1.

Metode

1.1

Spektrofotometrija
Spektroskopija se u poetku, odnosila na granu znanosti koja se bavila svjetlou (tj.

vidljivim zraenjem razluenim u valne duljine koje tvore spektar). Kako je vrijeme prolazilo,
znaenje spektroskopije se proirilo pa uz svjetlost ukljuuje i druge vrste zraenja: x-zraka,
ultraljubiasto, infracrveno, mikrovalno i radiofrekvencijsko zraenje. Danas imamo iroku
primjenu spektroskopije koja je proirena i na tehnike bez elektromagnetskog zraenja,
masena i elektronska spektroskopija [3]. S aspekta spektroskopije, apsorpcija je proces u
kojem je prisutna neka kemijska vrsta u propusnoj sredini koja selektivno priguuje odnosno
smanjuje intenzitet neke frekvencije elektromagnetskog zraenja. Apsorpcija fotona mogua
je samo ako je energija fotona jednaka energijskoj razlici izmeu osnovnog i nekog od viih
stanja estice. Tada atomi, molekule ili ioni prelaze u pobueno, vie energetsko stanje.
Vrijeme ivota pobuene vrste je vrlo kratko (u vremenu od 10 -6 do 10-9 s) a relaksacija u nie
ili osnovno stanje zasniva se uz otputanje suvika energije u obliku elektrokemijskog
zraenja, topline ili ak oboje [3]. Elektronska apsorpcija je proces kad elektron prelazi
izmeu dvije orbitale. U molekuli se pored elektronskih mogu pojaviti jo dvije vrste prijelaza
koji su inducirani zraenjem: vibracijski i rotacijski prijelazi. Vibracijski prijelazi se
pojavljuju zbog mnotva kvantiziranih energijskih stanja [14].

1.1.3

Instrumenti

Veina analitikih instrumenata za emisijsku, apsorpcijsku i fluorescencijsku

spektroskopiju su meusobno slini. Sastavljeni su od pet osnovnih dijelova: stabilnog izvora
energije zraenja, selektora valnih duljina koji omoguuje izdvajanje odreenog valnog
podruja, jednog ili vie spremnika za uzorke, detektora zraenja ili pretvornika energije
zraenja u mjerljiv signal (najee elektrine) te procesora signala i ureaja za njegovo
oitanje [3]. S obzirom na vrstu spektroskopije imamo razliite izvore zraenja. Zadatak
selektora valnih duljina je da suava mjerno podruje od uske vrpce koju uzorak apsorbira. Ne
postoji selektor koji bi mogao izdvojiti zraenje samo jedne valne duljine. Izdvajaju se
skupina susjednih valnih duljina, koja se zove vrpca. Osnovni tipovi selektora su
monokromatori i filtri. Spremnici za uzorke zovu se elije ili kivete. Moraju imati prozore
1

koji su prozirni u odreenom spektralnom podruju. Upotreba kvarca je za ultraljubiasto

podruje (ispod 350 nm), silikatna stakla za podruje izmeu 350 2000 nm a za vidljivo
podruje se koriste plastine posude. Materijal za infracrveni dio spektra je kristalini NaCl.
Detektor je ureaj koji pokazuje postojanje neke fizike pojave. Imamo jo i detektor koji
pretvara razliite tipove kemijskih i fizikih veliina u elektrine signale. Oni se na kraju
pretvaraju u broj koji oznauje veliinu poetnog signala. Imamo nekoliko tipova
spektroskopskih instrumenata [14]:
-

spektroskop,

kolorimetar,

fotometar,

spektrograf,

spektrometar s fotopretvornikom (spektrofotometar).

Spektofotometar je ureaj za identifikaciju elemenata u uzorku koji je ekscitiran u

plamenu ili nekoj drugoj vruoj sredini. Sadri modificirani monokromator u kojemu je je
arina ravnina s izlaznom pukotinom zamijenjena pokretnom leom koja omoguuje
vizualnu detekciju emisijskih linija.
Kolorimetar je instrument za apsorpcijska mjerenