je prikupiti to vie relevantnih podataka o dogaaju i osobi/osobama iji su ostatci mogue pronaeni. Potom se prilazi lociranju pretpostavljene grobnice. Podruje gdje ona moe biti smjetena mogue je otkriti zranim ili satelitskim fotografiranjem, ali najvaniji su izvor informacija izjave svjedoka. No, one
nisu uvijek tone ni dovoljno precizne, to zbog subjektivnih (emotivni stres, zaborav) ili objektivnih razloga (izmijenjena topografija terena zbog promijenjenoga godinjeg doba ili zbog tijeka vremena). Zbog toga je uvijek potrebno obaviti preliminarni posjet kojim e se utvrditi mogue postojanje grobnice (promjene u vegetaciji, na povrini zemlje i u sastavu tla), oznaiti mjesto kopanja, a uiniti i probna sondiranja radi utvrivanja postojanja razgradnje organske materije (ljudskih ostataka). Ako je rije o starijim ili skrivenim grobnicama, u obzir dolazi uporaba radara za otkrivanje objekata pod zemljom, detektora metala, metalnih sondi, kao i pasa uvjebanih za pronalaenje leeva. Bez obzira na to je li rije o pojedinanim ili masovnim grobnicama, ekshumacija zapoinje fotografiranjem irega i uega podruja, ienjem povrinske vegetacije, obiljeivanjem granica pretpostavljenoga groba te pretragom povrine, a u svrhu pronalaenja moguih dokaza (npr. strjeljiva). Uvijek je preporuljivo prije zapoinjanja ekshumacije odrediti granice ukopnoga mjesta, a najbolji je nain kopanje probnih jama kojima se ne samo omeuje povrina nego i dobivaju korisni podatci o slojevitosti terena, sastavu zemlje, ostatcima flore i faune, arheolokim uvjetima i slino. Za uklanjanje povrinskoga sloja zemlje doputena je uporaba tekih strojeva (rovokopa), zatim se nastavlja paljivim runim kopanjem i na kraju ienjem zidarskom lopaticom, etkicom i ostalim malim runim priborom do potpunog uklanjanja zemlje iznad i uokolo svakog ostatka tijela ili skeleta i pridruenih mu predmeta. Pri tomu je vano tono lociranje svakoga pojedinanoga groba, kao i cijeloga grobnog polja (sl. 4-1). Isto se moe obaviti prostorunim crtanjem skice poloaja i meusobnih odnosa grobova i karakteristinih okolnih detalja, ili ucrtavanjem
99
Slika 4-1. Primjer masovne grobnice iz Domovinskoga rata: bunar u itniu, Ercegovci, dubine 8 m, iz kojega su nakon uklanjanja vode i lia izvaeni skeletni ostatci etiriju osoba ubijenih godine 1992. Ekshumacija i identifikacija (na terenu) obavljena je 1998. godine.
Slika 4-2. Snimanje masovne grobnice iz Drugoga svjetskog rata, Zagvozd, Imotski. Ekshumacija je obavljena 2005. godine.
100
grobnih polja i detalja unutar pravilne mree kvadrata ili pak, to je najtonije, geodetskim snimanjem u lokalnom ili dravnom koordinatnom sustavu (sl. 4-2). Otkriveni posmrtni ostatci, dijagnosticirani kao ljudski, oznauju
se brojevima, fotografiraju, skiciraju u svom poloaju, te se biljei stanje tijela i svega to se uz njega ili na njemu nalazi (odjea, predmeti), (sl. 4-3. i 4-4.). Nakon toga se tijelo (ili njegovi ostatci) paljivo, zajedno s pripadajuim
Slika 4-3. Detalj masovne grobnice iz Drugoga svjetskog rata, Zagvozd, Imotski.
Slika 4-4. Skeletni ostatci ekshumacija rtava rata, Lukar, Drni, 1996. godine.
101
predmetima, stavlja u obiljeenu vreu, a tlo ispod tijela, do dubine od jo nekoliko centimetara, ispituje radi moguega pronalaenja zaostalih zuba, sitnih kostiju ili dokaznog materijala [912]. Ekshumirani posmrtni ostatci prebacuju se na mjesto sudskomedicinske obradbe i identifikacije, u baze na terenu ili u najblii zavod za sudsku medicinu.
4.3.
Postupak i metode identifikacija
Ovisno o okolnostima sluaja i stanju poslijesmrtnih promjena tijela, primjenjuju se razliite metode identifikacija ljudskih ostataka (tabl. 4-2.). Identifikacija poinje podrobnim pregledom i opisivanjem odjee, obue i svih predmeta naenih uz tijelo i na njemu, to se upisuje u za to prethodno pripremljene obrasce. Karakteristini odjevni predmeti ili njihovi
Tablica 4-2. Metode identifikacije ljudskih ostataka identifikacija koju obavljaju ive osobe koje su poznavale pokojnika izravnim prepoznavanjem lica umrle osobe daktiloskopija prepoznavanje odjee/obue i predmeta usporedba zubnog statusa sa zubnim kartonom usporedba obdukcijskih nalaza s informacijama iz medicinske dokumentacije antropoloke metode radiografske metode superimpozicije i rekonstrukcije lica odreivanje i usporedba genetikih biljega.
detalji peru se, sue, te s osobnim dokumentima i vrijednim stvarima obiljeuju, fotografiraju i pakiraju u prozirne najlonske vreice radi arhiviranja, kasnijeg izlaganja i mogue predaje rodbini nakon zavretka procesa identifikacije. U specifinim situacijama identifikacija rtava rata iz masovnih grobnica, kad su mnogi postupci neprimjenjivi, ova se metoda izlaganja pokazala vrlo korisnom u fazi preliminarne pozitivne identifikacije [13]. Postupak identifikacije nastavlja se vanjskim i unutarnjim pregledom i opisom tijela, odnosno posmrtnih ostataka. Ako je rije o relativno svjeim leevima, slijedi se uobiajeni sudskomedicinski i kriminalistiki nain opisivanja koji ukljuuje detaljno navoenje oblika i izgleda glave i svih dijelova lica, boje i osobitosti kose, oiju, uiju, te obiljeja zuba. Posebna se pozornost posveuje tjelesnim osobitostima kao to su tetovae, madei, bradavice, promjene pigmentacije koe, oiljci, prijelomi, uroene ili steene anomalije, profesionalna obiljeja i slino, kao i trajne promjene na unutarnjim organima. Treba napomenuti da je daktiloskopija otisci papilarnih linija, kao najsigurnija metoda identifikacije, neupotrebljiva kod starijih leeva zbog izraenih trulenih promjena te posljedino propalih papilarnih linija koe prstiju aka [1]. Ako je rije o analizi skeletnih ostataka, primjenjuju se razliite antropoloke metode i mjerenja, a na prethodno oienim i opranim kostima. Najprije je potrebno odrediti radi li se o ljudskim kostima ili ne (1015% kotanih uzoraka dostavljenih na sudskomedicinsku analizu nisu ljudski ostatci), to katkad ni usko specijaliziranim strunjacima nije jednostavno, poglavito ako je rije o pojedinanim ili sitnim kotanim fragmentima. Najee se zamjenjuju kosti svinje, psa, krave, ovce, ali i mnogih drugih ivotinja, pa ak i predmeti kao to su kamenje, vrtna crijeva
102
ili plastina ambalaa. Odreivanje podrijetla kostiju oteano je i u sluajevima kad je njihov normalni izgled izmijenjen zbog patolokih promjena, kirurkih zahvata ili meteorolokih prilika, a tada u dijagnosticiranju moe pripomoi mikroskopski izgled kosti [12]. Sljedei korak jest odreivanje spola. Ako postoji itav kostur, tada identifikacija spola nije teka; potekoe nastupaju kada se o spolu treba oitovati na temelju jedne ili vie pronaenih kostiju, odnosno njihovih fragmenata. U djece se spol odreuje usporedbom stupnja kalcifikacije zuba sa stupnjem zrelosti skeleta. U dobi od oko 18 godina spolne razlike na skeletu dobro su izraene pa razlikovanje mukarca od ene moe biti pouzdano utvreno. Openito, kosti mukarca su vee, deblje i robusnije, s jae izraenim grebenima i kvrgama. Najpouzdanije informacije dobivaju se pregledom zdjelice, a nakon toga lubanje i dugih kostiju, posebice natkoljenine kosti [1112, 1415]. Potom slijedi odreivanje ivotne dobi koje je to lake i preciznije to je osoba mlaa. U procesu sazrijevanja, u mladih osoba, koriste se kotane i zubne promjene koje prate rast i razvoj, a to su: kalcifikacija i izbijanje zuba, postojanje centara okotavanja, meusobno srastanje dijelova kostiju te duljina dugih kostiju. Pri procjeni dobi u trenutku smrti u odraslih osoba primjenjuju se tehnike i metode koje se zasnivaju na dobno uvjetovanim morfolokim i mikroskopskim promjenama na kostima, ponajprije promjenama na spojnoj plohi stidnih kostiju zdjelice, zglobnoj povrini bone kosti zdjelice i hvatitima rebara za prsnu kost, te zatvaranje lubanjskih avova, a korisne su i razliite radioloke i dentalne tehnike [1112, 1415]. Zaivotna visina odreuje se mjerenjem duljine pojedinih kostiju, uz uporabu odgovarajuih regresivnih formula, a najrairenija metoda jest mjerenje svih dugih kostiju udo-
va. Problemi nastupaju kada postoje samo fragmenti dugih kostiju pa se tada preporuuje metoda utvrivanja zaivotne visine mjerenjem njihovih pojedinih dijelova, primjerice gornjeg dijela goljenine kosti [11, 12, 15]. Kotani pokazatelji zaivotnih trauma ili patolokih stanja takoer su bitni u identifikaciji, kao i antropoloke analize koje mogu pruiti podatke o uobiajenim zaivotnim aktivnostima i navikama umrle osobe [15]. U identifikacijama se primjenjuju i druge, znatno sloenije, skuplje i dugotrajnije metode. Ako se raspolae itavom lubanjom i odgovarajuom zaivotno snimljenom fotografijom, mogue je prepoznavanje izvriti primjenom videosuperimpozicije kad se s pomou videokamere i raunala obavlja preklapanje fotografije i lubanje, mijeajui i proizvodei sekcije slike u eljenim tokama s usporedbom svih anatomskih i morfolokih znaajki. Vano mjesto ima usporedba rentgenolokih snimaka kotanoga sustava uinjenih za ivota s onima uinjenima nakon smrti, pri emu je posebno zanimanje usmjereno na utvrivanje individualnih rentgenomorfolokih znaajki kostiju. Usporedba zaivotnih s poslijesmrtnim dentalnim obiljejima (oblika, veliine, pozicije i abnormalnosti zuba, stanja parodonta, obiljeja kotanih struktura i oralne sluznice, postojanje protetikih radova) te mogunost identifikacije pronaenih tijela s pomou tih karakteristika pokazala se i dokazala kao nezamjenjiv i vrlo bitan postupak u utvrivanju identiteta. Najvaniji imbenik za uspjenost dentalne identifikacije jest kvaliteta prijesmrtnih zubnih kartona to su oni potpuniji i precizniji, to je bre i lake prepoznavanje [1618]. DNA-analiza potencijalno je vrlo korisna i svakako najtonija metoda identifikacije. Zasniva se na usporedbi genomske ili mitohondrijske DNA izolirane iz uzoraka kosti ili zuba ekshumiranih tijela (sl. 4-54-7),
103
Slika 4-5. Uzorak za DNA-analizu: dio lubanje sa zubima. Ekshumacija rtava rata, Kupres 1993. godine.
Slika 4-6. Uzorak za DNA-analizu: 3 natkoljenine ljudske kosti i 1 natkoljenina ivotinjska kost. Ekshumacija rtava rata, Kupres 1993. godine.
Slika 4-7. Uzorak za DNA-analizu: zubi. Ekshumacija rtava rata, 1999. godine.
104
odnosno posmrtnih ostataka s DNA izoliranom iz uzorka kr vi pretpostavljene ue rodbine. No, zbog jake trulene degradacije, kao i
poslijesmrtne kontaminacije DNA, i ta metoda ima svoja ogranienja. Pri svakom sluaju sloene identifikacije preporueno je uzeti
Slika 4-8 (A i B). Preuzimanje kostiju za DNA-analizu.
105
uzorak kosti (najbolje natkoljenine) i zub te ih pohraniti u zamrziva do trenutka zapoinjanja obradbe i DNA-analize, i to tako da se predviena kost/zub dobro oisti, opere i osui, a potom dio kosti izuzme odgovarajuim izrezivanjem (sl. 4-8. A i B). Ako prilike to ne doputaju (rad na terenu), potrebno je uzeti cijelu dugu kost i/ili zube te ih naknadno pripremiti za pohranu uzorka. To treba uiniti zato to DNA-analize mogu biti dugotrajne te je esto potrebno, i prije zapoinjanja analiza, tijelo ili njegove ostatke pokopati, kada, ako nisu izuzeti, izvori DNA vie ne bi bili dostupni [1920]. Podatci dobiveni sudskomedicinskom obradbom biljee se u posebne formulare ili obrasce, te se usporeuju s podatcima o nestalim osobama, prethodno prikupljenima od rodbine, prijatelja, poznanika, preivjelih stradalnika i svjedoka stradavanja. Ti se podatci upisuju u takoer posebno pripremljene protokole. Posljednjih godina irom svijeta u uporabi je INTERPOL-DVI (Disaster-Victim-Identification)-FORM, u novom obliku potvren godine 1989. u Francuskoj, a koji je omoguio bolju i bru meudravnu i meudisciplinarnu suradnju i razumijevanje i u pojedinanim i u masovnim nesreama. Taj oblik protokola primjenjivan je i u identifikacijama ratnih rtava u Republici Hr vatskoj. No, ne tako rijetko identifikacija je oteana zbog nepodudarnosti s podatcima prikupljenima od navedenih osoba, a zbog razliitih razloga: objektivnih (promjena predmeta, odjee, kose, zuba, zbog dugoga razdoblja od naputanja posljednjega poznatog mjesta boravka) i subjektivnih (emocije, zaboravnost, sugestija). Osim toga, pojavljuje se jo jedan dodatni problem: lano pozitivna, odnosno lano negativna identifikacija koju obavlja obitelj, pr va u elji da se nestala osoba, odnosno njezini postmortalni ostatci, napokon pronau, a druga zbog neprihvaanja injenice smr-
ti. Takoer, mogua je i namjerna pogrjeka u identifikaciji ako je to u interesu prepoznavatelja.
4.4.
Zakljuak
U svakom procesu prepoznavanja nuna je suradnja svih relevantnih slubi, a metodama identifikacije potrebno je sluiti se planski, primjenjujui razliite postupke koji e meusobnim upotpunjivanjem poveati uspjenost identifikacije. Identifikacije ljudskih ostataka esto su vrlo dugotrajni i sloeni postupci, te e se samo strogim pridravanjem svih navedenih faza i odreenog redoslijeda u tijeku procesa ekshumacije i identifikacije omoguiti uspjenije, lake i bre pozitivno prepoznavanje. Na temelju iskustava steenih u identifikacijama rtava rata moe se preporuiti identifikacijski model koji je mogue primijeniti u slinim sluajevima masovnih nesrea, odnosno istraivanja masovnih grobnica. Taj model ukljuuje sastavljanje preciznog popisa nestalih osoba, podrobno prikupljanje zaivotnih podataka, tono lociranje mjesta nesrea ili grobova, profesionalno provoenje ekshumacija uz aktivno sudjelovanje odgovarajueg osoblja (policijski istraitelji i kriminalistiki tehniari, sudski antropolozi i sudski medicinari), formiranje multidisciplinarnoga identifikacijskog tima strunjaka sastavljenog od specijalista sudske medicine, antropologa, stomatologa, radiologa i molekularnoga genetiara, koji e obradbom ljudskih ostataka utvrditi to je vie mogue elemenata potrebnih za prepoznavanje i privremenu identifikaciju usporedbom prijesmrtnih podataka s nalazima strunoga tima, te potvrivanje identiteta u nazonosti rodbine. Ako identitet nije utvren primjenom standardnih metoda identifikacije, potrebno je primijeniti DNA-analizu [21].
106
4.5.
Primjeri iz prakse
Primjer 1.
Tijekom 1993.1994. godine posmrtni ostatci 61 osobe stradale na kuprekom bojitu u Bosni i Hercegovini u travnju 1992. godine, a ekshumirani iz est masovnih grobnica pod nepoznatim okolnostima, dopremljeni su iz razmjene i sudskomedicinski obraeni radi utvrivanja identiteta i uzroka smrti. Tijela su bila u uznapredovalim stadijima raspadanja, dijelom i potpuno skeletirana, bez ikakvih antemortalnih podataka. Kombiniranjem klasinih metoda, ukljuujui antropoloke analize, stomatoloki pregled zuba, rentgenografski pregled kostiju i videosuperimpoziciju, uspjeno je identificirano 35 osoba. DNA-analiza u trima je sluajevima potvrdila identitet pretpostavljene osobe. Za preostalih 25 stradalnika proces identifikacije, i to iskljuivo DNA-analizom (budui da ostale metode nisu dale dovoljno elemenata za prepoznavanje), nastavio se sljedeih godina te je broj neprepoznanih osoba smanjen na polovinu. Ovakav primjer identifikacije rtava rata nametnuo je zakljuak kako na uspjeh procesa utjee ponajprije dostupnost antemortalnih podataka, kao i poznavanje vremena, naina i mjesta smrti, mjesta i naina pokapanja te iskopavanja posmrtnih ostataka. Takoer je, upozorio na injenicu da je DNA-analiza, kao posljednja metoda izbora, iako dugotrajna, skupa i neizvjesna, nezaobilazna, a rezultati neobino vani u konanom prepoznavanju [20].
tizom utvreno da je rije o mukarcu (natkoljenina kost), dobi 1820 godina (spoj stidnih kostiju), zaivotne visine 185190 cm (Trotter). Starost kostiju procijenjena je na desetak godina. Na temelju dobivenih podataka, pretpostavljeno je da kotani ostatci pripadaju nestalom mladiu. No, kako je rodbina i dalje izraavala sumnju u identitet, zatraena je DNA-analiza koja je nedvojbeno potvrdila isto. Valja napomenuti da je DNA dobivena iz kosti naene na tlu u izoliranom, vlanom okruenju, bez dodatnih atmosferskih utjecaja, bila vrlo visoke kvalitete [22].
Primjer 3.
U sjevernom dijelu grada Splita, izvan Dioklecijanove palae, tijekom arheolokih iskapanja, pronaen je ljudski kostur, a uz njega predmeti od keramike iz kasnoga romanikog razdoblja. Kostur je bio oteen pri iskopavanju. Ipak, utvreno je da je rije o mukoj osobi, dobi 3040 godina, zaivotne visine 1675 cm. Vrijeme proteklo od smrti do pronalaska skeleta uznosilo je 1 76080 godina (14C metoda). Unato starosti, DNA je uspjeno izolirana iz natkoljenine kosti i umnoena u 10 razliitih lokusa, ime je utvren genetiki profil osobe iji su ostatci pronaeni [23].
Primjer 4.
U travnju 2005. obavljena je ekshumacija ljudskih posmrtnih ostataka pronaenih u Zagvozdu, Imotski, u masovnoj grobnici iz Drugoga svjetskog rata. Nakon ekshumacije ostatci su prebaeni na Kliniki odjel za sudsku medicinu KB Split, gdje je obavljena sudskomedicinska obradba radi pokuaja identifikacije. Polazna je pretpostavka bila da se meu ekshumiranim ostatcima nalaze tijela osmorice nestalih fratara koji su u veljai 1945. godine odvedeni iz samostana na irokom Brijegu, BiH, te na putu prema SpliIdentifikacija ljudskih ostataka
Primjer 2.
Dvanaest godina nakon to je prijavljen nestanak 19-godinjeg mladia, u jami dinarskoga kra, na dubini od dvadesetak metara, pronaeni su dijelovi ljudskih kostiju s ostatcima odjee. Sudskomedicinskom je eksper-
107
tu ubijeni. Nakon provedene obradbe kojom su rekonstruirani skeleti 18 odraslih, mukih osoba, izuzeti su uzorci za DNA-analizu (zubi). DNA je uspjeno izolirana i umnoena uporabom AmpFLSTR Identifiler PCR-sustava (u 7 sluajeva) za uzorke koji bi se mogli identificirati putem DNK obaju roditelja, te uporabom AmpFLSTR Yfiler PCR-sustava (u svih 18 sluajeva) za uzroke koji bi se mogli identificirati putem DNA iz uzoraka rodbine naslijeene mukom linijom. Usporedbom s rezultatima DNA-analize uzoraka kr vi ivue rodbine i DNA-analize uzoraka kostiju naknadno ekshumirane umrle rodbine pretpostavljenih nestalih osoba, uspjeno su do danas (2007. godine) identificirane 3 osobe
(fratra iz irokobrijekog samostana). Iako se u itavome procesu ekshumacija i identifikacija postupalo u potpunosti po pravilima struke, identificiran je vrlo mali broj osoba. Dva su kljuna razloga zbog kojih je identifikacija trajala dugo, a broj prepoznanih osoba, barem za sada, nije bio vei: potpuno nepostojanje antemortalnih podataka potrebnih za usporedbu te izuzetno loa ouvanost skeletnih ostataka (kako onih iz ukopa u Zag vozdu, tako i naknadno ekshumiranih ostataka umrle bliske rodbine nestalih osoba iji su ostatci pretpostavljeno pronaeni u Zag vozdu). Navedeno je onemoguivalo i oteavalo primjenu odreenih antropolokih metoda i DNA-analizu, kao i interpretaciju rezultata [4].
Literatura
1. Zeevi D. i sur. Sudska medicina. 3. izd. Zagreb: Jumena, 1989. 2. Cihlar Z. Identifikacija i zbrinjavanje poginulih u ratu i masovnim katastrofama. Tuzla: Infograf, 1994. 3. Strinovi D, kavi J, Gusi S i sur. Obiljeja identifikacije u domovinskom ratu. I. hr vatski kongres patologa i sudskih medicinara, Zagreb, 1996. Hrvatsko drutvo za patologiju i sudsku medicinu, Zagreb, 1996. 4. Mari A, Definis-Gojanovi M, Sutlovi D. Tragom ubijenih hercegovakih fratara. Mostar: Franjevaka tiskara, 2007. 5. Definis-Gojanovi M. Znaaj i obiljeja ekshumacija i identifikacija rtava rata. Vladavina prava 2001;21:127-35. 6. enevske konvencije za zatitu rtava rata s dopunskim protokolima. Zagreb: Narodne novine, 1997. 7. Williams ED, Crews JD. From dust to dust: ethical and practical issues involved in the location, exhumation, and identification of bodies from mass graves. Croat Med J 2003;44:252-8. 8. Gaensslen RE, Lee HC. Genetic markers in human bone tissue. Forensic Sci Rev 1990; 2:126-45. 9. Skinner M. Planning the archeological recovery of evidence from recent mass graves. Forensic Sci Int 1987;34:267-87. 10. Klonowski EE. Uputstva za ekshumaciju i identifikaciju ljudskog skeleta. Sarajevo, Physicians for Human Rights: GIK, 1997. 11. Krogman WM, Iscan MY. The Human Skeleton in Forensic Medicine. 2nd ed. Springfield: Charles C Thomas, 1986. 12. Ubelaker DH. Human Skeletal Remains: Excavation, Aalysis, Interpretation. 3rd ed. Washington: Taraxacum, 1999. 13. Anelinovic , Definis-Gojanovi M, Primorac D, Schanfield MS. Methods of exhibiting victims belongings as a crucial tool in the identification of human remains from mass graves in specific situations. Proceedings of the American Academy of Forensic Sciences; 1999 Feb 15-20; Orlando, Florida: AAFS; 1999. 14. Roetzscher K. Techniques for evaluation of forensic odontological findings. 13th Meeting of the
108
15.
16.
17.
18.
19. 20.
International Association of Forensic Sciences, Dsseldorf, 1993. Berlin: Verlag dr. Koster, 1995. Reichs KJ. Forensic Osteology: Advances in the Identification of Human Remains. Springfield; Charles C Thomas, 1986. Koelmever TD. Videocamera superimposition and facial reconstruction as an aid to identification. Am J Forensic Med Pathol 1982;3:45-8. Kahana T, Hiss J. Identification of human remains forensic radiology. J Clin Forensic M 1991;4:710. Brki H, Strinovi D, Kubat M, Petroveki V. Odontological identification of human remains from mass graves in Croatia. Int J Legal Med 2000;114:19-22. Jeffreys AJ. DNA typing: approaches and aplications. J Forensic Sci Soc 1993; 33:204-11. Primorac D, Anelinovic , Definis Gojanovi M i sur. Identification of war victims from mass graves in Croatia, Bosnia and Herzegovina by the use of standard forensic methods and DNA typing. J Forensic Sci 1996;41:891-4.
21. Strinovi D, kavi J, eevi D i sur. Experiencebased identification model for mass disasters. Proceedings of the 10th International Meeting on Forensic Medicine Alpe-Adria-Pannonia; 2001 May 23-26; Opatija. Department of Forensic Medicine and Criminology, School of Medicine, University of Zagreb; 2001. 22. Definis-Gojanovi M, Sutlovi D, Drmi I, Anelinovic . Forensic identification of human skeletal remains from rugged cavity. Proceedings of the 10th International Meeting on Forensic Medicine Alpe-Adria-Pannonia; 2001 May 23-26; Opatija. Department of Forensic Medicine and Criminology, School of Medicine, University of Zagreb; 2001. 23. Anelinovi , Sutlovi D, Drmi I, Primorac D. Bone DNA old as Diocletians palace? Proceedings of the 10th International Meeting on Forensic Medicine Alpe-Adria-Pannonia; 2001 May 23-26; Opatija. Department of Forensic Medicine and Criminology, School of Medicine, University of Zagreb; 2001.
109
5.
Primjena analize DNA u hrvatskome kaznenopravnom sustavu

Damir Primorac
Sadraj poglavlja
5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. Uvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Sudski vjetaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Bioloki tragovi ljudskoga podrijetla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 Analiza DNA u hrvatskom kaznenopravnom sustavu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Primjeri iz sudske prakse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Zakljuak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
5.1.
Uvod
Za analizu DNA moemo rei da je to znanstveni molekularno-genetiki postupak koji se provodi u posebno opremljenim laboratorijima, kojemu je cilj analiza temeljnoga genetikog materijala. Uzorak DNA moe biti bilo koja supstancija organskog podrijetla koja se moe upotrijebiti radi analize DNA (kao npr. krv, dlaka, sperma, pljuvaka, nokti, kosti i dr.). Tehnologija temeljena na analizi DNA zauzela je nezamjenjivo mjesto
Deoksiribonukleinska kiselina (u daljnjem tekstu: DNA) vrlo je dugaka molekula koja nosi zapise nasljednih svojstava svakog organizma. Prema onome to znamo o strukturi DNA, ona se odlikuje dvama svojstvima: sadrava upute u obliku koda s pomou kojih upravlja razvojem stanice sposobna je da se razmnoavanjem tono ponavlja kako bi kodove u istom obliku predavala buduim generacijama stanica.
110
DNA analiza
u sudskomedicinskoj znanosti. Premda je razvoj tipizacije DNA u sudskomedicinskoj znanosti bio izuzetno brz, danas smo svjedoci novog doba razvoja DNA-tehnologije koji ukljuuje automatizaciju i minimalizaciju. U sudskomedicinskoj znanosti analiza DNA je oblik znanstvenog dokaza koji je javnost procijenila i koji je dokazao svoju vrsnou. Postoje dvije glavne primjene analize DNA u sudskim postupcima: u kaznenim postupcima, kada postoji vjerojatnost da e se analizom DNA pribaviti podatci vani za voenje kaznenog postupka u parninom postupku radi utvrivanja oinstva i materinstva, odnosno osporavanja oinstva i materinstva. Upravo je analiza DNA u kaznenopravnom sustavu dovela do toga da se unaprijedila tehnologija glede vjetaenja, to je bilo prijeko potrebno radi otkrivanja poinitelja teih kaznenih djela, odnosno radi pravilnog i potpunog utvrivanja injeninoga stanja u kaznenim postupcima. Jednostavno, na dananje oblike sofisticiranih oblika kriminalnih ponaanja trebalo je odgovoriti najsofisticiranjim znanstvenim dostignuima, u to se svakako ubraja primjena analize DNA u kaznenim postupcima kako bi se u sudskim postupcima na to kvalitetniji i bri nain utvrdile odlune injenice. Prema tome, takav razvoj znanosti prije svega dovodi do ouvanja najvanijih vrijednosti svake pravne drave, odnosno da nitko neduan ne bude osuen te da se poinitelju kaznenoga djela izrekne kazna ili druga mjera uz uvjete koje predvia zakon i na temelju zakonito provedenog postupka pred nadlenim sudom.1
1 2
5.2.
Sudski vjetaci
Prije nego to se upustimo u analizu primjene DNA u hrvatskome kaznenopravnom sustavu za poetak smatramo potrebnim osvrnuti se na osobe izvan pravne struke, koje umnogome odreuju tijek kaznenog postupka. Naravno, rije je o sudskim vjetacima. Meutim, ne emo se osvrnuti samo na sudskomedicinske vjetake, koji uz ostale vrste vjetaenja iz svoje struke, provode i analizu DNA, nego emo u jednome kratkom saetku, i to s pravnog aspekta, a kako je to odreeno u Zakonu o kaznenom postupku (Narodne novine, br. 110/97., 27/98., 58/99., 112/99., 58/02., 143/02., 178/04. i 115/06.) u daljnjem tekstu ZKP, pokuati openito prikazati tko su to sudski vjetaci, kad se odreuje vjetaenje, tko odreuje vjetaenje, na koji se nain procjenjuju nalaz i miljenje sudskih vjetaka u kaznenom postupku i dr. Sudjelovanje sudskih vjetaka u kaznenom postupku ureeno je odredbama l. 247. do l. 266. ZKP-a. Danas je sudjelovanje sudskih vjetaka u kaznenim postupcima gotovo sastavni dio svakoga sudskog postupka jer se pojavljuje sve vie situacija u kojima je sudovima za utvrivanje ili ocjenu neke vane injenice potrebno pribaviti nalaz i miljenje osoba koje raspolau strunim znanjem. Dakle, ako bi sud i imao kakvo struno znanje koje se odnosi na vjetaenje u odreenome kaznenom predmetu, tada se on tim znanjem ne bi mogao koristiti, nego bi morao pozvati sudskog vjetaka radi davanja nalaza i miljenja. Imajui na umu vanost vjetaenja u kaznenom postupku, ne zauuje injenica da se time u dananje vrijeme sve vie bavi znanost i praksa kaznenoga postupovnog prava.2
Vidjeti l. 1. ZKP-a te l. 28. Ustava Republike Hr vatske (Narodne novine, br. 41/01.) u daljnjem tekstu Ustav. O sudskim vjetacima vidi referat Primorac, D: Znaaj vjetaenja u kaznenom postupku, Aktualna pitanja kaznenog zakonodavstva 2007. godina, Inenjerski biro d. d., Zagreb, 2007. godina, str. 174189.
111
Sudski je vjetak osoba koja raspolae strunim znanjem i koju u sluaju potrebe poziva sud radi davanja i miljenja glede utvrivanja ili ocjene neke bitne injenice u sudskom postupku. Sudski je vjetak dakle struna osoba, prije svega nezainteresirana za ishod odreenog postupka, te iz izvanpravnog podruja, kojemu je tijelo kaznenog postupka povjerilo da, s obzirom na svoju strunost i znanje, pomogne sudu u utvrivanju odlunih injenica. Za sudskog vjetaka u kaznenim postupcima mogu se odrediti sljedee osobe: stalni sudski vjetak (fizika osoba koja je upisana u Popis stalnih sudskih vjetaka kod nadlenog suda) odreena struna ustanova (vjetaenja u takvim ustanovama odreuju se kad je rije o sloenijim predmetima i vjetaenjima ili pak u situaciji kad se odreuje tzv. tree vjetaenje) osoba koja nije upisana u Popis stalnih sudskih vjetaka, ali koja ima potrebno struno znanje za odreeno vjetaenje i koja se imenuje od sluaja do sluaja tzv. ad hoc sudski vjetak. U pravilu, sud bi najprije trebao odreivati vjetake koji se nalaze na Popisu stalnih sudskih vjetaka, a tek onda, ad hoc sudske vjetake. Meutim, ne postoji nikakva zakonska zaprjeka da se u odreenim predmetima postupi drukije, ako za to postoje opravdani razlozi koje treba uzimati od sluaja do sluaja.
Prije poetka vjetaenja sudski e se vjetak pozvati da briljivo proui predmet vjetaenja, da tono navede sve to zapazi i nae, te da svoje miljenje iznese nepristrano i u skladu s pravilima znanosti i vjetine. Pri tomu e se posebno upozoriti na to da je davanje lanog iskaza kazneno djelo. Dakle, prije poetka vjetaenja sudski e vjetak biti pouen o svojim opim dunostima i obvezama. Da bi neka osoba mogla vjetaiti u odreenom kaznenom predmetu, potrebno je da ima pisani nalog. Prema odredbi l. 248. ZKP-a vjetaenje odreuje, pisanim nalogom, tijelo koje vodi kazneni postupak, a u njemu se mora navesti u vezi s kojim se injenicama obavlja vjetaenje i komu se ono povjerava.3 U pravilu se odreuje jedan sudski vjetak, a kada je potrebno, mogu se odrediti dva ili vie sudskih vjetaka. Ako se odreuje vie vjetaka, oni mogu biti iste, srodnih ili razliitih struka. Homogena su vjetaenja ona u kojima sudjeluju vjetaci iste struke, a heterogena ako sudjeluju vjetaci raznih struka.4 Primjerak naloga o vjetaenju dostavlja se i strankama, premda se u praksi dogaa da to sudovi ne ine uvijek. Nalog je vano dostaviti strankama prije svega zato da bi one znale to je predmet vjetaenja, tko e obaviti vjetaenje, da mogu stavljati primjedbe i dopune na takav nalog, da se u tijeku postupka informiraju kako napreduje vjetaenje i sl. Ako za odreenu vrstu vjetaenja postoji struna ustanova, ili se vjetaenje moe obaviti unutar dravnog tijela, takva vjetae-
U praksi se zna dogaati da sudovi, nakon to je sudski vjetak izradio nalaz i miljenje, trae dopunu vjetaenja. Razlog tomu zna biti i u nedovoljno preciziranom nalogu za vjetaenje, to sudske vjetake moe dovesti u nedoumicu, pogotovu ako je rije o sudskim vjetacima s nedovoljno iskustva. Zato je vrlo vano da svaki nalog za vjetaenje sadrava jasne navode u vezi s kojim injenicama je potrebno obaviti vjetaenje. Ako to nije jasno navedeno, moe se vrlo lako dogoditi da i taj propust moe biti jedan od razloga koji utjee na odugovlaenje kaznenog postupka. Pavii, B: Komentar Zakona o kaznenom postupku, agar, Rijeka, 2003. godina, str. 355.
112
nja, osobito sloenija, povjeravat e se, u pravilu, takvoj ustanovi, odnosno tijelu. Ustanova, odnosno tijelo odreuju po svojemu slobodnom izboru jednog ili vie strunjaka koji e obaviti vjetaenje, i to tako da se pri tome vodi rauna o strunosti i kvalitetama pojedinih sudskih vjetaka za odreeno podruje. Svakako je vano istaknuti kako stranke ne mogu sudjelovati u takvom odabiru sudskog vjetaka, samo to mogu iznositi odgovarajue primjedbe, koje opet ne obvezuju sud pri odabiru sudskoga vjetaka. No, i u takvoj situaciji stranke zbog istih razloga kao gore imaju pravo znati komu je od fizikih osoba u toj ustanovi povjereno vjetaenje. Vjetaenje se, u pravilu, povjerava strunim ustanovama prije svega u sloenijim predmetima jer se u takvim ustanovama moe kvalitetnije obaviti vjetaenje, nego kada radi sam sudski vjetak (ustanove imaju kvalitetniju tehnologiju, vei izbor sudskih vjetaka i dr.). Struna ustanova, odnosno dravno tijelo duno je dostaviti pisani nalaz i miljenje koji su potpisale osobe koje su obavile vjetaenje.5 U zapisniku o vjetaenju ili u pisanom nalazu i miljenju naznait e se tko je obavio vjetaenje te zanimanje, struna sprema i specijalnost vjetaka. Dakle, uvijek se moraju znati osoba, struna sprema i specijalnost vjetaka. Ovo ima za cilj da se vidi tko je u strunoj ustanovi ili dravnom tijelu obavio vjetaenje, to moe biti znaajno za daljnji tijek kaznenog postupka. Isto tako, to moe biti vano i pri moguem izuzeu sudskoga
vjetaka, odnosno pri utvrivanju njegove odgovornosti zbog davanja lanog nalaza i miljenja. Nakon zavrenog vjetaenja, kojemu nisu bile nazone, stranke e biti obavijetene da je vjetaenje obavljeno i da zapisnik o vjetaenju, odnosno pisani nalaz i miljenje mogu razgledati. Upoznavanje stranaka s ovom mogunou prije svega se zasniva na naelu kontradiktornosti stranaka, tj. da obje stranke budu jednako ravnopravne u kaznenom postupku. Tako, primjerice, izvjeivanje stranaka o zavretku vjetaenja dok se postupak jo nalazi u tijeku istrage daje mogunost strankama da predlau nove dokaze, koje e tijekom glavne rasprave biti teko ili nemogue provesti, to sve moe utjecati na odugovlaenje kaznenog postupka. Vjetaenje zavrava davanjem iskaza sudskog vjetaka o utvrenim injenicama u kaznenom postupku.6 Iskaz se sastoji od dvaju dijelova: nalaza (visum repertum) i miljenja (parere). Nalaz je onaj dio iskaza sudskog vjetaka u kojemu on na temelju svoga posebnog strunog znanja utvruje promjene to ih je odreena injenica ostavila u izvanjskome svijetu, dok je miljenje onaj dio iskaza u kojemu sudski vjetak na temelju nalaza i svoga strunog znanja izlae svoje shvaanje o tome kakvo je znaenje utvrenih tragova koje je injenica ostavila u izvanjskome svijetu.7 Dakle, preduvjet za davanje miljenja jest postojanje nalaza na temelju kojega se i daje miljenje. ZKP je propisao nekoliko sluajeva obveznoga vjetaenja, i to:
Kada je vjetaenje povjereno strunoj ustanovi, nema povrjede Zakona, ako je nalaz i miljenje potpisao direktor te ustanove, a ne sam vjetak koji je obavljao vjetaenje, jer je direktor svojim potpisom ovjerio to vjetaenje, i u ime ustanove preuzeo odgovornost za obavljeno vjetaenje VSH K-1001/68. Vjetaenje je jedna od istranih radnji (Glava XIX. ZKP), uz napomenu da se vjetaenjem razjanjavaju samo injenina, a nikada pravna pitanja. Za razjanjavanje pravnih pitanja iskljuivo je relevantan sud. Jemri, M.: Zakon o krivinom postupku, VI. izdanje, Narodne novine, Zagreb, 1987., str. 299.
113
ako u kakvom smrtnom sluaju postoji sumnja ili je oito da je smrt prouzroena kaznenim djelom l. 258. ZKP-a ako postoji sumnja o trovanju l. 262. ZKP-a pri vjetaenju tjelesnih ozljeda l. 263. ZKP-a te ako postoji sumnja da je iskljuena ili smanjena ubrojivost okrivljenika l. 264. ZKP. Prema tome, ako je rije o ovakvim sluajevima, tada sud nema pravo izbora, ve uvijek mora odrediti vjetaenje. Meutim, u svim ostalim sluajevima ne postoji obveza vjetaenja tako da tijela kaznenog postupka sama odluuju hoe li u odreenim predmetima narediti vjetaenje ili e odlune injenice utvrivati na drugi nain predvien ZKP. Ako se podatci sudskih vjetaka u njihovu nalazu bitno razilaze ili ako je njihov nalaz nejasan, nepotpun ili u proturjenosti sam sa sobom ili s izvienim okolnostima, a ti se nedostatci ne mogu otkloniti ponovnim ispitivanjem vjetaka, obnovit e se vjetaenje s istim ili drugim vjetacima l. 256. ZKP-a. Primjena ove odredbe dolazi u obzir ako su
vjetaenje radila dva sudska vjetaka ili vie njih te ako se njihovi nalazi bitno razilaze ili pak ako je vjetaenje obavio jedan sudski vjetak, ali je njegov nalaz nejasan, nepotpun ili u proturjenosti sam sa sobom. Svi se ti nedostatci najprije trebaju pokuati otkloniti dopunskim vjetaenjem, tj. ponovnim ispitivanjem sudskih vjetaka radi otklanjanja nedostataka. Ako te nedostatke nije mogue otkloniti ponovnim ispitivanjem sudskoga vjetaka (jednog ili vie njih), tada e se obnoviti vjetaenje s istim ili drugim vjetacima. S druge strane, ako u miljenju vjetaka ima proturjenosti ili nedostataka ili se pojave osnove sumnje u tonost danog miljenja, a ti se nedostatci ili sumnja ne mogu otkloniti ponovnim ispitivanjem vjetaka, tada e se zatraiti miljenje drugih vjetaka.8 Dakle, u ovom sluaju sud ne moe prihvatiti jedno ili drugo miljenje, nego je duan takve nedostatke pokuati otkloniti ponovnim ispitivanjem vjetaka (dopunsko vjetaenje).9 Ako se ni nakon ponovnog ispitivanja vjetaka ne mogu otkloniti ti nedostatci, onda e se zatraiti miljenje drugih vjetaka. To, novo, tzv. tree vjetaenje esto se naziva super vjetaenjem
Kad je vjetak dao svoj pisani nalaz i miljenje o uraunljivosti optuenika, ali zbog opravdanih razloga ne moe pristupiti glavnoj raspravi, a sud nae potrebnim da vjetaenje obnovi drugi vjetak, o tom sluaju drugi vjetak treba da obavi ponovno vjetaenje na osnovi kojeg e dati svoj nalaz i miljenje Odluka VsS K 344/72. Ako dvojica sudskomedicinskih vjetaka iznesu razliito miljenje o moguem mehanizmu nastanka ozljede oteenika miljenje jednog je da je prijelom kostiju ruke nastao padom, a drugog da je prijelom tipina posljedica izravnog udarca po ruci pa kod takvih razliitih miljenja vjetaci ustraju i pri ponovnom sasluanju, sud se nije ovlaten uputati u ocjenu tih miljenja i miljenje jednoga vjetaka prihvatiti kao uvjerljivije, jer za takvu ocjenu sud nema strunoga znanja. U takvom sluaju, sud je duan, prema odredbi l. 257. ZKP-a, zatraiti miljenje drugoga vjetaka sudskomedicinske struke, jer, u suprotnom, ini relativno bitnu povrjedu odredaba kaznenog postupka iz l. 354. st. 2. ZKP-a upanijski sud u Bjelovaru K-396/1997 od 9. listopada 1997. Ako sud posumnja u tonost miljenja vjetaka, ocjenjujui da je u smislu odredbe l. 349. st. 2. ZKP-a duan pokuati nastalu situaciju otkloniti ponovnim ispitivanjem vjetaka, a, ako u tome ne uspije, treba odrediti novo vjetaenje s drugim vjetakom, odnosno drugim vjetacima. Ovo zbog toga to sud ne moe sam raspraviti o prijepornim pitanjima za koja nije struan Vrhovni sud Hrvatske K 356/99. U sluaju neslaganja u miljenju vjetaka danih istodobno ili sukcesivno, nuno je najprije pokuati da se to neslaganje otkloni ponovnim sasluanjem vjetaka, a, ako se to ne uspije, sud ne moe odluiti koje e miljenje uzeti kao pravilno, nego treba narediti novo vjetaenje s drugim vjetacima Odluka VsH K 906/67 i VsV K 771/74.
114
ili superekspertizom i u najveem broju sluajeva povjerava se strunim ustanovama.10 Prema odredbi l. 8. st. 2. ZKP-a, pravo suda i dravnih tijela, koji sudjeluju u kaznenom postupku, da ocjenjuju postojanje ili nepostojanje injenica nije vezano niti ogranieno posebnim formalnim dokaznim pravilima. To znai da sud pri ocjenjivanju dokaza nije vezan nikakvim pravnim propisima, osim to je vezan opim pravilima ljudskog miljenja i iskustva, a to znai da zakljuak tog ocjenjivanja mora biti takav da ga prihvaa svaki upueni graanin (slobodna ocjena dokaza).11 No, postavlja se pitanje, a s obzirom na strunost sudskih vjetaka, je li sud obvezan prihvatiti nalaz i miljenje sudskog vjetaka. Iako se i pri ocjenjivanju nalaza i miljenja sudskih vjetaka primjenjuje naelo slobodne ocjene dokaza, u pravnoj teoriji razvila su se tri razliita stajalita:12 Pr vo stajalite u potpunosti prihvaa naelo slobodne ocjene dokaza, pa nalaz i miljenje sudskoga vjetaka ocjenjuje kao i bilo koji drugi dokaz koji je proveden u kaznenom postupku. To znai da bi sud mogao nalaz i miljenje vjetaka ne prihvatiti i zamijeniti ga svojim miljenjem. Ova ekstremna stajalita sudska praksa danas ne prihvaa, Po drugom stajalitu, sud je u potpunosti vezan za nalaz i miljenje sudskoga vjetaka, kao strune osobe za odreeno podruje, pa sud, kao laik, ne moe ne prihvatiti ono to
mu je sudski vjetak, kao strunjak, u svojem nalazu i miljenju naveo, Tree stajalite, koje danas usvaja sudska praksa, omoguuje sudu da nalaz i miljenje vjetaka ocijeni kao i druge dokaze, da se s tim nalazom sloi ili ne sloi, to je duan u presudi temeljito obrazloiti, no, ako se sud ne sloi s nalazom i miljenjem vjetaka, on ga ne moe zamijeniti svojim miljenjem. Dakle, bez obzira na struno znanje kojim raspolau sudski vjetaci, u praksi nije prihvaeno stajalite prema kojemu su sudovi u potpunosti vezani za nalaze i miljenja sudskih vjetaka. Praksa je ila za tim da se nalaz i miljenje sudskoga vjetaka ocjenjuje kao i svaki drugi dokaz, uz napomenu da se s takvim nalazom i miljenjem sudovi mogu sloiti ili ne sloiti. Ako se sloe, sud je duan u presudi obrazloiti zbog ega je prihvatio nalaz i miljenje (pri obrazlaganju sudovi najee rabe formulaciju: ... sud je prihvatio nalaz i miljenje sudskog vjetaka kao logian i uvjerljiv te sukladan pravilima struke ... i dr.). Ako sud ne prihvati nalaz i miljenje sudskoga vjetaka, takoer je duan dati svoje obrazloenje, uz napomenu da tada nalaz i miljenje sudskog vjetaka ne moe zamijeniti svojim miljenjem, nego je duan narediti novo vjetaenje te postupiti sukladno odredbi l. 256. i 257. ZKP-a. Pri ocjeni nalaza i miljenja sudskih vjetaka sudovi mogu ocjenjivati tzv. vanjsku i unutarnju stranu vjetaenja.13 Problem se,
10
Kvalitetna izradba nalaza i miljenja svakako moe utjecati na smanjenje broja glede potrebe za superekspertizom ili super vjetaenjem. Prema tome, strunost sudskih vjetaka veoma je bitan imbenik za kvalitetan i brz nain utvrivanja odlunih injenica u kaznenom postupku. Isto tako, kvaliteta nalaza i miljenja sudskih vjetaka uvelike ovisi i o strunosti suca koji vodi kazneni postupak, odnosno o njegovu odabiru sudskoga vjetaka. Vidi o tome kod Primorac, D. i suradnici: Primjena analize DNA u sudskoj medicini i pravosuu, Biblioteka Pravo, Zagreb, 2001. godina, str. 135. Vidjeti kod Garai, A: Vjetaenja u kaznenom postupku, 1997. godina, www.vsrh.hr. Modly, D: Neki problemi pri odreivanju vjetaka, rukovoenju njegovim postupkom i ocjenjivanju njegovog iskaza, Hrvatski ljetopis za kazneno pravo i praksu, vol. 7, br. 1/2000, Zagreb, str. 181219.
11
12 13
115
zasigurno, ne pojavljuje pri ocjenjivanju vanjske strane vjetaenja, tj. kada sudovi provjeravaju je li se sudski vjetak pri izradbi nalaza i miljenja pridravao odredbi ZKP-a koje se odnose na vjetaenje. No, problem se pojavljuje pri ocjenjivanju tzv. unutarnje strane vjetaenja, tj. kada sud mora ocjenjivati dio vjetaenja koji se tie izravno struke.14 Jasno je kako netko, da bi mogao ocjenjivati struni dio materije, mora biti dobar poznavatelj te materije, a to sudovi sigurno nisu kad su u pitanju nalazi i miljenja sudskih vjetaka.15 Suci ak i mogu imati odreeno struno znanje iz pojedine materije, ali to opet ne iskljuuje potrebu za vjetaenjem, tako da to znanje sudaca moe posluiti samo radi lakeg razumijevanja problematike te pravilnije ocjene dokaza. Prema tome, cijenei injenicu da zbog znanja, sposobnosti te dostupne tehnologije, nalazi i miljenja sudskih vjetaka ine znanstveno objektivni dokaz, onda sudovi u najeem broju sluajeva samo potvruju ono to je navedeno u nalazima i miljenjima te poslije to obrazlau u presudi.
5.3.
Bioloki tragovi ljudskoga podrijetla
Pod tragom kaznenog djela razumijeva se svaka vidljiva ili golim okom nevidljiva materijalna promjena nastala na mjestu dogaaja, na rtvi ili na poinitelju, u vezi s poinjenjem kaznenog djela ili u povodu njega.16 Bioloki su tragovi pak oni tragovi koji su ljudskog podrijetla i koji se mogu pronai na mjestu
poinjenja kaznenoga djela (kao npr. tragovi kr vi, dlake, pljuvake, sperme i dr.). Bioloki tragovi kod kaznenih djela, pogotovu kad su u pitanju kaznena djela iz glave X. Kaznenog zakona (Narodne novine, br. 110/97., 27/98., 50/00. Odluka USRH, 129/00., 51/01., 111/03., 190/03. Odluka USRH, 105/04., 84/05. ispr. i 71/06.) u daljnjem tekstu KZ, koja nosi naziv Kaznena djela protiv ivota i tijela, glave XIV. koja nosi naziv Kaznena djela protiv spolne slobode i spolnog udorea te glave XVII. koja nosi naziv Kaznena djela protiv imovine, vrlo esto mogu biti jedini dokaz oko razjanjenja pojedinoga kaznenog djela (kao npr. otkrivanja poinitelja kaznenoga djela, utvrivanja tonoga mjesta poinjenja kaznenoga djela i dr.). Od tragova biolokog podrijetla na mjestu poinjenja kaznenih djela, posebno kod kaznenih djela protiv ivota i tijela, najee se pojavljuje krv i za nju slobodno moemo kazati da je najvaniji bioloki trag. Tragove kr vi treba traiti na osumnjieniku, rtvi, na cjelokupnom mjestu dogaaja, a posebno tamo gdje se moglo oekivati da su se osumnjienik i rtva kretali. Katkad ti tragovi kr vi mogu biti vrlo mali, pa ak i nevidljivi golim okom, to moe dodatno oteati napore u pronalasku takvih tragova. No, cijenei vanost tragova kr vi glede otkrivanja najteih oblika kaznenih djela, onda te napore svakako treba maksimalno uloiti jer je u znatnom broju sluajeva pitanje krivnje ili nedunosti okrivljenika ovisilo o pronalasku i vjetaenju tragova koji su nalikovali na krv. Iako se mikrotragovi kr vi najee vjetae, to ne znai da treba zanemariti i osta-
14
Vidi o tome kod Zeevi, D i suradnici. Vjetaenje teine tjelesnih ozljeda u krivinom postupku, Informator, Zagreb, 1985. godina, str. 14. Vodineli V, Aleksi . Kriminalistika, Informator, Zagreb, 1990., str. 539.
15 Garai A. Vjetaenje u kaznenom postupku., 1997., www.vsrh.hr 16
116
le tragove biolokog podrijetla jer uvijek treba imati na umu da svaki dio ljudskog tijela moe biti uzorkom radi analize temeljnoga genetikog materijala. Jedan od tragova poinjenja kaznenog djela moe biti i dlaka. Pronalaenje tragova dlaka vrlo je esto u kriminalistikoj praksi, pogotovu u sluajevima kad je postojao osobni kontakt17. Tragovi dlake mogu biti veoma vaan dokazni materijal, pod uvjetom da se pravilno izuzme s mjesta dogaaja, pakira i poalje na vjetaenje. Zato je iznimno vano dobro pretraiti mjesto dogaaja (pri takvom pretraivanju esto se upotrebljava jaka rasvjeta, povealo i druge naprave) jer i najprofesionalniji kriminalci pri poinjenju kaznenoga djela ne mogu predvidjeti hoe li im na mjestu dogaaja otpasti dlaka s glave, brade i sl. Kad su u pitanju kaznena djela protiv spolne slobode i spolnog udorea, onda je tu kao najznaajniji dokazni materijal trag sperme. U praksi se vrlo esto dogaa da se upravo s pomou traga sperme otkrije poinitelj kaznenoga djela, pa je stoga veoma bitno, pogotovu pri sumnji na poinjenje Kaznenoga djela protiv spolne slobode i spolnog udorea, pokuati pronai takve tragove i pravilno ih izuzeti. Tragovi sperme mogu se pronai na tijelu osumnjienika, rtve, njihovoj odjei te na mjestu dogaaja. Nadalje, kao jedan od tragova biolokog podrijetla na mjestu poinjenja kaznenih djela pojavljuje se i pljuvaka. Najee se takvi tragovi nalaze na ostavljenim ili baenim opucima cigareta, na omotnicama i dr. Tragovi pljuvake takoer vrlo esto mogu biti jedini pouzdani dokaz u otkrivanju poinitelja kaznenoga djela i u sudskim postupcima kod sudskih tijela imaju veliko znaenje.
Znaenje biolokih tragova kao dokazno sredstvo u kaznenom postupku prije svega se ogleda u njihovoj objektivnosti, za razliku od osobnih ili personalnih dokaza. Naime, poznato je da osobni dokazi, dakle iskazi okrivljenika i svjedoka, u sebi uvijek sadravaju velik dio subjektivnosti, zbog ega su njihovi iskazi veinom izmijenjeni. Upravo zbog toga vano je kriminalistiku obradbu mjesta dogaaja obaviti veoma struno jer bioloki tragovi vrlo esto ostanu iza poinitelja, a da oni sami toga nisu svjesni. To sve upuuje na vanost glede detaljnog i paljivog pretraivanja mjesta dogaaja, a posebno da se svaki pronaeni trag opie u zapisniku o oevidu, fotografira, pravilno izuzme i u to kraem roku dostavi na vjetaenje. No, ne treba se zavaravati i misliti kako e svaki put tragovi na mjestu poinjenja kaznenih djela biti oiti. Ima situacija kad e trebati biti posebno oprezan, a prije svega dovoljno educiran, radi pronalaska mikrotragova koji se teko uoavaju golim okom, tako da su za njihov pronalazak potrebna odreena tehnika pomagala, visoko profesionalno znanje i iskustvo. Poznato je da tragovi biolokog podrijetla, u razliitim okolnostima i uvjetima, brzo mijenjaju svoj oblik ili gube svoja svojstva, zbog ega je potrebno da se takvi tragovi na vrijeme i struno fiksiraju i konzer viraju te da se to prije dostave na vjetaenje radi analize temeljnoga genetikog materijala. Ako se to kvalitetno ne napravi, tada se tee otkrivaju poinitelji kaznenoga djela i katkad se ostaje bez pouzdanog, ako ne i kljunog dokaza. Osim toga, veoma je vano da se oevid napravi na pravilan i najbolji mogui nain, vodei rauna da sve to bude u skladu sa ZKP-om kako se ne bi dogodilo da se doe do dokaza koji je pribavljen na nezakonit nain, a na kojemu
17
Gregori-Kolar, T: Praktikum kriminalistike tehnike, MUP Republike Hrvatske, Zagreb, 1999., str. 169.
117
se ne moe utemeljiti sudska odluka. Samo se napominje da su nezakoniti oni dokazi koji su pribavljeni krenjem Ustavom, zakonom ili meunarodnim pravom, zajamenih prava obrane, prava na dostojanstvo, ugled i ast te prava na nepovrjedivost osobnog i obiteljskog ivota, kao i oni dokazi koji su pribavljeni povrjedom odredaba kaznenog postupka i koji su izriito predvieni ZKP-om te drugi dokazi za koje se iz njih doznalo18.
5.4.
Analiza DNA u hrvatskom kaznenopravnom sustavu
Do godine 1998. u hr vatskom Zakonu o krivinom postupku (Narodne novine, br. 34/1993.), l. 249. st. 2., postojala je jedino mogunost uzimanja kr vi radi analize i utvrivanja drugih vanih injenica za kazneni postupak, a nije bila propisana mogunost uzimanja povjerljivih uzoraka radi analize temeljnoga genetikog materijala ive osobe. No, unato tomu, u postupcima pred sudovima ve se od 1994., od kada je uvedena mogunost analize genetikoga materijala u Hr vatskoj, obavljaju takva vjetaenja te tako izraeni nalazi i miljenja slue kao dokazi u sudskim postupcima. Uporite za to hr vatski suci imali su u odredbi l. 249. st. 2. Zakona o krivinom postupku, koja je u to vrijeme jo uvijek bila daleko od osnovnih postulata Preporuke br. R (92) 1. Komiteta ministara drava lanica Vijea Europe o primjeni analize deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u kaznenopravnom sustavu, koja je prihvaena
18 19
10. veljae 1992. na 470. sastanku zamjenika ministara drava lanica Vijea Europe (u daljnjem tekstu: Preporuka)19. Znajui da se takve analize rade u kvalitetno opremljenim laboratorijima, da ih rade strune osobe koje su svoja znanja glede toga stjecale u SAD-u i raznim europskim dravama te da je rad u laboratorijima pod stalnim nadzorom mjerodavnih medicinskih i znanstvenih ustanova, sudovi su sasvim opravdano prihvaali takve nalaze i miljenja kao dokaz u kaznenim postupcima. Tek novim ZKP-om (NN, 110/97.), l. 265. st. 5. i 6., koji je stupio na snagu dana 1. sijenja 1998., zakonodavac je predvidio mogunost analize temeljnoga genetikoga materijala ive osobe. Tako, stupanjem na snagu tog ZKP-a, zakonodavac je u l. 265. st. 5. propisao kako istrani sudac moe odrediti da se uzimanje povjerljivih medicinskih uzoraka radi analize temeljnoga genetikoga materijala ive osobe bez njezine privole, poduzme prema osobi za koju postoje osnove sumnje da je poinila kazneno djelo za koje se moe izrei kazna zatvora kao glavna kazna te vjerojatnost da e se takvom analizom pribaviti podatci bitni za uspjeno voenje kaznenog postupka. Analiza se moe provesti na nain koji je pod stalnim nadzorom Ministarstva zdravstva, a tako pribavljeni podatci mogu se pohraniti i uvati deset godina nakon zavretka kaznenog postupka ako je okrivljenik u tom postupku pravomono osuen zbog tekoga kaznenoga djela protiv ivota i tijela, spolne slobode i spolnog udorea ili sigurnosti osoba. Isto tako, prema odredbi l. 265. st. 6. ZKP-a navedeno je kako Ministar
Vidi l. 9. ZKP-a. Vidi: Council of Europe, Committee of Ministers, Recommendation No. R (92) 1 of the Committee of Ministers to member states on the use of analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) within the framework of the criminal justice system, (Adopted by the Committee of Ministers on 10 February 1992 at the 470 th meeting of the Ministers Deputies.
118
zdravstva donosi pravilnik o nainu uzimanja uzoraka iz l. 265. st. 2. i 5. ZKP-a te o nadzoru nad uzimanjem, pohranom, obradbom i uvanjem podataka iz l. 265. st. 5. ZKP-a. Kasnijim izmjenama i dopunama Zakona o kaznenom postupku (NN, 58/02.), koje su donesene 17. svibnja 2002., dolo je do odreenih izmjena u l. 265. st. 5. ZKP-a20, tako da sada odredba l. 265. st. 5. glasi: Istrani sudac moe odrediti da se uzimanjem povjerljivih medicinskih uzoraka radi analize temeljnoga genetikog materijala ive osobe bez njezine privole poduzme prema osobi za koju postoje osnove sumnje da je poinila kazneno djelo za koje se moe izrei kazna zatvora kao glavna kazna te vjerojatnost da e se takvom analizom pribaviti podatci bitni za uspjeno voenje kaznenog postupka. Analiza se moe izvriti na nain koji propisuje i nadzire Ministarstvo zdravstva. Tako pribavljeni podatci mogu se pohraniti i uvati deset godina nakon zavretka kaznenog postupka ako je okrivljenik u tom postupku pravomono osuen zbog tekoga kaznenoga djela protiv ivota i tijela (Glava X. Kaznenoga zakona), spolne slobode i spolnog udorea (Glava XIV. Kaznenoga zakona), braka, obitelji i mladei (Glava XVI. Kaznenoga zakona) i zdravlja ljudi (Glava XVIII. Kaznenoga zakona).21 Dakle, iz toga je razvidno da je sada proiren broj onih kaznenih djela u odnosu
na koja se pribavljeni podatci analizom DNA mogu pohraniti i uvati deset godina nakon zavretka kaznenoga postupka. Radi lake preglednosti i razumijevanja smatram potrebnim navesti sva kaznena djela koja su sadrana u gore navedenim glavama Kaznenoga zakona (Narodne novine, br. 110/97., 27/98., 50/00. Odluka USRH, 129/00., 51/01., 111/03., 190/03. Odluka USRH, 105/04., 84/05. ispr. i 71/06.) u daljnjem tekstu KZ, a u odnosu na koja se pribavljeni podatci mogu pohraniti i uvati deset godina nakon zavretka kaznenog postupka, naravno, ako je okrivljenik pravomono osuen zbog jednog od tih kaznenih djela. 1. Kaznena djela protiv ivota i tijela (glava X. KZ-a): ubojstvo (l. 90.), teko ubojstvo (l. 91.), ubojstvo na mah (l. 92.), edomorstvo (l. 93.), usmrenje na zahtjev (l. 94.), prouzroenje smrti iz nehaja (l. 95.), sudjelovanje u samoubojstvu (l. 96.), protupravni prekid trudnoe (l. 97.), zabrana kloniranja ljudskog bia (l. 97.a), tjelesna ozljeda (l. 98.), teka tjelesna ozljeda (l. 99.), tjelesna ozljeda na mah (l. 100.),
20
l. 120. Zakona o izmjenama i dopunama Zakona o kaznenom postupku (NN, 58/02.) glasi: U lanku 265. stavku 1. u drugoj reenici ispred rijei: tijelu rije: njihovu zamjenjuje se rijeju: njegovu. U stavku 3. rijei: 1. i 2. ovoga lanka zamjenjuju se rijeima: 1., 2. i 5. ovoga lanka. U stavku 5. u pr voj reenici rije: temeljno zamjenjuje se rijeju: temeljnog. U drugoj reenici rijei: koji je pod stalnim nadzorom Ministarstva zdravstva zamjenjuju se rijeima: koji propisuje i nadzire Ministarstvo zdravstva. U posljednjoj reenici iza rijei: protiv ivota i tijela dodaju se rijei u zagradi: (Glava X. Kaznenoga zakona), iza rijei: spolne slobode i spolnog udorea dodaju se rijei u zagradi: (Glava XIV. Kaznenoga zakona) stavlja se zarez, briu se rijei: ili sigurnosti osoba, a dodaju rijei: braka, obitelji i mladei (Glava XVI. Kaznenoga zakona) i zdravlja ljudi (Glava XVIII. Kaznenoga zakona). Izmjene u tom lanku oznaene su masnim slovima.
21
119
tjelesna ozljeda iz nehaja (l. l. 101.), sudjelovanje u tunjavi (l. 103.), nepruanje pomoi (l. 104.), naputanje nemone osobe (l. 105.). 2. Kaznena djela protiv spolne slobode i spolnog udorea (glava XIV. KZ-a): silovanje (l. 188.), spolni odnoaj s nemonom osobom (l. 189.), prisila na spolni odnoaj (l. 190.), spolni odnoaj zlouporabom poloaja (l. 191.), spolni odnoaj s djetetom (l. 192.), bludne radnje (l. 193.), zadovoljenje pohote pred djetetom ili maloljetnom osobom (l. 194.), podvoenje (l. 195.), iskoritavanje djece ili maloljetnih osoba za pornografiju (l. 197.), djeja pornografija na raunalnom sustavu ili mrei (l. 197.a), rodoskvrnue (l. 198.). 3. Kaznena djela protiv braka, obitelji i mladei (glava XVI. KZ-a): dvobranost (l. 206.), omoguivanje sklapanja nedoputenog braka (l. 207.), krenje obiteljskih obveza (l. 208.), povrjeda dunosti uzdravanja (l. 209.), oduzimanje djeteta ili maloljetne osobe (l. 210.), promjena obiteljskoga stanja (l. 211.), naputanje djeteta (l. 212.), zaputanje i zlostavljanje djeteta ili maloljetne osobe (l. 213.), izvanbrani ivot s maloljetnom osobom (l. 214.), sprjeavanje i neizvrenje mjera za zatitu djeteta i maloljetne osobe (l. 215.),
nasilniko ponaanje u obitelji (l. 215. a). 4. Kaznena djela protiv zdravlja ljudi (glava XVIII. KZ-a): prenoenje zarazne bolesti (l. 238.), prenoenje spolne bolesti (l. 239.), nesavjesno lijeenje (l. 240.), samovoljno lijeenje (l. 241.), nedozvoljeno presaivanje dijelova ljudskog tijela (l. 242.), nepruanje medicinske pomoi (l. 243.), nadrilijenitvo (l. 244.), pripravljanje i proizvodnja tetnih sredstava za lijeenje (l. 245.), nesavjesno postupanje pri pripravljanju i izdavanju lijekova (l. 246.), proizvodnja i stavljanje u promet kodljivih ivenih namirnica (l. 247.), nesavjesni pregled mesa za prehranu (l. 248.), teka kaznena djela protiv zdravlja ljudi (l. 249). No, kad je u pitanju uzimanje uzoraka biolokoga materijala za potrebe analize DNA te njihovo pohranjivanje treba razlikovati dvije razliite situacije, i to: je li analiza DNA obavljena u Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, koji se vodi pri Ministarstvu unutarnjih poslova Republike Hr vatske u daljnjem tekstu: MUP RH; te je li analiza DNA obavljena u jednom od medicinskih laboratorija, a na nain kako to propisuje i nadzire Ministarstvo zdravstva Republike Hr vatske u daljnjem tekstu: MZ RH. U pr vom sluaju, dakle ako je analiza DNA obavljena u Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, tada odredbu l. 265. st. 5. ZKP-a treba gledati u vezi
120
s odredbama Pravilnika o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline (Narodne novine, br. 107/99.) te Zakona o policiji (Narodne novine, br. 129/00.) u daljnjem tekstu: ZOP. Naime, u smislu odredbe l. 5. st. 1. Pravilnika o nainu uzimanju uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline, uzorak biolokog materijala osoba za koje postoje osnove sumnje da su poinile kazneno djelo analizira se i pohranjuje u Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti. Isto tako, prema odredbi l. 6. st. 1. navedenog Pravilnika, podatci dobiveni analizom DNA uzoraka biolokog materijala pohranjuju se u evidenciji DNA osumnjienih i osuenih osoba, dok se, prema odredbama l. 72. to. 7. i l. 77. to. 7. ZOP-a, takvi podatci uvaju trajno. U drugom sluaju, dakle ako je analiza DNA obavljena u jednom od medicinskih laboratorija, a na nain kako to propisuje i nadzire Ministarstvo zdravstva, tada se podatci dobiveni analizom DNA uzoraka biolokog materijala ne pohranjuju i uvaju trajno, nego najvie deset godina, a kako je to uostalom i propisano u odredbi l. 265. st. 5. ZKP-a. Naravno, takvi se podatci mogu pohraniti i uvati
22
samo ako je okrivljenik pravomono osuen zbog tekoga kaznenog djela protiv ivota i tijela (glava X. KZ-a), spolne slobode i spolnog udorea (glava XIV. KZ-a), braka, obitelji i mladei (glava XVI. KZ-a) i zdravlja ljudi (glava XVIII. KZ-a). Podatci dobiveni na takav nain, sukladno odredbi l. 6. Pravilnika o nainu uzimanju uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline, pohranjuju se u medicinskom laboratoriju koji je i obavio analizu, a u odnosu na tako dobivene podatke primjenjuje se rok iz l. 265. st. 5. ZKP-a (dakle, rok od najvie 10 godina), nakon ega se ti podatci, na temelju odredbe l. 6. gore navedenog Pravilnika, unitavaju. Prema tome, kada se uzmu o obzir ova dva sluaja, zakljuak je sljedei: Ako je analiza DNA-uzoraka biolokog materijala obavljena u Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, koji se vodi pri MUP RH, tada se podatci dobiveni tom analizom pohranjuju u evidenciji DNA osumnjienih i osuenih osoba u navedenom centru te se uvaju trajno, a, ako je analiza DNA uzoraka biolokog materijala obavljena u jednom od medicinskih laboratorija, tada se ti podatci pohranjuju upravo u tim laboratorijima koji su obavili analizu i mogu se uvati najvie deset godina.22
Presuda se ne temelji na nezakonitom dokazu iz l. 367. st. 2. u vezi s l. 9. st. 2. ZKP-a time to je sud utemeljio presudu na nalazu i miljenju Centra za kriminalistika vjetaenja o provedenoj DNA analizi, jer je uzimanje uzoraka biolokog materijala za analizu DNA obavljeno u Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, sukladno l. 5. st. 1. Pravilnika o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za analizu DNA (Narodne novine, br. 107/99.) koji se pohranjuju u evidenciju DNA osumnjienih i osuenih osoba i prema odredbi l. 77. Zakona o policiji (Narodne novine, br. 129/00.) uvaju se trajno, pa se stoga iz ranije obavljene analize tog materijala mogu uzeti pohranjeni podatci u evidenciji DNA za potrebe novog vjetaenja. Osuenik nije u pravu kada predmetnu pravomonu presudu pobija zbog bitne povrede odredaba kaznenog postupka iz l. 367. st. 2. ZKP, jer, suprotno njegovim navodima, nalaz i miljenje Centra za kriminalistika vjetaenja o provedenoj DNA analizi nije nezakonit dokaz. Naime, osuenik se neosnovano poziva na odredbu l. 265. st. 5. ZKP, jer primjenu te odredbe treba tumaiti u vezi s odredbama Pravilnika o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za analizu DNA (Narodne novine br. 107/99 u daljnjem tekstu: Pravilnik). U skladu s l. 5. st. 1. Pravilnika, analiza uzoraka biolokog materijala, koji su uzeti od osobe za koju postoje osnove sumnje da je poinila kazneno djelo, obavlja se u Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti u Zagrebu i prema odredbi l. 6. st. 1. Pravilnika podatci dobiveni analizom pohranjuju se u evidenciji DNA osumnjienih i osuenih osoba i prema l. 77. Zakona o policiji (Narodne novine br. 129/00) uvaju se trajno.
121
Kao to je ve reeno, Preporuka Vijea Europe, koja se odnosi na primjenu analize DNA u kaznenopravnom sustavu, sadrava temeljne smjernice i postavke glede ureenja ove materije. Tako su u njoj sadrane definicije DNA-analize, DNA-uzoraka i DNA-dosjea, zatim su navedene odredbe koje se odnose na nain prikupljanja podataka i primjenu analize DNA (djelokrug rada i ogranienja), uvjete koje moraju ispunjavati laboratoriji u kojima e se obavljati analiza DNA, baze podataka, pohranjivanje i uvanje podataka, zatitu podataka, standardizaciju metode analize DNA te dostupnost i razmjenu rezultata DNA-analize meu dravama i dr. Osim toga, u Preporuci je poseban naglasak dan i na to kako postupak uzimanja i prikupljanja uzorka DNA te njihove analize mora biti u skladu sa standardima zatite podataka koje je odredilo Vijee Europe u svojoj Konvenciji o zatiti podataka i u svojim preporukama o zatiti podataka, pri emu posebnu pozornost treba obratiti na preporuku R (87) 15,
kojom se ureuje uporaba osobnih podataka pri obavljanju policijskih poslova.23 Upravo na tim smjernicama i hr vatsko je zakonodavstvo uredilo ovu problematiku koja se odnosi na analizu DNA u kaznenopravnom sustavu, i zatitu podataka, pa je tako u ZKP-u propisan nain uzimanja povjerljivih medicinskih uzoraka radi analize temeljnoga genetikog materijala ive osobe24, donesen je Zakon o zatiti osobnih podataka (Narodne novine, br. 103/03 i 118/06) u daljnjem tekstu: ZZOP, donesen je Zakon o potvrivanju Konvencije za zatitu osoba glede automatizirane obradbe osobnih podataka i dodatnog protokola uz Konvenciju za zatitu osoba glede automatizirane obradbe osobnih podataka u vezi s nadzornim tijelima i meunarodnom razmjenom podataka (Narodne novine, br. 4/05.), propisane su i policijske ovlasti glede prikupljanja, obradbe, evidencije i uporabe osobnih podataka (l. 16., l. 71.78. ZOP-a),25 te je propisan i nain policijskog postupanja glede utvrivanja identiteta osoba (l. 7. Pravilnika o nainu
Slijedom navedenog, odredba l. 265. st. 5. ZKP na koju se poziva osuenik kao podnositelj zahtjeva, ne primjenjuje se na konkretni sluaj, jer se ima u vidu analiza koja se moe izvriti na nain koji propisuje i nadzire Ministarstvo zdravstva Republike Hrvatske, te se dobiveni podatci u skladu s odredbom l. 6. st. 2. Pravilnika pohranjuju u laboratoriju ustanove koja je analizu obavila i u odnosu na te podatke primjenjuje se rok propisan citiranom odredbom Zakona, nakon kojega se podatci unitavaju u smislu odredbe l. 6. st. 2. Pravilnika. Na temelju svega izloenoga nedvojbeno je kako je vjetakinja Centra za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti u konkretnom kaznenom predmetu ispravno postupila kad je kao nesporni uzorak biolokog materijala i ranije izvrenu analizu tog materijala uzela pohranjene podatke u evidenciji DNA osumnjienih i osuenih osoba navedene ustanove. Naime, takvo postupanje je regulirano naprijed citiranim odredbama Pravilnika, pa u ovom predmetu nije bilo potrebno utvrivati pravilnost uzimanja nespornog uzorka u ranijem predmetu koji se protiv istog osuenika vodio kod Opinskog suda u P. Odluka Vrhovnog suda Republike Hr vatske br. III Kr 4/2006-3 od 11. 10. 2005.
23 24 25
Vidi kod Pavii B. Komentar Zakona o kaznenom postupku, agar, Rijeka, 2003., str. 370. l. 265. st. 5. i 6. ZKP-a. Prema odredbi l. 16. ZOP-a, uz ostalo je propisano, kako u policijske ovlasti spadaju i prikupljanje, obradba i uporaba osobnih podataka. Nadalje, u odredbi l. 71. ZOP-a navedeno je kako policija prikuplja, obrauje i upotrebljava osobne podatke te vodi evidencije o osobnim i drugim podatcima na ije je prikupljanje ovlatena prema ZOP-u radi sprjeavanja i otkrivanja kaznenih djela, prijestupa i prekraja te pronalaska poinitelja kaznenih djela, prijestupa i prekraja. Isto tako, prema odredbi l. 72. to. 7. ZOP-a navedeno je kako policija, uz ostalo, vodi i evidenciju osoba nad kojima je provedeno utvrivanje identiteta, daktiloskopiranih osoba, fotografiranih osoba i DNA pretraga.
122
policijskog postupanja [PNPP], Narodne novine br. 81/03).26 Ne treba takoer zaboraviti da je i u l. 37. Ustava odreeno kako se svakomu jame sigurnost i tajnost osobnih podataka te da se bez privole ispitanika osobni podatci mogu prikupljati, obraivati i upotrebljavati samo uz uvjete odreene zakonom. Isto tako, u toj je odredbi navedeno kako se Zakonom ureuje zatita podataka te nadzor nad djelovanjem informatikih sustava u dravi, dok je zabranjena uporaba osobnih podataka suprotna utvrenoj svrsi njihovoga prikupljanja. Kada se, s druge strane, uzme u obzir da je, sukladno odredbi l. 265. st. 6. ZKP-a, Ministar zdravstva Republike Hrvatske donio Pravilnik o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline (Narodne novine, br. 107/99.), kojim je odreen nain uzimanja uzoraka biolokog materijala za potrebe analize DNA, nain pohrane, obradbe i uvanja pribavljenih podataka te obavljanje nadzora, onda se slobodno moe rei kako je Republika Hr vatska veim dijelom prilagodila svoje zakonodavstvo sukladno Preporuci Vijea Europe, koja se odnosi na primjenu analize DNA u kaznenopravnom sustavu.
njenice u kaznenom postupku, smatrao sam potrebnim u ovom radu prikazati i nekoliko primjera iz sudske prakse koji e jo vie pribliiti ovu materiju itateljima i upozoriti na vanost ove metode u kaznenopravnom sustavu svake drave. Odabrao sam tri primjera te e o svakome od njih u iduem dijelu biti neto reeno.
Primjer 1.
Pr vi sluaj se odnosi na kazneno djelo silovanja iz l. 188. st. 1. KZ-a, koje je sadrano u glavi XIV. KZ-a, a koja nosi naziv Kaznena djela protiv spolne slobode i spolnog udorea. Kazneno se djelo dogodilo tako da je nepoznati poinitelj priao oteenoj dok se ova kretala ulicom, te ju je najprije poeo udarati, a zatim ju je bacio na pod i rekao skini hlae. Unato njezinu dozivanju u pomo i pruanju otpora, nepoznati ju je poinitelj i dalje nastavio tui, skinuo joj je hlae, ugurao svoj penis u njezinu vaginu, obavio snoaj, ne ejakulirajui u nju, jer su u tom trenutku naili prolaznici, te se tada dao u bijeg. Oteena je pri poinjenju tog djela zadobila brojne tjelesne ozljede (glave i vrata). Nakon poinjenja kaznenoga djela, djelatnici policije poeli su poduzimati potrebne izviaje te hitne istrane radnje. Dolaskom na mjesto dogaaja najprije su fiksirali i izuzeli sve pronaene tragove kaznenoga djela, a meu njima i cjelokupnu odjeu oteene. S obzirom na to da su na remenu oteene pronali tragove nalik na krv, remen su poslali na vjetaenje kako bi se utvrdilo radi li
5.5.
Primjeri iz sudske prakse
Imajui na umu da je primjena analize DNA u kaznenopravnom sustavu jedan od naina s pomou kojega se na izuzetno kvalitetan i pouzdan nain utvruju odlune i-
Nadalje, u odredbi l. 71. ZOP-a navedeno je kako policija prikuplja, obrauje i upotrebljava osobne podatke te vodi evidencije o osobnim i drugim podatcima na ije je prikupljanje ovlatena prema ZOP-u radi sprjeavanja i otkrivanja kaznenih djela, prijestupa i prekraja te pronalaska poinitelja kaznenih djela, prijestupa i prekraja. Isto tako, prema odredbi l. 72. to. 7. ZOP-a navedeno je kako policija, uz ostalo, vodi i evidenciju osoba nad kojima je provedeno utvrivanje identiteta, daktiloskopiranih osoba, fotografiranih osoba i DNA pretraga.
26
U l. 7. PNPP-a propisano je kako se utvrivanje identiteta osobe provodi primjenom metoda i sredstava kriminalistike tehnike i taktike te primjenom medicinskih i drugih odgovarajuih postupaka, a jedan od naina predvien je i s pomou utvrivanja strukture DNA.
123
se uope o kr vi, te, ako se radi, je li u pitanju krv ljudskoga podrijetla. Poslali su takoer na vjetaenje i nesporan uzorak kr vi oteene. Isto tako, obavili su i istranu radnju prepoznavanja osobe, te je upravo tijekom te radnje oteena prepoznala kao poinitelja osobu XY. Slijedom toga, uslijedilo je uhienje XY, njegovo ispitivanje, a zatim i podnoenje istranog zahtjeva protiv njega. XY je negirao poinjenje kaznenoga djela, a nakon njegova ispitivanja istrani je sudac donio rjeenje o provoenju istrage te sukladno prijedlogu upanijskoga dravnog odvjetnika protiv njega odredio pritvor. Usporedo s tim poslan je na vjetaenje i nesporan uzorak kr vi XY. Tijekom istranoga postupka istranom sucu dostavljeni su rezultati vjetaenja te je utvreno da su na remenu pronaeni tragovi kr vi ljudskoga podrijetla. Osim toga, u nalazu i miljenju navedeno je kako je, nakon analize DNA-prijepornih tragova na remenu oteene, utvreno da ti tragovi kr vi potjeu od DNA-profila dviju osoba (dakle, rije je o mijeanom profilu), uz napomenu da se dio alela podudara s DNA-profilom oteene, dok se preostali aleli podudaraju s alelima DNA profila XX (dakle, ne s DNA-profilom XY protiv kojega je pokrenuta istraga i odreen pritvor). Naime, kako je ve prije XX bio optuen zbog kaznenoga djela silovanja iz l. 188. KZ-a, tada su izuzeti njegovi bioloki tragovi i izvrena je DNA-analiza. Dakle, ve u tom trenutku dostavljen je nesporni uzorak DNA XX i pohranjen u arhivi Centra za kriminalistiko vjetaenje Ivan Vueti (tj. u tzv. DNA-bazu podataka). Odmah nakon toga uhiena je osoba XX te su djelatnici policije obavili hitnu istranu radnju prepoznavanja XX od oteene. Tada je oteena prepoznala XX kao poinitelja kaznenoga djela, a tek nakon to je XX pri prepoznavanju izgovorio rijei skini hlae, koje je ujedno izgovorio i pri poinjenju dje-
la, bila je sigurna da je XX upravo ta osoba. S obzirom na te, nove okolnosti, protiv XY obustavljena je istraga i ukinut pritvor, dok je upanijsko dravno odvjetnitvo podnijelo istrani zahtjev protiv XX i zatrailo odreivanje pritvora. Istrani je sudac, nakon prethodnog ispitivanja XX, protiv njega donio rjeenje o provoenju istrage i odredio pritvor. XX je tijekom itavog postupka negirao poinjenje kaznenoga djela, uz napomenu da nije znao objasniti kako su njegovi DNA-tragovi pronaeni na remenu oteene, odnosno na mjestu dogaaja. Na glavnu raspravu pozvan je i sudski vjetak koji je obavio vjetaenje te je naveo kako se nesporni uzorci DNA-profila XX ve otprije nalaze u bazi podataka te da je raunalo prepoznalo taj DNA-profil s onim DNA-profilom koji je pronaen na remenu i koji pripada XX-u. Takoer je naveo kako se DNA-profil XY sa sigurnou iskljuuje iz onog DNA-profila koji je pronaen na remenu. Prema tome, zakljuak je sudskog vjetaka kako sigurnost ovog utvrenja, na temelju raunalnog izrauna, upuuje na 4 000 000 000 (etiri milijarde) veu vjerojatnost da pronaeni trag kr vi potjee od XX i oteene, a ne od oteene i neke tree osobe. Slijedom toga, sudsko je vijee utvrdilo da je upravo XX poinio predmetno kazneno djelo, zbog ega je proglaen krivim i osuen na viegodinju kaznu zatvora. Ovaj nam je sluaj zanimljiv zato to su upravo rezultati DNA-analize doveli do pravog poinitelja kaznenoga djela, dok je protiv osobe koja je u poetku bila osumnjiena za to djelo te je ak dulje vrijeme bila u pritvoru, obustavljena istraga.
Primjer 2.
Tijekom poinjenja kaznenoga djela teke krae iz l. 217. st. 1. toka 1. Kaznenoga zakona nepoznati je poinitelj u mjesecu svi-
124
bnju 1999. provalio u jedan upni ured, odakle je odnio i za sebe zadrao pronaeni domai i strani novac u vrijednosti od 20 000,00 kuna. Pri oevidu djelatnici policije su, uz ostale tragove, pronali i tragove nalik na krv na etiri omotnice koje su se nalazile u ladici gdje je bio otueni novac, i jedan trag nalik na krv koji se nalazio na parketu ispod ladice. Poinitelj je bio nepoznat, oevidaca nije bilo, a kao osumnjienik pojavio se jedan ovisnik o opojnim drogama koji je u to vrijeme vie puta posjeivao upni ured i od upnika traio novac za lijeenje i putovanje. Osumnjienik (poslije okrivljenik) tijekom cijelog je postupka negirao poinjenje kaznenoga djela. upnik je za okrivljenika govorio kako je uvijek bio ljubazan i kulturan, te da mu je uvijek, kad je to mogao, davao manji iznos novca. Zbog osnovane sumnje da je poinio predmetno kazneno djelo, od osumnjienika je sukladno odredbama Zakona o kaznenom postupku (l. 184. st. 2., l. 265. st. 2. i 5.), uzeta krv te su redarstvene vlasti Centru za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti naredile sljedee vjetaenje: Nalae se vjetaenjem utvrditi potjeu li prijeporni tragovi nalik na krv s omotnica i vate od kr vi ljudskog podrijetla, te, ako potjeu, genotip prijepornih tragova potrebno
Tablica 5-1. Prikaz usporedbe utvrenih DNA profila CTT-aleli PRILOZI Omot br. 1 Omot br. 2 Omot br. 3 Omot br. 4 Omot br. 5 Omot br. 6 P. M. CSF1PO 11, 12 11, 12 11, 12 11, 12 11, 12 11, 12 TPOX 8, 10 8, 10 8, 10 8, 10 8, 10 8, 10
je usporediti s genotipom nespornog uzorka kr vi osumnjienika (tabl. 5-1). Metodologija DNA-vjetaenja s rezultatima DNA-analize Centra za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti u Zagrebu bila je: Tragovi nalik na krv sa Sangur-testom i antihumanim serumom daju pozitivnu (+) reakciju. Za analizu DNA rabljen je dio prijepornih tragova kr vi te nesporni uzorak osumnjienika. DNA je izolirana uporabom Chelexa, a potom je izvrena amplifikacija CTT i FFv-alela primjenom Gene Print STR Systems amerike tvrtke Promega. Identifikacija amplificiranih alela izvrena je elektroforezom na denaturiranom poliakrilamidnom gelu. Za vizualizaciju alela rabljena je otopina srebrnoga nitrata (AgNO3). Konano miljenje Centra za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti u Zagrebu bilo je: Prijeporni tragovi potjeu od kr vi ljudskoga podrijetla. Iz tablice rezultata analize DNA vidljivo je da se CTT i FFv-aleli prijepornih tragova meusobno podudaraju, te se podudaraju s alelima nespornog uzorka krvi osumnjienika. Uestalost genotipa osumnjienika izraunana na temelju ispitivanja u hr vatskoj populaciji iznosi 1 od 2 170 138 osoba.
FFv-aleli TH01 7, 9 7, 9 7, 9 7, 9 7, 9 7, 9 F13A01 3.2, 6 3.2, 6 3.2, 6 3.2, 6 3.2, 6 3.2, 6 FESFPS 10, 11 10, 11 10, 11 10, 11 10, 11 10, 11 vWA 15, 17 15, 17 15, 17 15, 17 15, 17 15, 17
125
Zahvaljujui kvalitetnoj kriminalistikoj obradbi koju su provele redarstvene vlasti u otkrivanju poinitelja kaznenog djela, bez obzira na to to je okrivljenik cijelo vrijeme pred sudom negirao poinjenje kaznenoga djela, dolo se do pouzdanog dokaza analizom DNA okrivljenika, na temelju kojega je sud okrivljenika proglasio krivim i osudio ga na kaznu zatvora.
Primjer 3.
Trei je sluaj primjer povrne i nestruno obavljene kriminalistike obradbe redarstvenih vlasti, pri kojoj uope nije obavljen oevid, vjetaenje noa za koji se sumnja da je upotrijebljen pri poinjenju kaznenoga djela te uvanje noa gdje mogui mikrotragovi kr vi ne bi bili podloni razgradnji i gubitku svojih svojstava. Radi se o sljedeem sluaju: Okrivljenik je optuen da je tijekom 1995., za vrijeme prepirke s oteenikom, u nakani da oteenika teko tjelesno ozlijedi, najprije ga kamenom udario u glavu, od kojeg je udarca oteenik pokleknuo, nakon ega ga je okrivljenik noem ubo u predjelu lijeve natkoljenice, nanijevi mu pri tome ubodnu ranu s oteenjem konog ogranka femoralnog ivca, to je ozljeda teke naravi. Okrivljeniku je stavljeno na teret da je poinio kazneno djelo teke tjelesne ozljede iz l. 99. st. 1. (prije l. 40. st. 1. Krivinoga zakona Republike Hrvatske) Kaznenoga zakona. U predmetnom postupku nije provedena istraga, nego je podignuta neposredna optunica. Okrivljenik, oteenik i svjedok, koji predmetni dogaaj nije vidio u cijelosti, ispitani su tek na glavnoj raspravi. Oevid nije obavljen, a no koji je oduzet od okrivljenika nije dostavljen na vjetaenje. Od trenutka oduzimanja noa pa do odravanja glavne rasprave proteklo je oko pet godina, a za to vrijeme no se nalazio u jednoj omotnici u spisu prekrajnog suda jer je protiv okrivljenika i oteenika istodobno bio pokrenut prekrajni postupak. Osim to-
ga, nije bilo osigurano ni adekvatno uvanje noa. Tijekom glavne rasprave okrivljenik je negirao poinjenje kaznenoga djela, dok je oteenik potvrdio ono to je navedeno u injeninom opisu optunog akta. Prema kazivanju okrivljenika, oteenik je ubodnu ranu zadobio tako da je pao na zemljite na kojemu su se nalazile taklje, vilice, avli, ostatci razbijenih boca i dr. Nakon to su ispitani optuenik, oteenik i svjedok te pribavljen predmetni no od prekrajnog suda, sud je naloio sudskomedicinsko vjetaenje radi utvrivanja ima li na nou nalaza mikrotragova kr vi, te ako navedeni tragovi postoje, tada je potrebno izvriti njihovu DNA-tipizaciju. Rezultate DNA-tipizacije potrebno je usporediti s DNA-karakteristikama oteenika. Metodologija rada Klinike bolnice Split Odjela za patologiju i sudsku medicinu Laboratorija za kliniku i sudsku genetiku bila je: Izuzet je obrisak s predmetnog noa radi utvrivanja postojanja mikrotragova kr vi. Nakon uzimanja uzorka provedena je DNA--ekstrakcija metodom Chelex. Nakon kontrole dobivene DNA, uporabom lanane reakcije polimerazom (PCR), umnoeni su ciljni fragmenti DNA. Vizualizacija rezultata napravljena je kapilarnom elektroforezom na ABI prism 310. Nalaz Klinike bolnice Split Odjela za patologiju i sudsku medicinu Laboratorija za kliniku i sudsku genetiku glasio je: Nakon napravljenih analiza genskih lokusa, na uzorcima obriska s predmetnog noa, nisu dobiveni rezultati koji bi upuivali na prisutnost mikrotragova kr vi. Radi odreenih pojanjenja u vezi s nalazom i miljenjem, sud je na glavnu raspravu pozvao sudskog vjetaka koji je izradio pismeni nalaz. Na glavnoj raspravi sudski je vjetak iskazao sljedee: Na uzorcima pred-
126
metnog noa nisu dobiveni rezultati koji bi upuivali na prisutnost mikrotragova kr vi. No koji ue u tkivo na sebi mora imati tragove kr vi, ali postoji mogunost da se takvi tragovi i ne ouvaju i to u sluajevima ako no nije odmah podvrgnut analizi, ako je no prije oduzimanja bio mehaniki oien te ako no prije analize nije uvan u adekvatnim uvjetima gdje mikrotragovi kr vi nisu podloni razgradnji, bakterijama ili drugim kemijskim i biolokim agensima. Unato tomu to na nou nisu pronaeni nikakvi tragovi kr vi, sud je nakon ocjene svakog dokaza pojedinano, i u vezi s ostalim dokazima, ipak zakljuio kako je okrivljenik poinio kazneno djelo te ga je proglasio krivim. Presudu opinskog suda potvrdio je upanijski sud. No, zbog ega je ovaj primjer zanimljiv? Zanimljiv je zbog toga to su se u prethodnom postupku dogodili odreeni propusti u radu redarstvenih vlasti. Naime, redarstvene su vlasti trebale odmah nakon to su doznale za kazneno djelo i poinitelja izai na mjesto dogaaja te o tome obavijestiti istranog suca radi poduzimanja oevida i odreivanja vjetaenje noa radi utvrivanja ima li na nou mikrotragova kr vi. Ako se pak radilo o hitnim istranim radnjama iz l. 185. ZKP-a, onda su redarstvene vlasti mogle same obaviti oevid i odrediti potrebna vjetaenja te o svemu tome izvijestiti dravnog odvjetnika. U predmetnom sluaju redarstvene vlasti nisu uinile ni jedno ni drugo. Isto tako redarstvene vlasti nisu osigurale ni adekvatno uvanje noa, pri emu mogui mikrotragovi kr vi ne bi bili podloni razgradnji i gubitku svojih svojstava. to se tie dravnog odvjetnitva, ono je trebalo odmah nakon primitka kaznene prijave provjeriti gdje je no i je li on poslan na vjetaenje, odnosno po potrebi zatraiti provoenje istrage ili odreenih istranih radnji.
Navedenim se primjerima htjelo upozoriti na vanost predistranog postupka, a posebno u radu redarstvenih vlasti i dravnog odvjetnitva pri poduzimanju potrebnih mjera radi otkrivanja kaznenih djela i pronalaenja poinitelja. Naime, redarstvene su vlasti te koje pr ve dolaze na mjesto dogaaja i koje moraju poduzeti sve da se otkriju i osiguraju svi vani tragovi kaznenoga djela, dok dravno odvjetnitvo aktivnim praenjem predistranog postupka ili pak same istrage, upuuje na potrebu prikupljanja odreenih dokaza o odlunim injenicama. Tu ne treba zaboraviti ni vanost istranog suca koji, nadzirui zakonitost policijskog djelovanja, osigurava pravnu valjanost dokaza pribavljenih prije poetka kaznenog postupka. Upravo rezultati njihova rada mogu olakati ili oteati voenje kaznenoga postupka. Ve smo napomenuli da bioloki tragovi katkad mogu biti jedini pouzdani dokaz u otkrivanju poinitelja kaznenoga djela, a to stoga to se znaenje takvih dokaza ogleda prije svega u njihovoj objektivnosti, za razliku od osobnih dokaza (iskaza svjedoka, okrivljenika). S obzirom na to da se rezultati ispitivanja biolokih tragova temelje na prirodnim znanostima i tehnici, oni ine vaan dio kaznenog postupka. Znanstvenim ispitivanjem biolokih tragova osigurava se trajan napredak u svrhu utvrivanja istine u kaznenom postupku i pribavljanja dokaza koji je prije svega objektivan.
5.6.
Zakljuak
Primjena analize DNA u kaznenopravnom sustavu dovela je do toga da su se u pojedinim sudskim postupcima poele na kvalitetniji i bri nain utvrivati odlune injenice. Rije je o metodi koja se, zasigurno, ubraja meu najsofisticiranija znanstvena dostignua i koja u velikome broju sudskih predmeta do-
127
vodi do ouvanja najvanijih vrjednota svake pravne drave, tj. da nitko neduan ne bude osuen. Temeljne postavke i smjernice koje se odnose na primjenu analize DNA u kaznenopravnom sustavu sadrane su u Preporuci br. R (92) 1. Komiteta ministara drava lanica Vijea Europe o primjeni analize deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u kaznenopravnom sustavu, koja je prihvaena 10. veljae 1992. na 470. sastanku zamjenika ministara drava lanica Vijea Europe. Kad je u pitanju Republika Hr vatska, treba istaknuti kako veliko znaenje u cjelovitom ureenju ove materije, osim navedene Preporuke, ima prije svega Zakon o kaznenom postupku, a zatim i Zakon o zatiti osobnih podataka, Zakon o potvrivanju Konvencije za zatitu osoba glede automatizirane obradbe osobnih podataka i dodatnog protokola uz Konvenciju za zatitu osoba glede automatizirane obradbe osobnih podataka u vezi s nadzornim tijelima i meunarodnom razmjenom podataka, Zakon o policiji, Pravilnik o nainu policijskog postupanja, Pravilnik o uzimanju uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline te Ustav Republike Hr vatske. Iako svi ti pro-
pisi, odnosno Ustav, ine sami sa sebe jednu cjelinu, oito je kako se jedino sagledavanjem svih tih propisa zajedno moe doi do potpuna ureenja ove problematike i odgovora na pojedina pitanja kao npr. o nainu uzimanja povjerljivih medicinskih uzoraka radi analize temeljnoga genetikog materijala ive osobe, o nainu pohrane i uvanja podataka, o zatiti podataka i dr. DNA-analiza zasigurno znai revolucionarni znanstveni napredak u otkrivanju poinitelja kaznenih djela i ona je samo odgovor na sve vei profesionalni pristup poinitelja, pri emu oni sve detaljnije i paljivije razrauju planove poinjenja i prikrivanja tragova kaznenih djela. Upravo zbog toga je znanost trebala pomoi u davanju kljunih odgovora i u tome je uspjela. Naime, u posljednjih desetak godina s pomou ove metode djelatnici policije irom svijeta uspjeli su otkriti na stotine poinitelja razliitih kaznenih djela. Da nije bilo toga, jasno se zakljuuje kako bi mnogi od njih izbjegli pravdi te bi danas bili na slobodi. Dakle, primjena analize DNA poveala je sigurnost graana, a smanjila sigurnost i samouvjerenost poinitelja kaznenih djela.
Literatura
1. Council of Europe, Committee of Ministers, Recommendation No. R (92) 1 of the Committee of Ministers to member states on the use of analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) within the framework of the criminal justice system, (Adopted by the Committee of Ministers on 10 February 1992 at the 470th meeting of the Ministers Deputies. 2. Garai A. Vjetaenja u kaznenom postupku, 1997., www.vsrh.hr. 3. Gregori-Kolar T. Praktikum kriminalistike tehnike, MUP Republike Hrvatske, Zagreb, 1999. 4. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. Hyper variable minisatelite regions in human DNA. Nature 1985; 314:67-73. 5. Jeffreys AJ, Thein SL, Wilson V. Individual specific fingerprints of human DNA. Nature 1985; 316:76-89. 6. Jemri M. Zakon o krivinom postupku, VI. izdanje, Narodne novine, Zagreb, 1997. 7. Kazneni zakon (Narodne novine br. 110/97, 27/98, 50/00 Odluka USRH, 129/00, 51/01, 111/03, 190/03 Odluka USRH, 105/04, 84/05 ispr. i 71/06), 8. Modly D. Neki problemi pri odreivanju vjetaka, rukovoenju njegovim postupkom i ocjenjivanju njegovog iskaza, Hr vatski ljetopis za kazneno pravo i praksu, vol. 7, br. 1/2000, Zagreb. 9. Odluka Vrhovnog suda Republike Hr vatske br. K 356/99.
128
10. Odluka Vrhovnog suda Republike Hrvatske br. K-906/67 i VsV br. K-771/74. 11. Odluka Vrhovnog suda Republike Hr vatske br. III Kr 4/2006-3 od 11. 10. 2005. 12. Odluka upanijskog suda u Bjelovaru br. K396/1997. 13. Pavii B. Komentar Zakona o kaznenom postupku, agar, Rijeka, 2003. godina, 14. Pravilnik o nainu policijskog postupanja (Narodne novine br. 81/03). 15. Pravilnik o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za potrebe analize deoksiribonukleinske kiseline (Narodne novine br. 107/99). 16. Primorac D i suradnici. Primjena analize DNA u sudskoj medicini i pravosuu, Biblioteka Pravo, Zagreb, 2001. 17. Primorac D, Schanfield SM, Primorac D. Application of forensic DNA in the legal system, Croat Med J 2000;41 (1):32-46. 18. Vodineli V, Aleksi . Kriminalistika, Informator, Zagreb, 1990.
19. Zakon o kaznenom postupku (Narodne novine br. 110/97, 27/98, 58/99, 112/99, 58/02, 143/02, 178/04 i 115/06). 20. Zakon o krivinom postupku (Narodne novine br. 34/93). 21. Zakon o policiji (Narodne novine br. 129/04). 22. Zakon o potvrivanju Konvencije za zatitu osoba glede automatizirane obrade osobnih podataka i Dodatnog protokola uz Konvenciju za zatitu osoba glede automatizirane obrade osobnih podataka u vezi nadzornih tijela i meusobne razmjene podataka (Narodne novine br. 4/05). 23. Zakon o zatiti osobnih podataka (Narodne novine br. 103/03 i 118/06). 24. Zeevi D i suradnici. Vjetaenje teine tjelesnih ozljeda u krivinom postupku. Informator, Zagreb, 1985. godina. 25. Ustav Republike Hr vatske (Narodne novine br. 41/01).
129
6.
Medicinska vjetaenja i primjena analize DNA u sudskom postupku radi utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva
Tihana Pivac
Sadraj poglavlja
6.1. 6.2. 6.3. Zakonsko reguliranje postupka utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva . . . . . . . 130 Dokazi u postupcima radi utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva. . . . . . . . . . . . . 136 Znaenje primjene analize DNA u medicinskim vjetaenjima u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
6.1.
Zakonsko reguliranje postupka utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva
Postupci radi utvrivanja i osporavanja majinstva te radi utvrivanja i osporavanja oinstva regulirani su odredbama Obiteljskog zakona, objavljenog u Narodnim novinama (NN) Republike Hr vatske broj 116/03 od 22. srpnja 2003., te izmijenjenog i dopunjenog Zakonom o izmjenama i dopunama Obiteljskog zakona (NN, broj 17/04), Zakonom o izmjenama i dopunama Obiteljskog zakona (NN, broj 136/04), kao i Zakonom
o izmjenama i dopunama Obiteljskog zakona (NN, broj 107/07)koji se primjenjuje od dana stupanja na snagu 22. srpnja 2003., sukladno prijelaznim i zavrnim odredbama od lanka 361. do lanka 368. toga zakona (u daljnjem tekstu: Obiteljski zakon) [1]. Do poetka primjene Obiteljskog zakona postupke utvrivanja i osporavanja majinstva (zakonski pojam ranije je bio materinstvo) i oinstva regulirao je Zakon o braku i porodinim odnosima objavljen u NN, broj 11/78, 45/89 te 59/90 [3]te Obiteljski zakon, objavljen u NN, broj 162/98 [2]. Odnos roditelja i djece nastaje prirodnim putem, roenjem djeteta, ali veina pravnih poredaka poznaje i zasnivanje odnosa ro-
130
Primjena analize DNA u sudskoj medicini i pravosuu
ditelja i djece pravnim putem posvojenjem, kao posebnim oblikom obiteljsko-pravnoga zbrinjavanja i zatite djece bez odgovarajue roditeljske skrbi, koji posvojiteljima omoguuje roditeljstvo. Pravni poredak odreuje tko se smatra ocem djeteta, ovisno o tome je li dijete roeno u braku ili izvan njega [5, 6]. Jo od rimskoga prava do danas obiteljska zakonodavstva izraavaju presumpciju da se ocem djeteta roenog u braku smatra majin mu (pater est iste quem nuptiae demonstrant), a to vrijedi i za na pravni sustav. Naime, odredbom lanka 54. Obiteljskog zakona, propisano je da se djetetovim ocem smatra majin mu ako je dijete roeno za vrijeme trajanja braka ili tijekom 300 dana od prestanka braka (kako je prije bilo propisano i odredbama lanka 53. Obiteljskog zakona, NN, broj 162/98), a na slian nain presumpciju branog oinstva propisivao je u lanku 98. stavku 1. i Zakon o braku i porodinim odnosima. Na ovaj nain, za djecu roenu u braku pojednostavnjeno se rjeava pitanje njihova statusa i oinstva (praesumptio iuris), zbog ega se oinstvo brane djece ne utvruje, kao to je to sluaj kod djece roene izvan braka. Rok od 300 dana od prestanka braka kao presumpcija branog oinstva odreen je zbog moguega trajanja trudnoe, jer poroaj najee slijedi u razdoblju od 274. do 280. dana od koncepcije. Za pravni je poredak mu majke otac djeteta toliko dugo dok se u posebnom postupku ne ospori njegovo oinstvo. Kad presumirani otac nije i stvarni bioloki otac djeteta roenog u braku, odnosno, tijekom 300 dana od prestanka braka jer dijete nije zaeto u odnosu majke s muem, nego s drugom osobom izvan braka, odredbe Obiteljskog zakona, kao i veina obiteljskih zakonodav-
stava, omoguuju da se presumpcija o oinstvu ospori u postupku osporavanja oinstva. Uspjelo osporavanje dovodi do usklaivanja pravnoga stanja sa stvarnim i oslobaa mua majke roditeljskih obveza prema djetetu koje ne potjee od njega. Za razliku od djeteta ije se oinstvo presumira, ocem djeteta roenog izvan braka smatra se osoba koja ga prizna za svoje ili ije je oinstvo utvreno sudskom odlukom (lanak 55. Obiteljskog zakona). Priznanje oinstva je pravni akt kojim izjavu volje, u postupku propisanom zakonom, daje osoba koja sebe smatra ocem djeteta. Izjava o priznanju oinstva uzima se u pravnom poretku kao istinita, premda je mogue da priznavatelj, uz suglasnost majke, svjesno prizna oinstvo u korist djeteta za koje zna da ne potjee od njega. Povjerenje pravnog poretka u izjavu o priznavanju oinstva postoji zbog dobrovoljnosti priznanja kao jednog od naina utvrivanja oinstva, za razliku od utvrivanja oinstva sudskom presudom, u kojem sluaju nema dobrovoljnosti za uspostavu pravnog odnosa roditelja i djeteta. Obiteljskim zakonom precizno je odreen oblik priznanja oinstva. Oinstvo se moe priznati na zapisnik pred matiarom, centrom za socijalnu skrb ili sudom, uz napomenu da su navedena tijela duna bez odgode dostaviti primjerak zapisnika o priznanju oinstva matiaru ovlatenom za upis djeteta u maticu roenih. Osim toga, mogue je priznanje oinstva i u oporuci, a oinstvo moe priznati i maloljetna osoba koja je navrila 16 godina ako je sposobna shvatiti znaenje izjave o priznanju, jednako kao i osoba djelomino liena poslovne sposobnosti. Prema odredbama Obiteljskog zakona, mogue je i priznanje oinstva zaetog, a jo neroenog djeteta, ako se dijete rodi ivo. U svakom sluaju, za upis priznanja oinstva potreban je pristanak djetetove majke, odnosno djete-
Medicinska vjetaenja i primjena analize DNA u sudskom postupku
131
ta starijeg od 14 godina ili centra za socijalnu skrb, u zakonom utvrenim sluajevima. Odredbama Obiteljskog zakona propisano je i priznavanje majinstva. U skladu s odredbama lanka 53. toga zakona, djetetova majka jest ena koja ga je rodila. Dakle, za razliku od presumpcije iz odredbe lanka 54. Obiteljskog zakona po kojoj se djetetovim ocem roenim u braku ili 300. dana od prestanka braka smatra majin mu, Obiteljski zakon izriito propisuje da djetetova majka jest ena koja ga je rodila. Priznanje majinstva na zapisnik pred matiarom, centrom za socijalnu skrb ili sudom, a i u oporuci te nakon djetetove smrti, regulirano je na isti nain kao i priznanje oinstva. Ako pri upisu djeteta u maticu roenih nema podataka o djetetovu ocu, matiar e upoznati majku s djetetovim pravom da zna tko mu je otac i s postupcima koji se mogu poduzeti radi ostvarenja toga prava, a majka moe matiaru izjaviti na zapisnik koga smatra djetetovim ocem te se ta njezina izjava smatra njezinim pristankom na priznanje oinstva (lanak 65. Obiteljskog zakona). O tome da je dijete u maticu roenih upisano bez podataka o ocu, matiar je duan odmah obavijestiti centar za socijalnu skrb prebivalita, odnosno boravita majke, uz primjerak zapisnika o majinoj izjavi, a centar je duan u roku od 15 dana pozvati majku da imenuje osobu koju smatra djetetovim ocem, uz upozorenje da bi to trebala uiniti radi dobrobiti djeteta. Od majke imenovanu osobu centar e pozvati te mu predoiti majinu izjavu i upoznati ga sa zakonskim odredbama o utvrivanju oinstva. Ako pak imenovana osoba prizna oinstvo, centar e izjavu o priznanju zapisnik o priznanju oinstva i majinu izjavu dostaviti matiaru radi upisa oinstva u maticu roenih. Kad majinstvo ili oinstvo nije utvreno priznanjem, preostaje pravna mogunost ut-
vrivanja majinstva i oinstva sudskom odlukom. Na taj nain, veina modernih pravnih poredaka zakonom tite pravni i stvarni interes djeteta za uspostavom obiteljsko-pravnog odnosa s obama roditeljima. Sada ve pripadaju prolosti zakonodavstva koja nisu priznavala ili su ogranieno priznavala pravo utvrivanja majinstva, odnosno oinstva u sudskom postupku, kao to je to bio sluaj sa Srpskim graanskim zakonikom ili pak francuskim zakonodavstvom nakon 1912. godine. Prema odredbama Obiteljskog zakona (od lanka 71. do lanka 74.), tubu radi utvrivanja majinstva ili oinstva moe podnijeti dijete do navrene 25. godine ivota ili u ime malodobnoga djeteta ili djeteta koje je djelomino ili potpuno lieno poslovne sposobnosti, osoba koja ga po zakonu zastupa te centar za socijalnu skrb do navrene 18. godine ivota djeteta. ena koja sebe smatra majkom moe podnijeti tubu radi utvrivanja majinstva do navrene 18. godine djetetova ivota. Tubu radi utvrivanja oinstva moe podnijeti djetetova majka te mukarac koji sebe smatra ocem djeteta u roku od jedne godine od primitka obavijesti da nije pribavljen pristanak djetetove majke i djeteta na priznanje oinstva, ali samo do navrene 18. godine djetetova ivota. Mukarcu koji je dijete priznao za svoje, a nije dobio suglasnost majke, priznato je pravo na tubu radi utvrivanja oinstva, radi zatite njegovih interesa, u svrhu utvrenja potjee li dijete doista od njega. Konano, Obiteljski zakon doputa i mogunost podnoenja tube protiv nasljednika osobe za koju se tvrdi da je majka, odnosno otac djeteta, ali je rok za podnoenje takve tube ogranien zbog oteanog dokazivanja relevantnih okolnosti i tekoa oko provoenja medicinskih vjetaenja, u svrhu utvrivanja majinstva ili oinstva, dulje vrijeme nakon smrti osobe ije se majinstvo ili oinstvo treba utvrditi. Meutim, treba naglasiti da je
132
ogranienje rokova u ovom sluaju posebice imalo znaenje prije primjene metode analize DNA u medicinskim vjetaenjima, a, s obzirom na to da upravo zahvaljujui primjeni analize DNA postoji mogunost utvrivanja majinstva i oinstva u znatnom postotku vjerojatnosti i dulje vrijeme nakon smrti osobe ije se oinstvo ili majinstvo dokazuje, o emu e biti govora u daljnjem tekstu. Pravomona sudska odluka kojom se majinstvo ili oinstvo utvruje ima deklaratorno, a ne konstitutivno znaenje jer je njezin obiteljsko-pravni uinak utvrenje postojanja odnosa izmeu djeteta, s jedne strane, i oca ili majke, s druge, koji odnos postoji od roenja djeteta. Na pravni poredak, kao i veina modernih zakonodavstava doputa i mogunost osporavanja majinstva i oinstva. ena koja je rodila dijete djetetova je majka, a mu majke presumirani je roditelj sve dok ne ospore majinstvo, odnosno oinstvo i do tada imaju zakonom odreena prava i dunosti prema djetetu. Tubu radi osporavanja majinstva i oinstva, prema Obiteljskom zakonu, moe podnijeti dijete ili njegov zakonski zastupnik protiv osobe koja je upisana u maticu roenih kao njegov roditelj do navrene 25. godine ivota, ena koja je upisana u maticu roenih kao djetetova majka moe osporavati svoje majinstvo u roku od 6 mjeseci od saznanja za injenicu koja iskljuuje njezino majinstvo, a najkasnije do navrene sedme godine djetetova ivota. ena koja sebe smatra djetetovom majkom moe osporavati majinstvo eni koja je upisana u maticu roenih kao majka, samo ako istodobno trai da se utvrdi njezino majinstvo, i to u roku od 6 mjeseci od saznanja da je ona majka toga djeteta, a najkasnije do navrene sedme godine djetetova ivota. Majin mu ili njegov skrbnik mogu osporavati oinstvo djeteta roenog za vrijeme trajanja braka ili tijekom 300 dana od
prestanka braka ako smatraju da on nije otac, a oinstvo moe osporavati i majka djeteta roenog za vrijeme trajanja braka ili tijekom 300 dana od prestanka braka, ali samo u roku od 6 mjeseci od djetetova roenja. Presumirani brani otac tubu radi osporavanja oinstva moe podnijeti samo u roku od 6 mjeseci od dana saznanja za injenicu koja dovodi u sumnju istinitost upisanog oinstva, a najkasnije do navrene sedme godine djetetova ivota. Na pravni poredak omoguuje osporavanje oinstva i mukarcu koji je priznao oinstvo, a poslije doznao injenicu koja iskljuuje njegovo oinstvo, ali opet samo u roku od 6 mjeseci od saznanja za injenicu i najkasnije do navrene sedme godine djetetova ivota. Slino je regulirano i pravo na tubu mukarca koji je izjavu o priznanju oinstva dao pod prisilom i mukarca koji je priznao oinstvo, a poslije doznao injenicu koja iskljuuje njegovo oinstvo. Konano, i onaj mukarac koji sebe smatra djetetovim ocem moe tubom osporavati oinstvo osobi koja je to dijete priznala za svoje, iskljuivo u sluaju da istodobno trai utvrenje svoga oinstva. Treba posebno istaknuti da u naemu pravnom sustavu nije doputeno osporavanje majinstva i oinstva utvrenog odlukom suda ni osporavanje majinstva i oinstva nakon djetetove smrti. Odredbama lanka 86. Obiteljskog zakona propisana je iznimka od naelne zabrane utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva djeteta zaetog u postupku oplodnje uz medicinsku pomo, utvrene radi zatite obiteljskoga statusa takvoga djeteta. Naime, na je pravni poredak pr vi put u odredbama lanka 86. stavka 2. i stavka 3. Obiteljskog zakona propisao da ena koja je rodila dijete koje je zaeto jajnom stanicom druge ene ima pravo osporavati majinstvo ako je do oplodnje uz medicinsku pomo dolo bez njezina pismenog pristanka. Osim toga, ena ijom je jajnom stani-
133
com dijete zaeto bez njezina pristanka ima pravo osporavati majinstvo eni koja ga je rodila ako istodobno trai da se utvrdi njezino majinstvo. S tim u vezi, treba kazati da je ve odredbama Obiteljskog zakona (NN, broj 162/98) majinom muu bila propisana mogunost osporavanja oinstva djeteta roenog za vrijeme trajanja braka, zaetog uz medicinsku pomo sjemenom druge osobe a ne majina mua, ako za to nije postojao pismeni pristanak majina mua. Navedene tube radi osporavanja majinstva, odnosno oinstva, mogu se podnijeti u roku od 6 mjeseci od dana saznanja da je do zaea dolo na opisani nain, a najkasnije do navrene sedme godine djetetova ivota, s time da, ako majin mu za nain zaea dozna prije djetetova roenja, tubu radi osporavanja oinstva moe podnijeti u roku od 6 mjeseci od djetetova roenja. Citirane novne u naem zakonodavstvu svakako su napredak i upotpunjuju pravnu regulativu utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva, premda i dalje ostaje niz praznina glede pravnog ureenja postupka oplodnje uz medicinsku pomo pa tako, primjerice, i dalje nije predvieno pruanje medicinske pomoi u postupku osjemenjivanja neudanoj eni. No, najznaajnija novna, koja je u na pravni sustav uvedena stupanjem na snagu Obiteljskog zakona u postupcima osporavanja i utvrivanja majinstva i oinstva, nedvojbeno jest zakonsko propisivanje obveze odreivanja izvoenja dokaza medicinskim vjetaenjem sukladno postignuima suvremene medicinske znanosti u navedenim postupcima osporavanja majinstva i oinstva. Naime, u odredbama lanka 77. i lanka 83. Obiteljskog zakona, kogentnim zakonskim normama propisana je dunost suda da, prije nego uope zapone raspravljati i odluivati o zahtjevu ene koja sebe smatra majkom djeteta radi osporavanja majinstva eni koja je upisana u maticu roenih
kao majka, odnosno o zahtjevu mukarca koji sebe smatra ocem djeteta radi osporavanja oinstva osobi koja je to dijete priznala kao svoje, odredi na troak tuitelja medicinsko vjetaenje sukladno postignuima suvremene medicinske znanosti, a to svakako podrazumijeva upravo medicinsko vjetaenje uz primjenu analize DNA. Koliko povjerenje na ovaj nain zakono davac iskazuje rezultatima medicinskoga vjetaenja s obzirom na postignuta dostignua primjenom znanstvene metode analize DNA u medicinskim vjetaenjima, jasno se vidi iz odredaba lanka 77. stavka 4. i lanka 83. stavka 4. Obiteljskog zakona, u kojima je propisano da e sud rjeenjem odbiti tubeni zahtjev tuitelja radi osporavanja majinstva, odnosno, oinstva ako iz medicinskih vjetaenja proizlazi da tuiteljica nije majka djeteta kojemu osporava majinstvo, odnosno da tuitelj nije otac djeteta kojemu osporava oinstvo. Tek ako iz medicinskih vjetaenja proizlazi da je tuiteljica majka djeteta, odnosno ako je tuitelj otac djeteta kojemu je osporeno majinstvo, odnosno oinstvo, sud e nastaviti raspravljati i odluivati o zahtjevima radi osporavanja majinstva, odnosno oinstva. Citirane zakonske odredbe sadravaju definitivnu i konanu potvrdu dokazne snage medicinskoga vjetaenja utemeljenog na znanstvenoj primjeni metode analize DNA te konaan kraj lutanja u pronalasku dokaza u postupcima utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva, o emu e vie rijei biti u daljnjem tekstu. Zakljuujui novne koje je u na pravni sustav unio Obiteljski zakon, svakako treba spomenuti odredbe lanka 78. toga Zakona, koje propisuju da se pravomonom odlukom o osporavanju majinstva smatra osporenim oinstvo majina mua, ali i mukarca ije je oinstvo utvreno priznanjem.
134
Za razliku od Obiteljskog zakona (NN, broj 162/98), Obiteljski zakon, na slian nain kao to je to prije regulirao i Zakon o braku i porodinim odnosima, odredbama koje propisuju postupak radi utvrivanja ili osporavanja majinstva ili oinstva (od lanka 286. do lanka 289.), odreuje koje sve stranke moraju biti obuhvaene, bilo na aktivnoj bilo na pasivnoj strani, u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva (nuni suparniari). Naime, raniji Obiteljski zakon (NN, broj 162/98), odredbama od lanka 285. do lanka 294., propisivao je tko sve moe biti stranka u postupku radi utvrivanja ili osporavanja majinstva ili oinstva, ali nije bila propisana obveza da sve te osobe moraju sudjelovati u postupku. tovie, odredbama lanka 292. toga Zakona bilo je propisano da pravomona presuda, donesena u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva ili oinstva djeluje prema svim osobama koje mogu biti stranke (koje je sud bio duan obavijestiti o pokretanju parnice te ih pouiti da se mogu pridruiti tuitelju ili tueniku), ak i ukoliko one nisu bile obuhvaene tubom (proireni uinak pravomonosti presude). Prema Obiteljskom zakonu koji propisuje tko sve mora biti stranka u navedenim postupcima, stranke u parnici radi utvrivanja majinstva jesu dijete i ena ije se majinstvo utvruje, centar za socijalnu skrb ili ena koja sebe smatra majkom ako su pokrenuli taj postupak te mukarac kojeg bi se smatralo djetetovim ocem za sluaj utvrenja majinstva u parnici u kojoj druga ena osporava majinstvo istodobno traei utvrivanje svoga majinstva. Stranke u parnici radi utvrivanja oinstva jesu dijete, djetetova majka i mukarac ije se oinstvo utvruje, a centar za socijalnu skrb ako je pokrenuo taj postupak. Stranke u postupku radi osporavanja majinstva jesu dijete, ena koja osporava majinstvo, ena ije se majinstvo
osporava ili djetetov otac. Konano, stranke u parnici radi osporavanja oinstva jesu dijete, djetetova majka i mukarac ije se oinstvo osporava, a ako se osporava oinstvo utvreno priznanjem, stranka je i mukarac koji osporava oinstvo. Prema odredbama lanka 290. Obiteljskog zakona, kada u postupku ima vie tuitelja ili tuenika, oni se imaju smatrati jedinstvenim suparniarima, to znai da se postupak moe rijeiti samo na jednak nain prema svima zbog naravi pravnog odnosa. Dakle, zakonodavac je ponovno uveo obvezu da sve potencijalne stranke moraju sudjelovati u postupku, tonije, da tubom radi utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva kao tuitelji i tuenici moraju biti obuhvaene sve osobe koje moraju biti stranke u postupku. Ako tuitelj tako nije uinio, sud ga je duan pouiti da tui i onu osobu koja tubom nije obuhvaena, a mora biti stranka ili da tu osobu pozove da se pridrui tubi kao novi tuitelj. Ako tuitelj u ostavljenom roku ne uredi tubu i ne postupi po nalogu suda, budui da se radi o nunim suparniarima, tuba se smatra neurednom i nepodobnom za raspravljanje pa e sud, primjenom odredaba lanka 109. Zakona o parninom postupku (NN, broj 53/91, 91/92, 112/99, 117/03 i 88/05 dalje: Zakon o parninom postupku) [4], smatrati tubu povuenom, odnosno tubu odbaciti. Daljnja novna u procesnom reguliranju postupaka radi utvrivanja ili osporavanja majinstva ili oinstva, koju donosi Obiteljski zakon, jest zakonsko propisivanje da sud odlune injenice u tim postupcima moe utvrivati i izvoenjem dokaza medicinskim vjetaenjem sukladno postignuima suvremene znanosti, to je daljnja potvrda napretka u znanstvenim metodama koje sudu sada stoje na raspolaganju, i vrlo visokoj vjerojatnosti tonosti rezultata vjetaenja koja se izvode kao dokaz u postupku.
135
Tako je propisano da sud u rjeenju o izvoenju dokaza medicinskim vjetaenjem odreuje i rok (ne dulji od 3 mjeseca) do kojeg e ekati izvoenje dokaza, a rjeenje uz poziv za izvoenje medicinskoga vjetaenja dostavlja osobno strankama te u pozivu oznauje ustanovu koja e izvriti medicinsko vjetaenje, vrijeme vjetaenja i upozorenje na posljedice izostanka. Ako ostavljeni rok bezuspjeno protekne, rasprava e se provesti bez obzira na to to taj dokaz nije izveden. Ako pak medicinsko vjetaenje nije provedeno jer se jedna stranka nije odazvala pozivu ili je uskratila izvoenje dokaza medicinskim vjetaenjem, prema odredbi lanka 292. stavka 6. Obiteljskog zakona, sud e odluujui o daljnjem tijeku postupka i odluujui o tubenom zahtjevu tuitelja, ocijeniti od kakvog je to znaenja za postupak i osnovanost istaknutog zahtjeva o kojem odluuje. Postupci radi osporavanja i utvrivanja majinstva i oinstva vode se po pravilima parninog postupka, oni se pokreu tubom i oznauju hitne postupke. Radi zatite prava i interesa djeteta, u postupcima radi osporavanja i utvrivanja majinstva i oinstva ograniena je dispozicija stranaka, radi ega u ovim postupcima nije doputeno donoenje presude na temelju priznanja, presude na temelju odricanja niti presude zbog izostanka, a ni presude zbog ogluhe. Dakle, stranke se ne mogu odrei svojih zahtjeva, priznati zahtjev protivne stranke niti se nagoditi, a sud je ovlaten utvrivati i injenice koje stranke nisu iznijele te moe odluiti da se dokazuju injenice koje su stranke priznale u postupku. Smisao ovakvih zakonskih odredbi nije u zabrani stranakog disponiranja jer e sud na dispozicijama stranaka zasnovati odluku ako ocijeni da su one u skladu s interesima djece i drugih osoba koje nisu sposobne same se brinuti o sebi i o svojim pravima i interesima, nego upravo zatita prava i interesa tih osoba. U ovim je
postupcima uvijek doputeno izjavljivanje revizije kao izvanrednoga pravnog lijeka protiv pravomone sudske odluke bez obzira na vrijednost predmeta spora, a javnost je iskljuena. Takoer, o trokovima u ovim postupcima sud e odluiti slobodno, vodei rauna o okolnostima sluaja i o ishodu postupka (lanak 272. Obiteljskog zakona).
6.2.
Dokazi u postupcima radi utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva
U parnicama radi utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva dunost je suda utvrditi materijalnu istinu. U interesu je djeteta utvrditi podrijetlo od majke i oca, a vrlo su znaajne i pravne posljedice koje proistjeu iz injenice da bioloka povezanost roditelja i djeteta postoji ne samo stvarno nego i pravnim odnosom. U postupku pred sudom doputena je uporaba svih dokaznih sredstava, koja mogu biti razliita s obzirom na specifinosti svakoga pojedinog sluaja. Odredbama Zakona o parninom postupku odreeno je kako dokazivanje obuhvaa sve injenice koje su vane za donoenje odluke, a o tome koji e se dokazi izvesti radi utvrivanja odlunih injenica, odluuje sud. Ranije, do stupanja na snagu i poetka primjene Obiteljskog zakona, u postupcima radi utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva najee su se izvodili dokazi pregledom isprava, rodnog i vjenanog lista, sasluanjem svjedoka i medicinskim vjetaenjima, a zbog naravi pravnog odnosa znaajno je bilo i izvoenje dokaza sasluanjem stranaka, bez obzira na to to je taj dokaz Zakonom o parninom postupku odreen kao supsidijaran dokaz koji se izvodi kada nema drugih dokaza
136
ili, kad unato izvedenim drugim dokazima, nisu dostatno utvrene vane injenice. Spor radi utvrivanja oinstva djeteta roenog izvan braka zahtijeva najprije utvrivanje vremena koncepcije djeteta, kao i utvrivanja injenice je li u to vrijeme majka odravala spolne odnose s osobom za koju u tubi tvrdi da je otac djeteta, u emu je u praksi esto bitan dokaz upravo sasluanje stranaka. Nekadanja zakonodavstva apstraktno su odreivala vrijeme zaea s obzirom na neprecizno odreenje trajanja trudnoe. Medicina, biologija, genetika i druge znanstvene discipline svojim su dostignuima poveale znanja o mogunosti znanstvenog dokazivanja majinstva i oinstva, zbog ega je, uz izvoenje dokaza sasluanjem svjedoka, pregledom isprava i drugih raspoloivih dokaza, sada upravo medicinskim vjetaenjima omogueno s vrlo visokom vjerojatnou utvrditi ili iskljuiti majinstvo ili oinstvo odreene osobe. Sukladno procesnom zakonu, sud e izvesti dokaz vjetaenjem kad je radi utvrivanja ili razjanjenja kakve injenice potrebno struno znanje kojim sud ne raspolae. Uobiajeno je u postupcima radi utvrivanja majinstva i oinstva od zdravstvene ustanove u kojoj je dijete roeno zatraiti podatak o pretpostavljenom vremenu koncepcije s obzirom na vrijeme roenja djeteta te oekivano vrijeme poroaja. Ovisno o tome upuuju li ostali dokazi dostatno na to da je djetetov bioloki otac osoba ije se oinstvo utvruje, sud e odluiti o potrebnosti izvoenja dokaza medicinskim vjetaenjem. Prema izriitoj odredbi lanka 286. stavka 4. Obiteljskog zakona, u parnicama radi utvrivanja majinstva i oinstva predujam za trokove vjetaenja isplatit e se iz sredstava suda, bez obzira na to koja je stranka predloila izvoenje spomenutog dokaza. Na ovaj nain osigurano je da se injenino stanje odluno za ocjenu osnovanosti tubenog zahtjeva potpuno i istinito utvrdi,
kako to nalau odredbe Zakona o parninom postupku, u svrhu zatite interesa djeteta, s obzirom na specifinost ovih postupaka. Kao i svaki drugi dokaz, rezultat medicinskoga vjetaenja sud cijeni uzimajui u obzir sve injenice i okolnosti. Pogrjeke u provedbi vjetaenja ne mogu se sasvim iskljuiti pa je u praksi esto odreivanje novoga vjetaenja, imenovanjem novih vjetaka ili drugih ustanova. Naime, vjetaenje uvijek mora biti obrazloeno, a, ako su miljenje i nalaz vjetaka nejasni, nepotpuni ili u proturjenosti sami sa sobom ili s izvienim okolnostima, a ti se nedostatci ne mogu otkloniti ponovnim sasluanjem vjetaka, obnovit e se vjetaenje s istim ili drugim vjetacima. Osim toga, sukladno odredbama Zakona o parninom postupku, ako u miljenju jednog ili vie vjetaka ima proturjenosti ili nedostataka ili se pojavi osnovana sumnja u pravilnost danog miljenja, a ti se nedostatci ili sumnje ne mogu otkloniti ponovnim sasluanjem vjetaka, sud e zatraiti miljenje drugih vjetaka. S obzirom na specifinost dokaznog postupka u parnicama radi utvrivanja majinstva i oinstva, u praksi je vrlo esto krunski dokaz medicinsko vjetaenje, posebno ako osoba ije se oinstvo utvruje osporava tubeni zahtjev, a izvoenje toga dokaza i pretpostavke odustanka od izvoenja sada su podrobno propisani ve citiranim odredbama lanka 292. Obiteljskog zakona. Stupanjem na snagu i primjenom Obiteljskog zakona zakonodavac je odredio redoslijed izvoenja dokaza u postupcima radi osporavanja majinstva i oinstva, upravo u svrhu onemoguivanja odugovlaenja tih postupaka i poveanja njihove efikasnosti i ekonominosti, a radi zatite prava i interesa djeteta, o emu je bilo rijei u prethodnom tekstu. Takvu inter venciju zakonodavca bez sumnje su omoguila znanstvena dostignua
137
suvremene medicine i sada ve nezamjenjiva uloga primjene DNA-analize u pronalasku materijalne istine u postupcima radi osporavanja (kao i utvrivanja) majinstva i oinstva. Upravo zahvaljujui preciznosti ove znanstvene metode i vrlo visokom stupnju vjerojatnosti (gotovo 100%-tnom) u kojem je mogue zakljuiti je li osoba roditelj malodobnoga djeteta, zakonom je bilo mogue propisati obvezu suda da u postupcima osporavanja majinstva i oinstva, prije poetka raspravljanja i izvoenja bilo kojega drugog dokaza, odredi izvoenje dokaza medicinskim vjetaenjem, a ako iz medicinskog vjetaenja proizlazi da tuiteljica nije majka, odnosno da tuitelj nije otac djeteta, odbijanje istaknutoga tubenog zahtjeva u cijelosti.
6.3.
Znaenje primjene analize DNA u medicinskim vjetaenjima u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva
Medicinsko vjetaenje, kao i izvoenje drugih dokaza, odreuje sud koji vodi vjetaenje, oznauje vjetaku predmet o kojem je potrebno dati nalaz i miljenje, postavlja mu pitanja i, prema potrebi, trai objanjenja u vezi s danim nalazom i miljenjem. Dunost je suda, prije poetka vjetaenja, pozvati vjetaka da predmet vjetaenja briljivo razmotri, tono navede sve to opazi i nae te svoje miljenje iznese savjesno i u skladu s pravilima znanosti i vjetine, pri emu je sud duan vjetaka upozoriti na posljedice davanja lanog iskaza. Ocjenjujui izvedene dokaze, sud e savjesno ocijeniti svaki izvedeni dokaz pojedinano i sve izvedene dokaze u njihovoj ukupnosti te
na temelju takve ocjene izvesti zakljuak je li neka injenica dokazana, to vrijedi i za ocjenu nalaza i miljenja sudskih vjetaka. Do primjene analize DNA u medicinskim vjetaenjima u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva i oinstva, primjenjivane su metode ispitivanja kr vnih grupa i faktora djeteta, majke i osobe za koju se tvrdi da je otac, odnosno ije se oinstvo osporava, kao i ispitivanja nasljednih biolokih osobina osoba za koje se tvrdi da su najblie kr vnosrodniki povezane. Kr vne ekspertize slue iskljuivanju, a ne utvrivanju oinstva, pri emu treba naglasiti kako se smatra da je i ovo mogue u maksimalno 90% sluajeva, i to iznimno posebnim i sloenim metodama. Ispitivanje kr vnih grupa i faktora sastoji se u vaenju i usporedbi kr vi majke, djeteta i mukarca ije se oinstvo utvruje, odnosno, osporava, jer su kr vne grupe i faktori konstantne bioloke osobine ovjeka koje se po tzv. Mendelovu zakonu prenose s roditelja na djecu. Za razliku od rezultata ispitivanja kr vnih grupa i faktora na temelju kojih se oinstvo moe samo iskljuiti, provoenjem antropolokoga vjetaenja mogue je zakljuiti da dijete potjee od odreenog mukarca. Antropoloko ili nasljedno bioloko vjetaenje podrazumijeva ispitivanje veega broja nasljednih svojstava za koja se zna da ih, po Mendelovu zakonu nasljeivanja, dijete stjee od svojih biolokih roditelja. Ova se metoda sastoji u mjerenju, usporeivanju i fotografiranju odreenih morfolokih oznaka, uzimanju otisaka, razmatranju fizikih oznaka, svojstava djeteta, majke i mukarca ije se oinstvo utvruje ili osporava, pri emu se u obzir uzima vei broj elemenata na temelju kojih se analizira podudarnost, odnosno odstupanja. Meutim, niti tom metodom nije mogue doi do rezultata kojim bi se u svakom sluaju moglo utvrditi potjee li odreeno dijete od odreenog mukarca. Osim navedenih metoda, znaajna je i metoda odreiva-
138
nja nasljednih tkivnih gena sustava HLA, ali ni tom metodom nije mogue uvijek utvrditi bioloku vezu izmeu djeteta i osobe ije se oinstvo utvruje ili osporava. Tek primjena analize DNA od godine 1994. u Republici Hr vatskoj, u medicinskim vjetaenjima u postupcima radi utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva, omoguila je znatno poveanje stupnja vjerojatnosti da je odreena osoba bioloka majka ili bioloki otac djeteta, odnosno iskljuenja mogunosti da bi ta osoba mogla biti bioloki roditelj djeteta. Budui da svaki dio ljudskog tijela moe biti uzorkom analize temeljnoga genetikoga materijala (krv, dlaka, nokti, skeletni ostatci i slino), zahvaljujui analizi DNA mogue je utvrivati ili osporavati majinstvo i oinstvo s vjerojatnou veom i od 99,99%, ak i u odnosu na osobe umrle prije vie godina, to je prije, uz primjenu tradicionalnih metoda, bilo gotovo nezamislivo i nemogue[7]. Sloenost dokazivanja oinstva tradicionalnim metodama, do primjene analize DNA u medicinskim vjetaenjima, dostatno je razvidna, primjerice, iz postupka koji se pred Opinskim sudom u Splitu vodi radi utvrivanja oinstva jo od 1988. godine. U tom su postupku do godine 2000. provedena ak tri medicinska vjetaenja na temelju kojih, na alost, uz ostale izvedene dokaze, nije bilo mogue izvesti zakljuak o osnovanosti tubenog zahtjeva, odnosno o tome je li tuenik, mukarac ije se oinstvo utvruje, doista bioloki otac djeteta. Pr vo vjetaenje proveo je 24. svibnja 1988. Zavod za transfuziologiju Sarajevo. Metodom analize kr vnogrupnih sustava utvreno je kako se tuenikovo oinstvo ne iskljuuje, analizom HLA-sustava utvreno je takoer da oinstvo nije mogue iskljuiti, analizom po Essen-Molleru utvreno je oinstvo u stupnju vjerojatnosti od 62%, uz napomenu da na djetetu nisu pronaene dominantne morfoloke
znaajke svojstvene samo njemu. Drugo vjetaenje provedeno je 27. rujna 1989. u Centru za tipizaciju tkiva, Klinici za urologiju Medicinskog fakulteta Sveuilita u Zagrebu, i njime je utvren postotak vjerojatnosti od 70% da je tuenik otac djeteta. Zakljuak u ovom vjetaenju bio je da tuenik moe biti bioloki otac, da se ne moe iskljuiti od oinstva, a premda je vjerojatnost oinstva tuenika izrazito niska, da nije mogue njegovo apsolutno iskljuenje. Na osnovi rezultata odreivanja gena HLA i ostalih kr vnih osobina utvreno je kako od stotinu nasumce odabranih nesrodnih osoba, moe biti 91,20% iskljuenih od oinstva djeteta. S obzirom na navedene rezultate vjetaenja kojima nije bilo dostatno dokazano oinstvo tuenika i prigovore stranaka, 4. listopada 1993. provedeno je novo vjetaenje u Centru za tipizaciju tkiva u Ljubljani. U nalazu i miljenju Centra utvreno je kako se na temelju imunogenetike analize tkivnih antigena sustava HLA smatra da je mogue da je tuenik otac djeteta u izraunanoj kumulativnoj vjerojatnosti oinstva od 93,86%. Nakon izvoenja dokaza na osnovi medicinskih vjetaenja provedenih u trima razliitim ustanovama ovlatenim za provoenje tih vjetaenja, budui da su stranke ustrajale u svojim prigovorima, a s obzirom na to da su i dalje postojali nepodudarnost, odreena proturjenost i nesuglasje izmeu pojedinih vjetaenja, sud je odluio izvesti dokaz novim medicinskim vjetaenjem u svrhu potpunog i istinitog utvrivanja injeninoga stanja. Provedbom vjetaenja od 5. lipnja 2000. u Odjelu za patologiju i sudsku medicinu Laboratorija za sudsku i kliniku genetiku Klinike bolnice Split, uz primjenu metode odreivanja DNA polimorfizma, koja se zasniva na principu o prijenosu genetikoga materijala s roditelja na potomka, utvreno je da bi tuenik bio otac djeteta s vjerojatnou ak od 99,998%.
139
To je vjetaenje provedeno analizom genskih lokusa radi odgovora na dva pitanja: kolika je statistika vjerojatnost da je tuenik stvarni bioloki otac djetetu te kolika je vjerojatnost nalaenja neke druge osobe u opoj populaciji koja bi takoer mogla biti bioloki otac toga djeteta, u konkretnom sluaju, tuitelja. Kako to iz citiranog vjetaenja proistjee, struni tim Odjela za patologiju i sudsku medicinu Laboratorija za sudsku i kliniku genetiku KB Split pri izradbi vjetaenja proveo je postupak izdvajanja DNA iz kr vi, umnoavanja DNA, prikaza rezultata te analize rezultata i statistike obradbe, na koji je nain utvreno da bi tuenik bio bioloki otac djeteta, kako je prije kazano, uz vjerojatnost od 99,998%, a vjerojatnost nalaenja istoga genotipa utvrenog za tuenika u opoj populaciji Hr vatske, procijenjena je s 1 : 38 904. Iz navedenog je primjera mogue zakljuiti o napretku koji je u medicinska vjetaenja u postupcima radi utvrivanja i osporavanja oinstva unijela primjena analize DNA. Zahvaljujui upravo mogunostima ove znanstvene metode znatno je poboljana efikasnost dokazivanja u predmetnim postupcima, kao i skraenje, ekonominost postupaka te onemoguivanje zlouporabe procesnih ovlatenja stranaka neosnovanim prigovorima na provedena vjetaenja. Tonije, primjenom analize DNA u medicinskim vjetaenjima olakano je provoenje dokaznog postupka i utvrivanje materijalne istine, uz napomenu da treba naglasiti kako e i ovaj dokaz sud procjenjivati u kontekstu ostalih izvedenih dokaza. Metoda analize DNA u Republici Hr vatskoj primjenjuje se tek nekoliko godina, no samo na Opinskom sudu u Splitu, osim gornjega primjera, u veem broju postupaka potvren je zakljuak o trajnom napretku koji je navedena metoda u postupke radi utvrivanja i osporavanja oinstva unijela ponajprije svojom preciznou i
dostignuima (s obzirom na to da su postupci radi osporavanja i utvrivanja majinstva vrlo rijetki u praksi). Primjerice, u postupku radi utvrivanja oinstva provedeno je vjetaenje metodom tipizacije tkiva kojim je utvren postotak vjerojatnosti da bi tuenik bio otac djeteta u omjeru od 74%, da bi vjetaenjem metodom odreivanja DNA-polimorfizma, postotak vjerojatnosti da je tuenik otac djeteta bio izraen s ak 99,999 587 93%, to preciznost ove metode ini neupitnom. Konano, u praksi je posebno znaajna primjena metode analize DNA pri utvrivanju majinstva i oinstva osobe koja nije iva, kada se tuba podnosi protiv njezinih nasljednika (lanak 74. Obiteljskog zakona). Zakonodavac je ograniio rokove u kojima se moe podnijeti takva tuba precizirajui da se tuba moe podnijeti u roku od godine dana od smrti osobe za koju se tvrdi da je majka, odnosno, otac djeteta ili u roku od 6 mjeseci od pravomonosti odluke o nasljeivanju. No, budui da svaki dio ljudskog tijela moe biti uzorkom radi analize temeljnoga genetikog materijala, primjenom analize DNA mogue je dokazivati majinstvo i oinstvo i umrle osobe, ak i dulje vrijeme nakon smrti te osobe, ako su dostupni materijali kao to su zubi, kosti, dlake, a, ako se radi o osobi umrloj prije kraeg vremena, i ouvana miina ili neka druga tkiva. Za razliku od tradicionalnih metoda ispitivanja kr vnih grupa i faktora te antropolokih vjetaenja, analizom DNA iz ouvana genetikoga materijala umrle osobe, u velikome stupnju vjerojatnosti mogue je utvrditi bioloku povezanost izmeu pretpostavljenog roditelja i djeteta. Dakle, za sluaj objektivno mogue ekshumacije tijela umrloga roditelja ije se majinstvo ili oinstvo utvruje, sud rjeenjem odreuje izvoenje dokaza medicinskim vjetaenjem primjenom analize DNA iz ouvanog genetikog materijala umrloga roditelja. U situaciji
140
kad ekshumacija tijela umrle majke ili oca nije mogua zbog objektivnih okolnosti (nedostupnost tijela, nemogunost ekshumacije i slino), odnosno kad sudu nisu dostupni ouvani genetiki materijali umrloga roditelja, mogue je odrediti i izvesti dokaz medicinskim vjetaenjem bliskih krvnih srodnika nasljednika umrlog roditelja koji su (i ako su) stranke u parnici. Potrebno je naglasiti da te osobe, kao i inae stranke u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva ili oinstva, nisu dune pristupiti vaenju krvi ili uzimanju drugog materijala u svrhu provedbe vjetaenja, a takvo njihovo postupanje sud e cijeniti pri odluivanju o istaknutom tubenom zahtjevu u kontekstu ostalih izvedenih dokaza i rezultata raspravljanja, u skladu s odredbama lanka 8. Zakona o parninom postupku. Znaenje metode analize DNA u postupcima utvrivanja majinstva i oinstva inae, jest nezaobilazan i esto odluan dokaz, posebno u okolnostima proturjenih iskaza stranaka i svjedoka. Nije rijetkost da tuenik, mukarac za kojega se tvrdi da je otac djeteta prigovara kako je majka u vrijeme koncepcije imala odnose s vie mukaraca (exceptio plurium concubantium). U takvoj situaciji
moe od presudnoga znaenja biti visok stupanj vjerojatnosti utvren ovom metodom vjetaenja, upravo zbog mogunosti da vie osoba bude bioloki otac djeteta, neovisno o tome jesu li sve te osobe stranke u postupku. Naime, s obzirom da mukarci za koje se tvrdi da su s majkom u vrijeme koncepcije imali odnose (konkubenti majke), u pravilu nisu stranke u postupcima radi utvrivanja ili osporavanja majinstva ili oinstva, sud nema mogunost po slubenoj dunosti ili na prijedlog stranaka odrediti izvoenje dokaza medicinskim vjetaenjem tih osoba. Stoga odluuje na temelju slobodne sudake ocjene svih dokaza izvedenih u postupku, osobito, lijenikih vjetakih nalaza i miljenja izraenih primjenom analize DNA parninih stranaka. Iz navedenih primjera i dosadanje prakse sa sigurnou moemo zakljuiti da je definitivno i nedvojbeno primjena znanstvene metode analize DNA u medicinskim vjetaenjima u postupcima utvrivanja i osporavanja majinstva i oinstva trajan napredak efikasnosti dokaznog postupka u ovim sporovima, to je stupanjem na snagu i primjenom Obiteljskog zakona i formalno potvreno u naemu pravnom sustavu.
Literatura
1. Obiteljski zakon (Narodne novine, broj 116/03, 17/04, 136/04, i 107/07). 2. Obiteljski zakon (Narodne novine, broj 162/98). 3. Zakon o braku i porodinim odnosima (Narodne novine, broj 11/78, 45/89 i 59/90). 4. Zakon o parninom postupku (Narodne novine, broj 53/91, 91/92, 112/99, 117/03 i 88/05). 5. Alini M, Bakari-Abramovi A, Hrabar D, Hlaa N. Obiteljsko pravo, Zagreb 1994. 6. Alini M, Hrabar D, Jakovac-Lozi D, Kora A. Obiteljsko pravo, Zagreb, 2006. 7. Primorac D, Schanfield SM, Primorac D. Application of forensic DNA in the legal system. Croat Med J 2000; 41 (1):32-46.
141
7.
DNA-analiza u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea

Gordan Mri i Petra Uvodi
Sadraj poglavlja
7.1. 7.2. Opa razmatranja o kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea . . . . 142 Tragovi u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea . . . . . . . . . . . . . . 145 7.2.1. Kontaktni tragovi tekstilnih vlakana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 7.2.2. Bioloki tragovi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 7.2.2.2. Izuzimanje biolokog materijala za DNA-analizu. . . . . . . . . . . . . . . . 147 7.2.2.3. Izuzimanje nespornih uzoraka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 7.2.2.4. Izuzimanje spornih tragova. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Sprjeavanje kontaminacije prilikom oevida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 7.3.1. Lijeniki pregled rtve silovanja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 7.3.2. Lijeniki pregled osobe osumnjiene za silovanje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 7.3.3. Uvjeti adekvatnog uvanja uzoraka/tragova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 Sprjeavanje kontaminacije prilikom suenja corpora delicti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 7.4.1. Pakiranje corpora delicti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 7.4.2. Prijenos corpora delicti u laboratorij . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 Laboratorijsko ispitivanje biolokih tragova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 7.5.1. Makroskopski pregled corpora delicti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 7.5.2. Kvantitativno odreivanje DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 7.5.3. Umnaanje DNA lananom reakcijom polimerazom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 7.5.4. Vizualizacija umnoene DNA metodom kapilarne elektroforeze . . . . . . . . . . . . 158 7.5.5. Rezultati DNA-analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 7.5.6. Izraunavanje uestalosti genotipa na temelju rezultata analize DNA . . . . . . . 161
7.3.
7.4.
7.5.
7.1.
Opa razmatranja o kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea
Zatita slobode odluivanja (samoodreenje) u spolnom ivotu i spolnog morala
propisana je kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnog udorea. Kaznena djela protiv spolne slobode i spolnog udorea [1] odnose se na sljedea kaznena djela: a) silovanje, b) spolni odnoaj s nemonom osobom, c) prisila na spolni odnoaj, d) spolni odnoaj zlouporabom poloaja,
142
Primjena analize DNA u sudskoj medicini i pravosuu
e) spolni odnoaj s djetetom, f) bludne radnje, g) zadovoljenje pohote pred djetetom ili maloljetnom osobom, h) podvoenje, i) iskoritavanje djece ili maloljetnih osoba za pornografiju, j) upoznavanje djece s pornografijom, k) djeja pornografija na raunalnom sustavu i mrei [2] l) rodoskvrnue. U komentaru Kaznenoga zakona autora Berislava Paviia i Petra Veia [3] kaznena djela protiv spolne slobode i spolnog udorea prema objektu zatite razvrstana su u dvije skupine: a) kaznena djela protiv spolne slobode b) kaznena djela protiv spolnog udorea. Kaznena djela protiv spolne slobode su kaznena djela silovanja, spolnog odnoaja s nemonom osobom, prisile na spolni odnoaj, spolnog odnoaja zlouporabom poloaja, spolnog odnoaja s djetetom i bludnih radnji. Kaznena djela protiv spolnog udorea su kaznena djela zadovoljavanja pohote pred djetetom ili maloljetnom osobom, podvoenje, iskoritavanje djece i maloljetnih osoba za pornografiju, upoznavanje djece s pornografijom i rodoskvrnue. Motiv kaznenih djela protiv spolne slobode i spolnog udorea je zadovoljavanje spolnog nagona. Udio prijavljenih kaznenih djela protiv spolne slobode i spolnog udorea u razdoblju 1998. 2006. (podatci Informacijskog sustava MUP-a Republike Hrvatske) (tablica 7-1) u odnosu na ukupan broj kaznenih djela na podruju Republike Hrvatske kree se prosjeno oko 0,72 %. Od ukupnog broja kaznenih djela protiv spolne slobode i spolnog udorea u razdoblju 1998. 2006. prosjeno 33,39% ine bludne radnje, 20,53% silovanja, 15,63% zadovoljavanje pohote pred dje-
tetom ili maloljetnom osobom, 10,25% spolni odnoaj s djetetom, 5,82% podvoenje, 3,87% iskoritavanje djece ili maloljetnih osoba za pornografiju, 3,45% upoznavanje djece s pornografijom, 2,76% spolni odnoaj s nemonom osobom, 1,59% rodoskvrnue, 1,34% spolni odnoaj zlouporabom poloaja, 0,77% djeja pornografija na raunalnom sustavu i mrei, 0,61% prisila na spolni odnoaj. Promatrajui brojnost pojedinih kaznenih djela protiv spolne slobode i spolnoga udorea na podruju Republike Hr vatske, najea su kaznena djela bludne radnje i silovanje. Osnovna forenzina teorija kae da im doe do kontakta dviju osoba ili predmeta dolazi do meusobne izmjene materijala. To je posebice vano kad se govori o seksualnim deliktima, a nadasve o kaznenom djelu silovanja, gdje su tvari koje meusobno izmjenjuju rtva i poinitelj tragovi koji se analiziraju u forenzinim znanstvenim laboratorijima. Vlasi kose, dlake, krv, sperma, slina, epitelne stanice, tekstilna vlakna i drugi tragovi koji zaostaju nakon poinjenja silovanja nedvojbeno su tragovi koji dovode, primjenom najnovijih metoda i instrumentarija u forenzinim znanstvenim laboratorijima, do otkrivanja i identificiranja poinitelja kaznenog djela. Silovanje je kazneno djelo koje ini osoba koja drugu osobu uporabom sile ili prijetnje da e izravno napasti na njezin ivot ili tijelo ili na ivot ili tijelo njoj bliske osobe prisili na spolni odnoaj ili s njim izjednaenu spolnu radnju. Kvalificirani, odnosno tei oblik kaznenoga djela silovanja bit e ako npr. poinitelj kazneno djelo izvri na osobito okrutan ili osobito poniavajui nain, ili ako je istom prigodom prema istoj rtvi poinjeno vie spolnih odnoaja ili s njim izjednaenih spolnih radnji od vie poinitelja, ako je prouzroena smrt silovane osobe, ili je teko tjelesno ozlijeena, ili joj je zdravlje teko narueno, ili je silovana enska osoba ostala trudna. Poini-
DNA u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea
143
Tablica 7-1. Kaznena djela protiv spolne slobode i spolnoga udorea u razdoblju od 1998. 2006. (podatci Informacijskog sustava MUP-a Republike Hrvatske) Glava Kaznena djela protiv / l. spolne slobode i XIV spolnog udorea 188 189 190 191 192 193 194 195 196 Silovanje Spolni odnoaj s nemonom osobom Prisila na spolni odnoaj Spolni odnoaj zlouporabom poloaja Spolni odnoaj s djetetom Bludne radnje Zadovoljavanje pohote pred djetetom ili maloljetnom osobom Podvoenje Iskoritavanje djece ili maloljetnih osoba za pornografiju Upoznavanje djece s pornografijom Djeja pornografija na raunalnom sustavu i mrei Rodoskvrnue 8 9 9 7 6 11 4 1998. 1999. 2000. 2001. 2002. 2003. 2004. 2005. 2006. 342 88 13 3 3 42 100 56 18 1 480 94 19 5 10 39 152 77 37 15 615 128 10 2 9 47 248 123 16 16 526 95 14 2 6 56 183 104 29 23 461 88 12 4 9 52 155 51 34 31 597 156 21 4 5 57 178 61 48 37 527 107 12 2 2 58 157 95 42 26 622 99 11 3 12 71 219 95 30 18 610 126 20 4 8 68 204 85 24 18
197
10
23
19
19
22
45
13
197a 198
12 7
25 15
telj ili poinitelji kaznenoga djela silovanja kao i njihove rtve mogu biti osobe obaju spolova (muke ali i enske osobe). injenica eventualnog postojanja braka ili izvanbrane zajednice, za postojanje djela nije presudna. Svaki spolni in pri kojem mukarac uvodi erigirani penis u tjelesnu upljinu svoga enskog ili mukoga seksualnog partnera i tamo izvodi snoajne radnje u irem smislu prema medicinskoj enciklopediji je spolni snoaj (coitus) [4]. Ta upljina moe biti vagi-
na, kada govorimo o vaginalnom snoaju, ili snoaju u uem smislu, anus, ako imamo analni snoaj, ili usna upljina kada postoji oralni snoaj. Bez obzira na spol, svaka penetracija erigiranoga penisa u analni ili oralni otvor rtve u svrhu zadovoljavanja spolnog nagona bez dvojbe jest radnja izjednaena sa spolnim odnoajem. Pod pojmom bludnje radnje misli se na sve one radnje koje se ne mogu opisati pojmom spolnoga odnoaja ili s njim izjednaene spolne radnje, a kojima se zadovoljava
144
spolni nagon razliitim nainom od spolnog odnoaja ili s njim izjednaene radnje [5].
3. tragovi papilarnih linija 4. ostali tragovi (tragovi uporabe sile, oruje, orue, uporabni predmeti i sl.)
7.2.
Tragovi u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea
7.2.1.
Kontaktni tragovi tekstilnih vlakana
Silovanje je kazneno djelo ije je obiljeje prijetnja i uporaba fizike sile koja na rtvi i poinitelju ostavlja tragove nasilja, a koji su bitno razliiti od tragova koji se nalaze pri dobrovoljnom snoaju [6]. Uporaba fizike sile i prijetnje fizikom silom, orujem ili oruem od strane poinitelja kaznenoga djela silovanja, te pruanje otpora, tj. otimanje poinitelju od strane rtve svakako pridonosi brojnosti tragova koji se mogu pronai forenzinom obradbom rtve silovanja, poinitelja silovanja i mjesta dogaaja. Tragove u kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea treba traiti na: rtvi poinitelju mjestu poinjenja kaznenoga djela odjei koju su u trenutku poinjenja kaznenoga djela na sebi imali rtva i poinitelj oruju, oruu i predmetima kojima je izvrena prijetnja, prisila ili nanoenje tjelesnih ozljeda fotografijama, videovrpcama, CD-ima, DVD-ima, raunalu, i dr. U uvjetima meusobnog kontakta i primjene fizike sile poinitelja prema rtvi, tragovi koji se mogu analizirati u forenzinim znanstvenim laboratorijima su: 1. kontaktni tragovi tekstilnih vlakana 2. bioloki tragovi
Oni odjevni predmeti koje je u vrijeme izvrenja djela rtva imala na sebi i koji su bili u kontaktu s odjeom i tijelom poinitelja i mjestom dogaaja, pravo su bogatstvo tragova koji se obino mogu pronai. Na vanjskim dijelovima odjee rtve mogue je pronai tragove tekstilnih vlakana odjee poinitelja. Odjeu koju je rtva nosila u vrijeme dogaaja potrebno je to prije izuzeti kako ne bi dolo do gubitka i kontaminacije tragova koji se nalaze na odjei. Izuzimanje odjevnih i uporabnih predmeta, te obue oteene i osumnjiene osobe potrebno je obaviti neposredno nakon izvrenja kaznenoga djela (tablica 7-2.) ili to je prije mogue. Ukoliko izuzeti odjevni i uporabni predmeti oteene i osumnjiene osobe nisu suhi, iste je potrebno osuiti na sobnoj temperaturi u odvojenim prostorijama na istim podlogama. Obvezno, nakon svakoga suenja, podloge treba oistiti sredstvom za dezinfekciju kako bi se izbjegla mogunost kontaminacije. Nakon svakog izuzimanja pojedinog uzorka materijala za komparativno vjetaenje tragova tekstilnih vlakana, rezanja noktiju ili izuzimanja sadraja ispod njih, te obljepljivanja dlanova, odjevnih predmeta i/ili mjesta dogaaja, nuno je oprati i dezinficirati pribor (kare, pincete, skalpele i dr.), kako bi se izbjegla mogunost kontaminacije materijala vjetaenja. Smatra se iznimno vanim onemoguiti svaki kontakt izmeu oteene i osumnjiene osobe ili njihovih odjevnih/uporabnih predmeta, nakon poinjenja kaznenoga djela.
145
Tablica 7-2. Nain izuzimanja tragova i uzoraka s mjesta dogaaja za vjetaenje kontaktnih tragova Pakiranje uzorak osuen na sobnoj temperaturi pakirati u papirnate vree odgovarajue veliine uzorak osuen na sobnoj temperaturi pakirati u papirnate vree odgovarajue veliine u papirnatu vreicu odgovarajue veliine
146
Obiljeivanje urudbeni broj broj izuzetog uzorka mjesto izuzimanja potpis tehniara urudbeni broj broj izuzetog uzorka mjesto izuzimanja potpis tehniara urudbeni broj broj izuzetog uzorka mjesto izuzimanja potpis tehniara urudbeni broj broj izuzetog uzorka mjesto izuzimanja potpis tehniara urudbeni broj broj izuzetog uzorka ime i prezime predmetne osobe oznaka ruke izuzimanja potpis tehniara urudbeni broj broj izuzetog uzorka ime i prezime predmetne osobe oznaka ruke izuzimanja potpis tehniara osueno sredstvo izvrenja paki- urudbeni broj rati u papirnatu vreicu odgova- broj izuzetog uzorka rajue veliine mjesto izuzimanja ako se radi o otrom predmetu, ime i prezime vlasnika sjeivo dobro zatititi potpis tehniara
Vrsta uzorka odjevni ili uporabni predmeti i obua
Izuzimanje rukavicama za jednokratnu uporabu
rukavicama za jednokratnu uporabu
Fiksiranje strjelicom brojem fotografijom unos u IKTP komadi mate- strjelicom rijala (tkanine, brojem pletiva i dr.) fotografijom unos u IKTP tekstilna vlakna strjelicom brojem fotografijom unos u IKTP mikrotragovi strjelicom s mjesta do brojem gaaja (pojedi- fotografijom nana tekstilna unos u IKTP vlakna) nokti ili sadraj strjelicom ispod noktiju brojem (ako su nokti fotografijom prekratki za re- unos u IKTP zanje)
rukavicama za jednokratnu uporabu pincetom (nedostupno mjesto)
mikrotragovi s dlanova i prstiju ruku
strjelicom brojem fotografijom unos u IKTP
prozirnim ljepljivim trakama irine 5 cm i duljine pravilno presavinute (ne zguvane) trake pakirati u papirnatu oko 30 cm, rukavicama za jednokratnu uporabu vreicu odgovarajue veliine ako se izuzima s tekstilne povrine obvezno izuzeti nesporni uzorak materijala veliine otprilike 1 cm2 (zastupljene sve boje po osnovi i potki) rezanje (odvojeno lijeva i desna ruka) istim o- odrezane nokte (ili izuzeti sadrtrim karicama u rukavicama za jednokratnu upoaj ispod noktiju) umotati u bijerabu na bijeli isti papir, ili ako su nokti prekratki li papir na kojem je izuzimano i za rezanje, vrhom sterilnog drvenog tapia izupakirati u papirnate vreice odzeti sadraj ispod noktiju u rukavicama za jednogovarajue veliine kratnu uporabu, na bijeli isti papir prozirnim ljepljivim trakama irine 5 cm i duljine pravilno presavinute (ne zguvaotprilike 15 cm, rukavicama za jednokratnu upone) trake pakirati (odvojeno lijerabu va i desna ruka) u papirnatu vreicu odgovarajue veliine
sredstvo izvrenja
strjelicom brojem fotografijom unos u IKTP
rukavicama za jednokratnu uporabu
Da bi se to postiglo, potrebno je poduzeti sljedee: iskljuiti mogunost da ovlatena osoba (kriminalistiki tehniar) koja je bila na mjestu dogaaja dolazi u kontakt s odjevnim ili uporabnim predmetima oteene ili osumnjiene osobe; odjeu oteene i osumnjiene osobe moraju zasebno izuzimati dvije osobe u odvojenim prostorijama, bez mogunosti meusobnog kontakta; iskljuiti mogunost da osobe koje sudjeluju u pretrazi stana, kue ili osobnog vozila, kasnije budu u kontaktu sa vlasnicima ili korisnicima istih; sve slubene osobe koje se nalaze na mjestu dogaaja ili dolaze u bilo kakav kontakt sa odjevnim i/ili uporabnim predmetima oteene/osumnjiene osobe moraju obvezno nositi propisanu zatitnu opremu (zatitni jednokratni kombinezon, zatitnu kapu, rukavice za jednokratnu uporabu, specijalne navlake za zatitu obue i jednokratnu zatitnu masku za nos i usta).
7.2.2.
Bioloki tragovi
Kad u forenzinoj analizi govorimo o biolokim tragovima najee se misli na tragove humanog podrijetla. Takav pristup tragovima biolokog podrijetla posljedica je spoznaje da je kazneno djelo poinio ovjek i da poinitelja treba to prije otkriti. U kaznenim djelima protiv spolne slobode i spolnoga udorea, najee, jedini svjedoci kaznenoga djela jesu oteena osoba i poinitelj(i). Ovakva kaznena djela tipina su kontaktna djela s prijenosom tragova s poinitelja na rtvu odnosno sa rtve na poinitelja, te na poinitelja i rtvu s mjesta dogaaja i obratno. U veini sluajeva oteena osoba nije u
stanju dati opis poinitelja, stoga odluujuu ulogu imaju bioloki tragovi ljudskoga podrijetla kao to su: krv, slina, sperma, epitelne stanice, dlake i kosa poinitelja i rtve izuzeti s mjesta dogaaja. Dakle, osnovni zadatak je osigurati tragove i samim time osigurati materijalne dokaze o poinitelju, rtvi, te o mjestu i nainu izvrenja djela [7]. Potrebno je odmah izuzeti odjevne predmete rtve koji su u vrijeme izvrenja djela bili u kontaktu s poiniteljem kako bi se na njima osigurale vlasi kose, dlake i ostali tragovi koji mogu otpasti i biti nepovratno izgubljeni. Ako je rtva odjevena u istu odjeu koju je nosila u vrijeme dogaaja, ne bi trebalo dopustiti da se u toj odjei odvede lijeniku, ukoliko lijenik nije upoznat s kriminalistikom vrijednou tragova i nainom izuzimanja istih. U pravilu bi trebalo, neposredno nakon to rtva da iskaz, izuzeti odjevne predmete uz asistenciju policijske slubenice ili policijskog slubenika [6]. Ovisno o protoku vremena na isti se nain izuzimaju i odjevni predmeti poinitelja. Kako bi se osigurali odgovarajui dokazi na tijelu rtve potrebno je to prije obaviti medicinski pregled rtve: opi i ginekoloki, te prema potrebi sudskomedicinski. Isto je tako potrebno to prije obaviti tjelesni pregled osumnjienika, te medicinski i prema potrebi sudskomedicinski pregled, te pristupiti provoenju oevida na mjestu dogaaja [7].
7.2.2.2.
Izuzimanje biolokog materijala za DNA-analizu
U prethodnim poglavljima jasno su prikazani osnovni imbenici na kojima se zasniva standardna forenzina DNA-analiza. U sklopu ovoga poglavlja te su osnove razmotrene s gledita njihove primjene u svakodnevnim aktivnostima konkretnoga laboratorijskoga posla, tj. u svjetlu onoga s ime se uposlenici jednoga laboratorija, u ovome sluaju DNA-laboratorija Centra za krimina-
147
listika vjetaenja Ivan Vueti, MUP-a Republike Hrvatske, svakodnevno susreu.
Ope upute za izuzimanje biolokih tragova

Ove upute sadravaju ope podatke o potrebnom priboru i postupcima izuzimanja, prijenosa i rukovanja uzorcima i tragovima za DNA-analizu, a odnose se na sve tipove kaznenih djela kod kojih je mogue pronai zaostale tragove biolokog materijala poevi od ubojstava, seksualnih zloina do razbojnitava, kraa itd. Tragove izuzimaju samo osobe ovlatene od strane pravosua ili policije poevi od lijenika pa do policijskih slubenika odgovarajue izobrazbe. Europska mrea forenzinih znanstvenih instituta (ENFSI) jest organizacija koju priznaje i Europska unija kao strunu organizaciju koja je zaduena na razini Europe za propisivanje, unificiranje i harmonizaciju forenzinih metoda rada. Ova organizacija u radnim skupinama definira forenzine radne zadae i okvire razultata u kojima se pojedine analize moraju kretati. Isto tako briga ove organizacije jest i provoenje akreditacijskih i certifikacijskih postupaka u laboratorijima koji su lanovi ove organizacije.
7.2.2.3.
7-3). Isti se na mjestu izuzimanja pakiraju u papirnate omote koje odmah nakon zatvaranja moraju biti ovjereni peatom ustanove i potpisane od ovlatene medicinske osobe, a zatim predane ovlatenom djelatniku MUPa. Uzorci za eliminaciju su nesporni uzorci izuzeti od svih osoba koje su bile ukljuene u proces obradbe. Oni ukljuuju policijske slubenike, ekipu za oevid na mjestu dogaaja, sve osobe koje su na mjesto dogaaja dole s ovlatenjem ili bez njega, sve osobe koje su imale kontakt s materijalom vjetaenja, te laboratorijsko osoblje. DNA-profili tih osoba slue kako bi se eliminirale sluajne kontaminacije tragova s mjesta dogaaja.
Postupak izuzimanja nespornih uzoraka:

Osoba koja izuzima nesporni uzorak mora nositi rukavice za jednokratnu uporabu za vrijeme izuzimanja. Kad se otvori komplet za izuzimanje uzoraka mora se provjeriti i da li se u njemu nalazi sve to je na priloenom popisu navedeno, te slijediti priloene upute. Ako se za vrijeme izuzimanja uzoraka dogodi da uzorak padne na bilo koju povrinu u prostoriji, sve treba baciti, uzeti novi komplet i izuzeti uzorak. Nakon to je uzorak uspjeno izuzet, sav pribor s mjesta izuzimanja i rukavice koje su se rabile treba pokupiti i baciti na za to predvieno mjesto. Na priloeni obrazac potrebno je upisati sve traene podatke o osobi kojoj je izuzet nesporni uzorak. Izuzeti nesporni uzorak (nakon to je osuen) i obrazac stave se u papirnati omot namijenjen slanju u laboratorij.
Izuzimanje nespornih uzoraka
Nesporni uzorak biolokoga materijala izuzima se od osobe za koju postoji osnovana sumnja da je poinila kazneno djelo, oteene osobe radi utvrivanja njene istovjetnosti, te od lanova obitelji u svrhu utvrivanja istovjetnosti mrtvog tijela. Obvezatno nesporni uzorak biolokog materijala izuzima doktor medicine ili neka druga struna osoba zdravstvene ustanove u nazonosti ovlatenog slubenog djelatnika MUP-a i pod njegovim izravnim nadzorom prema Pravilniku o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline [8] (tablica
7.2.2.4.
Izuzimanje spornih tragova
Sporne tragove pronaene na mjestu dogaaja izuzimaju ovlateni djelatnici MUP-a
148
Tablica 7-3. Vrste, nain izuzimanja, pakiranje i uvanje nespornih uzoraka za DNA-analizu do dostave u laboratorij Vrsta uzorka krv Nain izuzimanja ubodom u jagodicu prsta prikupiti 45 kapi krvi na filtar-papir (FTA-kartica) ili sterilnu gazu iupati s korijenom minimum 15 vlasi kose ili dlaka Pakiranje i uvanje osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osuiti na komadiu bijelog papira, pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij*
kosa ili dlake
bris bukalne sluznice
osoba mora prethodno isprati usnu upljinu osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u labo23 puta s pitkom vodom, a zatim se na za to posebno dizajniran sterilni tapi s visoko ratorij* upijajuim papirom izuzme bris stanica bukalne sluznice otrijim struganjem stijenke usne upljine (68 zahvata na jedan bris). namakanjem filtar-papira ili komadia sterilne gaze u krv veih krvnih ila u dostupnoj tjelesnoj upljini ili prikupiti 45 kapi krvi na filtar-papir (FTA-kartica) iupati s korijenom minimum 15 vlasi kose ili dlaka komadi tkiva veliine 1 cm3 koje nije zahvaeno trulenim promjenama komadi bedrene kosti ili 23 zdrava zuba osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osuiti na komadiu bijelog papira, pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* odmah zalediti i zaleeno dostaviti u laboratorij* odmah zalediti i zaleeno dostaviti u laboratorij*
postmortalni uzorci izuzeti pri obdukciji: krv kosa/dlake tkivo kosti/zubi
*uvjeti adekvatnog naina uvanja i dostave uzoraka/tragova opisani su u daljnjem tekstu
(kriminalistiki tehniari). Hitnost glede pronalaenja tragova silovanja i njihova izuzimanja diktirana je time to bioloki tragovi vrlo brzo postaju identifikacijski nepodobni, posebno ako je mjesto izvrenja kaznenog djela izloeno djelovanju atmosferilija. Vrste spornih tragova, te njihovo izuzimanje, pakiranje i uvanje opisani su u tablici 7-4. Prilikom obavljanja oevida kriminalistiki tehniari moraju nositi sljedeu zatitnu opremu: zatitni jednokratni kombinezon, zatitnu kapu, rukavice za jednokratnu uporabu, specijalne navlake za zatitu obue i jednokratnu zatitnu masku za nos i usta. Koveg za izuzimanje biolokih tragova (slika 7-1) pri oevidu sadrava: popis sadraja kovega
Slika 7-1. Koveg za izuzimanje biolokih tragova na oevidu.
149
upute o nainu izuzimanja tragova rukavice za jednokratnu uporabu kare i skalpele pincete boicu sa 70%-tnim etanolom ili drugim sredstvom za dezinfekciju pribor za pisanje i oznaivanje papirnate omote za corpora delicti kartonske kutijice (perforirane) za suenje izuzetih tragova sterilne vatirane tapie boicu s destiliranom vodom testove za preliminarno dokazivanje prisutnosti kr vi testove za preliminarno dokazivanje prisutnosti sperme
sterilne papirnate tapie za izuzimanje nespornih uzoraka stanica bukalne sluznice FTA-kartice za izuzimanje nespornih uzoraka kr vi jedinstveno oznaene naljepnice s brojevima ili bar-kodovima papirnate vree za zavrno pakiranje corpora delicti.
Sve tjelesne tekuine treba tretirati kao potencijalno infektivne. Bilo kakva ozljeda u obliku otvorene rane na rukama treba biti zatiena vodonepropusnim omotom i rukavicama. Ruke treba prati vrlo esto, a osobito pri poetku i zavretku obradbe jedne cjeline,
Tablica 7-4. Vrste, nain izuzimanja, pakiranje i uvanje spornih tragova za DNA-analizu do dostave u laboratorij Vrsta traga krv, sekret iz nosa, iz plua, slina, sperma s mjesta dogaaja Nain izuzimanja izuzeti iskljuivo sterilnim vatiranim tapiem navlaenim s minimalnom koliinom destilirane vode (ako je trag osuen) nastojei to manje zadirati u podlogu odjeu ili predmete s tragovima osuiti na sobnoj temperaturi i cijele dostaviti to prije izuzeti s podloge iskljuivo na sterilni, navlaeni vatirani tapi nastojei to manje zadirati u podlogu jer ove podloge nepovoljno utjeu na trag Pakiranje/uvanje osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij*
krv, sekret iz nosa, iz plua, ispljuvak, sperma na odjei i predmetima koje je mogue dostaviti u laboratorij krv, sekret iz nosa, iz plua, ispljuvak, sperma na drvenim drkama, letvama, korodiranim dijelovima orua, betonu, asfaltu, cigli, zidovima, gumi, prirodnoj i umjetnoj koi, travi, granju, liu i sl. krv, sekret iz nosa, iz plua, ispljuvak, sperma na podlogama od nehrajueg elika kondom
osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij*
tragove izuzeti ili predmete s tragovima osuiti na sobnoj temperaturi i cijele dostaviti cijeli kondom izuzeti (zajedno s tekuinom koja se u njemu nalazi) i staviti u sterilnu plastinu vreicu, ako u/na kondomu nema tekuine osuiti ga na sobnoj temperaturi
osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* HITNO s mjesta dogaaja (u prijenosnom hladnjaku) dostaviti u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij*
150
Tablica 7-4. Vrste, nain izuzimanja, pakiranje i uvanje spornih tragova za DNA-analizu do dostave u laboratorij Vrsta traga tkiva, organi, kosti Nain izuzimanja prikupiti komadie tkiva, organa ili kostiju u sterilne spremnike, posudice, ili epruvete izuzeti iskljuivo na sterilni, navlaeni vatirani tapi nastojei to manje strugati po koi!!! izuzeti pincetom tako da se kosa i/ili dlake ne otete i da se ne dodiruje korijen kose i/ili dlake. izuzeti s pincetom tako da se ne dodiruje dio filtra koji je bio u kontaktu s usnom upljinom izuzeti na navlaeni vatirani tapi snanim brisanjem dijelova koji su bili u kontaktu s usnom upljinom izuzeti na navlaeni vatirani tapi snanim brisanjem dijelova koji su bili u kontaktu s rukama ili drugim nezatienim dijelovima koe ne izuzimati izuzeti samo ako je naena u posudi; dobro promukati posudu i preliti mokrau u odgovarajuu, sterilnu plastinu boicu mokrau ne izuzimati iz zahodske koljke izuzeti, oistiti od tragova zemlje ili osuiti ako su vlani Pakiranje/uvanje odmah zalediti i zaleeno (u prijenosnom hladnjaku) dostaviti u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osuiti na komadiu bijelog papira, pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij*
krv, slina, sekret iz nosa, iz plua, sperma s tijela osobe kosa i/ili dlake
opuci
tragovi stanica usne upljine s aa, boca i pribora za jelo tragovi epitelnih stanica s hrapavih povrina i otrih rubova predmeta predmeta koji slue iskljuivo za osobnu uporabu feces mokraa
ne dostavljati u laboratorij* uvati u hladnjaku i u prijenosnom hladnjaku dostaviti u laboratorij*
ljudski ostatci (kosti i/ili zubi)
komadi butne (ili druge najdeblje kosti) i 23 zdrava zuba pakirati u papirnate omote, i adekvatno uvati i u prijenosnom hladnjaku dostaviti u laboratorij* osueno pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij* osuenu gumu za vakanje staviti na papir, zamotati i pakirati u papirnati omot i adekvatno uvati do dostave u laboratorij*
tragovi epitelnih stanica ili sluznica sa ileta, aparata za brijanje, etkica za zube, akalica, seksualnih pomagala i sl. tragovi stanica usne upljine s gume za vakanje
ne izuzimati tragove ve predmete dostaviti u laboratorij
ne izuzimati tragove ve predmete dostaviti u laboratorij
*uvjeti adekvatnog naina uvanja i dostave uzoraka/tragova opisani su u daljnjem tekstu
151
prije stanke za objed i na zavretku cjelokupne obradbe.
7.3.
Sprjeavanje kontaminacije prilikom oevida
Zbog osjetljivosti analize DNA nuno je noenje propisane zatitne opreme kao to su zatitni jednokratni kombinezon, zatitnu kapu, rukavice za jednokratnu uporabu, specijalne navlake za zatitu obue i jednokratnu zatitnu masku za nos i usta, kako ne bi dolo do kontaminacije epitelom, slinom, prhuti, kosom i sl. osobe koja izuzima tragove (slika 7-2). Redoslijed oblaenja zatite je sljedei: maska za lice stavlja se pr va, da bi se izbjegla mogua kontaminacija zatitnog odijela ili rukavica, zatim stavljamo kapu, oblaimo jednokratno zatitno odijelo, nazuvke za obuu i na kraju navlaimo rukavice. Pravila struke nalau da se nikad u ruke ne uzimaju dva predmeta ili traga istodobno. Na mjesto dogaaja treba donijeti propisane papirnate omotnice i vree u koje e se spremiti izuzeti tragovi. Ne smije se dopustiti da na bilo koji nain corpora delicti rtve doe u kontakt s corpora delicti osumnjienika. Potrebno je mijenjati rukavice za jednokratnu upotrebu nakon svakog kontakta s corpora delicti, a obvezna je prilikom rukovanja s corpora delicti koji potjee od oteene tj. osumnjiene osobe. Izmeu svakog koritenja pribor (kare, pinceta i ostali pribor) potrebno je dobro obrisati vatom natopljenom 70%-tnim etanolom.
7.3.1.
Slika 7-2. Zatitna oprema za jednokratnu uporabu.
Lijeniki pregled rtve silovanja
S obzirom na to da su dokazi u vezi sa silovanjem osjetljivog i prolaznog karaktera rtvu
treba to prije odvesti u zdravstvenu ustanovu u pratnji policijskih slubenika. Lijenika koji pregledava rtvu policijski slubenici moraju upoznati s onim to znaju o sluaju i to moe biti korisno u pronalaenju i osiguranju materijalnih dokaza na rtvi. Opi pregled sastoji se od podrobnog opisa ozljeda u smislu njihove veliine, naravi i starosti. Ginekoloki pregled rtve ukljuuje pregled bedara i stranjice kako bi se evidentirale eventualne ozljede. Teite ginekolokog pregleda je pregled usmina, djevinjaka, rodnice i ua maternice [7]. Lijenik s pomou medicinskoga kompleta (Paketi A oteena osoba) (slika 7-3) prilagoenoga
152
Slika 7-3. Medicinski kompleti za izuzimanje biolokih tragova pri kaznenom djelu silovanja ili bludnih radnji (Paketi A oteena osoba, Paketi B osumnjiena osoba).
potrebama medicinske obradbe osobe po nalogu policije u sluajevima seksualnih zloina izuzima sljedee: omot 1A nesporni uzorak kr vi na FTA-karticu, omot 2A kosu eljanjem na arak istoga papira s pomou eljia za jednokratnu uporabu, omot 3A stidne dlake eljanjem na arak istoga papira s pomou eljia za jednokratnu uporabu, omot 4A nesporni uzorak stidnih dlaka izuzetih upanjem, omot 5A nesporni uzorak kose upanjem, omot 6A vaginalni, rektalni i oralni bris koji se izuzimaju s pomou sterilnih vatiranih tapia, omot 7A odrezane nokte desne i lijeve ruke (odrezani nokti se pakiraju zasebno u omot 7AL odrezani nokti lijeve ruke i 7AD odrezani nokti desne ruke) i omot XA gaice koje je nosila oteena osoba za vrijeme ili nakon silovanja.
vi, ogrebotine ili iupana kosa [7]. Lijenik s pomou medicinskoga kompleta (Paketi B osumnjiena osoba) (slika 7-3B) prilagoenog potrebama medicinske obradbe osobe po nalogu policije u sluajevima seksualnih zloina izuzima sljedee: omot 1B nesporni uzorak kr vi na FTA-kartici, omot 2B kosu eljanjem na arak istoga papira s pomou eljia za jednokratnu uporabu, omot 3B stidne dlake eljanjem na arak istoga papira s pomou eljia za jednokratnu uporabu, omot 4B stidne dlake upanjem, omot 5B nesporni uzorak kose upanjem, omot 6B bris vanjskoga dijela spolovila koji se izuzima s pomou sterilnog vatiranog tapia i omot 7B odrezane nokte desne i lijeve ruke (odrezani nokti se pakiraju zasebno u omot 7BL odrezani nokti lijeve ruke i 7BD odrezani nokti desne ruke).
7.3.2.
Lijeniki pregled osobe osumnjiene za silovanje
7.3.3.
Uvjeti adekvatnog uvanja uzoraka/tragova
Ako je rtva pruala jak fiziki otpor na tijelu poinitelja mogu se nai ugrizi, podlje-
Suhe uzorke/tragove treba uvati na sobnoj temperaturi bez izravnog izvora Suneve
153
svjetlosti. Osueni uzorci/tragovi ostat e dugotrajno uporabljivi za DNA-analizu ako su pohranjeni u papirnate omote i vree. Navedeno znai da se tragovi koji su vjetaeni metodama konvencionalne serologije i morfologije, prije uvoenja u forenzinu znanost metode analize DNA, mogu ponovo vjetaiti ukoliko su tragovi bili uvani po pravilima struke [9]. Vlane uzorke/tragove najbolje je osuiti u sterilnim suionicima vodei rauna o potencijalnoj kontaminaciji. Ako nemamo takve uvjete onda se corpora delicti sue na sobnoj temperaturi. Dostavljena corpora delicti izuzeta od oteene i osumnjiene osobe ne smiju se suiti u istim prostorijama. Svjee uzorke/tragove svih vrsta tkiva treba odmah zalediti i uvati na 20 C, te ih zaleene dostaviti u laboratorij u prijenosnom hladnjaku. Svakim otapanjem i ponovnim zaleivanjem uzoraka/tragova umanjuje se njihova kakvoa.
izuzeti prilog mora biti pakiran, zalijepljen i obiljeen to je prije mogue. Ne smije se pakirati dva priloga u isti omot ili paketi. Prilozi se oznauju iskljuivo rastuim arapskim brojevima (npr. 1, 1.1, 2, 3 ). Veliina omota mora se prilagoditi veliini corpora delicti. Oteeni i/ili nepravilno pakirani omoti ne e se vjetaiti. Paketi i omoti se zatvaraju iskljuivo uporabom samoljepljivih traka preko kojih se potpisuje slubena osoba koja je izuzimala i pakirala corpora delicti.
7.4.2.
Prijenos corpora delicti u laboratorij
Vozila kojima se prevozi bioloki materijal moraju imati na sebi meunarodni znak upozorenja da prevoze materijal koji je potencijalno opasan. Corpora delicti prevoze se sukladno pravilima struke.
7.5. 7.4.
Sprjeavanje kontaminacije prilikom suenja corpora delicti
Laboratorijsko ispitivanje biolokih tragova
Prikupljena corpora delicti dostavljaju se u Centar za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti.

7.5.1.
Za sprjeavanje kontaminacije radnih povrina na kojima se tragovi sue, pakiraju ili uvaju one se moraju tretirati Plivasept tinkturom za radne povrine (Pliva-Barr), 10 %-tnim natrijevim hipokloritom (varikina) ili 1 M HCl-a.
7.4.1.
Makroskopski pregled corpora delicti
Pakiranje corpora delicti
Prilikom pakiranja vrlo je vano sprijeiti protresanje odjevnih predmeta, posteljine, presvlaka iz auta i dr. Osuena corpora delicti pakira se u oznaeni omot koji se zapeati i ne otvara se do dostave u laboratorij. Svaki
Dokazni materijal sastoji se od biolokih tragova izuzetih s oteene i osumnjiene osobe, te materijalnih dokaza poput kondoma, odjee, posteljine, presvlaka iz auta i drugih tragova ovisno o mjestu gdje je kazneno djelo poinjeno. Makroskopskim pregledom pretrauje se dokazni materijal u svrhu pronalaenja tragova kr vi, sline, sperme, epitelnih stanica, dlaka i kose. Zbog pravilnijeg i breg usmjerivanja
154
istrage, primjenjuju se jednostavne orijentacijske metode (preliminarni testovi) koji mogu s odreenim stupnjem vjerojatnosti pokazati potjee li ispitivana mrlja od kr vi, sperme, sline [10].
Preliminarni testovi
Vrlo je vano prikupiti sve tragove nalik na kosu ili dlake koji se pronalaze na odjei, posteljini, presvlakama iz auta ili drugom dokaznom materijalu. Tragovi sperme ne moraju uvijek biti vidljivi. U takvim sluajevima primjenjuje se ultraljubiasta svjetlost. Izvor ultraljubiastog svjetla moe pomoi u otkrivanju osuenih tragova sperme jer sastojci sperme fluoresciraju. Kemijske probe za utvrivanje prisutnosti sperme temelje se na utvrivanju prisutnosti enzima kisele fosfataze koja se nalazi u spermi u visokoj koncentraciji. Test se s provodi s pomou Phosphatesmo KM-testa njemake tvrtke Macherey-Nagel u sluaju prisutnosti sperme boja testnoga papiria mijenja se iz bi-
jele u ljubiastu. Za utvrivanje prisutnosti hemoglobina rabe se tvorniki pripremljene testne trakice Combur3-Test E njemake tvrtke Roche (slika 7-4). Hemoglobin katalizira oksidaciju indikatora vodikovim peroksidom koji se nalazi u papiriu, a pozitivan rezultat je promjena ute boje testne trake u intenzivno zelenu boju u svega nekoliko sekunda. Pronaeni tragovi izrezuju se i otapaju. Nakon otapanja ponavljaju se preliminarni testovi: Combur3 Test E njemake tvrtke Roche i Phosphatesmo KM-test njemake tvrtke Macherey-Nagel. Otopljeni tragovi testiraju se i Phadebas Amylase-testom tvrtke Pharmacia Diagnostics njemake tvrtke Macherey-Nagel za utvrivanje prisutnosti amilaze u slini, te PSA (za prostatu specifini antigen) testom njemake tvrtke Seratec za utvrivanje prisutnosti sjemene tekuine.
Pregled mikroskopskih preparata

Iz taloga otopljenih uzoraka izrauju se mikroskopski preparati vaginalnog, rektalnog
Slika 7-4. Primjer pozitivne reakcije preliminarnih testova Phosphatesmo KM i Combur3-Test E na gaicama rtve silovanja.
155
i oralnog brisa, te ostalih tragova. Preparati se boje specifinim bojama kako bi vizualizirali stanice i spermije. Stanice se boje PICS (picroindigocarmine) bojom i rezultat je zelenoplavo obojenje stanica, dok se spermatozoidi boje NFR (Nuclear Fast Red) bojom, a rezultat je cr veno obojenje glave spermatozoida. Osim pregleda pripremljenih preparata potrebno je mikroskopski pregledati i prikupljene dlake i vlasi kose (slika 7-5). Dlake i vlasi kose koje imaju puni korijen, dostatne su za analizu kromosomske DNA dok dlake i vlasi kose atrofinog korijena i ulomci bez korijena nisu dostatni za analizu kromosomske DNA. U tom sluaju preostaje jedino morfolokom analizom pokuati obaviti trijau osoba u svrhu iskljuenja istih kao moguih poinitelja. Individualizacija osobe temeljem morfoloke analize nije mogua. Morfoloka vjetaenja ukljuuju makroskopski i mikroskopski pregled kose i/ili dlaka, a prouava se boja, oblik, duljina, prisutnost i stanje korijena, sri, boja pigmenta, granulacija, gustoa,
rasprostranjenost pigmenta i promjer vlasi kose i/ili dlake. Sve te elemente svaki vjetak vidi subjektivno i temeljem toga daje nalaz i miljenje. Nema ni jednog elementa koji je individualno specifian niti se instrumentalno ili kemijski eg zaktno moe izmjeriti ili dokazati. Vrlo je esto praktiki nemogue i iskljuiti vie osoba kao mogue izvore spornih vlasi kose i/ili dlaka jer je za to nuno da sporni trag vlasi kose i/ili dlaka bude obilan te da su zastupljene vlasi kose i/ili dlake s razliitih dijelova glave odnosno tijela. Petnaest vlasi minimalan je broj spornih vlasi kose i/ili dlaka za morfoloko vjetaenje. Iz nekoliko vlasi kose i/ili dlaka nije mogue dati bilo kakvo decidirano miljenje, a najee se radi o jednoj do nekoliko spornih vlasi kose i/ili dlaka pronaenih na mjestu dogaaja. Kako bi morfoloka analiza dala rezultat (ne i potvrdu identiteta) sporni trag vlasi kose i/ili dlaka mora biti obilan, a nesporni uzorak izuzet od osumnjienika na nain da su zastupljene vlasi kose sa svih dijelova glave
Slika 7-5. Mikroskopiranje pripremljenih preparata vaginalnog, rektalnog i oralnog brisa, te spornih vlasi kose i dlaka.
156
u dostatnom broju (po desetak) i to eonog, sljepoonog, tjemenog i dijela zatiljka. Kad se radi o dlakama one bi morale biti izuzete sa svih dijelova tijela na kojima se nalaze (udovi, pod pazuhom, prsa, stidne dlake, lea). Svi uzorci moraju biti zamotani u zaseban bijeli papir s naznakom s kojega dijela glave i/ili tijela su izuzeti i kao odvojeni paketii stavljeni u isti omot s naznakom: nesporni uzorak kose ili dlaka. Nakon mikroskopskog pregleda preparata pristupa se izdvajanju DNA iz stanica.
SDS-softverska verzija 1.1 (Applied Biosystems, Foster City, SAD) prema postupniku proizvoaa uz koritenje QuantifilerTM Human DNA Quantification Kit istog proizvoaa. RT-PCR-a metoda omoguuje praenje sinteze novih kopija DNA ulomaka u stvarnom vremenu njihova nastajanja. Real-Time PCR-metoda temelji se na detekciji i kvantifikaciji fluorescentnog reportera, iji signal raste u izravnoj ovisnosti o poveanju broja kopija produkta u PCR-reakcijskoj smjesi [11].
7.5.3. 7.5.2.
Kvantitativno odreivanje DNA
Umnaanje DNA lananom reakcijom polimerazom
Po zavretku izdvajanja DNA iz tragova krvi, sperme, sline, epitelnih stanica i punih korijena dlaka ili kose pristupa se kvantitativnom utvrivanju DNA u njima (slika 7-6). DNA-molekule izolirane iz tragova kvantitativno se odreuju s pomou Real-Time PCR-a ABI Prism 7000 Sequence Detection System uz
Nakon to se utvrdi koncentracija DNA u uzorcima metodom lanane reakcije polimerazom (PCR prema engl. polimerase chain reaction) umnaa se odreeni slijed DNA pri emu se proizvode milijarde kopija DNA koje su istovjetne poetnom slijedu. Metoda PCR zasniva se na in vitro umnaanju ciljnih sljedova DNA s pomou oligonukleo-
Slika 7-6. Pripreme za kvantitativno utvrivanje DNA u nespornim uzorcima i spornim tragovima RealTime PCR-metodom.
157
tidnih poetnica i uz katalitiko djelovanje termostabilne DNA-polimeraze. Uzorci se umnaaju tako da se reagensi za umnaanje DNA dodaju u sterilne epruvetice u jednoj sterilnoj komori s vertikalnim protokom zraka, dok se uzorci dodaju u drugoj sterilnoj komori s vertikalnim protokom zraka (slika 7-7). Umnaanje DNA izvodi se uporabom AmpFLSTR SGM Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, SAD) na instrumentu GeneAmpPCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, SAD)[12].
7.5.4.
Vizualizacija umnoene DNA metodom kapilarne elektroforeze
Umnoeni produkti, dobiveni PCR metodom, pripremaju se za analizu metodom kapilarne elektroforeze (slika 7-8). Metoda kapilarne elektroforeze temelji se na svojstvu da elektrina struja pod naponom od 12 000 V, uzrokuje migriranje bojom obiljeenih
ulomaka DNA kroz kapilare ispunjene polimerom (set se sastoji od 16 kapilara za analizu ulomaka, ukupna duljina svake kapilare je 36 cm) . Polimer je specijalno izraen za analizu ulomaka s visokom rezolucijom (mikrosatelitna DNA) i naziva se POP4 (prema engl. performance optimized polymer). Ovisno o duljini, ulomci e putovati razliitom brzinom kroz polimer. S obzirom na to da je svaki ulomak obiljeen fluorescentnom bojom, svaka e boja emitirati svjetlost na za nju karakteristinoj valnoj duljini izazvanoj laserom, to e se detektirati na detekcijskom prozoriu. Obavlja se multikomponentna analiza kojom se etiri razliite boje (5-FAM, JOE, NED i ROX) razdvajaju u razliite spektralne komponente. 5-FAM emitira najkrau valnu duljinu koja se detektira kao plava, slijedi JOE zelena, NED uta i ROX cr vena. U svaku elektroforezu obvezno treba ukljuiti i razdvajanje alelnih ljestvi (prema engl. allelic ladder) koji, kako je navedeno u prvom poglavlju, slue za konano oditavanje razdvojenih ulomaka.
Slika 7-7. Priprema uzoraka za umnaanje DNA u sterilnoj komori.
158
Slika 7-8. Laboratorij s instrumentima za kapilarnu elektroforezu.
Elektroferogram dobiven razdvajanjem svih DNA-ulomaka analizira se raunalnim programom koji ih identificira, odreuje visine signala, duljine ulomaka i druge parametre, te ih prezentira grafiki u svakoj boji kojom su obiljeeni. Konano ih program GeneMapper ID softverska verzija 3.2 (Applied Biosystems, SAD) usporeuje s alelima prisutnim u alelnim ljestvama i svakom od ulomaka daje brojanu oznaku, uz mogunost i drugih naina obiljeivanja konanih rezultata [13].
7.5.5.
Rezultati DNA-analize
Nakon razdvajanja umnoenih kratkih ponavljajuih sljedova kapilarnom elektrofo rezom, rezultati se prikazuju grafiki elektroferogramima. U svaku elektroforezu nuno je ukljuiti i razdvajanje alelnih ljestvi koje sadravaju amplificirane sve alele iz svih ukljuenih kratkih ponavljajuih sljedova, koji slue za konano oditavanje razdvojenih ulomaka. Lokusi ukljueni u AmpFLSTR SGM Plus komplet su obiljeeni plavom
(D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338), zelenom (amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51), crnom (D19S433, TH01 i FGA) i cr venom bojom (standard) [13]. Uz svaki set uzoraka obvezne su pozitivna i negativna kontrola. Jedan signal (pik) u genetikom lokusu oznauje da je osoba za promatrani lokus homozigot, dok dva signala (pika) oznauju da je osoba za promatrani lokus heterozigot. Brojevi dodijeljeni svakom alelu oznauju broj ponavljanja kratkih ponavljajuih sljedova u odreenom genetikom lokusu za pojedini alel. Kao primjer, prikazani su rezultati dobiveni DNA-analizom nespornih uzoraka i spornih tragova izuzetih od rtve i poinitelja u kaznenom djelu silovanja (slike 7-9. do 7-12.). Kao to je vidljivo iz elektroferograma (slika 7-12) u spermalnoj frakciji spornoga traga izuzetog s vaginalnog brisa oteene osobe amplificirani su i identificirani navedeni aleli koji ine DNA-profil muke osobe a u potpunosti se podudara s alelima identificiranim u nespornom uzorku kr vi osumnjiene osobe (slika 7-10.), dok se DNA-profil identificiran
159
Slika 7-9. Elektroferogram koji prikazuje DNA-profil oteene osobe. Ordinata oznauje jakost fluorescencije boje kojom je obiljeena umnoena DNA, dok apscisa oznauje veliine ulomaka izraene u baznim parovima.
Slika 7-10. Elektroferogram koji prikazuje DNA-profil osumnjiene osobe. Ordinata oznauje jakost fluorescencije boje kojom je obiljeena umnoena DNA, dok apscisa oznauje veliine ulomaka izraene u baznim parovima.
Slika 7-11. Elektroferogram koji prikazuje DNA-profil oteene osobe (identificiran u epitelnoj frakciji vaginalnog brisa oteene osobe). Ordinata oznauje jakost fluorescencije boje kojom je obiljeena umnoena DNA, dok apscisa oznauje veliine ulomaka izraene u baznim parovima.
160
Slika 7-12. Elektroferogram koji prikazuje DNA-profil osumnjiene osobe (identificiran u spermalnoj frakciji vaginalnog brisa oteene osobe). Ordinata oznauje intenzitet fluorescencije boje kojom je obiljeena umnoena DNA, dok apscisa oznauje veliine ulomaka izraene u baznim parovima.
u epitelnoj frakciji spornog traga izuzetog s vaginalnog brisa oteene osobe (slika 7-11.) u potpunosti podudara s alelima identificiranim u nespornom uzorku kr vi osumnjiene osobe (slika 7-9.).
7.5.6.
Izraunavanje uestalosti genotipa na temelju rezultata analize DNA
Kako bi se interpretiralo znaenje podudarnosti DNA-profila meu genetiki tipiziranim uzorcima vano je znati distribuciju koritenih alela u svakom genetikom lokusu u populaciji. DNA-laboratorij Centra za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, MUP-a Republike Hrvatske primjenjuje vlastitu populacijsku studiju provedenu na 200 mladih, zdravih osoba iz hr vatske populacije koje nisu u srodstvu, a u kojoj su sadrane frekvencije alela genetikih lokusa AmpFLSTR SGM Plus sustava. Ako se DNA-profil dokaznog materijala (spornog uzorka) razlikuje od DNA-profila osumnjiene osobe (nesporni uzorak) tada
osumnjienu osobu iskljuujemo kao donora dokaznog materijala koji je analiziran. Iskljuenje je neovisno o frekvenciji dvaju genotipova u populaciji. Ako osumnjienik i sporni trag imaju isti DNA-profil tada se osumnjienik ukljuuje kao mogui izvor biolokoga materijala u tragu. Vjerojatnost da bi se neka druga osoba, koja nije u srodstvu s osumnjienikom, mogla ukljuiti kao mogui izvor istog biolokog traga izraunava se uestalou DNA-profila u populaciji iz koje osumnjienik potjee. Usporedbom DNAprofila dobivenog analizom traga povezanoga s kaznenim djelom i genotipa osobe koju se sumnjii za poinjenje kaznenoga djela u sluaju potpune podudarnosti moemo rei da trag potjee od osumnjienika. Naime, statistikim izraunom uz prethodno poznavanje uestalosti alela svakog analiziranoga genetikog lokusa u promatranoj populaciji dolazimo do broja od ~ 1014. Toliko iznosi prosjena uestalost DNA-profila osobe nakon analize 10 razliitih genetikih lokusa koji su sadrani u AmpFLSTR SGM Plus sustavu. Znaenje rezultata je gotovo jednoznano u promatranoj populaciji moralo bi ivjeti 1014
161
osoba da bi postojala eventualna mogunost pronalaska druge osobe istoga genotipa (to se ne odnosi na jednojajane blizance koji imaju identian DNA-profil). Statistiki izraun u sluajevima mijeanog DNA-profila puno je sloeniji. U sluajevima utvrivanja biolokog oinstva u kaznenim djelima rodoskvrnua potrebno je ukljuiti vie od 10 genetikih lokusa jer se radi o roacima po kr vi u ravnoj lozi ili bratu/sestri [14]. Da bi se dobila potvrdna informacija o pravilnom pristupu radu i tonosti rezulta-
ta rada, u predmetima vjetaenja biolokih tragova, a koje obavlja Centar za kriminalistika vjetaenja Ivan Vueti, provodi se meunarodna kontrola kvalitete rada. Laboratorij za analizu DNA ukljuen je u meunarodnu interlaboratorijsku kontrolu rada u organizaciji GEDNAP-a (German DNA Profiling Group Stain Commission). Sve dosadanje kontrole ispitivanja i vjetaenja dostavljenih uzoraka u Centru su provedene sa 100%-tnom tonou, a to upuuje na sigurnost rezultata rada ovog laboratorija.
Literatura
1. Pavii-Vei, Kazneni zakoni Roini prirunik, Zagreb 2006. 2. Zakon o izmjenama i dopunama Kaznenog zakona (Narodne novine br. 105/2004) 3. Pavii-Vei, Komentar Kaznenog zakona, Zagreb 1998. 4. Medicinska enciklopedija, Dopunski svezak, Zagreb, 1974. 5. Spolne radnje izjednaene sa spolnim odnoajem kod kaznenih djela protiv spolne slobode i spolnog udorea, tiskano u povodu seminara na temu: Konani prijedlog Zakona o izmjenama i dopunama Kaznenog zakona, Organizator, Zagreb, 2003. 6. Gorki S. Medicinska kriminalistika. Privredna tampa, Beograd 1981. 7. Modly D. Metodika istraivanja silovanja, Ministarstvo unutarnjih poslova Republike Hrvatske, Zagreb 1996. 8. Pravilnik o nainu uzimanja uzoraka biolokog materijala za analizu deoksiribonukleinske kiseline (Narodne novine br. 107/99). 9. Jurkovi K, Jurii I, Mri G. Vrednovanje DNA analize u predmetima vjetaenja prije uvoenja DNA tehnologije. Policija i sigurnost br. 1-2/04. 10. Lee HC. Materijalni tragovi. Ministarstvo unutarnjih poslova Republike Hrvatske, Zagreb 1998. 11. QuantifilerHuman DNA Quantification Kit, Users Manual, 2003. 12. AmpFLSTR SGM Plus PCR Amplification Kit, Users Manual, 1999. 13. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers, User Bulletin, 2005. 10. Macan M, Uvodi P, Botica V. Paternity testing in case of brother-sister incest. Croat Med J 2003; 44(3): 347-349.
162
8.
Sadraj poglavlja
8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5. 8.6. 8.7.
Bioterorizam i forenzina mikrobiologija

Alemka Markoti i James W. LeDuc
Definicije . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Povijest bioterorizma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Klasifikacija specifinih uzronika koji se mogu primijeniti u bioterorizmu. . . . . . . . . . . . . 164 Orua u forenzinoj mikrobiologiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Kriteriji za proglaavanje epidemije neuobiajenom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 Sumnjive epidemije zaraznih bolesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Biosigurnost i biozatita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
8.1.
Definicije
Bioterorizam podrazumijeva uporabu mikroorganizama ili njihovih toksina s nakanom ozljeivanja, razbolijevanja ili ubijanja ljudi ili ivotinja, zbog osobnih, politikih ili socijalnih razloga [1]. Forenzina mikrobiologija relativno je nova znanstvena disciplina koja se primjenjuje za analizu moguih bioteroristikih napada ili nenamjernih oslobaanja mikroorganizama i njihovih toksina [2].
8.2.
Povijest bioterorizma
Iako imamo dojam da je bioterorizam zlo novog doba, to definitivno nije izum moder-
noga svijeta. Jo u 6. stoljeu prije Krista Asirci su otrovali izvor svojih neprijatelja sa snijeti, a atenski zakonodavac Solon otrovao je vodu emerikom, biljnim purgativom, tijekom opsade Krisse. Tijekom pomorske bitke (184. g. prije Krista) protiv kralja Eumenesa iz Pergamona Hanibalove su snage gaale neprijatelja posudama punima zmija i pobijedile u bitci [3]. U 14. stoljeu tijekom opsade Kaffe tatarska je vojska katapultirala tijela umrlih od kuge preko gradskih zidova i prisilila obranu na predaju. Tijekom rata izmeu Francuza i Indijanaca (1767.) engleski general Sir Jeffrey Amherst dao je Indijancima lojalnima francuskim snagama deke kontaminirane virusom velikih boginja. Epidemija je desetkovala plemena, a Britanci su uspjeno napali Ft. Carillon [23]. Tijekom Pr voga svjetskog rata Nijemci su pokuali proiriti koleru u
163
163
Italiji, kugu u Petrogradu, a bacali su i bioloke bombe nad Britanijom. Dr. Anton Dilger, Nijemac koji je ivio u Americi, uz potporu njemake vlade uzgojio je kulturu Bacillus anthracis i Pseudomonas mallei u svojem domu u Washingtonu D. C. Uzronici su raspreni uz pomo nekoliko lukih radnika u Baltimoru, te je inficirano 3 000 konja, mula, i goveda namijenjenih saveznicima u Europi. Pretpostavlja se da je nekoliko stotina trupa bilo pogoeno tim uzronicima [3]. Na dan 17. lipnja 1925. bioloko je oruje zabranjeno enevskim protokolom. To je pr vi multilateralni sporazum koji je zabranu s kemijskih proirio i na bioloke agense. Tijekom Drugoga svjetskog rata, Japanci su proirili kugu u Chuhsienu, to je rezultiralo smru 21 osobe (1940.), a g. 1941. Britanci su na kotskoj obali eksperimentirali s antraksom [34]. U blioj povijesti, 1972., lanovi desnoga krila Reda izlazeeg Sunca u posjedu su imali 3040 kg kultura uzronika tifusa, kojima su planirali kontaminirati vodovode u Chicagu, St. Loisu, i u drugim gradovima srednjeg Zapada u Sjedinjenim Amerikim Dravama (SAD) [3]. Iste godine, 103 nacije potpisale su Konvenciju o biolokom oruju (Konvencija o zabrani razvoja, proizvodnje i gomilanja bakterijskog i toksinskog oruja i o njihovu unitenju). Bugarskom disidentu Georgiju Markovu je 1978. u Londonu utrcan ricin s pomou specijalno napravljenog kiobrana, te je umro tijekom nekoliko dana [23]. U Tokiju su 1995. naena tri kovega dizajnirana za oslobaanje botulinskog toksina u podzemnoj eljeznici. U Zadru je 1999. kradljivac pokuao orobiti mjenjanicu prijetei pricom koja je navodno sadravala HIV kao oruje [3]. Tijekom 2001. na adrese nekoliko medija, kao i amerikih senatora, bila su poslana pisma sa sporama antraksa [510]. Postoje brojni drugi vie ili manje poznati primjeri, a neki od njih bit e opisani u dijelu o sumnjivim epidemijama zaraznih bolesti.
8.3.
Klasifikacija specifinih uzronika koji se mogu primijeniti u bioterorizmu
Ameriki centri za kontrolu bolesti (Centers for Disease Control and Prevention CDC) sve su mikroorganizme koji bi se potencijalno mogli rabiti u bioteroristike svrhe klasificirali u tri kategorije [1]. A-kategorija antraks (Bacillus anthracis), botulizam (Clostridium botulinum toxin), kuga (Yersinia pestis), velike boginje (Variola major), tularemija (Francisella tularensis), virusne hemoragijske vruice (filovirusi npr., Ebola, Marburg, i arenavirusi npr., Lassa, Machupo) bioloki uzronici koji se lako mogu diseminirati ili prenijeti s osobe na osobu, rezultiraju visokim mortalitetom i imaju veliki javnozdravstveni uinak, mogu izazvati paniku i socijalne poremeaje i zahtijevaju specijalne akcije i javnozdravstvenu pripravnost. B-kategorija bruceloza (Brucella species), epsilon-toksin (Clostridium perfringens), uzronici koji mogu kontaminirati hranu (npr., Salmonella species, Escherichia coli O157:H7, Shigella), sakagija (Burkholderia mallei), melioidoza (Burkholderia pseudomallei), psitakoza (Chlamydia psittaci), Q-vruica (Coxiella burnetii), toksin ricin iz Ricinus communis, stafilokokni enterotoksin B, epidemijski tifus (Rickettsia prowazekii), virusni encefalitisi (alfavirusi npr. venezuelski konjski encefalitis, istoni konjski encefalitis, zapadni konjski encefalitis), uzronici koji mogu kontaminirati vodu (npr. Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum) bioloki uzronici koje je srednje lako diseminirati, rezultiraju srednjom stopom morbiditeta i niskom stopom mortaliteta te zahtijevaju specijalna poboljanja dijagnostikih kapaciteta kao i nadzora bolesti.
164
C-kategorija emergentne zarazne bolesti (npr. virus Nipah i hantavirusi) bioloki uzronici koji ukljuuju emergentne patogene koji se mogu prirediti za masovnu diseminaciju u budunosti zbog dostupnosti, lake proizvodnje i diseminacije, a potencijalno mogu uzrokovati visoke stope morbiditeta i mortaliteta, te veliki zdravstveni ok. Neke osnovne injenice o inkubaciji, putevima prijenosa, opim simptomima i znakovima, lijeenju i cjepivima za specifine uzronike koji se mogu primijeniti u bioterorizmu prikazane su u tablici 8-1.
8.4.
Orua u forenzinoj mikrobiologiji
Zahvaljujui modernoj tehnologiji i golemom porastu informacija i znanja o molekularnoj biologiji mikroorganizama danas moemo kreirati bazu poput DNA otisaka prsta za patogene uzronike, odnosno jedinstvenu identifikaciju uzronika. Da bismo te informacije uinkovito iskoristili na sudu i dobili vie podataka o biolokom materijalu uporabljenom u bioteroristikom napadu, potrebno je kombinirati razliite discipline kao to su: mikrobiologija, zarazne bolesti u medicini openito, populacijska genetika, kemija, fizika, statistika i raunalne znanosti. Identifikacija osoba koje su skrivile bioteroristiki napad namjerno ili zbog nepanje zahtijeva rigoroznu uporabu modernih mikrobiolokih analitikih metoda i orua, tradicionalnu forenzinu analizu i obradbu, DNA-testiranje, uzimanje otisaka prstiju i sl. [2]. Za uspjenu identifikaciju sumnjivih uzronika vano je imati standardizirane laboratorijske procedure za uspjenu ekstrakciju RNA/DNA, metode tipizacije DNA i odgovarajue kontrole te iscrpnu dokumentaciju. Preduvjet uspjene detekcije mikroorganiza-
ma jesu odgovarajui uzorci, pravilno prikupljeni, oznaeni i transportirani. Popis uzoraka i molekularnobiolokih tehnika za detekciju specifinih agensa koji se mogu primijeniti u bioterorizmu prikazani su u tablici 8-2. Kao to moemo vidjeti, za detekciju esto nije dovoljan samo kliniki materijal nego je esto potrebno uzeti uzorke od ivotinja ili iz okolia. Protokoli za izdvajanje DNA iz nekih ljudskih uzoraka ne moraju u potpunosti biti prikladni za uspjeno izdvajanje uzoraka iz okolia: koliina izolata moe biti mala, a inhibitori PCR-a ne moraju biti pravilno uklonjeni. Razliite, na analizi DNA bazirane tehnologije potrebne su za identifikaciju specifinih uzronika koji se rabe u bioterorizmu. Neke od njih navedene su u tablici 8-2. Openito, DNA-tehnologija za identifikaciju mikroorganizama koji se primjenjuju u bioterorizmu ukljuuje: sekvenciranje, sekvenciranje 16S rRNA, tehnike mikroipova, ukljuujui mikroip-analizu patogenosti, karakterizaciju polimorfizma pojedinanih nukelotida (single-nucleotide polymorphism SNP), razliit broj uzastopno ponovljenih analiza, te takoer vane tehnike u karakterizaciji gena odgovornih za rezistenciju na antibiotike. Laboratoriji takoer moraju moi identificirati mikroorganizme promijenjene biolokim inenjerstvom, te sa sigurnou razlikovati bioteroristike napade od prirodnih epidemija. Za identifikaciju toksina danas su dostupne razliite metode: razliiti imunoeseji proizvedeni rekombinantnom tehnologijom, biofunkcionalni eseji, eseji bazirani na proteinima i peptidima, masivna spektrometrija i na DNA bazirani eseji. Osim toga, za konanu detekciju i identifikaciju mikroorganizama, a takoer i osoba ukljuenih u bioterorizam, vane su brojne druge metode: metode klasine detekcije i identifikacije, odgovarajue baze podataka i informacije s terena, pohranjivanje uzroni-
165
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] A-kategorija Antraks (Bacillus anthracis) inkubacija nain prijenosa nekoliko sati do sedam dana zoonoza; goveda ili druga stoka inficirana sporama iz zemlje prenose infekciju ljudima; prijenos kontaktom, ingestijom, aerosolom; prijenos s osobe na osobu (meuljudski prijenos) vrlo je rijedak; predmeti i zemlja kontaminirani sporama ostaju infektivni desetljeima koni oteklina, ulceracija, crni prit zacjeljuje spontano tijekom 12 tjedna (80% sluajeva) pluni edemski faktor (EF), protektivni antigen (PA) i letalni faktor (LF) uzrokuju oteklinu i nekrozu u sredoprsju i pluima; septikemija i smrt unutar 25 dana gastrointestinalni letalna oteklina crijeva parenteralno penicillin, ciprofloksacin, doksiciklin cijepljenje titi protiv invazivnog oblika bolesti, preporuuje se samo za visokorizinu populaciju Botulizam (Clostridium botulinum toksin) inkubacija nain prijenosa 1236 sati sporogeni obvezno anaerobni bacil koji producira toksin u nepravilno obraenoj, konzerviranoj hrani niske kiselosti ili lunatosti ili u nedovoljno kuhanoj hrani; spore su este u zemlji i mogu kontaminirati hranu, ukljuujui i med toksin blokira oslobaanje acetilkolina i inter ferira s prijenosom signala za miinu kontrakciju (bolne flakcidne paralize, primarno su oteeni gutanje, vid i govor, te disanje sa smrtnim ishodom do 10%) trovalentni konjski serum koji sadrava antitoksin A, B i E; simptomatsko lijeenje; po potrebi smjetaj u jedinicama intenzivne skrbi uz mehaniku ventilaciju ako je potrebno, kod inficiranih rana primijeniti penicillin ili metronidazol parenteralno pentavalentni (ABCDE) toksoid, 3 doze; 100% uinkovit pri 25250 LD50 u primata Kuga (Yersinia pestis) inkubacija nain prijenosa 17 dana crna smrt srednjega vijeka; rezultat kontakta izmeu ljudi i umskih glodavaca, ali takoer moe inficirati domae ljubimce i njihove buhe (Xenopsylla cheopis); mogu meuljudski prijenos preko Pulex irritans (Juna Amerika, podruje Anda); sekundarna pluna kuga nastaje kao rezultat kapljine infekcije koja se prenosi meuljudski epidemije razorne snage bubonska kuga inflamirani, oteeni i bolni limfni vorovi (ingvinalno podruje 90%), vruica, moe progredirati u septikemiju s diseminacijom u krv s 50 do 60%-tnim letalitetom u nelijeenih bolesnika pluna kuga sekundarna upletenost plua (diseminacija krvlju) pneumonija s medijastinitisom ili pleuralnim efuzijama nakon meuljudskog prijenosa primarna pluna ili drijelna kuga; visoka stopa mortaliteta u plune kuge
osnovni znakovi/ simptomi
lijeenje* cijepljenje
osnovni znakovi/ simptomi lijeenje*
cijepljenje
166
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] lijeenje* cijepljenje streptomicin, tetraciklin, kloramfenikol suspenzija mrtvih (formalinom inaktiviranih uzronika) Yersinia pestis; potrebna su precizna kontrolna istraivanja; najmanje dvije cijepljene osobe dobile su plunu kugu nakon ekspozicije Y. pestis Velike boginje (variola major) inkubacija nain prijenosa 717 dana meuljudski prijenos kapljinim putem na osjetljivu osobu tijekom bliskog kontakta s bolesnikom (licem u lice); bolesnici s velikim boginjama najzarazniji su tijekom prvoga tjedna bolesti; odreen rizik prijenosa traje dok sve kraste ne otpadnu; prijenos zrakom i izluinama inicijalni simptomi visoka temperatura, malaksalost, glavobolja i bol u leima; karakteristian osip koji se razvija u 23 dana (najvie izraen na licu, rukama i nogama), poinje crvenim ravnim lezijama koje se zatim ispunjaju gnojem te se poetkom drugoga tjedna razvijaju kraste koje se odvajaju i otpadaju nakon 34 tjedna. Smrt nastupa u do 30% sluajeva. (http://www.bt.cdc.gov/agent/ smallpox/diagnosis/pdf/spox-poster-full.pdf ) simptomatska terapija dva cjepiva podrijetlom iz telee limfe, Dryvax (Wyeth Laboratories Inc., Marietta, Pennsylvania) i Aventis Pasteur cjepivo (Swiftwater, Pennsylvania); novoproizvedena cjepiva u Acambis/Baxter Pharmaceuticals (Cambridge, Massachusetts) jo u fazi ispitivanja; mogue je cijepljenje nakon ekspozicije, ali prije pojave bolesti; razvoj antivirotika specifinih protiv ortopoksvirusa za sada zvui obeavajue Tularemija (Francisella tularensis) inkubacija nain prijenosa 114 dana ubodima lankonoaca krpelji, buhe, komarci; rukovanjem ili ingestijom nedovoljno kuhanoga zaraenog mesa, pijenjem kontaminirane vode, inhalacijom praine iz kontaminirane zemlje, ita ili sijena oteeni i bolni limfni vorovi, oteene i bolne oi, grlobolja sa suhim kaljem i progresivnom slabou. Vanjski oblici: ulceroglandularni, glandularni, okuloglandularni, tonziloglandularni; unutarnji oblici: pluni, tifoidni, abdominalni. streptomicin ili gentamicin parenteralno, u lakim oblicima tetraciklin i doksiciklin, kod meningitisa kloramfenikol ivo atenuirano cjepivo Virusne hemoragijske vruice uzrokovane filovirusima (npr. Ebola, Marburg) inkubacija nain prijenosa Ebola virus: 221 dan Marburg virus: 39 dana meuljudski prijenos izravni kontakt s inficiranom krvlju, sekretima, organima i spermom; este nozokomijalne infekcije; visoki rizik pri izravnom kontaktu s akutnim bolesnicima ili tijelima umrlih s mortalitetom od 50 do > 80% (oko 90% u nekim epidemijama); rezervoar nepoznat
osnovni znakovi/ simptomi lijeenje* cijepljenje
167
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] osnovni znakovi/ simptomi lijeenje* cijepljenje za ivot opasne infekcije koje zahvaaju brojne organe, s vruicom, simptomima vezanima uz sredinji ivani sustav (SS), krvarenjima na multiplim mjestima, veinom sluznicama simptomatska terapija cijepljenje je bilo 100%-tno uinkovito u zatiti jedne skupine majmuna; bazirano na rekombinantnim cjepivima s virusima vezikularnog stomatitisa ili adenovirusa koji nose povrinske proteine Ebole; u ljudi za sada nisu zabiljeeni uspjesi. Virusne hemoragijske vruice uzrokovane arenavirusima (npr., Lassa, Machupo) inkubacija nain prijenosa 621 dan rezervoar/domain arenavirusa glodavci; glodavci izluuju virus mokraom, a infekcija nastaje izravnim kontaktom s kontaminiranim predmetima ili hranom kontaminiranom izluinama, te preko rana i posjeklina; meuljudski prijenos izravni kontakt sa zaraenom krvlju, sekretima, organima, spermom; este nozokomijalne infekcije za ivot opasne infekcije koje zahvaaju brojne organe i ukljuuju vruicu, retrosternalni bol, grlobolju, bol u leima, kaalj, bol u trbuhu, povraanje, proljev, konjunktivitis, oteklinu lica, proteinuriju i krvarenja iz sluznica; neuroloki problemi (gubitak sluha, tremor i encefalitis) sa smrtnou od 30 do 50% simptomatska terapija; iv. ribavirin moe uvjetno reducirati mortalitet ako se primijeni do sedmog dana od poetka bolesti ivo atenuirano cjepivo za Lassa-vruicu napravljeno je reasortmanom virusa Lassa i Mopeia; za sada nema uinkovitih cjepiva za ljude. Jedini pozitivan primjer jest uspjena primjena cjepiva u Argentini protiv argentinske hemoragijske vruice uzrokovane virusom Junin. B-kategorija Bruceloza (Brucella species) inkubacija nain prijenosa 560 dana kontakt s tkivima, krvlju, mokraom, vaginalnim izluinama, abortiranim fetusom i osobito placentom goveda (kroz oteenja koe); ingestija sirovog, kontaminiranog, nepasteriziranog mlijeka ili sira od inficiranih ivotinja; nema meuljudskoga prijenosa simptomi su sistemni i nespecifini, s vruicom, znojenjem, glavoboljom, anoreksijom, bolom u leima, gubitak tjelesne mase je est; kronini oblik bolesti moe imitirati milijarnu tuberkulozu sa supurativnim lezijama u jetrima, slezeni i kostima; mortalitet je do 5% u nelijeenih bolesnika tetraciklin + streptomicin ili doksiciklin + rifampin; djeca kotrimoksazol + gentamicin, neurokomplikacije doksiciklin + kortimoksazol + rifampin nema cjepiva za ljude; godine 1996. uveden je tip RB51, B. abortus kao ivotinjsko ivo atenuirano cjepivo
168
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] Epsilon-toksin Clostridium perfringens inkubacija nain prijenosa osnovni znakovi/ simptomi 822 sata epsilon-toksin vjerojatno se prenosi kontaminiranom hranom, vodom ili aerosolom epsilon-toksin jedan od 12 proteina, toksina koje proizvodi Clostridium perfringens, gram-pozitivni, anaerobni sporogeni tapi; toksin ima sposobnost stvaranja pora u stanicama; uzrokuje gubitak kalija i tekuine iz stanice; vrlo je malo informacija o djelovanju epsilon-toksina na ljude; ekstrapolacija iz istraivanja sa zaraenim pokusnim ivotinjama govori o moguoj pojavi neurolokih simptoma, kao i plunog edema simptomatska terapija, hiperimuni serum moe biti koristan ako je dan brzo nakon ekspozicije nema Uzronici koji se prenose hranom (npr. Salmonella species, Escherichia coli O157: H7, Shigella) inkubacija Salmonella: 672 sata E. coli O157:H7: 38 dana Shigella: 13 dana kontaminiranom hranom koja moe imati normalan miris i izgled; prijenos nedovoljno kuhanom ili sirovom hranom kontaminiranom ovim patogenima; meuljudski prijenos ako su higijenske prilike loe, prljavim rukama, osobito meu malom djecom koja jo nisu nauena na uporabu zahoda s vruicom ili bez nje, abdominalni grevi, esto s krvavim proljevom (dizenterija) simptomatska terapija; po potrebi kotrimoksazol, ciprofloksacin, kloramfenikol, ceftriakson, amoksicilin, ne davati terapiju pri infekciji E. coli O157:H7 (rizik pojaanog oslobaanja toksina i razvoja hemolitiko-ureminog sindroma) Ty21a (Vivotif Berna, Swiss Serum and Vaccine Institute); ViCPS (Typhim Vi, Pasteur Merieux) za trbuni tifus Sakagija (Burkholderia mallei) inkubacija nain prijenosa 15 dana kontakt sa ivotinjama, zabiljeeni su pojedinani sluajevi meuljudskoga prijenosa (dva mogua prijenosa seksualnim putem i nekoliko lanova obitelji koji su skrbili o bolesniku) lokalizirana gnojna infekcija koe, plune infekcije, bakterijemije i kronine supurativne infekcije koe; opi simptomi vruica, bolovi u miiima, bolovi u prsima, glavobolja, jako suzenje oiju, fotofobija i proljev tetraciklin, ciprofloksacin, streptomicin, novobiocin, gentamicin, imipenem, ceftazidim, sulfonamidi nema
nain prijenosa
osnovni znakovi/ simptomi Lijeenje*
cijepljenje
169
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] Melioidoza (Burkholderia pseudomallei) inkubacija nain prijenosa dva dana do godinama inhalacijom praine, pijenjem kontaminirane vode, kontaktom s kontaminiranom zemljom osobito preko ogrebotina na koi, u vojnika kontaminacijom ratnih rana, meuljudski je prijenos takoer mogu akutna lokalizirana infekcija: vor; mogu se pojaviti vruica i bolovi u miiima; pluna infekcija: blagi bronhitis do teke pneumonije; est je bol u prsima; neproduktivni ili produktivni kaalj s normalnim sputumom. Akutna bakterijemija: obino su u podlozi druge bolesti HIV, zatajenje bubrega i dijabetes; obino rezultira septinim okom; respiracijskim distresom, tekom glavoboljom, vruicom, proljevom, razvojem gnojnih lezija na koi, bolovima u miiima i dezorijentacijom. Kronina supurativna infekcija ukljuuje razliite organe (zglobove, limfne vorove, kou, mozak, jetra, plua, kosti i slezenu). imipenem, penicilin, doksiciklin, amoksicilin-klavulanska kiselina, azlocilin, ceftazidim, tikarcilin, ceftriakson, aztreonam nema Psitakoza (Chlamydia psittaci) inkubacija nain prijenosa 14 tjedna inhalacija uzronika u sasuenim kapljicama, sekretima i praini iz kaveza inficiranih ptica, no takoer i guske i golubovi mogu biti rezervoari; rijedak je meuljudski prijenos malaksalost, vruica, glavobolja, osip, zimica i katkad pneumonija doksiciklin, azitromicin, kinoloni nema Q-vruica (Coxiella burnetii) inkubacija nain prijenosa 23 tjedna velik broj C. burnetii izluuje se u reproduktivnim tekuinama i placentama inficiranih ivotinja; infekcija u ljudi inhalacija uzronika sitnim kapljicama ili inhalacijom u seoskim dvoritima kontaminiranim uzronikom C. burnetii. Infekcija ingestijom kontaminiranih mlijenih proizvoda; prijenos ubodom krpelja ili meuljudski prijenos su rijetki. iznenadna pojava visoke temperature, jake glavobolje, konfuzije, grlobolje, neproduktivnog kalja, munine, povraanja, proljeva, bola u trbuhu i prsima, te pneumonija; moe se pojaviti i gubitak tjelesne mase. Kronina Q-vruica koja je karakterizirana infekcijom, a perzistira dulje od est mjeseci rijetka je, ali mnogo ozbiljnija bolest. U bolesnika koji su imali akutnu bolest moe se razviti kronini oblik unutar jedne godine, ali i 20 godina nakon inicijalne infekcije s ozbiljnim komplikacijama endokarditis s visokom smrtnou (65%). doksiciklin, azitromicin
lijeenje*
170
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] cijepljenje cjepivo za ljude razvijeno i uspjeno se primjenjuje u Australiji; prije cijepljenja cjelostaninim cjepivom, osoba mora proi koni test koji pokazuje moguu prethodnu ekspoziciju C. burnetii Stafilokokni enterotoksin B inkubacija nain prijenosa 312 sati ingestija hrane koja sadrava toksin (kontaminirano mlijeko i mlijeni proizvodi); izvor veinom osobe koje rukuju hranom gnojne izluine (inficirani prst, oko, apsces, nazofaringealni sekret) iznenadna pojava visoke tempertaure, zimica, glavobolja, mijalgije, neproduktivni kaalj, kratak dah uz retrosternalni bol, munina, povraanje i proljev simptomatska terapija nema Epidemini pjegavac (Rickettsia prowazekii) Inkubacija nain prijenosa 12 tjedna preko Pediculus humanus corporis (tjelesna u) inficiraju se sisanjem krvi bolesnika s akutnom boleu; mogu se takoer inficirati sisanjem krvi bolesnika s Brill-Zinsserovom boleu; ljudi se inficiraju utrljavanjem zgnjeenih uiju ili njihova fecesa na mjestu uboda i abrazije koe glavobolja, zimica, klonulost, vruica i opi algiki sindrom; makularni osip prelazi u petehije ili hemoragije, zatim nastaju smeasto pigmentirana podruja; este su promjene mentalnoga statusa s delirijem i komom; toksemija, zatajenje srca i bubrega; smrtnost izmeu 10 i 40% meu nelijeenim bolesnicima tetraciklin, doksiciklin, kloramfenikol nema Virusni encefalitisi (alfavirusi npr. venezuelski konjski encefalitis, istoni konjski encefalitis, zapadni konjski encefalitis) inkubacija nain prijenosa venezuelski konjski encefalitis: 16 dana istoni konjski encefalitis: 515 dana ubod inficiranog komarca; virusi se odravaju u ciklusu glodavac ili ptica-komarac; ciklus takoer ukljuuje konje (iako katkad konji mogu biti krajnji i definitivni domain) visoka temperatura, povraanje, ukoen vrat, pospanost, generalizirani periorbitalni i edemi lica; pareze; znatna oteenja autonomnih funkcija (oteenje respiracijske funkcije ili hipersalivacija) s mortalitetom izmeu 0,3 i 60%; neuroloke sekvele u preivjelih; kognitivna oteenja simptomatska terapija samo u istraivake svrhe Uzronici koji se prenose vodom (npr. Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum) inkubacija kolera: 4 h5 dana kriptosporidioza: 112 dana
171
Tablica 8-1. Osnovne injenice o specifinim uzronicima koji se mogu primijeniti u bioterorizmu [1, 1119] nain prijenosa ingestija vode i hrane kontaminirane fekalijama, ukljuujui i vodu progutanu tijekom plivanja; izloenost fekalijama oneienom okoliu i povrinama i fekalno-oralnim putem s ovjeka na ovjeka iznenadno povraanje, distenzija abdomena, glavobolja, bol, blaga vruica ili bez vruice, praeni profuznim vodenim proljevom poput riine sluzi, dehidracijom, hipovolemijom i okom. Simptomi mogu biti blai u kriptosporidoze doksiciklin, ciprofloksacin za koleru; simptomatska terapija za kriptosporidozu. postoji cjepivo protiv kolere ne preporuuje se zbog ogranienog uinka; nema cjepiva protiv kriptosporidioze C-kategorija Emergentne zarazne bolesti uzrokovane npr. virusom Nipah ili hantavirusima inkubacija nain prijenosa virus Nipah: do jednog mjeseca hantavirusi: 935 dana virus Nipah na ljude, make i pse prenosi se bliskim kontaktom s inficiranim svinjama; jo se istrauju prirodni rezervoari; preliminarna istraivanja upuuju na imie iz roda Pteropus. Glavni rezervoari za hantaviruse jesu perzistentno inficirani mali glodavci (npr. Apodemus flavicollis, Apodemus agrarius, Clethrionomys glareolus, Peromyscus maniculatus, Olygoryzomis longicaudatus i dr.); glodavci izluuju virus svojim sekretima i ekskretima; infekcija udisanjem kontaminirane praine; profesionalna ekspozicija; pretpostavlja se da je meuljudski prijenos mogu samo hantavirusom Anda virus Nipah: encefalitis (upala mozga) se oituje vruicom, pospanou, kao i mnogo ozbiljnijim poremeajima SS-a kao to su koma, napadaji i nemogunost odravanja funkcija disanja; ozbiljne sekvele nastaju nakon infekcija virusom Nipah i srodnim virusima (npr. stalne konvulzije, promjene osobnosti). Dva se klinika sindroma prepoznaju pri infekciji hantavirusima: hemoragijska vruica s bubrenim sindromom (HVBS) i hantavirusni pluni sindrom (HPS); razliit spektar klinikih oblika od inaparentnih, ili blagih do fulminantnih oblika s hemoragijama i tekim bubrenim ili kardiopulmonarnim zatajenjem. simptomatska terapija; iv. ribavirin moe uvjetno reducirati mortalitet ako se primijeni unutar sedam dana od poetka bolesti u bolesnika inficiranih virusom Hantaan (nije dokazana uinkovitost za amerike tipove hantavirusa kao ni za Nipah) nema cjepiva za virus Nipah Hantavax mrtvo cjepivo; DNA cjepiva u istraivakoj fazi; za sada nema pouzdane uinkovitosti
Lijeenje* cijepljenje
Osnovni znakovi/ simptomi
Lijeenje*
Cijepljenje
* Informacije u dijelu Lijeenje openite su i informativne, a lijenici se upuuju na prirunike u kojima su navedene doze i nain primjene lijekova; lijeenje treba provoditi na osnovi laboratorijske potvrde uzronika i osjetljivosti na antibiotike gdje je to primjenjivo.
172
Tablica 8-2. Molekularnobioloke tehnike za detekciju specifinih uzronika koji se mogu rabiti u bioterorizmu [12, 10, 18, 2064] Uzronik antraks (Bacillus anthracis) Uzorci* Kategorija A obrisci, puna krv, tekuine (pleuralna, bronhalna, likvor), svjee tkivo, koagulum, serum, citrirana plazma, stolica lanana reakcija polimerazom u realnom vremenu (RT-PCR) u detekciji Bacillus anthracis za SmartCycler, ABI/PE 7700 i 5700 multilokusna ponavljajua analiza varijabilnoga broja tandema (konsekutivnih) MLVA (multi-locus variable-number of tandem (consecutive) repeat analysis); ispituje brojne segmente DNA unutar kromosoma ili plazmida Bacillus anthracis koji imaju specifine obrasce ponavljanja (fundamentalne jedinice DNA); ponavljanja se mogu razlikovati u sekvenciji ili duljini, broju ponavljanja; specifini obrazac koji identificira razliite sojeve mikroorganizama (identificirano je vie od 100 razliitih B. anthracis) Molekularnobioloka dijagnostika
botulizam (Clostridium botulinum toxin)
kompetitivna reverzna transkripcija PCR feces, klistir, gastrini aspirat ili povraeni sadraj, serum, tkiva ili eksudati, uzorci hrane, obrisci (kliniki ili iz okolia), zemlja, voda PCR-metode u amplifikaciji DNA Y. pestis donji respiracijski trakt (pluna): bronhalni ispirak ili transtrahealni aspirat (1 mL); sputum; krv; aspirati tkiva (bubonska) ili bioptiki uzorci; jetra, slezena, kotana sr, plua uzorci iz vezikula, uzorci krasta, biopsija lezija, serum uzorci krvi, obrisak konjunktive, uzorci okolia (voda, blato i dr.). PCR-identifikacija DNA variole u klinikim uzorcima, mikroipovi
kuga (Yersinia pestis)
velike boginje (variola major)
tularemija (Francisella tularensis) virusne hemoragijske vruice (filovirusi npr. Ebola, Marburg, i arenavirusi [npr. Lassa, Machupo]
PCR-detekcija DNA F. tularensis multiciljni RT TaqMan PCR-esej
ante mortem: bioptiki RT-PCR-eseji materijal plua ili aspirat kotane sri ili koagulum, puna krv i serum post mortem: slezena, plua, bubrezi, jetra, limfni vorovi, srce, guteraa, hipofiza, mozak, krv iz srca
173
Tablica 8-2. Molekularnobioloke tehnike za detekciju specifinih uzronika koji se mogu rabiti u bioterorizmu [12, 10, 18, 2064] Uzronik bruceloza (Brucella species) Uzorci* Kategorija B krv, kotana sr, slezena, jetra, sinovijska tekuina ili apsces, serum PCR-eseji s poetnicama koje potjeu od 16S rRNA sekvencije Brucella abortus RT, za rod specifian 5' nukleaza-PCR-esej za amplifikaciju 322-bp fragmenta per gena razvijeno za brzu (< 2 sata) identifikaciju Brucella spp. na agar ploama. Tri pristupa SYBR Green I (dvolanana DNA interkalcija boje), 5'-egzonukleaza (enzimatsko oslobaanje fluora), i hibridizacija proba (energetski transfer fluorescentne rezonancije) evaluirani su za primjenu u RT-PCR-eseju za detekciju Brucella abortus. PCR-esej moe detektirati gen epsilon-toksina. Molekularnobioloka dijagnostika
epsilon-toksin Clostridium perfringens
stolica, uzorci iz okolia
uzronici koji se krv, stolica, hrana prenose hranom (npr. Salmonella species, Escherichia coli O157:H7, Shigella)
Jednostavna TaqMan PCR-tehnika razvijena je za izolaciju vjerojatnih izolata Salmonella enterica. Komercijalno dostupan PCR-komplet (AnDiaTec Salmonella sp. PCR-ELISA) razvijen je i evaluiran za detekciju Salmonella sp. u uzorcima hrane. Multipleksni fluorogeni RT-PCR za detekciju i kvantifikaciju Escherichia coli O157:H7. Simultana identifikacija Escherichia coli serotipa O157: H7 i njihova iga-slinog toksina s pomou MAMA/ multipleksnog PCR-a. Uporaba PCR-a u amplifikaciji specifinog virA fragmenta gena za detekciju virulentne bakterije iz roda Shigella i enteroinvazivne Escherichia coli. 5'-nukleaza RT-PCR ciljni esej za fliP za brzu identifikaciju Burkholderia mallei u klinikim uzorcima RT-PCR TaqMan esej za brzu identifikaciju i diferencijaciju Burkholderia pseudomallei i Burkholderia mallei tip III Secretion sustav RT-PCR esej za dijagnozu melidioze RT-PCR TaqMan esej za brzu identifikaciju i diferencijaciju Burkholderia pseudomallei i Burkholderia mallei
sakagija (Burkholderia mallei)
krv, sputum, urin, kone lezije
melioidoza krv, sputum, urin, kone (Burkholderia pseu- lezije domallei)
psitakoza (Chlamydia psittaci)
sputum, bronhoalveolar- Nested, multipleksni PCR za simultanu detekciju trini lavat, obrisak drijela, ju vrsta klamidija u ljudskim i ptijim uzorcima serum genotipizacija DNA Chlamydophila psittaci u ljudskim uzorcima s pomou ompA sekvenciranja gena LightCycler Nested PCR (LCN-PCR), brzi esej u kojem se rabi serum uzet u ranoj fazi bolesti. PCR-postavka za jednostruku kopiju gena kao Com1 i 16S rRNA gena
Q-vruica (Coxiella krv, serum, tkivo burnetii) sranih zalistaka
174
Tablica 8-2. Molekularnobioloke tehnike za detekciju specifinih uzronika koji se mogu rabiti u bioterorizmu [12, 10, 18, 2064] Uzronik stafilokokni enterotoksin B Uzorci* serum, izolati kultura, hrana, uzorci iz okolia, obrisak nosa, inducirani respiracijski uzorci, urin, stolica/gastrini aspirati krv, uzorci tkiva, ukljuujui kone bioptike uzorke Molekularnobioloka dijagnostika bioloki stabilni oligonukleotidni ligandi (zrcalnog odraza mirror-image) DNA Spiegelmers za stafilokokni enterotoksin B kvantitativni RT-imuno-PCR pristup u detekciji stafilokoknih enzima RT-PCR dupleks-esej
epidemini pjegavac (Rickettsia prowazekii)
virusni encefalitis krv, serum, likvor, tkivo ljudi i ivotinja (alfavirusi npr. venezuelski konjski encefalitis, istoni konjski encefalitis, zapadni konjski encefalitis) uzronici koji se prenose vodom (npr. Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum) stolica, povraeni sadraj, uzorci hrane i vode
RT-PCR DNA-mikroipovi
PCR-metoda za selektivnu amplifikaciju DNA-fragmenta unutar ctxAB operona V. cholerae PCR koji amplificira Vibrio cholerae RTX (ponavljanje u toksinu repeat in toxin) gen toksina Cryptosporidium parvum detekcija mijeanih genotipova PCR-analiza detekcija Cryptosporidium parvum DNA u fecesu ovjeka s pomou nested PCR-a detekcija i genotipizacija oocista Cryptosporidium parvum s pomou RT-PCR-a i analizom krivulje otapanja PCR metoda za kvantifikaciju oocista Cryptosporidium parvum u uzorcima pitke vode
Kategorija C emergentne zarazne bolesti uzrokovane npr. virusom Nipah ili hantavirusima krv, serum, likvor, urin, tkiva ljudi i ivotinja dupleks nested RT-PCR (nRT-PCR) s unutarnjom kontrolom u detekciji RNA virusa Nipah specifini fluorogeni (5' nukleaza proba) Taqman RTPCR-esej za dijagnostiku i detekciju virusa Nipah RT-PCR za detekciju hantavirusa visoko osjetljivi Taqman PCR u detekciji hantavirusa Puumala. DNA-mikroipovi u detekciji hantavirusa
* Preporuuje se rukovanje potencijalno infektivnim klinikim materijalom i uzorcima svesti na najmanju moguu mjeru i osigurati da se rukovanje i testiranje obavljaju u odgovarajuim uvjetima bioloke i osobne zatite (osobito se to odnosi na filoviruse, uzronike virusnih encefalitisa, emergentnih zaraznih bolesti, ali i na druge uzronike).
175
ka, razvoj novih standardiziranih analitikih metoda, osiguranje kvalitete tijekom svih laboratorijskih procedura s briljivim dokumentiranjem od poetka prikupljanja uzoraka, detaljnom analizom fizikih svojstava (morfologija, mikrostruktura), analize izotopa, tradicionalne fizioloke metode, sposobnost analiziranja tragova medija i podloga za rast mikroorganizama i njihovih sastojaka, stabilizatora i aditiva, sluajnih biokontaminanata, poznavanje endemske pojavnosti mikroorganizama, praenje promjena u imunoreakcijama, panel razliitih imunoeseja. Za kvalitetan i uspjean posao u forenzinoj mikrobiologiji potrebno je uspostaviti rigorozne mjere kontrole kvalitete rada. Precizno i propisano rukovanje i analitike procedure moraju biti u potpunom skladu s detaljno pisanim protokolima i standardnim operativnim procedurama. Odgovarajua kontinuirana edukacija i uvjebavanje iskusnog laboratorijskog osoblja preduvjet je uspjeha. Jedino kalibrirana oprema sa standardiziranim reagensima moe se upotrebljavati s odgovarajuim internim standardima, ponovljenim analizama i slijepim testiranjem. Odravanje i dokumentiranje lanca nadzora (praenje tragova, dokumentiranje ili fizika kontrola dokaza) uzoraka od kritine je vanosti za konano sprovoenje kriminalaca pod nadzor, pravnu osudu i kaznu. Zbog istog razloga uzorci koji su naeni u kriminalnom inu moraju biti sauvani u sigurnom okruenju kao dokazi. Integritet uzoraka i rukovanje, s forenzinog je gledita vano i za branitelje i za tuitelje. Specifini uzronici koji se mogu rabiti u bioterorizmu, kao i svi bioloki opasni mikroorganizmi moraju se procesirati u certificiranim sigurnosnim biolokim kabinetima klase II i u laboratorijima razine-2 biosigurnosti (biosafety level-2, BSL-2), a, kad je potrebno, i na razinama BSL-3 i BSL-4 [12, 10, 18, 2064].
8.5.
Kriteriji za proglaavanje epidemije neuobiajenom
Ad hoc grupa Svjetske zdravstvene organizacije (World Health Organization WHO) dala je godine 1998. kriterije za proglaavanje neuobiajenih epidemija [2, 65]: 1. pr va pojava epidemije u regiji koja nije endemska za tu bolest, 2. pojava epidemije izvan uobiajene sezone, 3. neuobiajeni nain prijenosa uzronika, 4. rezer voari/insekti kao vektori ne obitavaju u regiji, 5. epidemioloki pokazatelji govore o neuobiajeno skraenom razdoblju inkubacije za odreenu bolest, 6. znaajke otkrivenog patogena razlikuju se od uobiajenih znaajki za taj agens (tip, sekvencije, rezistencija na antibiotike, struktura i dr.), 7. porast virulencije patogena, 8. patogen se moe koristiti novim prirodnim rezer voarima za ubrzavanje i odravanje prijenosa. Mikroorganizmi su raireni u cijelom svijetu. No, poznato je da neki od njih preivljavaju u odreenim klimatskim uvjetima i biotopima, a drugi ne preivljavaju. Svi znamo da su neke zarazne bolesti uobiajene ili se iskljuivo pojavljuju u odreenim sezonama [1112]. Na primjer, dokaz infekcije virusom gripe u ljudi tijekom ljeta bila bi svakako neuobiajena epidemija vrijedna daljnjeg istraivanja. Epidemioloka istraivanja u kojima razlikujemo prirodnu pojavu epidemija od namjerno uzrokovanih osobito su vana. Mikroorganizmi koji se sa ivotinja mogu prenijeti na ljude (zoonoze) ili kukcima (bolesti koje se prenose vektorima) usko su vezani uz
176
njihove ivotinjske rezer voare/vektore i njihove biotope. Primjerice, rezer voari hantavirusa Novog svijeta, koji uzrokuju hantavirusni pluni sindrom, razliiti su mali glodavci koje moemo nai samo u Sjevernoj ili Junoj Americi. Bilo kakva epidemija koja bi se dogodila u drugim dijelovima svijeta, ukljuujui Hr vatsku, bila bi sumnjiva na bioteroristiki napad i bila bi potrebna paljiva istraga. Osim toga, ako se iznenada neki ivotinjski rezer voari ili vektori pojave kao prijenosnici nekih novih mikroorganizama, to je potrebno paljivo analizirati u smislu moguega namjernog irenja bolesti. Takoer je vano znati sve znaajke bolesti, ukljuujui i vrijeme inkubacije. Ako se neka bolest pojavi s vrlo kratkom inkubacijom ili pojaanim i neuobiajenim znakovima i simptomima bolesti, osobito u populaciji koja se susretala s dotinim mikroorganizmom, to se takoer moe razumijevati kao sumnjiva pojava epidemije. Nain prijenosa za veinu patogena vrlo je dobro poznat kao i posljedini patogenetski mehanizmi. Znaajne varijacije u nainu prijenosa ili patogenetskim mehanizmima mogu biti rezultat infekcije genetikim inenjerstvom namjerno promijenjenih mikroorganizama. To ukljuuje i pojavu neoekivano visoke rezistencije na antibiotike, pojaanu virulenciju mikroorganizama koji su prije izazivali blage ili srednje teke infekcije [12, 1112].
8.6.
Sumnjive epidemije zaraznih bolesti
Kao to je ve pokazano, bioterorizam ima, na alost, bogatu i dugu povijest. No, danas je modernim metodama forenzine mikrobiologije, te uz veliki porast informacija i znanja o mikroorganizmima, ukljuujui moderne laboratorijske tehnike i globalni sustav
izvjeivanja o pojavama bolesti, mnogo lake razlikovati prirodne od namjerno uzrokovanih bolesti. Ovdje e biti opisano nekoliko za itatelje potencijalno zanimljivih sluajeva, a mnogo vie moe se nai u literaturi i na odgovarajuim mrenim stranicama. U travnju 1979. godine u Sverdlovsku, u jugoistonoj Ukrajini, zabiljeena je eksplozija u podruju na kojemu je stacionirana vojska. Tijekom nekoliko sljedeih dana, etiri kilometra juno i istono u stanovnika su se razvili visoka temperatura i oteano disanje, te je u kratkom vremenu umrlo vie od 200 bolesnika. Lokalni su lijenici objavili da je rije o epidemiji plunog antraksa. Suprotno tomu, vlada je slubeno izvijestila da su infekcije posljedica konzumacije mesa zaraenih ivotinja. No, bolesnici nisu pokazivali znakove gastrointestinalnog ili konog antraksa, a obdukcija umrlih pokazala je pluni edem i toksemiju. Ovce i koze u est razliitih sela (50 km) uginule su od antraksa. DNA-analiza je pokazala istodobnu infekciju s nekoliko razliitih sojeva antraksa, to je atipino za prirodnu infekciju u goveda. Zakljueno je da je antraks bio rezultat sluajnog irenja bakterija zbog incidenta u tvornici biolokog oruja [6670]. Tijekom 1980. godine, vie je osoba bilo inficirano HIV-om, a svojim nainom ivota i aktivnostima nisu bili u skupini visokorizinih za infekciju HIV-om. Kad je 1986. utvreno da je njihov stomatolog HIV-pozitivan, pokazalo se i da je veina bolesnika koji su se zarazili HIV-om posjeivala istog stomatologa. Napravljeno je DNA-sekvenciranje (bolesnici, stomatolog i lokalna kontrolna skupina). Nukleotidne sekvencije HIV-a u mnogih su bolesnika bile veinom, ali ne potpuno podudarne onima u stomatologa, te razliite od detektiranih u bolesnika koji su posluili kao kontrolna skupina. Nalazi su
177
snano potkrijepili (ali ne u potpunosti i potvrdili) sumnju o prijenosu infekcije HIV-om od stomatologa tijekom stomatolokih intervencija [2]. Ovo, meutim, nije bio namjeran prijenos infekcije HIV-om, jer stomatolog nije bio svjestan da je nosilac virusa. U rujnu 1984. indijski je religiozni kult kontaminirao salatom sa Salmonella typhimurium barove u Dallesu, Oregon, kao i u regiji Wasco County, takoer u Oregonu. Vie od 750 osoba je zaraeno, a oko 40 njih je hospitalizirano. Nakana je bila utjecati na ishod lokalnih izbora, a to je otkriveno godinu dana poslije [3, 71]. Aum Shinrikyo je tijekom 1995., u vie od 10 sluajeva pokuao proiriti antraks, botulinski toksin, Q-vruicu i Ebolu meu stanovnitvom i organima vlasti u Japanu. Na sreu, nisu zabiljeeni sluajevi infekcije [3, 71]. Meu posljednjim dogaajima jest i sluaj pisama sa sporama antraksa tijekom 2001. godine koja su se pojavila u dva navrata: najprije su poslana u nekoliko amerikih medija, a tri tjedna poslije i dvojici senatora. Petero je ljudi ubijeno, a 17 inficirano. DNA-sekvenciranjem antraksa iz pr ve rtve koja je umrla od plunog antraksa pokazano je da je antraks istovjetan originalnom soju Ames koji je istraivan u Amerikom vojnom medicinskom istraivakom centru za infektivne bolesti (U. S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases UAMRIID), Fort Detrick, Maryland, SAD, a nakon toga distribuiran u najmanje 15 istraivakih laboratorija u SAD-u, te na est prekomorskih lokacija. Takoer je pokazano da je antraks vjerojatno kultiviran oko dvije godine prije slanja pisama i da je voda rabljena za procesiranje spora antraksa iz podruja sjeveroistonog SAD-a. Uz to, daljnji su napori bili usmjereni na definiranje i identifikaciju procesa silikonizacije tijekom proizvodnje spora Clostridium. Istraivai su pronali da je antraks poslan u SAD-u iz Nassau ulice 10, Princeton, New Jersey. Pretpostavili su
da je Amerikanac ili stranac koji ima obiteljske poveznice u podruju Princeton-Clinton New Jersey doao u SAD i uspjeno izveo ovaj napad. Do sada krivac nije naen [510]. Jedno od vrlo vanih orua koja pomau u diferenciranju prirodne epidemije od namjernog napada jest nadzor nad zaraznim bolestima i globalni sustavi za izvjeivanje o tim bolestima. Postoji nekoliko programa na mrei kao to su ProMed (http://www. promedmail.org) ili GOARN (WHOs Global Outbreak Alert and Response Network http://www.who.int/csr/outbreaknetwork), koji su iznimno korisni u prepoznavanju epidemija i moguih bioteroristikih napada. Vano je prikupiti sve nune informacije o svim znaajnim imbenicima epidemije, a koje nas mogu upozoriti na koji se nain i zato bolest pojavila. U tu svrhu moraju neizostavno biti uspostavljeni: rutinsko praenje promjena oblika bolesti, dokumentiranje i razumijevanje imbenika koji su inicirali promjene, pravodobno prosljeivanje informacija nadreenima zaduenima za donoenje odluka, razumijevanje normalnih pojava bolesti, praenje programa na mrei o meunarodnom nadzoru zaraznih bolesti uz izvjea o bolestima u ljudi i ivotinja [2].
8.7.
Biosigurnost i biozatita
U podruju forenzine mikrobiologije potrebno je harmonizirati napore znanstvenika u polju zaraznih bolesti, epidemiologije i mikrobiologije, te osoba koje donose politike, administrativne i zakonske odluke u stvaranju smjernica za bioobranu. To je preduvjet za izgradnju nacionalnih kapaciteta u istraivanju bioterorizma. Najbolji pristup za pripravnost u detekciji ili odgovoru na akt bioterorizma je integrirana mrea koju ine vladine institucije, akademska zajednica,
178
industrija te javno zdravstvo [72, 73]. Zbog brojnih izazova koje bioterorizam postavlja, ukljuujui mnoge patogene koji postoje u prirodi i ne zahtijevaju posebnu strunost ni tehnologiju da bi se proizveli u oruje, imperativ je uspostaviti snanu potporu i mogunosti za razvoj forenzine mikrobiologije ojaane metodama, educiranim znanstvenicima i strunjacima kao bitnim dijelom nacionalnog kapaciteta u obrani od bioterorizma. Znanstvene zajednice u polju infektivnih bolesti, mikrobiologiji, epidemiologiji i imunologiji trebaju pomoi svojim sposobnostima i znanjem i pridonijeti naporima u izgradnji nacionalnih kapaciteta biosigurnosti i biozatite. Temeljna istraivanja, ukljuujui genomiku, cjepiva, lijekove i snane timove talentiranih i predanih znanstvenika, uvjebanih i educiranih, vani su u stvaranju nacionalne biozatite i biosigurnosti. Osim toga postoji potreba za laboratorijima i javnozdravstvenim strunjacima koji su upoznati sa zakonskim provedbama/ nacionalnim uredima za istragu ili slinim institucijama i vice versa. Planiranje i izgradnja nacionalnih sigurnosnih laboratorija nuni su u obrani od bioterorizma (npr. izgradnja prvog BSL3 laboratorija u Hr vatskoj, u Klinici za infektivne bolesti Dr. Fran Mihaljevi u Zagrebu). Drugi aspekt biosigurnosti jest osiguranje kolekcija patogenih uzronika koji moraju biti sigurno pohranjeni, s ogranienim pristupom, te paljivim praenjem osoba koje imaju pristup radu s takvim uzronicima. U Americi su pravila o selekcioniranim agen-
sima i provjere o moguim kriminalnim dosjeima vani dijelovi organizacije programa biozatite. To ukljuuje i pratnju pri ulasku u zgrade u kojima su patogeni spremljeni, zakljuavanje i ogranien pristup u laboratorije gdje se radi s takvim patogenima, brave na zamrzivaima u kojima su agensi pohranjeni. Uz to, s takvim je uzronicima u laboratorijima bitno rukovati s odgovarajuima razinama bioloke zatite (BSL-2, -3, -4), i koristiti se sigurnosnim kabinetima (hudovima). Nedvojbeno je da je odgovornost za biosigurnost i biozatitu na vladi svake zemlje, ali, osim toga, postoje profesionalne organizacije (institucije, akademski i privatni sektor), te pojedini strunjaci koji su odgovorni za razvoj prirunika o ispravnom postupanju i opoj koristi pri uporabi genskih resursa, mikroorganizama (osobito selektiranih), te etikim implikacijama u biotehnologiji, meunarodnom upravljanju biotehnologijom i biosigurnou, programima cijepljenja i donoenjem regulativa [12, 7276]. Bez sumnje svi, od pojedinaca do razliitih skupina moramo biti pripravni za mogue bioteroristike napade, ali i preventirati paranoidne reakcije i pristupe. Bitno je u svemu ovome usmjeriti napore, sredstva, organizaciju i znanje u velikoj mjeri i na nove infekcije koje se prirodno pojavljuju, jer mnoge od njih su eksperimenti prirode [79], a priroda nas zna koji put iznenaditi novim i opasnim infektivnim bolestima poput pravog bioterorista.
Literatura
1. http://www.bt.cdc.gov/Agent/agentlist.asp 2. Breeze RG, Budowle B, Schutzer SE, editors. Microbial Forensics. Amsterdam: Elsevier Academic Press; 2005.
3. http://www.bioterry.com/HistoryBioTerr.html 4. Kasten FH. Biological weapons, war crimes, and WWI. Science. 2002; 296:1235-7. 5. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Update: Investigation of bioterrorismrelated anthrax and adverse events from antimic-
179
6.
7. 8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
robial prophylaxis. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2001; 50:973-6. Jernigan JA, Stephens DS, Ashford DA, Omenaca C, Topiel MS, Galbraith M, Tapper M, Fisk TL, Zaki S, Popovic T, Meyer RF, Quinn CP, Harper SA, Fridkin SK, Sejvar JJ, Shepard CW, McConnell M, Guarner J, Shieh WJ, Malecki JM, Gerberding JL, Hughes JM, Perkins BA. Anthrax Bioterrorism Investigation Team. Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis. 2001; 7:933-44. Atlas RM. Bioterrorism: from threat to reality. Annu Rev Microbiol. 2002; 56:167-85. Greene CM, Reefhuis J, Tan C, Fiore AE, Goldstein S, Beach MJ, Redd SC, Valiante D, Burr G, Buehler J, Pinner RW, Bresnitz E, Bell BP. CDC New Jersey Anthrax Investigation Team. Centers for Disease Control and Prevention. Epidemiologic investigations of bioterrorism-related anthrax, New Jersey, 2001. Emerg Infect Dis 2002; 8:1048-55. Tan CG, Sandhu HS, Crawford DC, Redd SC, Beach MJ, Buehler JW, Bresnitz EA, Pinner RW, Bell BP. Regional Anthrax Sur veillance Team; Centers for Disease Control and Prevention New Jersey Anthrax Sur veillance Team. Sur veillance for anthrax cases associated with contaminated letters, New Jersey, Delaware, and Pennsylvania, 2001. Emerg Infect Dis 2002; 8:1073-7. Hoffmaster AR, Meyer RF, Bowen MD, Marston CK, Weyant RS, Thurman K, Messenger SL, Minor EE, Winchell JM, Rassmussen MV, Newton BR, Parker JT, Morrill WE, McKinney N, Barnett GA, Sejvar JJ, Jernigan JA, Perkins BA, Popovic T. Evaluation and validation of a real-time polymerase chain reaction assay for rapid identification of Bacillus anthracis. Emerg Infect Dis 2002; 8:1178-82. Beneson AS, editor. Control of Communicable Diseases Manual. An official report of the American Public Health Association. Washington DC: American Public Health Association; 1995. Begovac J, Boinovi D, Lisi M, Bari B, Schnwald S, urednici. Infektologija. Zagreb: Profil; 2006. Schnwald S, Bari B, Beus A, Boinovi D, Franceti I, Ladan V, Lisi M, Santini M. Prirunik za lijeenje i spreavanje infektivnih bolesti. Zagreb: Birotisak; 2000. Gilbert DN, Moellering RC Jr., Eliopoulos GM, Sande MA, editors. The Sanford Guide for AntimicrobialTherapy 2006. Sperryville, VA, USA: Antimicrobial Therapy Inc.; 2006. Markotic A, LeDuc JW, Hlaca D, Rabatic S, Sarcevic A, Dasic G, Gagro A, Kuzman I, Barac V, Av-
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
sic-Zupanc T, Beus I, Dekaris D. Hantaviruses are likely threat to NATO forces in Bosnia and Herzegovina and Croatia. Nat Med 1996; 2:269-70. Meltzer MI, Damon I, LeDuc JW, Millar JD. Modeling potential responses to smallpox as a bioterrorist weapon. Emerg Infect Dis. 2001; 7:959-69. LeDuc JW, Damon I, Relman DA, Huggins J, Jahrling PB. Smallpox research activities: U.S. Interagency Collaboration, 2001. Emerg Infect Dis 2002; 8:743-5. Jahrling PB, Hensley LE, Martinez MJ, Leduc JW, Rubins KH, Relman DA, Huggins JW. Exploring the potential of variola virus infection of cynomolgus macaques as a model for human smallpox. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:15196-200. Engelthaler DM, Lewis K, editors. Zebra Manual: A Reference Handbook for Bioterrorism Agents. Phoenix, Arizona, USA: Arizona Department of Health Ser vices, Division of Public Health Ser vices; 2004. McGrath S, Dooley JS, Haylock RW. Quantification of Clostridium botulinum toxin gene expression by competitive reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 2000; 66:1423-8. Lindler LE, Fan W, Jahan N. Detection of ciprofloxacin-resistant Yersinia pestis by fluorogenic PCR using the LightCycler. J Clin Microbiol. 2001; 39:3649-55. Melo AC, Almeida AM, Leal NC. Retrospective study of a plague outbreak by multiplex-PCR. Lett Appl Microbiol 2003; 37:361-4. Tomaso H, Reisinger EC, Al Dahouk S, Frangoulidis D, Rakin A, Landt O, Neubauer H. Rapid detection of Yersinia pestis with multiplex realtime PCR assays using fluorescent hybridisation probes. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003; 38:117-26. Fedele CG, Negredo A, Molero F, Sanchez-Seco MP, Tenorio A. Use of internally controlled realtime genome amplification for detection of variola virus and other orthopoxviruses infecting humans. J Clin Microbiol 2006; 44:4464-70. Sulaiman IM, Tang K, Osborne J, Sammons S, Wohlhueter RM. GeneChip resequencing of the smallpox virus genome can identify novel strains: a biodefense application. J Clin Microbiol. 2007; 45:358-63. Versage JL, Severin DD, Chu MC, Petersen JM. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J Clin Microbiol 2003; 41:5492-9.
180
27. Barns SM, Grow CC, Okinaka RT, Keim P, Kuske CR. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl Environ Microbiol 2005; 71:5494-500. 28. Whitehouse CA, Hottel HE. Comparison of five commercial DNA extraction kits for the recovery of Francisella tularensis DNA from spiked soil samples. Mol Cell Probes. 2007; 21:92-6. 29. Tomaso H, Scholz HC, Neubauer H, Al Dahouk S, Seibold E, Landt O, Forsman M, Splettstoesser WD. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol Cell Probes 2007; 21:12-6. 30. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H, Kawaoka Y, Yasuda J. Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2007; 141:78-83. 31. Zhai J, Palacios G, Towner JS, Jabado O, Kapoor V, Venter M, Grolla A, Briese T, Paweska J, Swanepoel R, Feldmann H, Nichol ST, Lipkin WI. Rapid molecular strategy for filovirus detection and characterization. J Clin Microbiol 2007; 45:2246. 32. Gunther S, Asper M, Roser C, Luna LK, Drosten C, Becker-Ziaja B, Borowski P, Chen HM, Hosmane RS. Application of real-time PCR for testing antiviral compounds against Lassa virus, SARS coronavirus and Ebola virus in vitro. Antiviral Res 2004; 63:209-15. 33. Hass M, Westerkofsky M, Muller S, Becker-Ziaja B, Busch C, Gunther S. Mutational analysis of the Lassa virus promoter. J Virol 2006; 80:12414-9. 34. Romero C, Gamazo C, Pardo M, Lopez-Goni I. Specific detection of Brucella DNA by PCR. J Clin Microbiol. 1995; 33:615-7. 35. Newby DT, Hadfield TL, Roberto FF. Real-time PCR detection of Brucella abortus: a comparative study of SYBR green I, 5'-exonuclease, and hybridization probe assays. Appl Environ Microbiol. 2003; 69:4753-9. 36. Bogdanovich T, Skurnik M, Lubeck PS, Ahrens P, Hoorfar J. Validated 5' nuclease PCR assay for rapid identification of the genus Brucella. J Clin Microbiol. 2004; 42:2261-3. 37. Al-Khaldi SF, Myers KM, Rasooly A, Chizhikov V. Genotyping of Clostridium perfringens toxins using multiple oligonucleotide microarray hybridization. Mol Cell Probes 2004; 18:359-67. 38. Villalobo E, Torres A. PCR for detection of Shigella spp. in mayonnaise. Appl Environ Microbiol 1998; 64:1242-5.
39. Hoorfar J, Ahrens P, Radstrom P. Automated 5' nuclease PCR assay for identification of Salmonella enterica. J Clin Microbiol 2000; 38:3429-35. 40. Metzger-Boddien C, Bostel A, Kehle J. AnDiaTec Salmonella sp. PCR-ELISA for analysis of food samples. J Food Prot 2004; 67:1585-90. 41. Ibekwe AM, Watt PM, Grieve CM, Sharma VK, Lyons SR. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl Environ Microbiol 2002; 68:4853-62. 42. Sharma VK, Dean-Nystrom EA. Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 by using a multiplex real-time PCR assay for genes encoding intimin and Shiga toxins. Vet Microbiol 2003; 93:247-60. 43. URen JM, Van Ert MN, Schupp JM, Easterday WR, Simonson TS, Okinaka RT, Pearson T, Keim P. Use of a real-time PCR TaqMan assay for rapid identification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. J Clin Microbiol. 2005; 43:5771-4. 44. Tomaso H, Scholz HC, Al Dahouk S, Eickhoff M, Treu TM, Wernery R, Wernery U, Neubauer H. Development of a 5'-nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapid identification of Burkholderia mallei in clinical samples. Clin Chem 2006; 52:307-10. 45. Meumann EM, Novak RT, Gal D, Kaestli ME, Mayo M, Hanson JP, Spencer E, Glass MB, Gee JE, Wilkins PP, Currie BJ. Clinical evaluation of a type III secretion system real-time PCR assay for diagnosing melioidosis. J Clin Microbiol 2006; 44:3028-30. 46. Messmer TO, Skelton SK, Moroney JF, Daugharty H, Fields BS. Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks. J Clin Microbiol 1997; 35:2043-6. 47. Heddema ER, van Hannen EJ, Duim B, de Jongh BM, Kaan JA, van Kessel R, Lumeij JT, Visser CE, Vandenbroucke-Grauls CM. An outbreak of psittacosis due to Chlamydophila psittaci genotype A in a veterinary teaching hospital. J Med Microbiol 2006; 55:1571-5. 48. Fournier PE, Raoult D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J Clin Microbiol. 2003; 41:5094-8. 49. Purschke WG, Radtke F, Kleinjung F, Klussmann S. A DNA Spiegelmer to staphylococcal enterotoxin B. Nucleic Acids Res. 2003; 31:3027-32. 50. Fischer A, von Eiff C, Kuczius T, Omoe K, Peters G, Becker K. A quantitative real-time immuno-
181
51.
52. 53. 54.
55.
56.
57.
58.
59.
60. 61.
62.
63.
64.
PCR approach for detection of staphylococcal enterotoxins. J Mol Med 2007; 85:461-9. Jiang J, Temenak JJ, Richards AL. Real-time PCR duplex assay for Rickettsia prowazekii and Borrelia recurrentis. Ann N Y Acad Sci; 990:302-10. Vernet G. Diagnosis of zoonotic viral encephalitis. Arch Virol Suppl. 2004; (18):231-44. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-28.html Chow KH, Ng TK, Yuen KY, Yam WC. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J Clin Microbiol. 2001; 39:2594-7. Balatbat AB, Jordan GW, Tang YJ, Silva J Jr. Detection of Cryptosporidium par vum DNA in human feces by nested PCR. J Clin Microbiol. 1996; 34:1769-72. Chung E, Aldom JE, Carreno RA, Chagla AH, Kostrzynska M, Lee H, Palmateer G, Trevors JT, Unger S, Xu R, De Grandis SA. PCR-based quantitation of Cryptosporidium par vum in municipal water samples. J Microbiol Methods 1999; 38:119-30. Gile M, Warhurst DC, Webster KA, West DM, Marshall JA. A multiplex allele specific polymerase chain reaction (MAS-PCR) on the dihydrofolate reductase gene for the detection of Cryptosporidium par vum genotypes 1 and 2. Parasitology. 2002; 125:35-44. Tanriverdi S, Tanyeli A, Baslamisli F, Koksal F, Kilinc Y, Feng X, Batzer G, Tzipori S, Widmer G. Detection and genotyping of oocysts of Cryptosporidium par vum by real-time PCR and melting cur ve analysis. J Clin Microbiol. 2002; 40:3237-44. Wacharapluesadee S, Hemachudha T. Duplex nested RT-PCR for detection of Nipah virus RNA from urine specimens of bats. J Virol Methods. 2007; 141:97-101. http://www.iscb.org/ismb2003/posters/ian. pritchardATcsiro.au_156.html Aitichou M, Saleh SS, McElroy AK, Schmaljohn C, Ibrahim MS. Identification of Dobrava, Hantaan, Seoul, and Puumala viruses by one-step real-time RT-PCR. J Virol Methods. 2005; 124(1-2):21-6. Garin D, Peyrefitte C, Crance JM, Le Faou A, Jouan A, Bouloy M. Highly sensitive Taqman PCR detection of Puumala hantavirus. Microbes Infect 2001; 3:739-45. Nordstrom H, Johansson P, Li QG, Lundkvist A, Nilsson P, Elgh F. Microarray technology for identification and distinction of hantaviruses. J Med Virol 2004; 72:646-55. U.S. Department of Health and Human Ser vices. Biosafety in microbiological and biomedical labo-
65.
66. 67.
68. 69.
70.
71. 72.
73.
74.
75. 76.
77.
78.
79.
ratories. Washington: U.S. Government Printing Office; 1999. Dando M, Pearson GS, Kriz B, editors. Scientific and technical means of distinguishing between natural and other outbreaks of disease. Proceedings of the NATO Advanced Research Workshop, Prague, Czech Republic, 18-20 October 1988. 2001. Wade N. Death at Sverdlovsk: a critical diagnosis. Science 1980; 209:1501-2. Walker DH, Yampolska O, Grinberg LM. Death at Sverdlovsk: what have we learned? Am J Pathol 1994; 144:1135-41. Sternbach G. The history of anthrax. J Emerg Med 2003; 24:463-7. Brookmeyer R, Blades N, Hugh-Jones M, Henderson DA. The statistical analysis of truncated data: application to the Sverdlovsk anthrax outbreak. Biostatistics 2001;2:233-47. Wilkening DA. Sverdlovsk revisited: modeling human inhalation anthrax. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:7589-94. http://www.ndu.edu/centercounter/Full_Doc.pdf Budowle B, Beaudry JA, Barnaby NG, Giusti AM, Bannan JD, Keim P. Role of the low enforcement response and microbial forensics in investigation of bioterorism. Croat Med J 2007;48:437-49 Shemer J, Shoenfeld Y, editors. Terorizam i medicina. Medicinski aspekti biolokoga, kemijskoga i radiolokoga terorizma. Zagreb: Medicinska naklada: 2007. Center for Disease Control and Prevention (CDC), Department of Health and Human Services (HHS). Requirements for facilities transferring or receiving select agents. Final rule. Fed Regist 2001; 66:45944-5. Atlas RM, Reppy J. Globalizing biosecurity. Biosecur Bioterror 2005; 3:51-60. Cook-Deegan RM, Berkelman R, Davidson EM, Finder S, Heitman E, Kelley MC, King NM, Moseley R, Thomas JC, Tilden SJ, Vangsnes NM. Issues in biosecurity and biosafety. Science 2005; 308:1867-8. Atlas RM, Dando M. The dual-use dilemma for the life sciences: perspectives, conundrums, and global solutions. Biosecur Bioterror 2006; 4:276-86. Bork KH, Halkjaer-Knudsen V, Hansen JE, Heegaard ED. Biosecurity in Scandinavia. Biosecur Bioterror 2007; 5:62-71. Calisher CH. Bioterorism or natural disasters. What shall we worry about next? Croat Med J 2007;48:574-8
182
9.

Goran uri i Gordan Lauc
Sadraj poglavlja
9.1. 9.2. Forenzina entomologija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 9.1.1. Analiza ljudske DNA izdvojene iz kukaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 Forenzina analiza kraljenjaka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 9.2.1. Analiza jezgrine DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 9.2.2. Analiza mitohondrijske DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192 9.2.3. Ostali izvori ivotinjske DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 9.2.3.1. Slina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 9.2.3.2. Fekalni materijal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 9.2.4. Izvjeivanje i statistiko potkrjepljivanje analize ivotinjske DNA. . . . . . . . . . . 195 9.2.5. Forenzina analiza u kontroli podrijetla prehrambenih proizvoda. . . . . . . . . . . 195
Razvoj molekularne biologije, te otkrivanje i usavravanje molekularnih i biokemijskih tehnika te opreme, omoguili su tonu identifikaciju razliitih vrsta. Nakon primjene u analizi ljudske DNA, nove su tehnologije utrle put i u analizi ivotinjske DNA u forenzine svrhe. Iako je ovo podruje forenzine analize relativno mlado, ima velik potencijal te polako postaje rutinska metoda u razliitim sluajevima forenzine problematike. Jedna od moguih podjela pri analizi DNA ivotinjskih uzoraka jest podjela prema vrsti ivotinje od koje bioloki uzorak potjee. U tom podruju temeljna podjela osobito izdvaja: 1. forenzinu entomologiju
i 2. forenzinu analizu kraljenjaka (potkoljeno Vertebrata). Forenzina entomologija ima primjenu gotovo iskljuivo kao pomona metoda u humanoj forenzinoj analizi, dok forenzina analiza kraljenjaka ima podjednaku primjenu i u humanoj i u animalnoj forenzinoj analizi u iremu smislu.
9.1.
Forenzina entomologija
Entomologija (od gr. entomon kukac, i logos znanje) bavi se prouavanjem ivotinja koljena lankonoaca (Arthropoda), iz
183
razreda kukaca (Insecta). Forenzina entomologija prouava kukce u svjetlu pravnih i kriminalistikih istraga. Moe se podijeliti na: 1. urbanu, 2. vezanu uz skladitenje razliitih proizvoda te 3. sudskomedicinsku forenzinu entomologiju. Urbana forenzina entomologija ima ulogu u parnicama u vezi s dezinsekcijom u gradskim naseljima. Forenzina entomologija u vezi sa skladitenjem razliitih proizvoda ima ulogu u parnicama koje se tiu kontaminacije hrane insektima. Kudikamo najea primjena forenzine entomologije jest u sudskomedicinskim sluajevima: pri ubojstvima, samoubojstvima, silovanjima, fizikom zlostavljanju i krijumarenju. Analiza DNA ima praktinu primjenu ponajprije u sudskomedicinskoj forenzinoj entomologiji te je to predmet razmatranja ovog dijela poglavlja. Analizom DNA kukaca moe se: 1. povezati osumnjienog s mjestom zloina ili sa rtvom, 2. dokazati da je tijelo rtve bilo pomaknuto ili 3. utvrditi vrijeme smrti rtve. Glavni cilj forenzine entomologije jest doprinos odreivanju vremena, uzroka, naina i mjesta smrti (osobito kod jako raspadnutih ili skeletiranih leeva), s pomou svih elemenata i spoznaja koje se mogu dobiti prouavanjem kukaca naenih na leu ili oko njega. Primjenom medicinskih analiza (mrtvake pjege, mrtvake ukoenosti i dr.) vrijeme smrti moe se tono procijeniti za pr va 23 dana. S pomou forenzine entomologije, prouavanjem prisutnih nekrofagnih vrsta i utvrivanjem dobi razvojnih stadija kukaca koji se hrane truplom, vrijeme proteklo od trenutka smrti do otkria trupla moe se tono procijeniti za inter val od jednog dana do nekoliko tjedana. U forenzinoj entomologiji, uz razvojni stadij pronaenog kukca, kljuna je i tona identifikacija vrste. Prepoznavanje na osnovi morfolokih obiljeja esto je teko pa je potrebno vrlo specijalizirano taksonomsko znanje. Jedan od razloga sloenosti takvog naina
prepoznavanja jest taj to vrste razreda Insecta ine vie od 80% svih vrsta carstva ivotinja. Vrlo je mali broj strunjaka koji mogu identificirati liinke forenzino bitnih kukaca na razini vrste. Za neke skupine kukaca razlikovanje na stadiju liinke primjenom morfolokih kriterija nije mogue. U takvim sluajevima uobiajen je uzgoj liinki do odraslih jedinki. Ta je metoda spora, zbog dugotrajnosti uzgoja, i nesigurna, kad uzgoj ne uspije. U okolnostima manjka strunjaka (forenzinih entomologa) i nemogunosti razlikovanja liinki kukaca, rjeenje problema moe biti identifikacija vrste na osnovi analize genetikog materijala. Moderne analize DNA omoguuju brzu i pouzdanu identifikaciju nekrofagnih kukaca. Analizom DNA (mitohondrijskog ili jezgrinog podrijetla) mogue je utvrditi vrstu kukca u svakoj fazi ivotnog ciklusa, a takoer u sluajevima kada su dostupni samo dijelovi kukaca (ahure liinki, raspadnute liinke ili dijelovi odrasle jedinke). Analiza DNA, u sluajevima kad je dostupna mala koliina uzorka, jedina je mogua opcija. Za analizu genetikog materijala potrebno je najprije izolirati DNA te je umnoiti lananom reakcijom polimerazom (PCR). Zatim se radi analiza slijeda nukleotida dobivenih fragmenata DNA i usporedba s referentnim uzorcima. Izdvajanje DNA iz uzorka obino nije problem. U primjeni su razliite metode: ekstrakcija fenol/kloroformom, isoljavanjem, s pomou cetil-trimetil-amonijeva bromida (CTAB), ekstrakcija Chelexom ili komercijalnim ekstrakcijskim kompletima (primjerice QIAampTissue Kit ili DNAzol). Entomoloki uzorci, prikupljeni na truplu i oko njega, obino se uvaju u 7095%-tnom etanolu te su tako pohranjeni prikladni za izdvajanje DNA. Kad je god to mogue, analiziraju se primjerci u najkasnijemu razvojnom stadiju, i to radi sprjeavanja kontaminacije stranom
184
Tablica 9-1. Popis forenzino bitnih kukaca* Muhe rod dvokrilci (Diptera) porodica Calliphoridae zujare (engl. blowflies) porodica Sarcophagidae strvinarke (engl. fleshflies) porodica Muscidae muhe (engl. house Flies) porodica Piophilidae sirne muhe (engl. cheese flies) porodica Phoridae grbavice (engl. coffin flies) porodica Sphaeroceridae (engl. lesser corpse flies) porodica Fanniidae (engl. lesser house flies) porodica Sepsidae (engl. black scavenger flies) porodica Heleomyzidae (engl. sun flies) porodica Stratiomyidae (engl. black soldier fly) porodica Staphylinidae kusokrilci (engl. rove beetles) porodica Histeridae kusonje (engl. hister beetles) porodica Silphidae strvinari (engl. carrion beetles) porodica Cleridae (engl. ham beetles) porodica Trogidae (engl. carcass beetles) porodica Dermestidae koukari, gagrice (engl. skin/hide beetles) porodica Scarabaeidae listoroci (engl. bcarab beetles) porodica Nitidulidae sjajnici (engl. sap beetles) porodica Tyroglyphidae porodica Oribatidae porodica Tineidae moljci (engl. clothes-moths)
Kornjai rod kornjai (Coleoptera)
Grinje red grinje (Class Acari) Leptiri rod leptiri (Lepidoptera) Opnokrilci rod opnokrilci (Hymenoptera)
porodica Vespidae ose (engl. wasps) porodica Formicidae mravi (engl. ants) natporodica Apoidea pele (engl. bees)
* popis nije potpun, jer se jo mnoge vrste mogu nai na truplu te mogu postojati bitne razlike s obzirom na klimatske uvjete
DNA (u kasnim su stadijima crijeva liinki prazna) te zbog to tonijeg utvrivanja posmrtnog razdoblja PMI (od engl. postmortal interval). Izdvajanje DNA referentnog uzorka nije uvijek toliko uspjena. Referentni primjerak vrste obino je dio entomoloke zbirke, a izdvajanje moe biti neuspjena zbog degradacije DNA tijekom vremena ili zbog uporabe etilnih estera za ubijanje kukca. Umnoavanje izoliranih fragmenata lananom reakcijom polimerazom (PCR) i analiza sekvencija slijedi uobiajene protokole.
esto su analizirani mitohondrijski geni za podjedinice I i II citokrom-oksidaze (COI i COII), 12S rRNA i 16S rRNA gen. Od nuklearno kodiranih gena najee su analizirani 18S rRNA i 28S rRNA. Do sada je napose analiziran mitohondrijski genom te je kompletan slijed mitohodrijskoga genoma poznat za oko 400 vrsta (pohranjeno kao GOBASE, http>//megasun.bch.umontreal. ca/gobase/). Od mitohondrijskih gena najopsenije je prouavan COI, kao dio pristupa COI DNA barcoding incijative da se na globalnoj razini stvori baza podataka sa sljedovi-
185
ma COI-gena svih ivotinja na Zemlji. Smislenost stvaranja takve, univerzalne baze podataka jo je uvijek predmet ustrih rasprava (za sada su u toj bazi pohranjeni referentni sljedovi za oko 9 600 vrsta http://www.barcodinglife. com). Budui da su muhe forenzino najvaniji kukci, istraivanja su bila usredotoena na red dvokrilaca (Diptera). Unosom slijeda nepoznata uzorka mogue je uiniti filogenetiku analizu usporediti nepoznati uzorak s homolognim podatcima poznatih uzoraka. Ako se takvom analizom i ne otkrije tona vrsta, moe se suziti izbor moguih vrsta te zatim nastaviti s ciljanom analizom. I u redu dvokrilaca najee se analiziraju geni COI i/ili COII. Kada se slijed nukleotida nepoznatog kukca podudara s referentnim uzorkom, moemo zakljuiti da te dvije jedinke pripadaju istoj vrsti ili barem pripadaju istoj skupini vrsta. U sluaju nepodudaranja, moe se u veini sluajeva pretpostaviti da je rije o razliitim vrstama. Ako postoje manja odstupanja u redoslijedu nukleotida, potrebno je procijeniti informacije o varijacijama unutar vrste, ne samo izmeu vrsta. Usporedbom sljedova COI i COII u dvije vrste muha zujara (porodica Calliphoridae, engl. blow fly), Chrysomya rufifacies i Chrysomya albiceps, utvreno je manje od 1% nepodudaranja unutar vrste te oko 3% nepodudaranja izmeu vrsta. (Iako nije iskljueno bar djelomino preklapanje varijacija unutar vrste i varijacija izmeu vrsta.) Slina razina varijacije utvrena je i za muhe str vinarke (porodica Sarcophagidae, engl. flesh fly) Sarcophaga argyrostoma i S. crassipalpis (varijacija unutar vrste 1%, izmeu vrsta oko 3%) te muha zujara (porodica Calliphoridae) Calliphora vicina i C. vomitoria (varijacija unutar vrste <1%, izmeu vrsta oko 5%). Iako su varijacije unutar vrste uglavnom manje od varijacija izmeu vrsta, potrebna je
paljiva interpretacija, jer podatci o sljedovima i varijacijama jo uvijek nisu potpuni. Dodatni su problem mogua krianja izmeu razliitih vrsta te mogue bitne razlike sljedova kod primjeraka iste vrste iz geografski udaljenih lokaliteta. Analiza slijeda zasigurno je najzastupljenija metoda u forenzinoj entomologiji, ponajprije stoga to je to najinformativnija meu dostupnim metodama analize DNA. Kompleti za analizu, raunalizirani analizatori i programska potpora uinili su analizu slijeda dostupnom i relativno lako izvedivom. Mnoge tvrtke danas nude analizu slijeda po relativno povoljnoj cijeni. Analiza slijeda zasigurno je metoda izbora u najveem broju sluajeva kada je potrebno analizirati entomoloke uzorke u forenzinoj primjeni, no, uz analizu slijeda, dostupne su i druge metode analize DNA. Analiza polimorfizma duljine restrikcijskih ulomaka nakon lanane reakcije polimerazom PCR-RFLP (engl. polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism) neto se rjee rabi, ponajprije zbog slabije pouzdanosti. Umnoenu DNA kidaju endonukleaze na karakteristinim mjestima te se dobivaju fragmenti DNA razliite duljine. Ovom se metodom dobiva informacija samo o manjem dijelu slijeda te se, u sluaju varijacije redoslijeda nukleotida unutar vrste na restrikcijskom mjestu, moe doi do lanog iskljuivanja. Metoda nasumino umnoene polimorfne DNA (engl. random amplified polymorphic DNA RAPD) omoguuje brzu identifikaciju vrste kukca i moe posluiti kao pomona metoda pri klasinoj morfolokoj analizi. Jedan primjer primjene te metode bilo je utvrivanje jesu li liinke naene u vrei s truplom bile identine onima naenima izvan vree i kukuljicama na podu ispod trupla. S obzirom na broj vrsta kukaca, jedan od glav-
186
Tablica 9-2. Prednosti i nedostatci RAPD analize Prednosti Nedostatci velika informativnost: varijabilni uzorak kod vei- velika informativnost: varijabilni uzorak kod veine ne (ako ne i svih vrsta) (ako ne i svih) vrsta brzina (pripremljena reakcijska smjesa) razliite visine vraka na elektroferogramu i razliiti oblici vraka
laka pohrana (na sobnoj temperaturi i u hladnja- trenutano ne postoji valjana statistika podrka za ku ako se rijetko rabi) izraunavanje vjerojatnosti/iskljuivanje nije podlona oneienju (unaprijed pripremlje- trenutano ne postoji baza podataka za usporedbu na reakcijska smjesa) profila mala vjerojatnost pogrjeaka pri pipetiranju (vr- rezultati analize u razliitim laboratorijima mogu lo malo koraka pri pripremi) biti razliiti
nih problema u klasificiranju i analizi DNA jest nedostatnost prikladnih poetnica (engl. primer) za PCR. Poetnice za RAPD-analizu nisu vrstnospecifine, a ipak stvaraju jedinstveni uzorak za mnoge ivotinje i biljke. Nedostatak spomenute metode jest osjetljivost na razlike u reakcijskim parametrima PCR-a, ukljuujui i primjenu razliitih instrumenata, no standardizacijom i matematikim pristupom znatno je unaprijeena. RAPD-analiza ima ograniene mogunosti pouzdana je u iskljuivanju (da su dva uzorka razliita), no ne i u potvrdi da dva uzorka potjeu od iste jedinke ili vrste, zbog mogunosti istog ili slinog RAPD-uzorka kod neke druge ivotinje. Unato navedenim ogranienjima, RAPD-analiza mogla bi biti korisna metoda u hitnim forenzinim sluajevima identifikacije liinki, kad uzgoj do odrasle dobi, zbog manjka vremena, nije mogu. Takoer je mogue razlikovanje liinki iz razliitih vremena polaganja jajaaca. Polimorfizam konformacije jednolanane DNA SSCP (engl. single strand conformation polymorphism) vrlo je rijetko rabljena metoda u forenzinim analizama. Omoguuje samo izravnu usporedbu (site-to-site),
jer se dobivaju rezultati koji se teko mogu provjeriti u drugom laboratoriju. To je takoer metoda koja brzo daje rezultate analize, no ne moe osigurati nedvojbeno odreivanje vrste.
9.1.1.
Analiza ljudske DNA izdvojene iz kukaca
Analiza ljudske DNA izolirane iz kukaca jo je jedna bitna primjena molekularnih metoda u rasvjetljivanju zloina. Ta metoda moe biti korisna: 1. u sluajevima kada je truplo dislocirano te su na mjestu mogueg ubojstva pronaene samo liinke, 2. na mjestu zloina postoji alternativni izvor hrane koji je mogao rezultirati pojavom liinki nekrofagnih kukaca, ili 3. kad je pouzdanost prikupljenih dokaza prijeporna. Dokazom ljudske DNA u probavnom sustavu liinke moe se potvrditi da se ona hranila ljudskim truplom. Analizom takve ljudske DNA (Dpetlja, STR-lokusi) moe se dokazati da se liinka hranila tono odreenim truplom. Za takvu se analizu izdvajanje DNA iz liinke radi i za utvrivanje vrste kukca i za povezivanje liinke s njezinim posljednjim obrokom. Budui da je to relativno novo podruje
187
istraivanja, to je metoda jo neispitanih ogranienja. Istraivanja su potvrdila loginu pretpostavku da su zrele liinke treeg stupnja (engl. third-instar larvae duge 1520 mm, stare 46 dana) koje se aktivno hrane na truplu najbolji izvor ljudske DNA. Pri dokazivanju domainove DNA u probavnom sustavu kukca, kljuna je specifinost poetnica. Identifikacija ljudi na osnovi mitohondrijske DNA obino poiva na dvjema hiper varijabilnim regijama (HV1 i HV2) unutar nekodirajue kontrolne regije (D-petlja). Razlikovanje meu kraljenjacima takoer moe biti temeljeno na D-petlji, iako je za veinu ivotinja biljeg izbora kodirajui gen (primjerice citokrom B, Cyt B). Za kukce su forenzini geni za podjedinicu I i II citokrom-oksidaze (COI i COII). DNA kraljenjaka iz razliitih kukaca uspjeno se moe umnoiti i analizirati. DNA izolirana iz komarca (do 26 sati nakon obroka) kvalitativno i kvantitativno je zadovoljavajua za identifikaciju (primjenom analize mikrosatelitnih i minisatelitnih ponavljanja). U forenzinom kontekstu ljudska je DNA uspjeno izolirana i umnoena iz kr vnog obroka i izmeta stidne ui (lat. Phthirius pubis, var. pubis). MtDNA moe biti neoteena i u kasnim fazama raspadanja i uz dugu izloenost okolinim uvjetima te potom biti izolirana iz liinki kukaca koji se pojavljuju na truplu u kasnim fazama raspadanja lea (vrste u kasnoj fazi faunalne sukcesije). Rezultati genetike analize sadraja probavnoga sustava kukca mogu biti kljuni u povezivanju osumnjienog sa rtvom ili mjestom zloina, rekonstrukciji okolnosti zloina ili utvrivanju vjerodostojnosti izjava svjedoka. Uzorke za takvu analizu najbolje je pohraniti na hladnjaku na 70 C ili u 95%-tnom etanolu na sobnoj temperaturi. Pri analizi se analizira ponajprije predcrijevo liinke, koje slui kao skladite hrane. (Za podrobne upu-
te za disekciju i obradbu kukca vidi: Linville JG. i Wells JD. [7] te Campobasso C.P., et al. [6]). Za analizu se mogu upotrijebiti i itave liinke, ako su premale za ralambu (disekciju) ili se predcrijevo vie ne vidi kod kasnih razvojnih stadija liinke. U takvim sluajevima izdvajanje DNA moe biti manje uspjeno, posebice ako su liinke bile ive neko vrijeme (dan ili dva dana) nakon to su uklonjene s tijela.
9.2.
Forenzina analiza kraljenjaka
Primjenu analize ivotinjskih uzoraka moemo naelno podijeliti na: 1. forenzinu primjenu te 2. analizu ivotinjske DNA pri kontroli podrijetla prehrambenih proizvoda. Povremeno se u sudskomedicinskoj problematici pojavljuju bioloki tragovi koji ne potjeu od ljudi te je utvrivanje vrste kojoj takav uzorak pripada pr vi korak pri postupku identifikacije. Tradicionalno se to postizalo prouavanjem odreenih morfolokih znaajki te dokazom vrstnospecifinih proteina (elektroforetikim, kromatografskim ili imunolokim metodama). Danas se temelji na razliitosti slijeda nukleotida odreenih regija DNA. Gotovo svaka vrsta moe se genetiki okarakterizirati s visokim stupnjem sigurnosti. Napredak molekularne biologije i molekularne tehnike (razluivosti i specifinosti) danas olakavaju odreivanje vrste, no omoguuju i prjelazak na razinu utvrivanja jedinke vrste o kojoj je rije. Lanana reakcija polimerazom i izravno sekvenciranje DNA omoguuju brzu i pouzdanu identifikaciju i uzoraka koji sadravaju samo nekoliko kopija DNA koju se analizira. Osim primjene u razliitim sluajevima humane forenzine
188
analize, metode analize ivotinjske DNA u forenzinome smislu danas imaju mnogo iru primjenu. Neke su od primjena u sluajevima zatite divljih ivotinja te pri provjeri podrijetla i sigurnosti hrane. Standardi i smjernice za analizu ivotinjskih uzoraka jo se uvijek razvijaju i utvruju, temeljeni na modelu forenzine analize ljudske DNA, a ukljuuju analitike postupke, provjere valjanosti, nomenklaturu, validaciju alela, populacijska ispitivanja, statistiku, testiranje izvrsnosti i izvjeivanje. Metode analize neljudske DNA kao dokaz su nale put do sudnice, no, za potpunu afirmaciju nuno je tono definiranje standarda i smjernica. Principi forenzine analize ivotinjske DNA prikazani su ponajprije s osvrtom na analizu psee DNA, no temeljna su naela ista i za ostale ivotinjske uzorke. U oko 90% objavljenih istraivanja molekularne identifikacije ivotinja primijenjena je neka od sljedeih triju metoda: vrstnospecifini PCR, PCR-RFLP i PCR-FINS (forensically informative nucleotide sequencing). Vrstnospecifini PCR temelji se na primjeni poetnica karakteristinih za odreenu vrstu. PCR-RFLP je analiza polimorfizma duljine restrikcijskih ulomaka nakon lanane reakcije polimerazom (primjerice, umnoeni fragmenti citokroma B izloe se djelovanju razliitih restrikcijskih enzima, a zatim se analiziraju dobiveni fragmenti). Prednosti vrstnospecifinog PCR-a i PCR-RFLP-a jesu brzina razvoja molekularnih biljega, niska cijena i nedvosmisleni rezultati. PCR-FINS je najizravnija metoda za dobivanje informacija iz produkata umnoavanja PCR-a, a temelji se na primjeni univerzalnih poetnica za neke (forenzino informativne) regije ili gene. Takav pristup omoguuje identifikaciju velikoga broja vrsta, a ipak nije previe osjetljiv na varijacije unutar vrste. Prednost je i da se s pomou kloniranja moe dokazati DNA
razliitih vrsta u istom uzorku. Novije metode poput lanane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (real time PCR) i DNAipova nisu jo uvijek znatno zastupljene u forenzinoj analizi ivotinja. Tri su glavne skupine forenzinih sluajeva kad je ivotinjska DNA dokaz: 1. ivotinja kao svjedok (povezivanje osumnjienog i rtve ili povezivanje osumnjienog s mjestom zloina), 2. ivotinja kao rtva i 3. ivotinja kao poinitelj (pri napadu na ovjeka). Velik broj ljudi u razvijenim zemljama dri ivotinje u kui, a ponajprije su to psi i make. U SAD-u 50% kuanstava ima bar jednog psa ili maku. U Europi 510% ljudi ima bar jednog psa, a 816% barem jednu maku. Ljudi su esto vrlo bliski sa svojim ljubimcima, tako da se njihove dlake lako nau posvuda: na odjei, po kui, u automobilu (primarnim ili sekundarnim prijenosom). Dlake su najei forenzini nalaz, no kao uzorak mogu biti i ostatci sline, izmeta i drugo. Gotovo je nemogue posjetiti kuu u kojoj se dri dlakavi kuni ljubimac, a da se posjetitelj ne kontaminira ivotinjskim dlakama. Budui da je pas najei kuni ljubimac, on je i forenzino najvanija ivotinja te za njih postoji najvie forenzinih podataka. Dokazi ivotinjskog podrijetla mogu biti naeni u sluajevima kad je rtva ili poinitelj bio u (bliskom) kontaktu s nekom ivotinjom, pri napadu divljih ili domaih ivotinja na ljude itd. Dosta je opisanih sluajeva kad je trag/dokaz ivotinjskog podrijetla bio poveznica osumnjienog i mjesta zloina. Neki su od njih dobro poznati u forenzinim krugovima, poput tzv. Snowball sluaja iz 1994. Analiza 10 specifinih majih dinukleotidnih ponavljanja iz uzoraka majih dlaka s kr vlju umrljane kone jakne naene na mjestu ubojstva potvrdila je da dlake pripadaju maki zvanoj Snowball, koja je ivjela s osumnjienikom.
189
ivotinje linjanjem gube mnogo vie dlaka nego njihovi vlasnici te vjerojatnost pronalaska biolokoga traga koji potjee od ljubimca moe biti vea nego vjerojatnost pronalaska uzorka koji potjee vlasnika. ivotinjska je dlaka est nalaz na mjestu zloina, no ipak je taj dokaz esto previen. Moderna analiza ivotinjske DNA u slubi humane forenzine analize obino ide u smjeru dokaza da je odreena jedinka predmnijevane vrste izvor odreenoga biolokog traga. Veina dlaka koje ivotinje otputaju linjanjem ima korijen, no, ako nema korijena i ako je koliina uzorka vrlo mala (nekoliko ivotinjskih dlaka), analiza moe biti problematina. U takvim sluajevima moe se pokuati poboljati ekstrakcijski postupnik. Jedno od moguih poboljanja jest primjena ekstrakcijskog pufera s Ca2+, umjesto EDTA ili Chelexa, jer aktivira proteinazu K. Analizu DNA prema podrijetlu DNA dijelimo na: 1. analizu jezgrine DNA te 2. na analizu mitohondrijske DNA.
9.2.1.
Analiza jezgrine DNA
Pri forenzinoj analizi jezgrine DNA u ivotinja se gotovo iskljuivo radi o analizi mikrosatelitnih ponavljanja. Aleli mikrosatelitnih lokusa razlikuju se po broju ponavljanja odreenoga slijeda nukleotida (27 nukleotida). Aleli umnoene regije nakon elektroforetikog se razdvajanja razabiru detekcijom radioaktivnosti, bojenja srebrom ili fluorescentnog signala. Druge metode analize DNA, poput RFLP i RAPD-analize, rjee su primjenjivane, ponajprije zbog slabije dokazne snage tih biljega, iako te metode imaju neke prednosti (kao metoda probira, cijena). Poetnice za neke visoko konzer virane sljedove DNA, kao, na primjer, amelogeninski sustav, umnoavaju DNA razliitih vrsta. Umnoeni ulomci DNA s amelogeninskim poetnicama razliite su duljine,
no varijabilnost meu vrstama je mala. Takve su metode nedovoljno informativne za valjanu analizu. Analiza jezgrinih mikrosatelitnih ponavljanja ljudskoga genoma u svrhu identifikacije jedinke standard je u humanoj forenzinoj analizi. Mikrosatelitni STR (od engl. short tandem repeat) lokusi su vrlo informativni biljezi, iroko su prihvaeni u forenzinoj zajednici i postoji dosta komercijalnih STR-kompleta. Analizom mikrosatelitnih ponavljanja, uporabom vrstnospecifinih poetnica, dobiva se informacija o vrsti od koje uzorak potjee. Sroenost uobiajena u domaih ivotinja smanjuje varijacije u mikrosatelitnim ponavljanjima i time njihovu dokaznu vrijednost. Veim brojem prouavanih lokusa postie se visoka mo razluivanja, te je utvreno da psei STR-lokusi imaju podjednaku diskriminatornu mo kao i ljudski STR-lokusi. Velik broj pseih STR-biljega i odgovarajuih poetnica opisan je u literaturi, razvijene su baze podataka i provedena populacijska istraivanja te se ti podatci rabe u svrhu forenzine identifikacije, ali i za potrebe uzgoja pasmina pasa i provjere rodovnika. Unato tomu, informacije o sekvencijama jo su uvijek nepotpune, a populacijski podatci nisu iroko primjenjivi. Do sada je podrobno proueno i opisano dvadesetak pseih STR-biljega, no ne postoji meunarodni dogovor o standardnom setu biljega dostatnom za pouzdano utvrivanje identiteta psee jedinke. Na tritu postoje brojni multipleksni kompleti za identifikaciju pasa. Pri uporabi komercijalnih kompleta za identifikaciju vrste/jedinke preporuljivo je napraviti kvantitativnu analizu izolata DNA. Ispad alela (allele drop-out) i nejednakost alela uoeni su kad je poetna koliina ulazne DNA bila manja od 50 pg, no i prevelika koliina DNA moe uzrokovati probleme pri analizi. Metoda koja ujedinjuje kvantitativnu ana-
190
Tablica 9-3. Neki predloeni setovi biljega za identifikaciju pasa Prijedlog seta od 17 mikrosate- StockMarks za pse (Canine Prijedlog seta od 15 mikrosatelitlitnih biljega (DeNise et al. [7]) Genotyping Kit) 10 biljega* nih biljega (Eichman et al. [11]) PEZ 6 PEZ 12 PEZ 5 PEZ 3 PEZ 8 FHC 2054 PEZ 20 FHC 2010 FHC 2079 CATA1 PEZ 10 PEZ 11 PEZ 13 PEZ 15 PEZ 16 PEZ 17 PEZ 21 PEZ 6 PEZ 12 PEZ 5 PEZ 3 PEZ 8 FHC 2054 PEZ 20 FHC 2010 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 6 PEZ 12 FH 2087a ZUBECA 4 WILMS-TF FH 2054 ZUBECA 6 FH 2010 FH 2079 FH 2132 PEZ 2 FH 2611 VWF.X PEZ 15 SRY CHR.X
* izbor mikrosatelitnih biljega po preporuci Amerikoga kinolokog drutva (Americal Kennel Club)
lizu i umnoavanje DNA kvantitativna je lananoj reakciji polimerazom u stvarnom vremenu qPCR (od engl. quantitative real-time PCR). Jedna od esto upotrebljavanih metoda za qPCR jest uz uporabu TaqMan probi za MC1R gen (Melanocortin-1 Receptor, kodiran jezgrinim genomom), a drugi za regiju SINE (short interspersed element, dio mtDNA) uz SYBR Green I boju. Kvantifikacija DNA poglavito je potrebna radi optimiziranja uvjeta lanane reakcije polimerazom (PCR), multiplex PCR i stoga to komercijalni kompleti najbolje funkcioniraju u relativno uskom rasponu koncentracije izolirane DNA. Veina istraivanja prouava nekoliko vrsta ivotinja u trima glavnim skupinama kraljenjaka sisavaca, riba i ptica (jezgrina DNA i/ili mitohondrijska DNA). U sisavaca je u veini istraivanja rije o psima i makama te o ostalim eim domaim ivotinjama (govedo, svinja, ovca i koza), dok su ostalo uglav-
nom ugroene vrste ivotinja. Meu pticama u 60% istraivanja radilo se o kokoima i/ili purama, dok su ostala istraivanja najee obuhvaala guske, patke i nojeve. Broj prouavanih ribljih vrsta mnogo je vei, no najee su prouavani tuna, losos i keiga. Usprkos relativno velikom broju objavljenih istraivanja, broj vrsta za koje postoje podatci o molekularnoj identifikaciji jo je uvijek relativno malen, moda za stotinjak vrsta. Za ivotinjske vrste za koje postoji manji (forenzini) interes ne postoje komercijalni kompleti. Za te je vrste jo potrebno dogovoriti nomenklaturu alela (najpraktinije temeljeno po broju ponavljanja, slinoj onoj u ljudskih STR-lokusa), razviti standard za svaki biljeg (allelic ladder) i odrediti kontrolni uzorak DNA, ime e se omoguiti usporedivost rezultata razliitih laboratorija i primjenjivost populacijskih podataka u cijeloj forenzinoj zajednici.
191
Tablica 9-4. Neki komercijalni mikrosatelitni kompleti za analizu ivotinjske DNA pas, vuk StockMarks for Dogs Canine Genotyping Kit Canine MapPairs Microsatellite Markers domaa maka i druge vrste porodice Feline MapPairs Microsatellite Markers Felidae (puma, ocelet, itd.) MeowPlex govedo, bizon konj, magarac, zebra i njihovi krianci koza svinja ovca impanza ljama The StockMarks for Cattle Bovine Genotyping Kit Bovine MapPairs Microsatellite Markers StockMarks for Horses Equine Genotyping Kit Equine MapPairs Microsatellite Markers Caprine MapPairs Microsatellite Markers Porcine MapPairs Microsatellite Markers Ovine MapPairs Microsatellite Markers Chimpanzee MapPairs Microsatellite Markers Llama MapPairs Microsatellite Markers
9.2.2.
Analiza mitohondrijske DNA
DNA u keratiniziranim stanicama dlake dosta je degradirana, duljine samo oko 100 pb. Ako analiza jezgrine DNA iz dlake ili iz drugih forenzinih uzoraka ne daje rezultat, moe se analizirati mtDNA. S obzirom na vei broj kopija (103104 po stanici) i esto manju degradaciju od jezgrine DNA, mitohondrijska DNA osobito je korisna pri analizi jako raspadnutih uzoraka (dlake ili nekih drugih ivotinjskih uzoraka). Mitohondrijski genom nalazi se u obliku male krune molekule (veliine oko 16 kb u veine kraljenjaka). Nasljeuje se maternalno u veine ivotinjskih vrsta i ne podlijee rekombinaciji te je stoga analiza jednostavnija. MtDNA evoluira mnogo bre od jezgrine DNA pa se analizom mtDNA mogu diferencirati i identificirati bliske vrste. Zbog visoke ureenosti mtDNA domaih ivotinja ima manje varijacija nego u ljudi te je posljedica i neto slabija mo razluivanja ove metode.
S druge strane, forenzina identifikacija na temelju mtDNA ima neke nedostatke. Zbog maternalnog nasljeivanja ne mogu se razluiti srodnici s majine strane. Jedinka moe imati dvije populacije mitohondrija (heteroplazma), to moe zakomplicirati tumaenje rezultata. MtDNA redovito migrira u jezgrinu DNA, gdje fragmenti mogu biti stabilizirani kao pseudogeni. Jezgrina mtDNA moe biti protumaena za pravu mtDNA i dovesti do pogrjenih zakljuaka. Analiza mtDNA naelno se moe podijeliti u dvije skupine analiza: 1. odreivanje vrste od koje uzorak potjee te 2. odreivanje jedinke unutar neke vrste/pasmine. Prikladan DNA-biljeg za identifikaciju na razini vrste trebao bi biti dovoljno varijabilan meu vrstama (osobito meu onim najbliskijim) te imati nikakve ili slabe varijacije unutar vrste s obzirom na geografsku distribuciju. K tomu bi taj biljeg trebao biti prouavan u velikome broju vrsta da bi bila mogua usporedba nepoznatog uzroka s referentnim sekvencijama
192
iz baze podataka. Gen za citokrom B (cyt B cytochrome B) zadovoljava veinu ovih uvjeta te je kudikamo najee prouavani gen za filogenetike potrebe. Oko 80 000 sekvencija citokroma B dostupno je u GenBank u 2007. godini. Taj gen ima konzer viranu regiju, to omoguuje uporabu univerzalnih poetnica, ali i visoko varijabilne ulomke, to pak omoguuje prouavanje i vrlo bliskih vrsta. Otprilike u polovine svih istraivanja molekularne identifikacije ciljni je gen citokrom B. Uestalo prouavana regija mtDNA jest i D-petlja. To je nekodirajua, hiper varijabilna regija (otprilike 500 pb) mtDNA te je polimorfizam te regije dosta prouavan u genetici razliitih ivotinjskih vrsta. Identitet jedinke unutar vrste/pasmine moe se utvrditi analizom mtDNA. Slino kao to se radi u analizi ljudske mtDNA, u pasa su prouavana dva hiper varijabilna segmenta, HVS-I (engl. hypervariable segment I) i HVS-II unutar kontrolne regije mtDNA.
Tablica 9-5. Neke dostupne referentne sekvence mitohodrijskog genoma nekih forenziki bitnijih ivotinja (s pristupnim kodom u NCBI National Center for Biotechnology Information). domae ivotinje pas (NC_002008) maka (NC_001700) govedo (NC_001567) koko (NC_001323) koza (NC_005044) konj (NC_001640) svinja (NC_000845) ovca (NC_001941) divlje ivotinje jelen (NC_004563) medvjed (NC_s003426) losos (NC_001960) keiga (NC_004420)
Sekvenciranje kontrolne regije u maaka neto je sloenije zbog podruja dugih ponavljanja LTR (long tandem repeat) u sredini. Ovo ponavljanje unosi znatan polimorfizam u sekvenciju, no zbog veliine fragmenata moe biti potekoa pri sekvenciranju forenzinih uzoraka, kao to su dlake. Meu ee prouavanim biljezima jo su geni za 12S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, a povremeno je ispitivano jo petnaestak drugih biljega. Razvoj sudskomedicinske prakse koji se odnosi iskljuivo na ivotinjska bia poinje donoenjem jasnih zakona i propisa o trgovini, zatiti, dobrobiti i ouvanju razliitih ivotinjskih vrsta. Analiza ivotinjske DNA u takvim sluajevima ima neke svoje posebnosti (wildlife forensics). Na treem mjestu po uestalosti protuzakonite trgovine, nakon droga i oruja, jesu razliite divlje ivotinje ive ili njihovi dijelovi. Milijuni ugroenih ivotinja bivaju nezakonito ubijeni ili uhvaeni za privatne zooloke zbirke, lovne trofeje, ukrasne predmete (bjelokost), za hranu (morske kornjae i njihova jaja) ili za sastojke lijekova tradicionalne medicine (tigrovi i nosorozi). Zatita ugroenih ivotinja i bioloke raznolikosti zahtijevaju pouzdane i tone metode utvrivanja ivotinjske vrste u irokom rasponu uzoraka. Analiza ivotinjske DNA u slubi animalne forenzine analize ivotinja obino ide u smjeru dokaza da je odreena vrsta izvor odreenoga biolokog traga. Kao pr va metoda probira identifikacije vrste od koje potjee neki uzorak, moe biti analiza mitohondrijskoga gena citokroma B, a zatim eventualna tona identifikacija jedinke utvrene vrste (primjerice analizom jezgrinih STR-lokusa ili kontrolne regije mtDNA). Izvor DNA u takvim sluajevima mogu biti vrlo razliiti dijelovi tijela: kljove, kosti, meso, rogovi, koa, krzno, jaja, krv itd.
193
Uporabom univerzalnih poetnica za specifini segment mitohondrijskoga gena citokroma B moe se odrediti pripadanje uzorka nekoj od velikoga broja sekvenciranih vrsta. 3' krajevi poetnica nalijeu na evolucijski ouvanu regiju citokroma B, to osigurava univerzalnost primjene, a vrlo varijabilni nizvodni sljedovi umnoeni tim poetnicama omoguuju filogenetiku analizu do razine porodice, roda i vrste. Na osnovi analize gena citokroma B moe se utvrditi filogenetiko srodstvo meu vrstama, a sline genetike analize danas su temelj moderne molekularne taksonomije i sistematike.
9.2.3. 9.2.3.1.
Ostali izvori ivotinjske DNA

Slina
Ostatci sline kao bioloki trag gotovo iskljuivo potjeu od pasa. Takav se ivotinjski uzorak nalazi pri napadu na ljude ili kao trag na mjestu zloina. Pri napadu ivotinje na ovjeka analiza sline iz rane i njezine neposredne okolice moe biti pouzdanija u utvrivanju identiteta napadaa nego dokaz analize ivotinjske dlake ili kr vi naene na rtvinoj odjei. Pri izdvajanju ivotinjske DNA iz (ostataka) sline mogui su problemi zbog relativno velike koliine DNA rtve i male koliine ivotinjske DNA (primjerice kr vavi zavoj). Kod takvih uzoraka moe biti vrlo korisna kvantifikacija DNA s pomou qPCR. Kvantifikacija moe pomoi uspjehu genotipiziranja s pomou STR-lokusa kod uzoraka s malom koliinom DNA. Pokazalo se da je izdvajanje ivotinjske DNA uz veliku koliinu kr vi rtve ipak najee uspjena. Kod manje kr vavih uzoraka uzrok neuspjeha u izdvajanju ivotinjske DNA moe biti posljedica ienja rane.
9.2.3.2.
Fekalni materijal
Fekalni je materijal povremeno forenzini uzorak. Izvor DNA u fekalnom ma-
terijalu jesu epitelne stanice koje se ljute s crijevne stijenke. Epitelne stanice ug lavnom ostaju na povrini izmeta te je povrina fecesa izvor najmanje degradirane DNA, s najniom koncentracijom inhibitora PCRa. Svje fekalni materijal kao vrlo pouzdan izvor DNA tek je neto manje pouzdan od kr vi ili tkiva. Najuspjenijim metodama izdvajanja DNA pokazale su se metode s cetil-trimetilamonijevim bromidom (CTAB), s gvanidintiocijanatom, magnetnim kuglicama te komercijalnim kompletima za izdvajanje DNA iz fekalnog materijala. Uspjenost izdvajanja moe ovisiti o stanju fekalnog uzorka. Prije izdvajanja DNA uzorci trebaju biti pohranjeni u 70100%-tnom etanolu ili u DETS-otopini (DMSO/EDTA/Tris/salt), no i suenje je prihvatljiva metoda pohrane. (Uzorci bi se trebali to prije osuiti, jer time DNA na povrini biva najkrae izloena bakterijskoj degradaciji.) Glavni problem kod uporabe fekalnog materijala kao izvora DNA jesu razliite neistoe, poput unih soli i drugih polifenolnih spojeva, koje ometaju PCR. Jedan od naina smanjenja koliine inhibitora jest ispiranje povrine fecesa fosfatnim puferom (PBS phosphate-buffered saline, pH 7,4), uz izbjegavanje dezintegracije uzorka, kao i uporaba supernatanta te otopine za izdvajanje DNA. Za inaktivaciju PCR-inhibitora preporuuje se dodavanje BSA goveega serumskog albumina (engl. bovine serum albumin) u reakcijsku smjesu za PCR. Iako su se istraivanja s jezgrinom DNA pokazala uspjenima, odreen udio lananih reakcija polimerazom daje netone rezultate (ispad ili lani aleli), tako da je za pouzdano genotipiziranje potreban vei broj istovjetnih PCR-a. No, feces se pokazao kao dobar izvor mtDNA. U svakom sluaju, uvijek je potrebno raditi barem dvije lanane reakcije polimerazom iz istog uzorka.
194
9.2.4.
Izvjeivanje i statistiko potkrjepljivanje analize ivotinjske DNA
Pri vrjednovanju i izvjeivanju o ivotinjskim dokazima potrebno je dobro statistiki poduprijeti rezultate analize DNA. Nekoliko je metoda za utvrivanje pouzdanosti dokaza brojenje (counting), vjerojatnost sluajnog podudaranja (random match probabilities), omjer vjerojatnosti LR (likelihood ratios), vjerojatnost iskljuivanja (probability of exclusion) i metode temeljene na Bayesovu teoremu. Uz uvjet odabira primjerene statistike metode i pravilnu primjenu, iz svake se od ovih statistikih metoda mogu dobiti pouzdani zakljuci. Potreban je oprez pri statistikim proraunima za domae ivotinje (meu kojima su uobiajena sroenost i substrukturiranost populacije). Ako se rauna odabrani LR, pri izraunu frekvencije genotipova potrebno je uraunati i odreeni koeficijent substrukturiranosti populacije ( population substructure coeficient). Prema podatcima iz nekih istraivanja, za pse je njegova vrijednost = 0,11 (prema pseoj STR-bazi podataka tvrtke Zoogen). Za domae make nema dostupnih procjena sroenosti, no nasumino sparivanje prisutno je ee nego u pasa te je veina mijeanog podrijetla. Pri izvjeivanju o rezultatima analize ivotinjske DNA potrebno je napomenuti koja/koje statistike metode su primijenjene, uz algoritam izrauna i citiranje referencije.
9.2.5.
Forenzina analiza u kontroli podrijetla prehrambenih proizvoda
Skoranji strahovi u vezi s hranom (poput kravljeg ludila BSE /Bovine Spongiform Encephalopathy/, ptije gripe, slinavke i
apa itd.), nesavjesnost nekih proizvoaa hrane, religijski razlozi, alergije na hranu i genetiki modificirani organizmi (GMO) podigli su svijest javnosti o sastavu prehrambenih proizvoda. Molekularne metode mogu biti primijenjene i za utvrivanje podrijetla prehrambenih proizvoda, ponajprije mesa, no i krmiva u prehrani domaih ivotinja. Specifinost takve analize DNA jesu problemi zbog mogue jake degradacije DNA tijekom postupka proizvodnje. Sirovine prehrambenih proizvoda mogu biti podvrgnute termikoj obradbi, visokom tlaku, razliitom pH, zraenju, isuivanju i tako dalje. Molekularne metode identifikacije takvih vrlo degradiranih proizvoda trebaju biti usmjerene na analizu vrlo kratkih ulomaka DNA, dugakih izmeu 100200 parova baza. Uz to to je degradirana, DNA je prisutna u maloj koliini, to znatno smanjuje broj DNA-ulomaka prikladnih za molekularnu analizu. Zbog tih je razloga katkad potrebno poveati broj ciklusa lanane reakcije polimerazom na 45 ili 55 da bi se dobila dovoljna koliina DNA za susljedne analize. Poetnice za analizu takve DNA moraju biti vrlo specifine. Za postizanje visoke pouzdanosti analize nuno je paljivo odvajanje postupaka prije i nakon lanane reakcije polimerazom te uporaba negativnih kontrola pri svakoj analizi. Budui da je PCR vrlo osjetljiva metoda, moe se preteno umnoiti samo jedna strana molekula DNA, umjesto degradirane DNA. Primjer primjene molekularnih metoda pri utvrivanju podrijetla hrane jest istraivanje sastava jedne hrane za kune ljubimce (sl. 9-1). Na konzer vi je bilo naznaeno samo da ima okus mesa. DNA je izolirana i umnoena uporabom univerzalnih poetnica za citokrom B. Umnoene su DNA klonirane i razdvojene te se dobilo 30 klonova, koji su zatim izravno sekvencirani. U tom je proizvo-
195
du dokazana prisutnost 5 vrsta kraljenjaka: goveda (Bos taurus 7 klonova), svinje (Sus scrofa 4 klona), patke (Cairina moschata 5 klonova), kokoi (Gallus gallus 7 klonova) i lososa (Salmo trutta 7 klonova). Ova je metoda, uz DNA-ipove, jedina koja omoguuje identifikaciju velikoga broja vrsta upotrijebljenih u prehrambenim proizvodima. Kontrola podrijetla prehrambenih proizvoda izuzetno je bitna s vie stajalita. Primjer viestruke opravdanosti takve kontrole moe se vidjeti na primjeru identifikacije goveda. Goveda su zanimljiva zbog velikoga znaenja u ljudskoj prehrani, ali i zbog opasnosti koje moe donijeti konzumiranje mesa upitnoga podrijetla. Molekularna biologija omoguuje praenje puteva ivotinja koje ulaze u ljudsku prehranu (from stable to table), te time pomo u suzbijanju crnog trita stoke,
ponajprije goveda. Deklaracija na prehrambenom proizvodu trebala bi omoguiti sljedivost komada mesa do ivotinje od koje (kojih) potjee. U interesu je svake drave takav oblik nadzora kakvoe, no to je nuno i za meunarodnu trgovinu prehrambenih proizvoda. Time se istodobno postie osiguranje kakvoe i zatita proizvoaa koji svoje stado uzgajaju u skladu s meunarodnim smjernicama za suzbijanje i sprjeavanje irenja zoonoza i drugih bolesti od kojih ovjek moe oboljeti konzumiranjem zaraenoga mesa. Osiguranje kontroliranog podrijetla nuno je i za certifikaciju autohtonosti odreenih prehrambenih proizvoda i podrijetla sirovina za proizvodnju odreenih proizvoda od autohtonih pasmina te dokaz geografskog podrijetla. S praktinoga stajalita malo je dostupnih kompleta za identifikaciju domaih ivotinja.
Slika 9-1. Shema analize DNA ivotinjskoga podrijetla.
196
Trenutano dostupne komplete je potrebno usavriti (na osnovi naih iskustava, ponajvie u identifikaciji goveda) i time poboljati vjerodostojnost nalaza identifikacije, iako je uz paljivu, strunu i iskusnu interpretaciju analize DNA mogue postii vrlo visoku vjerojatnost identifikacije jedinke. Mnogi sastojci hrane mogu biti izolirani zajedno s ciljnom DNA, a poznati su kao inhibitori umnoavanja DNA. Neki su od njih polisaharidi, glikogen, masti, bjelanevine mlijeka, kolagen, eljezo. Neumnoavanje DNA iz hrane ili forenzinog uzorka (negativan rezultat) moe biti objanjeno inhibicijom umnoavanja u lananoj reakciji polimerazom, a ne samo nepostojanjem ili nedostatnom koliinom ciljne DNA. Neke od inhibitora
mogue je neutralizirati dodatkom BSA ili spermidina u reakcijsku smjesu za PCR. Opisane su brojne metode izdvajanja DNA, no ni jedan se protokol nije pokazao prikladnim za sve vrste uzoraka. Za svaki novi oblik uzorka prehrambenoga proizvoda moe biti potrebno prilagoditi postojee metode izdvajanja i umnoavanja DNA. Molekula DNA izdvojena iz prehrambenih uzoraka, ali i iz drugih forenzinih uzoraka izloenih razliitim okolinim uvjetima (kiseli medij, UV-svjetlo, vlaga itd.), moe biti kemijski modificirana. U takvim sluajevima mogu nastati lomovi ili mutacije, tako da pri analizi takvih uzoraka treba imati na umu i mogunost postojanja artefakata.
Literatura Forenzina entomologija

1. Amendt J. et al. Best practice in forensic entomology standards and guidelines. Int J Legal Med 2007;121(2):90104. 2. Amendt J, Krettek R, Zehner R. Forensic entomology. Naturwissenschaften 2004;91(2)5165. 3. Benecke M. A brief history of forensic entomology. Forensic Sci Int 2001;120(12):214. 4. Benecke M. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) typing of necrophageous insects (Diptera, Coleoptera) in criminal forensic studies: validation and use in practice. Forensic Sci Int 1998;98(3):15768. 5. Campobasso CP, Introna F. The forensic entomologist in the context of the forensic pathologists role. Forensic Sci Int 2001;120(12):1329. 6. Campobasso CP. et al. Forensic genetic analysis of insect gut contents. Am J Forensic Med Pathol 2005. 26(2):1615. 7. Linville JG, Wells JD. Surface sterilization of a maggot using bleach does not interfere with mitochondrial DNA analysis of crop contents. J Forensic Sci 2002;47(5):10559. 8. Maceljski M. Poljoprivredna entomologija, Zrinski, akovec, 2002. 9. Nelson LA. et al. Using COI barcodes to identify forensically and medically important blowflies. Med Vet Entomol 2007;21(1):4452. 10. Wells JD, Sperling FAH. DNA-based identification of forensically important Chrysomyinae (Diptera: Calliphoridae). Forensic Sci Int 2001;120(1):1105. 11. Wikipedia contributors. Forensic entomology [Internet]. Wikipedia, The Free Encyclopedia; 2007 Jul 7, 20:36 UTC [cited 2007 Jul 9]. Available from: http://en.wikipedia.org/w/index. php?title=Forensic_entomology&oldid=143158 243.
Forenzina analiza ivotinja

1. Andreas P, Hellmann AP. et al. A proposal for standardization in forensic canine DNA typing: Allele nomenclature of six canine-specific STR Loci. J Forensic Sci., 2006;51(2):27481. 2. Bataille M. et al. Multiplex amplification of mitochondrial DNA for human and species identi-
197
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
fication in forensic evaluation. Forensic Sci Int 1999;99(3):16570. Bjrnstad G, Red KH. Evaluation of factors affecting individual assignment precision using microsatellite data from horse breeds and simulated breed crosses. Animal Genetics 2002;33(4):6470. Bowling AT, Del Valle A, Bowling M. A pedigree-based study of mitochondrial D-loop DNA sequence variation among Arabian horses. Animal Genetics 2000;31(1):17. Budowle B. et al. Recommendations for animal DNA forensic and identity testing. Int J Legal Med 2005;119(5):295302. Dalmasso A. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol Cell Probes 2004;18(2):817. DeNise S. et al. Power of exclusion for parentage verification and probability of match for identity in American kennel club breeds using 17 canine microsatellite markers. Animal Genetics 2004;35(1):147. Dimsoski P. Development of a 17-plex microsatellite polymerase chain reaction kit for genotyping horses. Croat Med J 2003;44(3):3325. Eichmann C, Parson W. Molecular characterization of the canine mitochondrial DNA control region for forensic applications. Int J Legal Med. 2007 Jan 12; [Epub ahead of print] Eichmann C. et al. Canine-specific STR typing of saliva traces on dog bite wounds. Int J Legal Med 2004;118(6): 33742. Eichmann C. et al. Estimating the probability of identity in a random dog population using 15 highly polymorphic canine STR markers. Forensic Sci Int 2005;151(1): 3744. Evans JJ. Real-time polymerase chain reaction quantification of canine DNA. J Forensic Sci 2007;52(1):936. Flagstad . et al. Reliable noninvasive genotyping based on excremental PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol. Mol Ecol 1999;8(5):87983. Guha S, Kashyap VK. Molecular identification of lizard by RAPD & FINS of mitochondrial 16s rRNA gene. Legal Medicine 2006;8(1):510. Halverson JL, Basten C. Forensic DNA identification of animal-derived trace evidence: Tools for linking victims and suspects. Croat Med J 2005;46(4):598605.
16. Imaizumi K. et al. Development of species identification tests targeting the 16S ribosomal RNA coding region in mitochondrial DNA. Int J Legal Med 2007;121(3):18491. 17. Jobling MA, Gill P. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nat Rev Genet 2004;5(10):73951. 18. Karlsson AO, Holmlund G. Identification of mammal species using species-specific DNA pyrosequencing, Forensic Sci Int 2007;doi:10.1016/ j.forsciint.2007.01.019 19. Kurose N, Masuda R, Tatara M. Fecal DNA Analysis for identifying species and sex of sympatric carnivores: A noninvasive method for conser vation on the Tsushima Islands, Japan, Journal of Heredity 2005;96(6):68897. 20. Nakaki S. et al. Study of animal species (human, dog and cat) identification using a multiplex single-base primer extension reaction in the cytochrome b gene. Forensic Sci Int 2007;doi:10.1016/ j.forsciint.2007.02.010 21. Pfeiffer I. et al. Forensic DNA-typing of dog hair: DNA-extraction and PCR amplification, Forensic Sci Int 2004;141(2-3):14951. 22. Verma SK, Singh L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes 2003;3(1):2831. 23. Schanfield MS. Review of: fundamentals of forensic science. J Forensic Sci 2007;52(3):7489. 24. Teletchea F, Maudet C, Hnni C. Food and forensic molecular identification: update and challenges. Trends Biotechnol 2005;23(7):35966. 25. Verma SK. et al. Was elusive carnivore a panther? DNA typing of faeces reveals the mystery. Forensic Sci Int 2003;137(1):1620. 26. Walsh SJ. Recent advances in forensic genetics. Expert Rev Mol Diag 2004;4(1):3140. 27. Wasser SK. et al. Using DNA to track the origin of the largest ivory seizure since the 1989 trade ban. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(10):422833. 28. Wehausen JD, Ramey II, RR. Epps CW. Experiments in DNA extraction and PCR amplification from bighorn sheep feces: the importance of DNA extraction method. Journal of Heredity 2004;95(6):5039. 29. Wetton JH. et al. Mitochondrial profiling of dog hairs. Forensic Sci Int 2003;133(3):23541.
198
10.
Forenzina botanika: biljke kao dokazi u kriminalistikim sluajevima

Heather Miller Coyle, Timothy M. Palmbach
Sadraj poglavlja
10.1. 10.2. 10.3. Uvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 Prikupljanje dokaza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 Pregled tehnika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 10.3.1. Mikroskopija. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 10.3.2. Identifikacija vrste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 10.3.3. Individualizacija DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 Palinologija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Nestale osobe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 10.5.1. Mjesto pronalaska tijela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 Toksikologija. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 10.6.1. Bioterorizam. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 Saetak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
10.4. 10.5. 10.6. 10.7.
10.1.
Uvod
Forenzina botanika je kombinacija vie disciplina biljne biologije i njihove primjene u podruju zakonodavstva [1]. Na taj nain ona u sebi sintetizira aspekte anatomije i fiziologije biljaka, biljne genetike i populacijske analize, zatim aspekte botanike klasifikacije zasnovane na morfologiji, kao i osnove molekularne biologije biljaka (DNA). Forenzina
primjena ukljuuje prepoznavanje dotinih dokaza na mjestu zloina, njihovo primjereno prikupljanje i pohranjivanje, potovanje slijeda postupaka za osiguranje dokaza, razumijevanje znanstvenih metoda testiranja, validaciju novih forenzinih metoda, pruanje osnovnih znanstvenih spoznaja o primjeni i ogranienjima botanikih dokaza istraiteljima, izradbu referentnih populacijskih baza podataka i osiguranje okvirnih naela za prihvaanje ovih dokaza na sudu [15].
199
Ovo je poglavlje napisano tako da prui opi pregled forenzine botanike i naglasi neke osobitosti kao to je primjena palinologije (identifikacija peluda) u kriminalistikim obradbama, te mogunost uporabe biljaka kao bioteroristikih agenasa. Iako je ovo poglavlje ponajprije usredotoeno, kako je ve navedeno, na primjenu u kriminalistikim obradbama, postoji gotovo jednak broj tzv. civilnih podruja koja ukljuuju biljke i biljne proizvode. U Sjedinjenim Dravama ova podruja spadaju pod jurisdikciju Uprave za hranu i lijekove (Food and Drug Administration FDA), a komercijalni i privatni uzgajivai biljaka koji ele zatititi kvalitetu svojih biljnih proizvoda ili nove genetike inaice spadaju pod jurisdikciju Zakona o zatiti biljne raznolikosti i Zakona o biljnim patentima [1]. Postoji bezbroj modaliteta prema kojima biljke mogu biti bioloki dokazi, a navodimo tek nekoliko primjera: mrlje od trave na odjei nakon kaznenih djela protiv spolne slobode lie i stabljike biljaka zahvaene donjim trapom vozila na sekundarnom mjestu zloina, kamo je odbaeno tijelo rtve sjemenje koje se zadralo u naborima nogavica provalnika pri bijegu s mjesta provale u kuu sadraj eludca s biljnom tvari iz rtvina posljednjeg obroka kako bi se potvrdilo vrijeme smrti ili pak alibi prema lokaciji pelud za odreivanje godinjeg doba kad su posmrtni ostatci zakopani u masovnu grobnicu geografsko profiliranje kako bi se utvrdila mogua podruja s kojih bi neki biljni uzorak mogao potjecati. Svi ovi primjeri slue kao pomo forenzinoj zajednici da se utvrdi veza izmeu neke osobe i nekog predmeta, osobe i mjesta ili pak osumnjienika i rtve. Kad je malo drugih bio-
lokih dokaza, biljke mogu pruiti vrijedne dokaze u takvom sluaju, ali se esto previde zbog mikroskopske veliine peludnih zrnaca ili siunoga sjemenja. Pr vi i najpresudniji korak u uporabi biljaka kao dokaza u nekom sluaju jest prepoznavanje dokazne vrijednosti ovoga oblika biolokih dokaza. To nije uvijek izravno mogue, jer mnogim istraiteljima nedostaje specijalizirana poduka, a oteavajue je i to to broj i sastav biljne zajednice moe znatno varirati od jednoga do drugoga geografskoga lokaliteta [1, 3, 5].
10.2.
Prikupljanje dokaza
Istraitelji na mjestu zloina trebaju u obzir uzeti mogunost lociranja botanikih dokaza i tako prilagoditi svoje istraiteljske metode i podruja koja se pretrauju kako bi u najveoj mjeri osigurali vjerojatnost pronalaenja ovakve vrste dokaza. Prije nego prepuste mjesto zloina drugim slubama treba provesti pregled itavoga prizorita kako bi se utvrdilo nije li prigodom prikupljanja dokaza moda promaknuo kakav botaniki trag [1, 5]. Osobitu pozornost treba posvetiti moguoj prisutnosti malih listia biljaka, sjemenki, peludnih zrnaca, alga, dr venog iverja i stabljika na tijelu i odjei pronaenima na prizoritu. Osim toga, valja prikupiti poznate referentne uzorke i kontrolne uzorke za kasniju usporedbu, a kod biljnih dokaza jedan dokaz obino nije dostatan. Primjerice, ako se list boikovine nae stisnut u rtvinoj ruci na sekundarnom prizoritu, te ako se u boravitu osumnjienika nalaze tri grma boikovine, tada treba uzeti najmanje tri uzorka (po jedan sa svakoga grma) radi kasnije usporedbe. Postoji mnotvo razliitih genetikih varijanata iste biljne vrste, pa stoga treba prikupiti poznati referentni uzorak sa svakoga grma za naknadnu individualizaciju prema osobitim morfolokim obiljejima
200
ili genetikom analizom. Ako su uzorci biljaka mali, istraitelji e moda trebati uzeti referentne uzorke mnogih razliitih moguih biljnih izvora koji se nalaze na prizoritu ili blizu njega [1]. Provedba odgovarajuih usporedbi jedan je od najvanijih i najdugotrajnijih imbenika u forenzinoj botanici. Iz jednog jedinog dokaza esto je mogue identificirati biljnu vrstu; no, za provedbu individualizacije unatrag sve do pojedinog izvora esto treba uspostaviti usporedbenu referentnu bazu podataka. U identifikaciji ljudskih ostataka s pomou metoda DNA forenzini znanstvenici rabe prethodno postojee populacijske referentne baze podataka kako bi procijenili individualnost nekog uzorka [6]. Kod biljaka, u veini sluajeva, potrebno je uspostaviti referentnu populacijsku bazu podataka iz istoga, specifinoga zemljopisnog podruja za dotinu vrstu, i to zbog goleme biljne raznolikosti na koju se u postupku moe naii. Na alost, takve baze podataka ne postoje, osim vrlo maloga broja iznimaka, pa dio cjelokupnoga procesa ispitivanja moe zahtijevati i izradbu ukupne specifine baze podataka. Stvarni proces prikupljanja biljnih dokaza slijedi tradicionalne metode forenzinog prikupljanja, ukljuujui dokumentiranje mjesta zloina, fotografiranje, pojedinano pakiranje uzoraka u papirnate omote ili prikupljanje peludnih obrisaka u sterilne spremnike [13, 5]. Svaki primjerak dokaza treba spremiti zasebno, a pritom potovati slijed postupaka za osiguranje dokaza i njihovu zapeaenost. Kod nekih neuobiajenih oblika biljnih dokaza (npr. sadraj eludca, povraeni sadraj, fekalije) uvanje moe biti neto drukije, kao to je prikupljanje u plastinu au i pohrana na 4 C, jer se isuivanjem mogu unititi obiljeja biljnih stanica, to e oteati identifikaciju vrste. Kad postoji odreeno dvoumljenje u odabiru procedure prikupljanja ovakvih
tragova, preporuuje se savjetovanje s forenzinim botaniarom ili laboratorijem za forenzinu znanost. Dokumentacija mjesta zloina treba obuhvatiti fotografije izbliza i u krupnome planu razliitih izvorita biljaka na prizoritu [5]. Istraitelji trebaju paljivo procijeniti cjelokupno prizorite tako da prikupe referentne uzorke od svake biljke koja pripada istoj vrsti kao i potencijalno prijeporni botaniki materijal [1]. Prije nego se izie pred sud s biljnim dokazom, a nakon to je on usporeen i ispitan, valja razmotriti nekoliko pitanja koja mogu utjecati na prihvatljivost dokaza na sudu [1]. Je li proveden odgovarajui pregled dokaza i postupaka testiranja od mjesta zloina do testiranja u forenzinom laboratoriju? Je li slijed postupaka za osiguranje dokaza dokumentiran i potovan? Jesu li biljni dokazi ikad prije bili prihvaeni u vaem sudskom sustavu? Jesu li ispitivai koji su provodili pretrage i pisali izvjea dovoljno kvalificirani? Je li bilo mogue provesti slijepu usporedbu za potrebe identifikacije? Je li dostupna reprezentativna populacijska baza podataka uzoraka ili profila DNA za usporedbu? I je li takva baza podataka izraena posebno za ovaj sluaj? Je li poznata genetika reprodukcijska strategija dotinih biljnih vrsta? Na primjer, razmnoava li se ona klonski i je li vjerojatno da u genetikom smislu ima vie od jednog srodnog para? Razmnoava li se pak sjemenjem pa je stoga individualna u svojemu genetikom profilu? Jesu li svi sudionici u sluaju obavijeteni o koristima i ogranienjima botanikih dokaza kako bi se izbjegla razilaenja u svjedoenju?
201
Kakve su poznate i mogue stope pogrjeke u odnosu na ovu vrstu analize? Jesu li postupci zasnovani na openito prihvaenim znanstvenim naelima? Botaniki dokazi su po sebi raznovrsni zbog velikoga broja biljnih vrsta koje postoje na tlu i u vodi. Sveobuhvatno razumijevanje izmeu osoblja na prizoritu, forenzinih znanstvenika, akademskih strunjaka i tuiteljstva/odvjetnika moe rezultirati jasnim prikazom pred sucem i porotom kad se biljni dokazi predouju na sudu.
10.3. 10.3.1.
Pregled tehnika
Mikroskopija
i ostala obiljeja koja neku biljku ine jedinstvenom. U pravilu se botaniki klju rabi u pretraivanju referentne baze podataka za one biljne vrste koje posjeduju uoene karakteristike i to omoguuje identifikaciju vrste [1]. Usporedbeni je mikroskop koristan ako se eli utvrditi fizika slinost dvaju biljnih fragmenata. Biljni dokazi esto su siuni i bez dodatnih vizualnih pomagala oku ba ne izgledaju jedinstveni. No, kad se oba fragmenta promatraju pod istim poveanjem na usporedbenom mikroskopu, tada se njihove slike mogu preklapati i sparivati analogno dvama odgovarajuim, tj. specifinim dijelovima slagalice. Uzorci stoma i trihoma na povrini lista mogu dopuniti informaciju dobivenu usporedbom, kao i pokazati izravno fiziko poklapanje dvaju rubova.
10.3.2.
Jednostavni i isplativi postupci kao to je svjetlosna mikroskopija i uporaba usporedbenog (komparativnog) mikroskopa tradicionalne su metode u forenzinoj znanosti. Veina laboratorija forenzine znanosti ima odsjek za dokaze, koji prikuplja vlakna (od kojih su mnoga biljnoga podrijetla), dlake, mr vice boje, tla i peludna zrnca iz dokaza procesom usisavanja ili pak postupkom struganja. U procesu usisavanja rabi se modificirani runi usisava sa specijalnim filtrom na koji se sakuplja mikroskopski pelud [5]. Vei fragmenti biljnih dokaza sakupljaju se pincetom i stavljaju u pojedinane papirnate omote kako bi se ouvali boja, oblik i povrinska svojstva kao to su trihomi, lijezde, stome i druga vana obiljeja korisna u identifikaciji vrste. U postupku struganja rabi se patula kako bi se fiziki sastrugali mali djelii biljnog materijala s odjee i sagova radi prikupljanja i pohrane u papirnate omote [5]. Mikroskopijom se uveavaju fizika obiljeja djelia biljke pa se bre mogu identificirati uzorci vena i stoma, trihomski oblici
Identifikacija vrste
Ispravna identifikacija biljke do razine vrste korisna je ako se nastoji utvrditi povezanost s primarnim ili sekundarnim mjestom zloina [1, 5]. rtve esto budu ubijene na jednome mjestu i potom premjetene na sekundarno mjesto u nastojanju da se zloin sakrije. Mnogi sluajevi u kojima su uvedeni biljni dokazi ukljuuju tragove naene stisnute u rtvinoj ruci, na rtvinoj odjei, na pokrivau ili u vozilu koje je upotrijebljeno za prijevoz rtve. U drugim sluajevima katkada treba ispitati odgovaraju li dr veni fragmenti prikupljeni s podvoza vozila dr vetu koje se nalazi na mjestu zloina; ili pak mogu li se iglice bora naene u cijevi pitolja povezati s dr vetom koje se nalazi na mjestu gdje je napada uao ekajui rtvu. Ovi primjeri mogu izgledati kao neki udni oblici asocijativnih dokaza, no oni se temelje na stvarnim sluajevima u kojima je zatraena individualizacija biljke s pomou DNA. Identifikacija biljne vrste odgovara na pitanje koja je ovo vrsta biljke i u
202
kojoj vrsti podneblja ona raste?, no ne moe osigurati individualizaciju koja odgovara na pitanje potjee li ovaj fragment s ovoga dr veta, i to iskljuivo s toga dr veta?. Identifikacija biljne vrste pr vi je prijeko potreban korak kad se nastoji utvrditi forenzina povezanost, a potom se provodi individualizacija ako je na raspolaganju dostatan uzorak za testiranje DNA (sl. 10-1.). Identifikacija vrste moe se provesti procjenom znakovitih fizikih obiljeja biljnoga dokaza, no, esto je fragment premalen ili nema dovoljno detalja za potpunu identifikaciju. U takvoj situaciji moe se takoer primijeniti DNA-analiza radi identifikacije vrste [4, 610]. DNA biljke moe se izolirati tijekom manje od dva sata uz primjenu setova za ekstrakciju biljne DNA koji su dostupni na tritu. Dio iskoritene biljne DNA tada se umnoava s pomou specifinih PCR poe-
tnica za selektivno ciljanu regiju koja je specifina za tu biljnu vrstu. Postoje stotine biljnih sekvencija koje se mogu rabiti za identifikaciju na osnovi DNA (PCR-poetnice mogu se izraditi tako da umnoavaju one regije koje se najee rabe u evolucijskim studijama), a danas je na raspolaganju mnotvo baza podataka (npr. http://www.ncbi.gov) koje se mogu pretraivati radi potvrde podataka o sekvencijama.
10.3.3.
Individualizacija DNA
AFLP: Polimorfizmi duljine amplificiranih ulomaka (Amplified Fragment Length Polymorphisms)

Vos i sur. [10] pr vi su opisali metodologiju AFLP-a koji ini metodu za genotipiziranje biljnih uzoraka iz jednoga izvora i to
Slika 10-1. Pelud iz uzoraka droge moe posluiti u pokuaju odreivanja zemljopisnog podrijetla ako je pomijean s peludi autohtonih vrsta koje rastu na istome mjestu. Prisutnost dlaica cistolita na liu kanabisa smatra se jednim oblikom botanike identifikacije s pomou mikroskopije. Sve botanike dokaze treba ispravno fotografirati, dokumentirati i zapakirati u iste papirnate omote uz potivani slijed postupaka za osiguranje dokaza.
203
na velikome broju molekularnih biljega kako bi se stvorio visoko diskriminirajui uzorak DNA-vrpce ili, u slobodnome prijevodu, biljni DNA-profil. Tehnika AFLP-a temelji se na otkrivanju genomskih restrikcijskih ulomaka nakon umnoavanja s pomou PCR-a. Uzorci vrpce stvaraju se bez prethodnog poznavanja sekvencije uz primjenu ogranienog niza poetnica za umnoavanje. Metoda AFLP omoguuje pregledavanje polimorfizama na velikome broju mjesta u kratkom vremenu, a zahtijeva samo malu koliinu DNA (oko 10 ng). Iako postoje i druge tehnike tipizacije DNA koje su razvijene za specifine namjene, analiza AFLP-a metoda je izbora, jer je openito primjenjiva na biljni uzorak iz bilo kojega pojedinanog izvora bez obzira na vrstu [1, 3, 9]. Na tritu je dostupno nekoliko setova za analizu AFLP-a i svi oni slijede jedan opi postupak: reakcija digestije-ligacije u jednom koraku, gdje se kratki adaptori DNA dodaju svakom kraju ulomka DNA PCR predselektivno umnoavanje podskupine ulomaka DNA jednom poetnicom kako bi se stvorio skup (pool) ulomaka PCR selektivno umnoavanje i fluorescentno obiljeivanje podskupine ulomaka DNA kako bi se stvorio individualizirajui barkod
otkrivanje ulomaka DNA s pomou sekventora DNA i genetika analiza s pomou raunalnoga programa za pretvaranje barkoda u brojani kod za usporedbu. Slika 10-2. prikazuje tipian profil AFLP-a koji se od analize STR-a razlikuje po tome to diskretni aleli nisu tipizirani. Metoda AFLP najblia je izvornoj metodi za identifikaciju ljudi koju je razvio Alec Jeffreys, poznatoj kao tipiziranje vie lokusa s pomou RFLP-a (restriction fragment length polymorphism, polimorfizam duljine restrikcijskih ulomaka), uz primjenu tzv. binova u bodovanju ulomaka DNA ak i tada kad su ulomci pokazivali manje razlike u mobilnosti tijekom elektroforeze na gelu [2, 46]. Proces biniranja (binning) ukljuuje stvaranje programskih binova zasnovanih na veliini ulomaka DNA, koji su proizvoljni utoliko to pozicija binova moe spadati bilo kamo od 30 do 100 baza, i to sve dok je proces bodovanja dosljedan. Tada prisutnost ili odsutnost detektiranoga zupca iznosi jedan, odnosno nula. to je vei broj bodovanih ulomaka DNA, to je vii stupanj sigurnosti mogueg poklapanja izmeu dokaznog uzorka i poznatoga referentnog usporedbenog uzorka [1].
STR: kratki ponavljajui sljedovi (Short Tandem Repeats)

STR, takoer poznat i kao SSRs (simple sequence repeats) ili minisateliti visoko su indi-
Slika 10-2. Primjer profila AFLP-a lia Sutera. Relativne jedinice fluorescencije (RFU) prikazane su na osi y (01 000); veliina (0460 nukleotidnih baza) prikazana je na osi x.
204
vidualizirani i izvrsni za otkrivanje mijeanih uzoraka kad ih se razvije i potvrdi za dotinu biljnu vrstu. Ako ve postoji panel biljega STR-a ili ako nema ogranienja u potrebnom vremenu i sredstvima, tada je ovo dobra metoda [79]. No, est je sluaj da se provede iskoritenje neke neuobiajene biljne vrste, ali nema interesa za uspostavu panela biljega STR-a za neki pojedinani sluaj, jer njegovo upotpunjivanje i potvrivanje mogu potrajati otprilike dvije godine. U takvim je sluajevima AFLP dobar izbor, jer je ova tehnologija primjenjiva na svaku biljnu vrstu sve dok je uzorak iz jednoga izvora. Obino se primjenjuju multipleksni STR-sustavi, tj. simultana uporaba vie biljega u jednoj reakciji za umnoavanje s pomou PCR-a, a potom se detektiraju s pomou DNA sekvencera, i to u obliku diskretnih fragmenata DNA specifine veliine u usporedbi s alelnim ljestvama (allelic ladder). Za razliku od forenzinog testiranja identiteta u ljudi, moe se dogoditi da alelne ljestve nisu dostupne za svaku biljnu vrstu, pa e se stoga odreivanje ulomka DNA osnivati na programskoj analizi i mobilnosti ulomka bez komercijalno dostupne referencije. Ipak, paneli biljega STR-a razvijeni su za mnoge razliite ivotinjske i biljne vrste, a neki su setovi ak i dostupni na tritu [1]. Za biljne vrste s visokim stupnjem razmnoavanja unutar vrste preporuuje se AFLP kad razlikovanje izmeu pojedinanih biljaka s pomou biljega STR-a ne uspije zbog visoke razine genske slinosti [1, 3, 710].
10.4.
Palinologija
Analiza peluda ili palinologija korisna je u otkrivanju forenzinih veza, kao i u utvrivanju vremena smrti [1117]. Jedan od najpoznatijih sluajeva jest onaj masovne grobnice u Magdeburgu u Njemakoj. U veljai 1994.
otkrivena je masovna grobnica u kojoj su bila trideset dva muka kostura. Nepoznat je bio identitet rtava kao i ubojica. Budui da su svi pripadali mukoj populaciji i uskom dobnom rasponu, pretpostavilo se da su ovi mladi mukarci moda bili pripadnici vojnih postrojba. Postavljene su dvije hipoteze: 1. rtve je ubio i ukopao Gestapo u proljee 1945., na kraju Drugoga svjetskog rata ili 2. rtve su bili sovjetski vojnici koje je ubila tajna policija u lipnju 1953. nakon Demokratske pobune u Njemakoj. Analizirana je dvadeset jedna lubanja i sedam ih je pokazalo visoke razine peluda trputca, lipe i rai. Sve ove tri biljne vrste isputaju pelud tijekom mjeseca lipnja i srpnja, to potvruje drugu hipotezu [17]. Pelud moe isto tako biti koristan u sluajevima kao to je ubojstvo, seksualni i fiziki napad, krivotvorina, oruana pljaka ili raspaavanje droge [1, 16]. Analiza peluda moe pomoi u osuivanju zloinaca, no glavna joj je primjena u osiguranju asocijativnih dokaza za potrebe istranih postupaka. Da bi se utvrdio izvor peludnoga zrnca, njegove se fizike znaajke procjenjuju pod mikroskopom [1]. Te fizike znaajke ukljuuju: veliinu, oblik, tip otvora, ornamentiku ili izgled povrine, strukturu i sastav stijenke, te nain rasprivanja peludnih zrnaca. Kontrolni su uzorci tipini uzorci povrine tla, mulja ili vode s prizorita, uz peludna zrnca iskoritena iz gotovo bilo kojeg drugog materijala kao dokazni uzorci [11]. Primjeri za vrste materijala koji su ispitani na pelud u forenzinim sluajevima ukljuuju: zrane filtre, voe, med, heroin, kou, lie, opij, ambalau, tlo, dr vo, oruje, sag, kavu, papirnate novanice, odjeu, cipele itd. [1]. Primjer sluaja s Novog Zelanda ukljuuje iskoritenje i identifikaciju peluda kanabisa s poljoprivrednog zemljita koje je kupila i onda preprodala jedna obitelj pod sumnjom na uzgoj i raspaavanje marihuane. Budui da
205
pelud ostaje u uzorcima tla tijekom duljeg razdoblja, uzorak je prikupljen iz podnih dasaka u gospodarskoj zgradi koju je ta obitelj posjedovala u tijeku prethodnih pet godina. Vlasti su sada mogle zaplijeniti imovinu te obitelji na osnovi procjene njihova cjelokupnog prihoda [1, 11]. Druga zanimljiva primjena identifikacije peluda jest pokuaj da se heroin i kokain slijede do njihova zemljopisnog izvorita, gdje se uzgajaju i pakiraju. Ako su tipovi peluda rijetki i specifini za neko podruje, tada mogu biti informativni za odreivanje geografskoga mjesta podrijetla, to je korisno kad se, primjerice, prate nelegalne avionske poiljke [1, 11, 12, 14].
10.5. 10.5.1.
Nestale osobe
Mjesto pronalaska tijela
Primjena botanike u forenzinim istraivanjima obuhvaa identifikaciju fragmenata biljaka, odreivanje starosti korijena i stabljika, te uporabu vegetacije kao indikacije poremeaja povrine. Mnoge agencije kao to je NecrosearchInternational(http://www.necrosearch.org/) pruaju specijalizirano usavravanje u forenzinoj botanici kao sredstvu za identifikaciju tajnih grobnica i utvrivanje vremena pokopa. Biljke ponovno rastu po predvidivoj stopi nakon to se dio tla poremeti, primjerice, ukopom. Ako se uzorak vegetacije razlikuje od okolnih podruja, moe se na osnovi tipa vegetacije i procijenjene stope rasta biljaka ocijeniti koliko je dugo tijelo bilo na tom mjestu. Naslage lia uspjeno su posluile u lociranju nestalih osoba u sluaju ubojstva/samoubojstva kada je bilo malo drugih dokaza. Dana 4. lipnja 2002. dva su forenzina znanstvenika iz kalifornijskog Ministarstva pravosua nazvala Katedru biolokih znanosti
na California State University (Chico, CA) traei forenzinog botaniara koji e im pomoi u profiliranju lokacije za jednu nestalu djevojicu prema botanikim dokazima iskoritenim iz vozila njezina oca [1, 18]. Djetetov je otac umro od prostrijelne rane koju si je sam zadao u svojem kamionetu na brdskoj cesti u okrugu Butte u Californiji. Jakna s djevojiinom kr vlju naena je na sjedalu uz oca, zajedno s nekim listovima biljaka, no sveobuhvatna pretraga toga podruja nije dovela do otkrivanja njezina tijela. Na osnovi vrsta biljaka prisutnih u uzorku utvreno je da botaniki uzorak potjee iz gornjeg centimetra naslage lia u tom podruju. Biljne vrste obuhvaale su manzanitu (Arctostaphylos patula), kanjonsku crniku (Quercus chrysolepsis), unutarnju crniku (Quercus wislizenii), bijelu jelu (Abies concolor), veliki bor (Pinus ponderosa) i crni hrast (Quercus kelloggii). Identifikacija biljnih vrsta provedena je usporedbom prema morfolokim obiljejima s poznatim referentnim uzorcima dostupnima u Herbariju na California State University. Tada su razmotrena stanita i uvjeti rasta u podruju gdje je naeno vozilo, te su se odreene regije u planinama mogle iskljuiti na temelju injenice da spomenute biljne vrste nisu naene da rastu zajedno u tom stanitu biljaka. Sastav i tamna boja naslage lia upuivali su na visok sadraj organske tvari te na to da je tijelo vjerojatno bilo ispod vrlo gustoga umskog pokrova. Nakon to su razmotreni svjetlosni uvjeti za rast i visinski zahtjevi, na karti je oznaeno pet moguih podruja te su dovedeni timovi ljudi i psi kako bi pokuali nai tijelo nestale djevojice. Napokon je njezino tijelo locirano u petom podruju unutar nekoliko milja od mjesta gdje je naen kamionet. Tijelo je pronaeno izmeu dvaju palih stabala; otac je tijelo paljivo zamotao u deku nakon to ju je ubio. Kad su rekonstruirane oeve mogue putanje tijekom ubojstva, istra-
206
itelji su naili na sve biljne vrste i ovaj sluaj ocrtava kako se, uz pravu poduku, iskustvo i suradnju osoblja, ak i ovakvi sluajevi mogu uspjeno razrijeiti [1, 18].
je tako to su ih djeca sluajno progutala, osobito mala djeca. No, u nekim sluajevima mogue je i otrovanje.
10.6.1.
Bioterorizam
10.6.
Toksikologija
Biljke se mogu identificirati s pomou biolokih i kemijskih metoda, a kad se jednom opiu, te se metode esto mogu primijeniti u forenzinoj procjeni da bi se razlikovala ispravno uzeta hrana od otrovne biljke. To postaje vano u forenzinoj znanosti kako bi se pomoglo utvrditi uzrok i nain smrti, kao i da bi se utvrdilo je li zakonski postupak primjeren za zakonski sumnjivu smrt [1, 19]. Jedan od kljunih aspekata parnice zbog zakonski sumnjive smrti jest utvrditi je li preminuli namjerno uzeo neku tetnu tvar ili je svjesno prekoraio preporuenu dozu. Uz to, u graanskim parnicama vano je utvrditi je li smrt ili teka bolest bila izazvana oneienjem hrane koje je nastalo u njezinoj proizvodnji. Standardni toksikoloki testovi izraeni su za mjerenje toksinih tvari u kr vi ili za procjenu tkivnih promjena koje mogu pomoi u identifikaciji mnogih estih biljnih otrova. Bez obzira na to je li preminuli bio otrovan ili je smrt nastupila zbog nesree ili samoubojstva, forenzini znanstvenik ipak podatke dobivene autopsijom mora povezati s izvorom i vremenom uzimanja dotine tvari [2, 5]. Pr vi korak u tom procesu jest ispravna identifikacija biljne vrste. U pregledu forenzine literature identificirani su najei izvori smrti povezanih s biljkama. Centri za kontrolu otrova irom Sjedinjenih Drava primili su u godini 2003. vie od 57 000 upita u vezi s izloenou biljkama [20]. Osamdeset pet posto tih upita odnosilo se na djecu mlau od est godina. Veina takvih sluajeva izloenosti biljkama nastala
U forenzinim krugovima jo veu zabrinutost izaziva mogunost lake dostupnosti biljaka i njihovih otrova zbog njihove uporabe kao sredstava bioterorizma kako bi se potaknula masovna histerija i panika u opoj populaciji [20]. Neki od biljnih otrova koji izazivaju zabrinutost jesu sljedei: Abrin dobiven iz biljke Abrus precatorius L., korova koji je est u tropskim i subtropskim krajevima. Sjemenke su mu dekorativne i rabe se u biuteriji, rukotvorinama i talismanima za sreu, pa ih turisti donose u Sjedinjene Drave. Toksin je biljni lektin koji inhibira sintezu staninih bjelanevina i visoko je toksian. Abrin se nalazi u tvrdoj ovojnici sjemenke i ne otputa se sve dok se ne savae i probavom dospije u probavni sustav, gdje moe uzrokovati teak poremeaj. Unos abrina ne mora izazvati smrt, osobito ako sjemenka ostane cjelovita tijekom probave. Ako se injicira ili udahne, ak i u malim dozama abrin moe uzrokovati vieorgansko zatajenje [20]. Akonitin se dobiva iz viegodinje biljke (rod Aconitum) zemljopisno rasporeene u Sjevernoj Americi i Euroaziji. itava je biljka otrovna, ukljuujui sjemenke; akonitin djeluje kao aktivator natrijskih kanala. Spomenute se biljke upotrebljavaju u nekim biljnim proizvodima i vjerojatan su izvor izloenosti. Simptomi su preteito kardioloki i neuroloki, a dovode do konvulzija i kome prije smrti [20]. Ricin se dobiva iz jednogodinje biljke (Ricinus communis L.) koja naraste do 4,5m u tropima (sl. 10-3.). Ta se biljka pri-
207
To su samo etiri vanija otrova koji se dobivaju iz biljaka, no postoji neizmjeran broj razliitih, manje poznatih i znatno tee sljedivih otrovnih biljaka od kojih mnoge imaju otrovne sjemenke. Pravilna identifikacija vrste biljke prije negoli nastupi smrt moe pomoi u lijeenju bolesnika, odreivanju razine opasnosti u odreenom kontekstu, te osigurati dodatni vremenski okvir za dobivanje klinikih nalaza.
10.7.
Saetak
Slika 10-3. Ricin, tvar koja se dobiva iz jednogodinje biljke (Ricinus communis L.) smatra se moguim bioteroristikim otrovom. Fotografija s mrene stranice: http://item.express.ebay.com.
rodno nalazi u zapadnoj Indiji, a kao korov i u Sjedinjenim Dravama (Florida, Teksas, Kalifornija i Havaji). Takoer je dostupna na tritu i prodaje se zbog svoje kronje. Toksin se nalazi u sjemenkama i ne otputa se dok se ne probije ovojnica sjemenke. Simptomi su slini onima kod abrina. Postoji nekoliko forenzinih sluajeva u kojima je ricin upotrijebljen za uspjeno otrovanje drugih ljudi, ukljuujui poznati sluaj pijuna, Georgija Markova [1923]. Strihnin se dobiva iz biljke Strychnos nuxvomica L. To je malo dr vce, domovina mu je u Aziji, a uzgaja se na Havajima radi proizvodnje strihnina. Otrovna je itava biljka, ukljuujui sjemenke. U nekim se zemljama te sjemenke rabe kao ljekoviti biljni proizvodi. Velike doze mogu izazvati konvulzije i hipertermiju [20].
Moda naoj ljudskoj naravi postoji svojstvena potreba za organiziranjem i svrstavanjem predmeta i organizama koje susreemo. Mnoge stavke i organizme lako je identificirati i opisati; no, s drugima je to tee zbog nedostatnosti fizikih obiljeja ili konfliktnih svojstava kao to su morfoloki i molekularni biljezi koji se ne slau. Botaniki su dokazi korisni u kriminalistikim i graanskim sluajevima, no jo uvijek se premalo rabe. Biljni su dokazi esto povezani s mjestom zloina i rtvama; kao botaniki tragovi najee se upotrebljavaju stabljike, lie, sjemenke i cvjetovi. Ne samo cjelovit biljni materijal nego i mikroskopski pelud i biljne smole mogu se rabiti kako bi se dokazala asocijativna veza izmeu prizorita i dokaznih primjeraka. Koristan je i pelud ako je jedinstven za godinje doba ili mjesto, za slijed do zemljopisnog izvorita ili za procjenu doba u kojem je nastupila smrt i tijelo pokopano. Kako se bude sve vie spoznavalo o forenzinoj botanici, a takva vrsta dokaza sve se vie rabila na sudu, biljni asocijativni dokazi sve e se vie smatrati presudnima u rjeavanju nekog sluaja i putem identifikacije vrste i putem naknadne individualizacije uzorka.
208
Literatura
1. Coyle HM. Forensic Botany: Principles and Applications to Criminal Casework, CRC Press, Boca Raton, FL, 2005. 2. De Forest PR, Gaensslen RE, Lee HC. Forensic Science: An Introduction to Criminalistics, McGraw-Hill, New York, 1983. 3. Miller Coyle H, Ladd C, Palmbach T, Lee HC. The Green Revolution: botanical contributions to forensics and drug enforcement. Croat Med J. 2001 Jun; 42(3):340-5. 4. Lee HC, Ladd C. Preser vation and collection of DNA evidence. Croat Med J. 2001 Jun; 42:225. 5. Lee HC, Palmbach TM, Miller MT. Henry Lees Crime Scene Handbook, Academic Press, Boston, 2001. 6. Lee HC, Ladd C, Scherczinger CA, Bourke MT. Forensic applications of DNA typing, collection and preser vation of DNA evidence. Am J Forensic Med Pathol.1998; 19:10. 7. Newton C, Vo T. Application of microsatellite markers in plant forensics. Can Soc Forensic Sci J. 2003; 36:57. 8. Craft KJ, Owens JD, Ashley MV. Application of plant DNA markers in forensic botany: genetic comparison of Quercus evidence leaves to crime scene trees using microsatellites. Forensic Sci Int. 2007 Jan 5; 165(1):64-70. 9. Ward J, Peakall R, Gilmore SR, Robertson J. A molecular identification system for grasses: a novel technology for forensic botany. Forensic Sci Int 2005 Sep 10; 152(2-3):121-31. 10. Vos P et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995; 23:4407. 11. Mildenhall DC, Wiltshire PE, Bryant VM. Forensic palynology: why do it and how it works. Forensic Sci Int 2006 Nov 22; 163(3):163-72. 12. Mathewes RW. Forensic palynology in Canada: an over view with emphasis on archaeology and anthropology. Forensic Sci Int. 2006 Nov 22; 163(3):198-203. 13. Brown AG. The use of forensic botany and geology in war crimes investigations in NE Bosnia. Forensic Sci Int. 2006 Nov 22; 163(3):204-10. 14. Bryant VM, Jones GD. Forensic palynology: current status of a rarely used technique in the United States of America. Forensic Sci Int 2006 Nov 22; 163(3):183-97. 15. Montali E, Mercuri AM, Trevisan Grandi G, Accorsi CA. Towards a crime pollen calendar pollen analysis on corpses throughout one year. Forensic Sci Int 2006 Nov 22; 163(3):211-23. 16. Mildenhall DC. Hypericum pollen determines the presence of burglars at the scene of a crime: an example of forensic palynology. Forensic Sci Int 2006 Nov 22; 163(3):231-5. 17. Miller Coyle H, Lee CL, Lin WY, Lee HC, Palmbach TM. Forensic botany: using plant evidence to aid in forensic death investigation. Croat Med J. 2005 Aug; 46(4):606-12. 18. Schierenbeck KA. Forensic biology. J Forensic Sci 2003 May; 48(3):696. 19. Moffat AC. Forensic pharmacognosy poisoning with plants. J Forensic Sci Soc 1980 Apr; 20(2): 103-9. 20. Nelson LS, Shih RD, Balick MJ. Handbook of Poisonous and Injurious Plants, Springer, New York, 2007. 21. Schier JG, Patel MM, Belson MG, Patel A, Schwartz M, Fitzpatrick N, Drociuk D, Deitchman S, Meyer R, Litovitz T, Watson WA, Rubin CH, Kiefer M. Public health investigation after the discovery of ricin in a South Carolina postal facility. Am J Public Health 2007 Apr; 97 Suppl 1:S152-7. 22. He X, Brandon DL, Chen GQ, McKeon TA, Carter JM. Detection of castor contamination by real-time polymerase chain reaction. J Agric Food Chem 2007 Jan 24; 55(2):545-50. 23. Ler SG, Lee FK, Gopalakrishnakone P. Trends in detection of warfare agents. Detection methods for ricin, staphylococcal enterotoxin B and T-2 toxin. J Chromatogr A. 2006 Nov 10; 1133 (1-2):1-12.
209
11.
Sadraj poglavlja
11.1 11.2. 11.3. 11.4. 11.5. 11.6. 11.7. 11.8. 11.9. 11.10.
Meunarodna praksa glede DNA-baza podataka

Chris Asplen
Ujedinjeno Kraljevstvo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 11.1.2. Nacionalna DNA-baza podataka Ujedinjenog Kraljevstva. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Njemaka unaprjeivanje potencijala DNA-analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 11.2.1. Prekogranina razmjena DNA podataka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Europska unija novi zakon o povezivanju. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Interpolov globalni DNA-protokol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 Interpolov projekt uvezivanja drava G8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 Sjedinjenje Amerike Drave trokomponentni sustav . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 Indija nunost uvoenja DNA-tehnologije. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 Juna Afrika potreba za suradnjom javnosti i privatnog sektora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 Australija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217 Novi Zeland. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
Forenzina DNA-tehnologija i DNA-baze podataka iroko su prihvaene kao neka od najuinkovitijih i najuspjenijih sredstava dostupnih snagama zakona u borbi protiv kriminala. No, u odsutnosti DNA-baze podataka, ta tehnologija prestaje biti uinkovito orue istrage i moe biti uporabljiva samo tada kad je policija ve identificirala osumnjienog tradicionalnim nainom istrage. U tim uvjetima, kad je policija ve uinila svoj posao, sama DNA moe samo dodatno poduprijeti sluaj. No, s bazom podataka sam proces istrage postaje uspjeniji i uinkovitiji. To je posebno tono kada tradicionalnim tehnikama istrage nije mogue identificirati osumnjienog. Svaki dan, u cijelome svijetu, stotine sluajeva biva rijeeno s pomou DNA-dokaza,
ak i tada kada policija nije prethodno poznavala identitet potencijalno osumnjienoga. To su najee sluajevi najgnusnijih i najnasilnijih zloina, stari i po nekoliko godina ili ak i desetljea. S obzirom na mogunosti koje pruaju DNA-dokazi, sve vie drava i institucija za provedbu zakona irom svijeta osnivaju i rabe DNA-baze podataka. Velik je broj imbenika koji utjeu na kreiranje uinkovite DNA-baze podataka. No, najvaniji od njih jest specifina legislativa i ogranienja koja zakon namee snagama zakona pri uporabi tih baza. ak i ako je kvaliteta laboratorija izvrsna i vrijeme procesiranja uzoraka veoma kratko, neadekvatna legislativa moe umnogome ograniiti iskoritavanje potencijala koje DNA-baze podataka imaju. Upravo
210
je kvaliteta danog zakona ono to DNA ini efikasnim sredstvom istrage. Mnoge drave u svijetu iskoristile su prednosti DNA-tehnologije, no svaka je od njih na razliit nain pristupila procesu uvoenja i uporabe DNA-baza podataka. Pitanja poput: iji bi podatci trebali biti ukljueni u bazu, kako pohraniti uzorke, koliko je dugo doputeno uvati uzorke, trebaju li i kada podatci biti izbrisani iz baze, samo su neka o kojima se mora voditi rauna pri kreiranju i razvoju baze podataka. Vidjeti tablice 11-1., 11-2. i 11-3. na kraju poglavlja radi usporedbe razliitih praksi glede DNA-baza podataka u europskim zemljama. U ovom e poglavlju biti izloeno kako su razliite drave diljem svijeta implementirale uporabu DNA-dokaza i baza podataka u svrhu poboljanja kapaciteta u borbi protiv kriminala. Takoer, bit e naglaene i neke potekoe na koje se nailazilo pri pokuaju uvoenja ove znaajne tehnologije u svakodnevnu praksu.
11.1
Ujedinjeno Kraljevstvo
Engleska slovi kao zemlja s najuspjenijim i najuinkovijim pristupom uporabe forenzine DNA-tehnologije u svijetu. Osnivanjem Nacionalne DNA-baze podataka (National DNA Database NDNAD) 10. travnja 1995. Engleska je preuzela primat u svijetu na podruju otkrivanja inovativnih naina uporabe DNA-dokaza u svrhu identificiranja osumnjienih, zatite nedunih i kanjavanja krivih. DNA-tehnologija i arhiviranje DNA--podataka postale su sredinje toke u procesu kriminalistike istrage. Odluka da se ova tehnologija integrira tako temeljno u proces istrage i potonji uspjeh Nacionalne DNA-baze podataka moe se pripisati trima kljunim imbenicima: politika volja Odjela unutarnjih poslova
(Home Office), tehnika opremljenost Slube za forenzinu znanost (Forensic Science Service) i operativna spremnost policije. Sve istrage bazirane na DNA-dokazima u Engleskoj i Walesu temelje se upravo na stalno rastuoj bazi podataka. Ipak, brojni su drugi imbenici koji pridonose uspjehu britanskoga pristupa primjeni DNA u forenzici. Engleska ima populaciju od otprilike 52 milijuna stanovnika. Ima 43 okrune policijske slube, s vie od 123 000 slubenika [1]. Devedeset posto svih forenzinih analiza DNA provedenih u Engleskoj obavlja poludravna agencija Forensic Science Service (FSS) Sluba za forenzinu znanost. Nadalje, ne samo da ta sluba obavlja veinu DNA-analiza u dravi, ona takoer ima i slubenu ovlast nad DNA-bazom podataka, koju joj je dodijelila Asocijacija policijskih zapovjednika (Association of Chief Police Officers ACPO). U Ujedinjenom se Kraljevstvu u prosjeku provede 2 milijuna uhienja godinje. Statistika pak pokazuje da manje od etvrtine tih uhienja otpada na prijestupnike koji su neki prekraj poinili pr vi put [2]. Nadalje se pokazalo da 85 posto prijestupnika bude osueno pr vi put izmeu svoje 14. i 19. godine ivota, a da vjerojatnost da e neki 14-godinjak ponovno nainiti prekraj iznosi 77 posto [3]. Vladine statistike takoer pokazuju da 20% kriminalaca poini 80% svih zloina, a 60% sudskih suoenja tie se 21% svih prijestupnika. Sve su ovo imbenici koji snano podupiru iroku uporabu DNA baza podataka [4].
11.1.2.
Nacionalna DNA-baza podataka Ujedinjenog Kraljevstva
Sluba za forenzinu znanost (FSS) bila je pionir na putu uvoenja DNA-tipizacije u
Meunarodna praksa glede DNA i DNA-baza podataka
211
forenzinu medicinu i uspostavila je pr vu svjetsku obavjetajnu kriminoloku DNA-bazu podataka pokrenutu u travnju godine 1995. Struktura i uporaba Nacionalne DNA-baze ipak se znatno razlikuje od strukture i uporabe lokalnih, dravnih i Nacionalne DNA-baze Sjedinjenih Drava. Za razliku od SAD-a, iji je Nacionalni sustav za DNA-indeksiranje (National DNA Indexing System NDIS) baziran na sustavu po kojem samo profili osuenih prijestupnika mogu biti arhivirani i usporeivani s profilima dobivenima s mjesta zloina, Nacionalna DNA-baza Ujedinjenog Kraljevstva zasnovana je na uporabi i profila osumnjienih osoba. U Engleskoj i Walesu, policija ima ovlasti uzeti i arhivirati bioloki uzorak od bilo koje osobe uhiene za bilo koje kazneno djelo. Od svibnja 2007. Nacionalnom bazom podataka upravlja Jedinica za nacionalnu DNA-bazu podataka (National DNA Database Unit) [5]. Svrha te jedinice jest da, pod vodstvom efa Jedinice, nadzire pruanje usluga nacionalne DNA-baze podataka, ali i da osigura funkcionalnost svih sustava koji tite integritet baze [6]. Usluge DNA-baze podataka pruaju se na osnovi uvjeta koje je odredio FSS. Jedinica je nedavno postala dio Nacionalne agencije za unaprjeenje standarda (National Policing Improvement Agency NPIA) i ovlatena je za akreditiranje svih znanstvenih laboratorija koji analiziraju uzorke DNA za potrebe policije i koji alju profile u bazu podataka. Takoer je odgovorna i za nadzor nad upravljanjem i odravanjem NDNAD [7]. Nacionalna DNA-baza podataka trenutano sadrava 3,8 milijuna profila pojedinaca osumnjienih i/ili uhienih za bilo koje kazneno djelo. Ti su DNA-profili oznaeni kao kazneni ili CJ (Criminal Justice) profili. S druge strane, NDNAD sadrava vie od 300 000 neidentificiranih profila s mjesta zloina.
Nadalje: otprilike 900 profila osoba svaki se tjedan dovede u vezu s profilima naenima na mjestu zloina oko 55 000 profila osoba pohranjuje se mjeseno u bazu podataka oko 4 500 profila tragova pronaenih na mjestu zloina pohranjuje se mjeseno u bazu podataka tijekom 2006./2007. godine, 1 175 nasilnikih/seksualnih delikata povezano je, koritenjem DNA-baze, s jednom osobom ili vie njih; 852 sluaja zlouporabe narkotika povezano je s jednom osobom ili vie njih, a 7 892 sluaja provala povezano je sa jednim profilom ili vie njih pohranjenih u bazi [8].
11.2.
Njemaka unaprjeivanje potencijala DNAanalize
Dok se Ujedinjeno Kraljevstvo openito smatra zemljom koja najbolje iskoritava utjecaj DNA-tehnologije na rjeavanje i procesuiranje zloina, Njemaka ubrzano preuzima prvo meunarodno mjesto u primjeni forenzike analite DNA. Od nedavnih promjena u legislativi, do udjela u rjeavanju prekograninih zloina uporabom analize DNA, te promocije forenzike analize DNA tijekom predsjedanja Europskom Unijom, Njemaka poduzima velike korake u maksimiranju mogunosti analize DNA. U godini 2005. njemaki Parlament i Federalno Vijee usvojili su zakon koji znatno proiruje mogunosti uporabe DNA-analize u kriminolokim istragama [9]. Slino zakonima koji doputaju arhiviranje DNA-podataka u UK-u, policijske snage u Njemakoj sada
212
mogu uzimati DNA-uzorke u sluajevima koji ukljuuju bilo koje kazneno djelo. Drugim rjeima, policija sada moe prikupljati DNA s mjesta zloina bilo kojega kaznenog djela, bez sudskog naloga. Jo je vanije da policija moe takoer uzeti DNA-uzorak bilo koje osobe osumnjiene ili osuene za bilo koje kazneno djelo [10]. Ova promjena u legislativi ini Njemaku jednom od najnaprednijih drava u svijetu kad je rije o shvaanju potencijala DNA-tehnologije.
11.2.1.
Prekogranina razmjena DNA podataka
Budui da sve vie zemalj uspostavlja i iri svoje forenzine DNA-baze podataka, mogunost da se uspjeno razmjenjuju podatci izmeu zemalja takoer se poveala. Openito, drave nastavljaju s praksom usvajanja i dopune legislative koja se tie ovoga pitanja. ak i zemlje koje nemaju legislativu koja se posebno bavi uporabom analize DNA poele su s procesom pohrane podataka pod nadzorom nekih drugih institucija policijskog i pravosudnog sustava. Kako baze podataka rastu u sadraju i uinkovitosti, tako i znaenje prekogranine razmjene podataka postaje sve oitije. Njemaka takoer prednjai u procesu prekogranine razmjene DNA-profila. Na osnovi sporazuma sklopljenog u Prmu, od prosinca godine 2006., Njemaka i Austrija mogu usporeivati sadraje svojih nacionalnih DNA-baza podataka. Pr vi su put dvije zemlje dopustile jedna drugoj pristup svojim nacionalnim policijskim bazama podataka po metodi slaganja/neslaganja profila. Nakon samo est tjedana, pri usporedbi njemakih kriminolokih profila s austrijskom bazom podataka naeno je 1 500 unosa koji su se slagali [11]. Kad su austrijski profili usporeeni s njemakom bazom podataka, to je rezultira-
lo s 1 400 podudarnih unosa. Na taj nain, u veoma kratkom vremenu, njemaka i austrijska vlada osigurale su vane podatke za policiju i pravosue, dokazujui tako vrijednost prekogranine integracije DNA-baza podataka. Njemaka je svoje predsjedanje Europskom unijom iskoristila za promociju razmjene DNA-podataka i profila unutar cijele Europe. Pr vobitno potpisan od sedam drava (i naknadno jo od etiriju), sporazum iz Prma olakao je razmjenu DNA-podataka izmeu zemalja potpisnica. Kao predsjedateljica Europske unije, Njemaka je prenijela koncept Sporazuma u EU-legislativu, to je uinilo da svih 27 lanica Europske unije sada postanu sudionici u mrei nacionalnih baza podataka [12]. Sada kad je takva legislativa usvojena, kriminalci vie nisu u mogunosti izbjei najefikasnijemu policijskom oruu u borbi protiv kriminala tako to e se jednostavno prevesti preko granice.
11.3.
Europska unija novi zakon o povezivanju
Poveanje kapaciteta za prekograninu razmjenu DNA-profila svakako je bilo uvjetovano i ubrzanom potrebom za takvom vrstom povezanosti. irenje Europske unije rezultiralo je i mogunou putovanja unutar njezinih granica bez posebnog nadzora. Ljudi mogu slobodno putovati izmeu drava lanica, a da ne budu legitimirani ili da njihovi podatci budu provjereni u bazi podataka prije samog ulaska u zemlju. To se odnosi ne samo na one koji potuju zakon nego i na one koji e ga potencijalno prekriti. Na taj nain iskusan kriminalac s poveim kriminalnim dosjeom moe slobodno putovati izmeu drava, bez straha da e ga njegov dosje pratiti. To je posebno tono u sluaju DNA-profila pohranje-
213
nih u pojedinane dravne baze podataka. I najgnusniji pedofil, jednom puten na slobodu, moe otputovati iz zemlje u ijoj je bazi pohranjen njegov DNA-profil u susjednu zemlju, gdje mo i potencijal takvog podatka postaju beskorisni. Drugim rjeima, prijestupnik moe biti osuen u Ujedinjenom Kraljevstvu (gdje se DNA-analiza intenzivno rabi u rjeavanju zloina), preseliti se u panjolsku (koja nema kriminoloku bazu podataka) i poiniti brojne zloine neotkriven, upravo zbog nepostojanja razmjene vitalnih podataka. to je slabija baza podataka neke drave, utoliko je ta drava privlanija kriminalcima.
11.4.
Interpolov globalni DNA-protokol
Interpol je takoer uspostavio Interpolov DNA-protokol (Interpol DNA Gateway), kreiran da bi olakao usporedbu DNA-profila izmeu drava lanica Interpola. Interpol odrava bazu podataka DNA-profila, a svaka joj drava lanica nakon usvajanja povelje kojom se osigurava njezina sigurna uporaba moe pristupiti putem interneta. Baza sadrava vie od 69 000 DNA-profila koje je pohranilo 45 drava lanica, a do sada su zabiljeena 143 transnacionalna pozitivna identificiranja, koja su ukljuivala 13 razliitih zemalja [13]. Drava lanica moe dostaviti DNA-informaciju za pohranu u DNA-protokol Generalnom sekretarijatu putem Interpolova sigurnoga telekomunikacijskog sustava ili u obliku tiskanog dokumenta i temelji se na Interpolovu standardnom setu lokusa (Interpol Standard Set of Loci ISSOL). Sustav je indeksiran u etiri osnovne kategorije: uzorci mje-
sta zloina, referentni uzorci, nestale osobe i neidentificirani umrli. Takoer je vrijedno spomenuti da drave lanice koje dostavljaju DNA-profile Interpolu, u skladu s njihovom legislativom, imaju mogunost ograniavanja pristupa informacijama onim dravama koje imenuju. Kada su drave lanice obavijetene o postojanju pozitivnog identificiranja, na dravi koja je pohranila prijeporni profil jest da odlui eli li otkriti dodatne informacije koje se tiu tog DNA-profila. Meunarodna povezanost forenzinih DNA-baza podataka jest sljedei logian korak u nastojanju da se u potpunosti iskoristi potencijal DNA-tehnologije u borbi protiv kriminala. Konano, drave e imati mogunost da rabe DNA u svrhu lociranja prijestupnika bilo gdje u svijetu, potvrujui omiljenu krilaticu snaga zakona: Moete bjeati, ali se ne moete sakriti. Zanimljivo je da je prvo podudaranje u okviru Interpolove DNA baze podataka dobiveno na osnovi zahtjeva Republike Slovenije, a prema DNA profilu koji su u bazu unijele odgovorne institucije iz Hrvatske.*
11.5.
Interpolov projekt uvezivanja drava G8
U srpnju 2007. godine DNA-strunjaci iz Interpola i drava lanica G8 uspjeno su testirali novu mreu elektronike dojave, koju je razvio Interpol i koja e nacionalnim forenzinim laboratorijima u dravama G8 omoguiti da meusobno izravno razmjenjuju informacije o DNA [14]. Podgrupa za G8 Projekt provedbe zakona zatraila je od Interpola da razvije sigurnu mreu koja e osigurati integri-
* http://www.ombo.nsw.gov.au/publication/PDF/Other%20Reports/dna%20report%202.pdf
214
tet DNA-podataka, zadovoljavajui u isto vrijeme zahtjeve policije i pravosua. Pr vi su put forenzini laboratoriji iz drava G8 povezani tom mreom, to im daje mogunost da izravno razmjenjuju forenzine podatke.
11.6.
Sjedinjenje Amerike Drave trokomponentni sustav
Sustav arhiviranja DNA-podataka u Sjedinjenim Dravama temeljen je na softverskom sustavu zvanom CODIS. CODIS-baze podataka postoje na lokalnoj, dravnoj i nacionalnoj razini. Ovako struktuiran sustav doputa kriminolokim laboratorijima da kontroliraju vlastite podatke svaki laboratorij zasebno odluuje o tome koje e profile podijeliti s ostatkom zemlje. Od godine 2006. otprilike 180 laboratorija iz svih 50 drava dio je programa CODIS. Nacionalnim DNA-indeksnim sustavom (National DNA Index System NDIS), programom na nacionalnoj razini, upravlja FBI, na tajnoj lokaciji. U svojem prvobitnom izdanju CODIS se sastojao od dvaju dijelova: Indeksa osuenih prijestupnika i Forenzinog indeksa. Prvi indeks sadravao je profile osoba osuenih za neki zloin; dravni zakon odreuje koje vrste zloina ulaze u CODIS-sustav. (Svih 50 drava usvojilo je DNA-legislativu kojom se doputa prikupljanje DNA-profila osuenika radi pohranjivanja podataka u CODIS.) Forenzini indeks sadrava profile dobivene iz biolokih tragova naenih na mjestu zloina [15]. Tijekom nekoliko prolih godina, CODIS je dodao i nekoliko novih indeksa, ukljuujui: Indeks uhienika, Indeks nestalih ili neidentificiranih osoba i Referentni indeks
nestalih osoba. CODIS sadrava algoritam za pretraivanje koji pretrauje i usporeuje razliite indekse na osnovi strogih pravila koja tite privatnost osoba. Za rjeavanje sluajeva silovanja i ubojstava, CODIS usporeuje Forenzini indeks s njim samim i s Indeksom osuenika. Usporeivanje Forenzinog indeksa s njim samim daje mogui trag koji povezuje dva sluaja ili vie prethodno nepovezanih sluajeva. Vano je naglasiti da CODIS-algoritam daje samo potencijalne veze. Svaku potencijalnu vezu potvruje ili opovrgava kvalificirani DNA-analitiar. (Da bi postao kvalificiran, DNA-analitiar mora posjedovati specifino obrazovanje i radno iskustvo, i poloiti polugodinji test kompetentnosti, koji nadzire trea strana.) Od svibnja 2007. godine prikupljeno je 177 870 forenzinih i 4 582 516 profila prijestupnika, to ini ameriku bazu podataka najveom DNA-bazom podataka na svijetu. CODIS je dao 49 400 pozitivnih identificiranja, pruajui tako pomo u 50 343 istrage [16]. Rastue odobravanje javnosti glede DNA-baza podataka u Sjedinjenim Dravama rezultiralo je razvojem DNA-baza u mnogim amerikim dravama. Kalifornija trenutano posjeduje treu po veliini DNA-bazu podataka u svijetu (naravno, CODIS sadrava sve podatke iz dravnih baza).
11.7.
Indija nunost uvoenja DNA-tehnologije
U godini 2003. indijska je vlada formirala Parlamentarni DNA-savjetodavni komitet (DNA Parliamentary Advisory Committee DPAC). Njegova je svrha bila da daje savjete i izradi nacrt zakona koji bi se odnosio na
215
stvaranje forenzine DNA-baze podataka u Indiji. Prole godine, nakon iscrpnih studija i istraivanja, DPAC je podnio svoj prijedlog zakona. To je dobro osmiljen, iscrpan prijedlog koji e, kada bude u potpunosti implementiran, imati izvanredan utjecaj na kazneni sustav u Indiji. Prijedlog zakona, meutim, jo uvijek eka na usvajanje. Dvije pojave u indijskome kaznenome sudskom sustavu, meutim, neusvajanje DNA-legislative ine alarmantnim. Pr vo, u Indiji se oslobodi vie uhienih nego u bilo kojoj drugoj zemlji u svijetu. Zapravo, vie od 1,1 milijun oslobaajuih presuda u Indiji godinje znai triput vie takvih presuda nego u Turskoj, dravi sljedeoj na listi po broju oslobaanja (vie od 300 000) [17]. S druge strane, Indija, druga zemlja na svijetu po broju stanovnika, nalazi se tek na 52. mjestu po broju uhienja po stanovniku. Bilo da se ini previe pogrjeaka pri samom procesu uhienja pa stoga velik broj nedunih ljudi mora biti osloboen na suenju bilo da pravosudni sustav nije kadar osuditi krive, jasno je da bi DNA-tehnologija mogla biti kljuni imbenik koji bi indijski pravosudni sustav uinio uinkovitijim. Podjednako je alarmantan i nedavni izvjetaj o uestalosti zlostavljanja djece u Indiji. Objavilo ga je Ministarstvo za ene i razvoj djeteta, a obuhvatio je 13 drava i pokazao da je 53,22 posto zlostavljane djece bilo rtva jednog ili vie oblika seksualnog zlostavljanja [18]. Istraivanje je sponzoriralo navedeno Ministarstvo, a provela ga je nevladina organizacija Prayas u saradnji s UNICEF-om i organizacijom Save the children. Poznajui mo DNA-tehnologije u identificiranju napadaa u kontekstu seksualnih delikata, ubrzano usvajanje zakona o DNA-bazama podataka zapoelo bi proces uinkovitije borbe protiv tako uasavajue statistike. Pa ipak, ak i s usvajanjem legislative, Indija se suoava sa velikim izazovom u svojem
naporu da maksimalno iskoristi potencijal DNA-tehnologije. Plan Direkcije za forenzinu znanost (Directorate of Forensic Sciences) podrazumijeva izgradnju 50 laboratorija u roku od pet godina. Iako je vlada obeala novanu potporu za izgradnju tako zahtjevne infrastrukture, to e svakako biti izazovan pothvat. Sama poduka tolikoga broja analitiara nunih za rad u takvom sustavu laboratorija bit e veliki zadatak. Podjednako teak bit e i proces poduke policije i drugog osoblja koje pr vo dolazi na mjesto zloina o tome kako pravilno identificirati, zatititi i prikupiti bioloke tragove.
11.8.
Juna Afrika potreba za suradnjom javnosti i privatnog sektora
Zloin nasilja u Junoj Africi sasvim je uobiajena ivotna injenica. Juna Afrika ima jednu od najviih stopa zloina nasilja u svijetu i, iako je veina tih zloina poinjena u siromanijim podrujima, kriminal je glavna briga cjelokupne populacije. Nasilje ima i nevjerojatan ekonomski utjecaj. Samo s gledita turizma, milijuni dolara bivaju izgubljeni samo zbog reputacije June Afrike kao podruja s uestalim nasiljem. Iako je junoafrika policija pokuala iskoristiti mo DNA-tehnologije u borbi protiv kriminala, postoje brojne preprjeke koje oteavaju uinkovitu uporabu DNA u te svrhe. ak i uz najsofisticiraniji automatizirani sustav DNA-testiranja na svijetu, sam broj kriminalnih sluajeva u Junoj Africi je porazan. Trenutano se baza podataka osuenih prijestupnika u Junoj Africi sastoji samo od DNA-profila prikupljenih na mjestima zloina i DNA-uzoraka osoba osumnjienih da su poinili zloin. DNA-profili osuenih
216
prijestupnika nisu ukljueni u bazu. Razlog za takvo stanje jest to da, umjesto da usvoji specifine legislative o pohranjivanju DNA-profila u bazu podataka, junoafrika vlada bazira svoje DNA-baze podataka na legislativi usvojenoj godine 1977. [19]. Oito, ti su zakoni ratificirani prije nego je DNA-testiranje ulo u uporabu. Nadalje, s obzirom na to da je pr vobitna metoda prikupljanja uzoraka bila putem uzimanja uzorka kr vi, kasnije interpretacije zakona sprijeile su prikupljanje profila osuenika pozivajui se na to da je uzimanje uzorka kr vi, tehniki gledano, napad. Zbog tog razloga DNA-profili osuenika nisu ukljueni u bazu podataka [20]. Budui da je danas mogue dobiti DNA-profil iz obriska bukalne sluznice, junoafrika vlada mora pronai nain da pohranjivanje DNA-profila osuenika u bazu podataka bude prihvatljivo prema postojeem zakonu ili da usvoji novu legislativu koja e to omoguiti. Drugi legislativni problem koji sprjeava uinkovitu uporabu DNA jest injenica da profili bivaju izbrisani iz baze nakon odsluenja kazne. To je svakako kontradiktorno onomu to samu bazu ini efikasnim oruem mogunost da se osoba identificira nakon to napusti zatvor i ponovno poini zloin. Trenutana se procedura sastoji od toga da se, nakon odsluenja kazne, DNA-profil ukloni iz aktivne Nacionalne kriminalistike DNA-baze podataka i prebaci u inaktivnu bazu. Ovo je posebno frustrirajua praksa, jer otisci prstiju ostaju pohranjeni u arhivi ak i nakon to je kazna odsluena. Vanessa Lynch jedna je od osoba koje su pogoene nasiljem u Junoj Africi. Vanessin otac ubijen je u Johanessburgu 2004. godine. Vanessa, odvjetnica po profesiji, godine 2005. zatvara svoju kancelariju i zajedno s obitelji Matthews, iji je sin otet i ubijen iste godine, pokree Projekt DNA. Pokuali su pronai nain kako da znatno pridonesu smanje-
nju stope kriminala u Junoj Africi. Traili su svrhovit, uspjean i konkretan nain reduciranja kriminala, koji bi u konanici imao dugoroan uinak. Iskustva uspjenih policijskih i pravosudnih sustava u svijetu upuivala su na jedno oito rjeenje: smanjenje stope kriminala u drugim zemljama postignuto je pokretanjem Nacionalnih kriminalistikih DNA-baza podataka (National DNA Criminal Intelligence Database NDCID). Stoga je i Projekt DNA kreiran radi maksimalnog iskoritavanja mogunosti forenzinih DNA-baza podataka u Junoj Africi suradnjom javnosti i privatnog sektora i lobiranjem za promjenu legislative [21]. Trenutana iskoritenost DNA-tehnologije gotovo je zanemariva. Zatrpana prevelikim brojem sluajeva, bez nune infrastrukture, sa zastarjelim sustavima informiranja i manjkom kompetentnog kadra, Juna Afrika ne moe iskoristiti prednosti koje prua DNA. Jedna od stvari koja umanjuje uinkovitost DNA-baze podataka u reduciranju kriminala jest i ogranienje koje je nametnula vlada da se DNA moe iskoristiti samo u sluajevima u kojima je osumnjieni identificiran.
11.9.
Australija
Australija je demokratska zemlja s federalnim ureenjem, a sastoji se od est drava i dvije teritorije. Iako sastavljena od relativno maloga broja drava i teritorija, Australija je iskusila veliki manjak koordinacije izmeu tih administrativnih jedinica kad je rije o uporabi DNA u forenzine svrhe. Umjesto da usvoje pravni akt na temelju kojega bi se razmjenjivali podatci o DNA-forenzinim profilima izmeu teritorijalnih granica kroz nacionalni sustav razmjene (slino Nacionalnom sustavu DNA-baza podataka), drave i
217
teritoriji u Australiji razmjenjuju podatke o DNA-profilima na osnovi niza meusobnih bilateralnih sporazuma. Australska drava Viktorija, 1997. godine, pr va je u zemlji usvojila legislativu kojom se regulira uporaba DNA-baza podataka [22]. Australski forenzini laboratoriji, 1998. godine, usvojili su zajedniki nacionalni standard za prikupljanje DNA-profila kriminalaca [23]. Savjetodavni komitet kaznenopravnih dunosnika (The Model Criminal Code Officers Committee) pri Stalnom komitetu glavnih dravnih odvjetnika (Standing Committee of Attorneys-General) objavio je prijedlog Modela zakona o forenzinim procedurama u svibnju 1999. godine, koji je trebao posluiti kao vodi vlastima australskih teritorija da usvoje ili unaprijede svoju legislativu koja se tie primjene DNA-analize [24]. Commonwealth, Novi Juni Wales i teritorij australskoga glavnoga grada pomno su se drali modela zakona, s nekoliko manjih izmjena [25]. Tasmanija se donekle drala Modela, ali uz vie izmjena [26]. Viktorija i Juna Australija nedavno su prilagodile svoje legislative kako bi bile u veoj suglasnosti s Modelom, iako su se odreene razlike zadrale [27]. Zapadna je Australija implementirala legislativu koja se donekle slae s Modelom zakona [28]. S druge strane, Sjeverni Teritorij nije se uope vodio prijedlogom Modela [29]. U toj administrativnoj jedinici, s obzirom na to da policija ne svrstava DNA-uzorak kao povjerljiv, policija je u mogunosti prikupiti takav uzorak bez dobivanja suglasnosti osobe ili sudskog naloga [30]. Queensland takoer ne slijedi prijedlog Modela zakona, iako je vlada iskazala nakanu da izmijeni svoju legislativu sa svrhom pojednostavnjenja sudjelovanja u sustavu nacionalnih baza podataka [31]. Dana 1. srpnja 2000. u Australiji je osnovana agencija CrimTrac. Ta agencija za pro-
vedbu zakona opsluuje nacionalnu DNA-bazu podataka Nacionalnu istranu DNA-bazu podataka (National Criminal Investigation DNA Database NCIDD) [32]. NCIDD sustav daje policiji pristup DNA-profilima sa svrhom da im pomogne u rjeavanju zloina. [33]. CrimTrac opsluuje bazu DNA-profila koja se rabi za pretragu i usporeivanje profila unutar i izmeu administracijskih jedinica. No, sama agencija CrimTrac ne sakuplja niti pohranjuje DNA-uzorke u bazu. Federalnom je parlamentu godine 2004. predoena legislativa koja bi omoguila da se australski nacionalni forenzini sustav DNA-baza podataka rabi i za identificiranje rtava nepogoda u Australiji [34]. Ta legislativa pomie granice uporabe sustava DNA-baza podataka i izvan podruja kriminoloke istrage, i dopustit e uporabu nacionalnog sustava DNA-baza podataka u svrhe identificiranja nestalih i mrtvih osoba u sluaju nesree s velikim brojem rtava na australskome tlu [35].
11.10.
Novi Zeland
Novi Zeland bio je druga zemlja u svijetu koja je usvojila zakon o stvaranju nacionalne forenzine DNA-baze podataka. To je takoer jedina zemlja u svijetu u kojoj nadlenost nad bazom podataka ima privatni subjekt, Institut za okolinu znanost i istraivanje (Institute of Environmental Science and Research). Dokument o kriminolokim istragama (uzorci kr vi) usvojen je godine 1995. na Novom Zelandu [36]. Taj dokument dopustio je uzimanje DNA-uzoraka od neokrivljenih dobrovoljaca, osoba osumnjienih za neki zloin i osuenih kriminalaca (krivih za odreeni prekraj), i svi ti uzorci arhiviraju se u nacionalnu bazu podataka [37]. Poevi od godine 1998., baza podataka bila je iskoritena u svrhu usporeivanja DNA-profila osoba i profila iz
218
nerijeenih sluajeva [38]. Preciznije, uzorci iz baze podataka usporeivani su s DNA-profilima iz nerijeenih sluajeva, u pokuaju da se identificiraju bilo koje osobe koje bi mogle biti povezane sa sluajem preko biolokog traga ostavljenog na mjestu zloina [39]. Originalni dokument dopunjen je godine 2003. kako bi se u njega uvela znanstvena dostignua u forenzinoj DNA-tehnologiji, i sada je oznaen kao Dokument iz 1995. o kriminolokim istragama (fiziki dokazi) [40] .Novi dokument dopustio je unoenje u bazu podataka i DNA-profila dobivenih iz uzoraka bukalne sluznice, uz one profile dobivene iz kr vi [41]. Na Novom Zelandu uzorci dobiveni od pojedinca ne mogu biti iskoriteni ni u jednu drugu svrhu osim za dobivanje DNA-profila radi pohrane u Nacionalnu DNA-bazu podataka. Uzorci, izolirana DNA i umnoeni DNA-produkti moraju biti uniteni nakon to se dobije DNA-profil. Trenutano, DNA-baza podataka sadrava vie od 64 198 DNA-profila osoba, dok se otprilike 800 do 1 000 novih profila doda svaki mjesec [42]. Baza takoer sadrava i vie od 13 900 profila mjesta zloina, s otprilike 200 novih profila dodanih svaki mjesec [43]. Institut za okolinu znanost i istraivanje upravlja DNA-bazom podataka u ime novozelandske policije [44]. Od svih DNA-profila dobivenih iz nerijeenih sluajeva, otprilike 58% podudara se s profilom osobe ve prisutnim u NDD-u (Nacionalna DNA-baza podataka). Osim toga, otprilike 34% nerijeenih sluajeva podudara se s drugim zloinima unesenim u CSD [45]. DNA-baza omoguila je novozelandskoj policiji da doe do podataka za vie od 5 000 prethodno nerijeenih sluajeva. Ovi su brojevi meu najviim u svijetu i predouju uinkovitost DNA-baze podataka kao orua u rjeavanju zloina.
Kriteriji za arhiviranje profila

Profili osuenih prijestupnika Kriteriji za arhiviranje profila osuenih prijestupnika umnogome variraju od zemlje do zemlje. No, ono to je zajedniko za sve sustave jest tendencija ukljuivanja veega broja i specifinih zloina (npr. pljake ili krae automobila) i skupina osuenih pojedinaca (npr. teki nasilni delikti). U nekim zemljama unos profila osuenih poinitelja kaznenih djela u bazu podataka provodi se samo za posebno naznaene zloine. U drugim pak zemljama unos ovisi o duljini kazne ili o moguoj duljini kazne. U nekim su zemljama za uzimanje uzoraka potrebni i presuda i specifian sudski nalog, dok u drugim zemljama policija ima ovlasti uzeti uzorke bez posjedovanja navedenih dokumenata. Profili osumnjienika Slino kao i za profile osuenih poinitelja kaznenih djela, kriteriji za pohranu DNA-profila osumnjienika i uhienika u baze podataka izrazito se razlikuju od zemlje do zemlje. U nekim zemljama pohrana podataka u bazu ovisi o specifinom zloinu za koji se odreena osoba sumnjii. U drugim zemljama odluka o pohrani podataka ovisi o moguoj duljini kazne koju bi osumnjienik mogao dobiti ako bude osuen. Neke zemlje ne prave razliku izmeu ovih dvaju pristupa i doputaju unos podataka o osobama osumnjienim ili uhienim za bilo koje kazneno djelo. Kao i za profile osuenika, postoji tendencija u svijetu za dopunom postojee legislative kako bi se dopustio unos podataka o osumnjienim osobama radi poveanja uinkovitosti baza podataka. Profili dobiveni iz mrlja naenih na mjestu zloina Nekolicina drava ograniava unos u bazu podataka DNA-profila dobivenih iz tragova naenih na mjestu zloina.
219
Tablica 11-1. Kriteriji za unos profila u bazu podataka Drava Austrija da bilo koji prijestup okarakteriziran kao teki prijestup da Osueni prijestupnici Osumnjienici Trag
Belgija nema baze podataka ogranieno na specifine prijestupe nad drugim oso- osumnjienika bama eka Republika ukljueni su svi osueni pri- doputeno uzimanje jestupnici, osim onih osue- uzoraka osumnjienika nih za lake prekraje u svrhu usporedbe, ali unos podataka u bazu doputen samo u sluaju podizanja optunice Estonija usvajanje legislative u tijeku Francuska Doputeno za naznaene Doputeno za naznaezloine: ne zloine (vidjeti pod seksualni delikti, osueni prijestupnici). zloini protiv ovjenosti, terorizam, razbojnitvo, nasilje s predumiljajem, muenje, posjedovanje ukradenih dobara, krivotvorenje novca, pranje novca, trgovina narkoticima, svodnitvo, svi zloini protiv ivota (ubojstvo itd.), protupravno lienje slobode (provedba u tijeku). Svaki neidentificirani trag iz sluajeva koji odgovaraju popisu zloina. nema podataka nema podataka nema podataka samo tragovi s nerazrijeenih mjesta zloina; Profil mora biti uklonjen iz baze podataka ako se poklapa s prije unesenim profilom. svaki trag moe biti arhiviran ako je to zatraio sudac
220
Tablica 11-1. Kriteriji za unos profila u bazu podataka Drava Finska Doputeno za naznaene zloine: silovanje, seksualni napad, silovanje malodobnih osoba, zavoenje djece, ubojstvo, ubojstvo s umiljajem, ubojstvo iz predumiljaja, ubojstvo iz nehaja, napad, razbojnitvo, prisila, zloporaba narkotika. Grka nema baze podataka Hrvatska nema legislative nema podataka Italija nema legislative nema podataka Maarska Po osudi za zloine kanjive s vie od 5 godina ili za navedene zloine: seksualni napad s uporabom nasilja, zloini koji ukljuuju meunarodnu aktivnost, zloini protiv djece, serijski ili organizirani zloini, zloporaba narkotika, zloini koji se tiu novca ili prijevare osiguranja, oruani zloini, terorizam, zloini protiv drave, zlouporaba nuklearne energije, pranje Zloini kanjivi s vie od 5 godina ili za navedene zloine: seksualni napad s uporabom nasilja, zloini koji ukljuuju meunarodnu aktivnost, zloini protiv djece, serijski ili organizirani zloini, zloporaba narkotika, zloini koji se tiu novca ili prijevare osiguranja, oruani zloini, terorizam, nema ogranienja nema podataka nema podataka nema podataka nema podataka nema baze podataka da Kada maksimalno mogua kazna prelazi jednu godinu; Takoer, pokuaji, potpomaganje ili navoenje na bilo koji zloin naveden pod osueni prijestupnici. Pravno, profili svih tragova mogu biti uneseni u bazu podataka. U praksi, profil mora sadravati minimum 6 lokusa i ne unose se mijeani tragovi koji sadravaju profile vie od dviju osoba. Osueni prijestupnici Osumnjienici Trag
221
Tablica 11-1. Kriteriji za unos profila u bazu podataka Drava Osueni prijestupnici novca, pripremanje teroristikih napada, zloini protiv slubene dunosti, krenje meunarodnih prava i obiaja (isti kriteriji kao i za profile osumnjienika), (nema retroaktivnih unosa profila osuenih prijestupnika). Osumnjienici zloini protiv naroda, zlouporaba nuklearne energije, pranje novca, pripremanje teroristikih napada, zloini protiv slubene dunosti, krenje meunarodnih prava i obiaja (isti kriteriji kao i za profile osuenih prijestupnika). Trag nema ogranienja
Nizozemska Unos profila ovisi o moguoj duljini kazne od vie od etiri godine. DNA-uzorak mora biti uzet od poinitelja tijekom originalne istrage (usvajanje legislative, koja e ukljuivati sve prijestupnike osuene za zloine kanjive s vie od 4 godine, u tijeku). Norveka Teki zloini ukljuuju: seksualno zlostavljanje, zloine protiv ivota i tijela, razbojnitva, ucjenu, zloine protiv ope sigurnosti (npr. piromanija). Predviena kazna mora biti najmanje dvije godine. Njemaka Policija/sud mora smatrati da postoji opasnost da e osuenik i u budunosti poiniti jedan od navedenih zloina: svi zloini protiv ivota (ubojstvo itd.), terorizam, Policija/sud mora smatrati da postoji opasnost da e osumnjienik i u budunosti poiniti jedan od navedenih zloina: svi zloini protiv ivota (ubojstvo itd.), terorizam, Analizu mora odrediti sudac, i to samo za navedene zloine: svi zloini protiv ivota (ubojstvo itd.), terorizam, svi zloini protiv spolnog integriteta, Nema unosa profila osumnjienih u bazu podataka. Izmjena legislative u tijeku. Ogranienja: mijeani trag ne vie od 2 osobe i mrlja mora biti u vezi sa zloinom. Unos profila ovisi o moguoj duljini kazne od vie od etiri godine. Dodatni je zahtjev da tuilac ili istrani sudac mora smatrati da test moe pridonijeti rjeavanju sluaja). Svi tragovi. Profil pohranjen dulje od 18 godina mora biti uklonjen nakon presude.
222
Tablica 11-1. Kriteriji za unos profila u bazu podataka Drava Osueni prijestupnici svi zloini protiv spolnog integriteta, svi zloini protiv slobode (otmica itd.), sva razbojnitva i ucjena, napad i zlostavljanje, provala i kraa automobila, podmetanje poara, drugi zloini koji odgovaraju kriterijima tekih zloina (isti kriteriji kao i za profile osumnjienika). Osumnjienici svi zloini protiv spolnog integriteta, svi zloini protiv slobode (otmica itd.), sva razbojnitva i ucjena, napad i zlostavljanje, provala i kraa automobila, podmetanje poara, drugi zloini koji odgovaraju kriterijima tekih zloina (isti kriteriji kao i za profile osuenih prijestupnika). Trag svi zloini protiv slobode (otmica itd.), sva razbojnitva i ucjena, napad i zlostavljanje, provala i kraa automobila, podmetanje poara, drugi zloini koji odgovaraju kriterijima tekih zloina (isti kriteriji kao i za profile osumnjienika i osuenih prijestupnika).
Portugal CODIS implementiran samo za tragove povezane sa zloinima Poljska (usvajanje legislative u toku) nema unosa podataka u baze osobe osumnjiene za ubojstvo, zloine protiv spolne slobode ili udorea, odreene kategorije zloina protiv imovine nema podataka za svako kazneno djelo kada postoje opravdane indicije da se pretpostavi umijeanost osobe u kazneno djelo, a DNA-uzorak moe potvrditi ili opovrgnuti njegovu umijeanost u zloin nema podataka svi tragovi povezani sa zloinom nema podataka nema podataka da
Republika Irska nema legislative nema podataka Slovenija za svako kazneno djelo
223
Tablica 11-1. Kriteriji za unos profila u bazu podataka Drava Sjeverna Irska Trenutano nema unosa, osim: profili uzeti od osumnjienih koji su naknadno osueni. Trenutano u razmatranju uzimanje uzoraka zatvorenika. kotska Svatko zakonito uhien ili pritvoren. Kriteriji policije za unos profila: seksualni delikti, zloini nasilja, provale, sve krae i pokuaji krae, kad god slubenik smatra da je nuno. panjolska nema legislative nema podataka vedska unos profila ovisi o moguoj duljini kazne od vie od dvije godine vicarska ako je kazna dulja od dvije godine Ujedinjeno Kraljevstvo za svako kazneno djelo za svako kazneno djelo kada postoje opravdane indicije da se pretpostavi umijeanost osobe u kazneno djelo, a DNA-uzorak moe potvrditi ili opovrgnuti njegovu umijeanost u zloin svi tragovi povezani sa zloinom svaka osoba osumnjiena za protuzakonito djelo ili zloin svaki trag koji prikupi policija ili sudski vjetaci svi osumnjienici svi tragovi nema podataka nema podataka Svatko zakonito uhien ili pritvoren. nema ogranienja Profili osumnjienih za nema pravnih ogranienja sva kaznena djela. Kazneno djelo ono koje moe rezultirati zatvorskom kaznom. Osueni prijestupnici Osumnjienici Trag
Kriteriji policije za unos nema ogranienja profila: seksualni delikti, zloini nasilja, provale, sve krae i pokuaji krae, kad god slubenik smatra da je nuno.
224
Kriteriji za uklanjanje profila iz baze podataka

Profili osuenih prijestupnika Kao i kriteriji za unos profila osuenih prijestupnika u bazu podataka, kriteriji za uklanjanje profila iz baza razlikuju se od zemlje do zemlje. Uvidjevi mogunost rjeavanja starih, nerijeenih sluajeva, neke zemlje zadravaju profile osuenih prijestupnika u bazama podataka neodreeno dugo ili sve
do smrti te osobe. U nekoliko zemalja profili ostaju pohranjeni u bazi podataka onoliko godina koliko traje dodijeljena kazna. Osumnjienici/uhienici U veini zemalja koje imaju baze podataka DNA-profila osumnjienika profili se uklanjaju nakon oslobaajue presude ili odbacivanja optubi. Ako osumnjiena osoba bude osuena, tada se primjenjuju kriteriji za uklanjanje profila osuenih prijestupnika.
Tablica 11-2. Kriteriji za uklanjanje profila iz baze podataka Drava Austrija nikada Belgija 10 godina nakon smrti prijestupnika eka Republika Profili se revidiraju svake tri godine. Uklanjaju se nakon 80 godina. Estonija planirana legislativa Finska godinu nakon smrti prijestupnika Uzorak mora biti uniten, a profil uklonjen u tijeku godinu dana nakon to je revizor obavijeten od istraitelja da nema dokaza zloinu, da su optube odbaene ili da je presuda ponitena. pet godina nakon smrti nakon oslobaajue presude nema baze podataka nema baze podataka Osumnjieni, ako je osloboen, mora podnijeti zahtjev za uklanjanje profila iz baze. Osueni prijestupnici Osumnjienici
Francuska Neidentificirane mrlje: 40 godina nakon DNA-analize. Osueni prijestupnici: profil biva uklonjen 40 godina nakon konane presude, ili kad osoba dosegne dobnu granicu (80 godina ivota). Grka nema legislative nema podataka nema podataka Uklanjanje profila iz baze mora zatraiti istraitelj ili osumnjieni kada uvanje profila vie nije od koristi (nema dokaza zloinu, ili osumnjieni nije osuen).
225
Tablica 11-2. Kriteriji za uklanjanje profila iz baze podataka Drava Italija nema legislative Maarska Profil se zadrava sve do odbacivanja Ako je osoba osuena, profil se zadrava optubi ili oslobaanja. 20 godina nakon isteka kazne. Ako je osoba podvrgnuta prisilnom medicinskom lijeenju, osuena na uvjetnu kaznu ili kaznu zatvora, profil se zadrava do isteka kazne. Nizozemska Vrijeme uvanja profila varira: 20 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom od 4 do 6 godina; 30 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom duljom od 6 godina. Norveka Profili moraju biti uklonjeni iz baze nema podataka podataka u roku od 2 godine nakon prijestupnikove smrti ili ako je sluaj ponovno otvoren i osoba naknadno proglaena nedunom. Njemaka Podatci se provjeravaju nakon 10 godina za odrasle, nakon 5 godina za malodobne osobe. Ako postoji opasnost od ponavljanja zloina ili osoba ima kriminalni dosje, produljenje je mogue. Neogranieno zadravanje profila u bazi mogue je u sluaju ubojstva ili seksualnog delikta. U suprotnom, profili se uklanjaju. Poljska (usvajanje legislative u tijeku) Portugal nema podataka nema podataka Podatci se provjeravaju nakon 10 godina za odrasle, a nakon 5 godina za malodobne osobe. Ako postoji opasnost od ponavljanja zloina ili osoba ima kriminalni dosje, produljenje je mogue. Neogranieno zadravanje profila u bazi je mogue u sluaju ubojstva ili seksualnog delikta. U suprotnom, profili se uklanjaju. Ako je osumnjieni osuen, profil se zadrava sukladno duljini kazne: 20 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom od 4 do 6 godina; 30 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom duljom od 6 godina. nema podataka nema podataka Osueni prijestupnici Osumnjienici
226
Tablica 11-2. Kriteriji za uklanjanje profila iz baze podataka Drava Republika Irska nema legislative Slovenija Vrijeme ovisi o zloinu za koji su osu- Nakon oslobaajue presude. eni. Sjeverna Irska Nema pravnih zahtjeva za brisanje profila iz baze podataka. Administrativna je praksa da profili osoba koje su umrle ili navrile 100 godina ivota bivaju uklonjeni iz baze. kotska Profili ostaju u bazi neogranieno du- Profili ostaju u bazi podataka sve do oslobago. anja ili dok policija ne odbaci optube. panjolska (samo neodobreni prijedlog smjernica) vedska Uklanjaju se 10 godina nakon odslue- Ostaju pohranjeni sve do odobrenja da se nja kazne. osumnjieni ubiljei kao osueni prijestupnik. vicarska Nakon 30 godina ako osoba nije ponovno osuena. Ako je osoba umrla. Po zahtjevu: 20 godina nakon putanja na slobodu ili zavretka terapijskog tretmana. Ako je osumnjienik izuzet u odreenim okolnostima. Ako je osoba umrla. Po zahtjevu nakon oslobaanja: godinu dana nakon zavretka suenja, 5 godina nakon putanja na uvjetnu kaznu, 5 godina nakon plaanja globe. Nema pravnih zahtjeva za brisanje profila iz baze podataka. Administrativna je praksa da profili osoba koje su umrle ili navrile 100 godina ivota bivaju uklonjeni iz baze. nema podataka nema podataka Osueni prijestupnici Osumnjienici
Ujedinjeno Kraljevstvo Zakon doputa zadravanje profila u Zakon doputa zadravanje profila u bazi bazi podataka neodreeno dugo. podataka neodreeno dugo ak i ako je osumnjieni puten ili osloboen. Napomena: Podatci vezani za hrvatsko zakonodavstvo prezentirani su u poglavlju 6 ove knjige.
227
uvanje uzoraka
uvanje referentnog uzorka ima praktine i politike implikacije. Neke su zemlje odluile zadrati uzorke u bazama podataka radi usporedbe ili buduih analiza u sluaju
grjeke ili napretka tehnologije. Pa ipak, neke zemlje odluile su unititi referentne uzorke kako bi uklonile svaku mogunost ili pomisao da bi ih vlada mogla iskoristiti za bilo kakve neprikladne ili nezakonite analize.
Tablica 11-3. uvanje uzoraka Drava Austrija Uzorak se uva. Osumnjieni, ako je osloboen, mora podnijeti zahtjev za uklanjanje profila iz baze i unitenje uzorka. Osueni prijestupnici Osumnjienici
Belgija Uzorak mora biti uniten odmah na- Uzorak mora biti uniten nakon potvrde da kon dobivanja profila. nema zahtjeva za supravjetaenjem. eka Republika Nema specifinih zakonskih odredbi glede uvanja ili unitavanja uzorka. Sudbina uzorka obino slijedi sudbinu sluaja. Estonija planirana legislativa Finska Unitavanje uzorka vezano je za brisanje profila. Uzorak mora biti uniten, a profil izbrisan u tijeku godine dana nakon to je istraitelj obavijestio revizora da nema dokaza zloinu, da su optube odbaene ili da je presuda ponitena, ili pak godinu dana nakon smrti osobe. Francuska Uzorci se uvaju 40 godina nakon odsluene kazne ili dok osoba ne dosegne dobnu granicu (80 godina ivota). Uzorak osumnjienika vraa se u Magistrat ili zaduenom policijskom slubeniku i pohranjuje se kao i svaki drugi dokaz. Ako je osumnjieni osuen, uzorak se prosljeuje u skladite andarmerije (SCPPB) na pohranu. Unitavanje uzorka vezano je za brisanje profila. Uzorak mora biti uniten, a profil izbrisan u tijeku godine dana nakon to je istraitelj obavijestio revizora da nema dokaza zloinu, da su optube odbaene ili da je presuda ponitena, ili pak godinu dana nakon smrti osobe. nema podataka nema podataka Nema specifinih zakonskih odredbi glede uvanja ili unitavanja uzorka. Sudbina uzorka obino slijedi sudbinu sluaja (nema baze podataka za osumnjienike).
228
Tablica 11-3. uvanje uzoraka Drava Grka nema podataka Ako je profil osumnjienog usporeen s podatcima iz baze, uzorak mora biti uniten u roku od 10 dana. Osueni prijestupnici Osumnjienici
Italija nema legislative Maarska Mogue je zadrati referentni biolo- Mogue je zadrati referentni bioloki uzoki uzorak onoliko dugo koliko po- rak onoliko dugo koliko postoje okviri za stoje okviri za uvanje profila u bazi uvanje profila u bazi podataka. podataka. Nizozemska Bioloki se uzorak uva onoliko dugo koliko i sam profil. Vrijeme uvanja profila varira: 20 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom od 4 do 6 godina; 30 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom duljom od 6 godina. Norveka Uzorak mora biti uniten nakon to Uzorak mora biti uniten nakon to je profil je profil unesen u bazu podataka. unesen u bazu podataka. Njemaka Svi referentni uzorci moraju biti uni- Svi referentni uzorci moraju biti uniteni nateni nakon zavretka DNA-analize. kon zavretka DNA-analize. No, uzorci uzeti za potrebe istrage (izvjetaj vjetaka) moraju biti uvani do zavretka kaznenog postupka donoenjem konane presude. Poljska (usvajanje legi- Zahtijevat e se uvanje uzorka. slative u tijeku) Portugal nema podataka nema podataka (Trenutana baza podataka sadrava (Trenutana baza podataka sadrava samo samo mrlje naene na mjestu zloi- mrlje naene na mjestu zloina.) na.) Zahtijevat e se uvanje uzorka. Bioloki se uzorak uva onoliko dugo koliko i sam profil. Vrijeme uvanja profila varira: 20 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom od 4 do 6 godina; 30 godina ako je osoba osuena za zloin s moguom kaznom duljom od 6 godina. Ako je osumnjieni osloboen, profil mora biti izbrisan. nema podataka Uzorci se pohranjuju.
229
Tablica 11-3. uvanje uzoraka Drava Republika Irska nema podataka Slovenija Nema specifinih zakonskih odredbi Nema specifinih zakonskih odredbi glede glede uvanja ili unitavanja uzorka. uvanja ili unitavanja uzorka.. Sjeverna Irska Nema pravnih zahtjeva za unitava- Nema pravnih zahtjeva za unitavanje uzonje uzoraka. raka. Lokalna policija nalae unitavanje uzorka u posebnim okolnostima, nakon oslobaanja/zavretka postupka. kotska Uzorci se uvaju neogranieno dugo. Uzorci se uvaju neogranieno dugo. panjolska (samo neodobreni prijedlog smjernica) vedska Uzorak se uva dvije godine. Uzorak se uva dvije godine. Ako je prijestupnik mrtav, uzorak se Ako je osumnjienik mrtav, uzorak se uva uva 25 godina. 25 godina. vicarska Svi uzorci i odgovarajua DNA moraju biti uniteni u roku od tri mjeseca nakon pohrane profila u bazu podataka ili to je mogue prije nakon to uzorak vie nije potreban u svrhu usporedbe. Ujedinjeno Kraljevstvo Zakon doputa neogranieno dugo Zakon doputa neogranieno dugo legalno legalno uvanje uzoraka. uvanje uzoraka (ak i ako je osumnjieni osloboen). Napomena: Podatci vezani za hrvatsko zakonodavstvo prezentirani su u poglavlju 6 ove knjige. Svi uzorci i odgovarajua DNA moraju biti uniteni u roku od tri mjeseca nakon pohrane profila u bazu podataka ili to je mogue prije nakon to uzorak vie nije potreban u svrhu usporedbe. Nakon isteka vremena za mogue su- Nakon isteka vremena za mogue supravjepravjetaenje, uzorci e biti uniteni taenje, uzorci e biti uniteni po odluci po odluci suda. suda. nema podataka Osueni prijestupnici Osumnjienici
230
Literatura
1. United Nations Office on Drugs and Crime Center for International Crime Prevention, Seventh United Nations Sur vey of Crime Trends and Operations of Criminal Justice Systems, 19982002:117. 2. Busher Lesley. The Use of the UK National DNA Database to Support an Intelligence Led Approach to the Investigation of Crime, Journal of Forensic Medicine, 2002; 2125. 3. Ibid., 21-25. 4. Ibid., 21-25. 5. http://www.npia.police.uk/en/7737.htm 6. http://www.npia.police.uk/en/7737.htm 7. http://www.npia.police.uk/en/7737.htm 8. http://www.npia.police.uk/en/7737.htm 9. Strafprozessordnung (StPO), 81a-81h. (German legislation) 10. Ibid. 11. Presentation to the ENFSI DNA working Group by Representatives of Austrian and German forensic laboratories. 12. http://www.eu2007.de/en/, Press release, EU Wide networking of criminal records. June 13, 2007. 13. ht tp : / / w w w. i nt er p o l . i nt / Pu b l i c / I C P O / PressReleases/PR2007/PR200729.asp 14. ht tp : / / w w w. i nt er p o l . i nt / Pu b l i c / I C P O / PressReleases/PR2007/PR200729.asp 15. http://www.fbi.gov/hq/lab/html/codis3.htm 16. http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/clickmap.htm 17. http://www.nationmaster.com/graph/cri_acq crime-acquitted 18. Government of India, Ministry of Women and Child Development: Study on Child Abuse: India 2007, p.vi. 19. http://www.dnaproject.co.za/content/content. php?type=article&section=15&id=38 20. http://www.dnaproject.co.za/content/content. php?type=article&section=15&id=38 21. Interview, Vanessa Lynch, Founder of the DNA project, June 11,2007. 22. http://www.crimtrac.gov.au/dnahistory.htm 23. http://www.crimtrac.gov.au/dnahistory.htm 24. http://www.bc.edu/bc_org/avp/law/lwsch/ journals/bciclr/24_2/05_TXT.htm 25. ttp ://www.austl ii.e du .au/au/other/a lrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html 26. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html 27. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html 28. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html 29. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html 30. http://www.bc.edu/bc_org/avp/law/lwsch/ journals/bciclr/24_2/05_TXT.htm 31. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html 32. http://www.crimtrac.gov.au/aboutus.htm 33. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html#heading2 34. http://www.news-medical.net/?id=3967 35. http://www.news-medical.net/?id=3967 36. http://www.bc.edu/bc_org/avp/law/lwsch/ journals/bciclr/24_2/05_TXT.htm 37. http://www.bc.edu/bc_org/avp/law/lwsch/ journals/bciclr/24_2/05_TXT.htm 38. http://www.bc.edu/bc_org/avp/law/lwsch/ journals/bciclr/24_2/05_TXT.htm 39. h t t p : / / w w w. e s r. c r i . n z / c o m p e t e n c i e s / forensicscience/dna/DNAdatabank.htm 40. h t t p : / / w w w. e s r. c r i . n z / c o m p e t e n c i e s / forensicscience/dna/DNAdatabank 41. h t t p : / / w w w. e s r. c r i . n z / c o m p e t e n c i e s / forensicscience/dna/DNAdatabank.htm 42. h t t p : / / w w w. e s r. c r i . n z / c o m p e t e n c i e s / forensicscience/dna/DNAdatabank.htm 43. h t t p : / / w w w. e s r. c r i . n z / c o m p e t e n c i e s / forensicscience/dna/DNAdatabank.htm 44. http ://www.austlii.edu.au/au/other/alrc/ publications/reports/96/39_Forensic_Uses_of_ Genetic_Information.doc.html#heading24 45. Bedford Keith and Lai Betty. ESR, Powerpoint Presentation, The Effective Use of DNA Databases: The New Zealand Experience. International Academy of Sciences meeting, August 2005.
231
Kazalo pojmova
A ABO sustav krvnih grupa 50, 84 ACPO 211 adenin 7 ad hoc sudski vjetak 112 AFLP vidi polimorfizam duljine umnoenih ulomaka alel 6, 8, 37, 40-54, 64, 65 allelic ladder 30, 31, 191 Alternativno prekrajanje 3 AluQuant Human DNA Ouantitation System 24 amelogenin 30 AmpFLSTR Cofiler sustav 30 AmpFLSTR Identifiler sustav 18, 30-33, 108 AmpFLSTR Minifiler sustav 17 AmpFLSTR Profiler Plus sustav 30 AmpFLSTR Profiler sustav 30 AmpFLSTR Yfiler sustav 14 AmpliType DQA1 sustav 27 AmpliFLP D1S80 sustav 28 AmpFLSTR Identifiler sustav 31 Andersonova sekvencija 15 antraks 164, 166, 173 automatsko sekvenciranje 33 autosom 6, 7
B Bayesov teorem 38 benzidinska proba 80 bezmajinski (deficijentni) test oinstva 41, 44 biljna DNA 54, 203 biljni dokaz 200, 201 bioloki tragovi 17, 76-78, 145, 147 bioloki otac 37 biosigurnost 178 bioterorizam 163, 177, 207 biozatita 179 bludne radnje 143 BodePlex I 17 BodePlex II 17 C 14C metoda 46, 107 bentricon 22 Chelex 100 18, 21, 22, 74, 125, 126 citokrom B 60, 193 citozin 7 CODIS (engl. Combined DNA Indexing System) 11, 29, 215 COI 185, 186, 188 COII 185, 186, 188
233
Combur3 test 155 CPI vidi kombinirani indeks oinstva CRFNE vidi kombinirana neiskljuenost sluajno odabrane ene iz ope populacije CRMNE vidi kombinirana neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji CRPNE vidi kombinirana neiskljuenost sluajno odabranih roditelja iz ope populacije CRS (engl. Cambridge Reference Sequence) 61 CTAB (cetil-trimetil-amonijev bromid) 84 D D-petlja 60, 61 daktiloskopija 102 denaturirajua visokotlana tekuinska kromatografija (DHPLC) 69 denaturirajua gradijent gel-elektroforeza (DGGE) 69 DETS-otopina 194 DNA analitiki strojevi 33 DNA-baza podataka 210-218 DNA fingerprinting 37 DNA (genetiki) profil 37, 50-52, 83, 155, 206, 224 domovinski rat 47 Drugi svjetski rat 47 E EDTA 22, 81, 190 ekshumacija 99, 100 elektroferogram 31, 32, 159 elektroforeza 23, 24 ENFSI 148 entomologija 183 eukarioti 4, 59
F fenol-kloroform 22 fenolftaleinska proba (Kastk-Mayerov reagens) 80 fenotip 49 forenzina botanika 199, 200 forenzina entomologija 183 forenzina identifikacija 49 forenzina mikrobiologija 163 FSS (engl. Forensic Science Service) 29, 211 FTA 21, 23, 149, 150, 153 G gen 4, 5, 36 GenBank 193 Gene Print STR System 125 genetiki drift 35 genetiko usko grlo 69, 70 genom 3 genotip 49 genska ravnotea 35, 36 GMO 195 GOBASE 185 gvanin 7 H haplotip 53 Hardy-Weinbergova ravnotea 35, 49, 50 heteroplazma 14, 15, 68-70 heterozigot 6, 35 hibridizacija 18 hipoklorit 154 HIV 164, 177 HLA (humani leukocitni antigeni) analiza 80, 139 homologni kromosom 6 homoplazma 68-70 homozigot 6, 35 HV-1 14, 60, 61, 63, 64, 65
234
HV-2 14, 60, 61, 63, 64, 65 HVS I 193 HVS II 194 I identifikacije 45-48, 97, 102 ILS (engl. Internal Lane Standard) 30 indeks oinstva (engl. Paternity index PI) 37, 38 INTERPOL 29 Interpol DNA-protokol 214 INTERPOL-DVI (Disaster-Victim-Identification)-FORM 106 intron 7 ISHF (engl. International Society of Forensic Haemogenetics) 11 ISFHG (engl. International Society for Forensic Human Genetics) 9 ISGN (engl. International System of Gene Nomenclature) 8 iskaz 113 ispad alela 190 izolacija 36 J jezgra 4, 59 K Kazneni zakon (KZ) l. 90.95. 119 l. 96.249. 120 kemijske probe 82 klon 195 kodon 7 kombinirana neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji (engl. Combined Random Man Not Excluded CRMNE) 40 kombinirana neiskljuenost sluajno odabrane ene iz ope populacije (engl. Combined Random Female Not Excluded CRFNE) 45
kombinirana neiskljuenost sluajno odabranih roditelja iz ope populacije (engl. Random Man Not Excluded CRPNE) 47 kombinirani indeks oinstva (engl. Combined Paternitv Index ili (CPI) 37, 38, 42 kombinirana vjerojatnost 39 kontaktni tragovi 145 kontaminacija 152, 154 kontributor mijeanoga traga 52 kontrolna regija mtDNA 60, 61 kratke tandemski ponavljajue sekvencije (engl. Short Tandem Repeats STR) 7, 9-17, 27, 29-33, 47, 50, 62, 63, 187, 190, 193, 194, 204, 205 kromosom 5, 36 kukci 184, 185 kvantificiranje DNA 23 L lanana reakcija polimerazom (engl. Polymerase Chain Reaction PCR) 3, 9, 17, 23, 26-29, 33, 63, 157, 165, 173, 184, 187, 188, 189, 191, 194, 204 leukomalahitska proba (LMG) 80 liinka 184, 185, 188 LR (engl. likelohood ratio) 50, 51, 195 lokus 6 LTR (engl. Long Tandem Repeats) 29, 193 luminolna proba 80 M makrotrag 76 makroskopski pregled 82 Maxam-Gilbertova metoda 33 MC1R gen 191 Mendelovo nasljeivanje 35 metoda brojenja 66 migracija gena 36 mijeani trag 51
Kazalo pojmova
235
mikroip 173-175 mikrosatelitna ponavljanja 10 mikroskopski preparat 155 mikrotrag 76, 87 miniSTR sustav 17 miljenje 113 mitohondrij 4, 59 mitohondrijska DNA (mtDNA) 14, 46, 59-70, 191 mjesto dogaaja 73, 74, 87 monohibridno krianje 35 multipleksni STR sustav 10, 29-33, 190 mutacija 36 N NaF (natrijev fluorid) 81 nalaz 113 Narodne novine broj 11/78 130 broj 45/89 130 broj 59/90 130 broj 53/91 135 broj 91/92 135 broj 110/97 116, 118, 119 broj 27/98 111, 116, 119 broj 162/98 130 broj 58/99 111 broj 112/99 111, 135 broj 50/00 116, 119 broj 129/00 116 broj 51/01 116 broj 58/02 111, 119 broj 143/02 111 broj 103/03 122 broj 111/03 116 broj 116/03 130 broj 117/03 135 broj 193/03 116 broj 17/04 130 broj 178/04 111
broj 4/05 122 broj 88/05 135 broj 115/06 111 broj 118/06 122 nasumino umnoena polimorfna DNA (engl. Random Amplified Polymorphic DNA RAPD) 186, 187, 190 neiskljuena vjerojatnost oinstva 40 neiskljuenost sluajno odabrane ene iz ope populacije (engl. Random Female Not Excluded RFNE) 43-46 neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji (engl. Random Man Not Excluded RMNE) 40, 43, 48, 49 neiskljuenost sluajne odabranih roditelja iz ope populacije (engl. Random Man Not Excluded RPNE) 46, 47 neprijeporni (nesporni) uzorci 82, 148 nuklearna DNA (jezgrina DNA) 5 nukleotid 16 O obdukcija 75 Obiteljski zakon l. 53.-55. 131 l. 65. 132 l. 71.-74 . 132 l. 77. 133, 140 l. 78. 133 l. 86. 133 l. 88. 133, 140 l. 272. 135 l. 286. 135 l. 292. 135, 137 l. 361.-368. 130 obvezatni alel 37, 41 oevid 74, 87, 89, 91, 93 oinstvo vidi dokazivanje oinstva odnos izgleda 66 oralni bris 156 organska otapala 20
236
P par baza 7 PBS (phosphate-buffered saline) otopina 194 palinologija 205 PCR vidi lanana reakcija polimerazom PCR-RFLP 186, 189 PCR-FINS 189 pelud 200, 202, 205 Phadebas Amylase-test 155 Phosphatesmo KM-test 155 PI vidi indeks oinstva plazmid 4 PNPP (propisani nain policijskoga ponaanja) 123 poetnica 27, 34, 187 pohranjivanje tragova 77 polimeraza 27 polimorfizam 8 polimorfizam duljine restrikcijskog ulomka (engl. Restriction Fragment Length polymorphism RFLP) 9, 24, 26, 27, 29, 190 polimorfizam duljine umnoenih ulomaka (engl. Amplified Fragment Length polymorphism AFLP) 7, 203, 204 polimorfizam konformacije jednolanane DNA (engl. Single Strand Conformation Polymorphism SSCP) 77 polimorfizam pojedinih nukleotida (engl. Single Nucleotide Polymorphism SNP) 13, 16, 61, 63, 165 polimorfni lokus 8 PowerPlexY sustav 14, 53 Power Plex 16 sustav 18, 30, 31 preporuka 92 36, 118, 128 pretpostavljeni otac 37, 39 prijeporni (sporni) uzorci 84, 148 prikupljanje tragova 77 prirodna selekcija 36
produkt gel 23, 25 prokarioti 4 promjenjivi broj ponavljajueg niza (engl. Variable Number Tandem Repeats VNTR) 7, 26, 27, 29 PSA 155 Q Quantiblot Human DNA Identification Kit 24 Quantifiler Human DNA Identification Kit 24, 157 Quantifiler Y-male DNA Identification Kit 24 Qiagen 18, 22 QRT-PCR 18, 24, 25 R rekombinacija 13, 35, 36 rektalni bris 155 RFNE vidi neiskljuenost sluajno odabrane ene iz ope populacije RMNE vidi neiskljuenost sluajne osobe u opoj populaciji RPNE vidi neiskljuenost sluajno odabranih roditelja iz ope populacije RNA 165, 175 RFLP vidi polimorfizam duljine restrikcijskog ulomka RAPD vidi nasumino umnoena polimorfna DNA S Sangerova metoda 33 Sangur test 80 segregacija 35 Seratec-test 156 silovanje 143, 215 SINE (engl. Short Interspersed Element) 191 Size standard 33
Kazalo pojmova
237
slobodna ocjena dokaza 115 snaga iskljuenja 40 SNP vidi polimorfizam pojedinih nukleotida spektrofotometrija 23 spolne stanice 6 spolna sloboda 143 spolni kromosomi 6, 12, 14 spolno udoree 143 sroivanje 36 SSCP vidi polimorfizam konformacije jednolanane DNA SSO (engl. Sequence Specific Oligonucleotide Probe Analysis) 15 StockMarks for Cattle Bovine Genotyping Kit 191 StockMarks for Dogs Canine Genotyping Kit 191 StockMarks for Horses Equine Genotyping Kit 191 STR vidi kratke tandemski ponavljajue sekvencije Stutter 29 sudski vjetak 111 T Taq polimeraza 27 TE-pufer 22 testiranje roditeljstva 35 timin 7 tjelesne (somatske) stanice 6, 61, 62 toksikologija 207 trag 75 two exclusion rule 43 U uestalost alela 37, 38, 40 usporedna mikroskopija 202 uravnoteeno vezivanje 36
V vaginalni bris 156 vjerojatnost oinstva 39, 40, 42, 44 vjetaenje 113 VNTR pogledaj promjenjivi broj ponavljajueg niza W WHO (engl. World Health Organization) 176, 178 X X-kromosom 6, 12, 14 Y YHRD baza podataka 53, 54 Y kromosom 6, 14, 52 Y-Plex 14 Y-STR sustav 14, 53 Yiedl gel vidi produkt gel Z Zakon o braku i porodinim odnosima l. 286.-289. 135 Zakon o kaznenom postupku (ZKP) l. 8. 114 l. 249. 118 l. 258.-262. 114 l. 247.-266. 112, 114, 115, 118, 119, 121, 123 Zakon o parninom postupku 135, 136 Zakon o potvrivanju (ZOP) 122 Zakon o zatiti osobnih podataka (ZZOP) 122 ivotinjska DNA 54
238
Dragan Primorac i suradnici / ANALIZA DNA U SUDSKOJ MEDICINI I PRAVOSUU
Izdava MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB, Cankarova 13
Za izdavaa ANA RAI, prof.
Urednica ANA RAI Lektor TOMISLAV SALOPEK Korektorica JASENKA LESNIK-GAPI Slog i prijelom
Naslovnicu oblikovala ANDREA KNAPI
Tisak: MEDICINSKA NAKLADA, Zagreb, 2008.

DNA Analiza

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

DNA Analiza

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Dragan Primorac i suradnici / ANALIZA DNA U SUDSKOJ MEDICINI I PRAVOSUU

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB

ANALIZA DNA U SUDSKOJ MEDICINI I PRAVOSUU

Dragan Primorac Damir Marjanovi

MEDICINSKA NAKLADA ZAGREB, 2008.

Prevoditeljica 10. poglavlja:

Prevoditeljica 11. poglavlja:

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

1.14. 1.15. 1.16. 1.17.

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Kratak prikaz povijesti istraivanja DNA

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

Uvod u humanu genetiku

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

jezgra citoplazma kromosom

stanica DNA molekula DNA

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

DNA (deoksiribonukleinska kiselina)

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

i o njima e biti neto vie rijei u iduim dijelovima ovoga poglavlja.

Varijabilnost (raznolikost) DNA

Struktura i nomenklatura STR-biljega

A TGCA T T T AA T ACGT AAA T T

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

9 mikrosatelitnih ponavljanja 9 mikrosatelitnih ponavljanja ATCC

9 mikrosatelitnih ponavljanja ATCC B) a)

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT GAAT

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

Analiza spolnih kromosoma

X X 106 bp X 106 bp X `enski spol Y mu{ki spol

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

Mitohondrijska DNA (mtDNA)

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Primjena novih molekularnih biljega

T A A T C A T GG T C A T AG C T G T T T C C T G T G T GA A A T T G T T A T 100 110 120 130

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

datnoj analizi mitohondrijske DNA [34]. Naime, kako je ve nagovijeteno u prethod-

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Potencijalni bioloki izvori DNA

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

b) stupnju razgradnje DNA. Dugotrajno stajanje ak i velike kr vne mrlje u nepoUzorak

izdvajanje DNA (organska, Chelex, Qiagen, IQ)

kvantificiranje DNA (spektrofotometrija, hibridizacija, QRT-PCR)

multipleksni STR-sustav (PowerPlexTM 16 System, AmpFLSTR IdentifilerTM PCR Amplification Kit)

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Osnovni modeli i etape procesa forenzine DNA-analize

Prikupljanje i pohranjivanje uzoraka

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu

Metode izdvajanja DNA

Izdvajanje DNA s pomou organskih otapala

Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuu

Metode izdvajanja DNA u forenzi~noj genetici

B) izdvajanje DNA Chelex 100 metodom krvna mrlja

inkubacija na sobnoj temperaturi centrifugiranje

odbacivanje supernatanta 5% Chelex

ispiranje s ekstrakcijskim filtrom odbacivanje supernatanta dodavanje PCR-reagensa

inkubacija (56 C) inkubacija 100 C centrifugiranje

nije potrebna kvantifikacija DNA PCR kvantificiranje DNA PCR

pohranjivanje na 20 C kvantificiranje DNA PCR

Analiza DNA u sudskoj medicini i u pravosuu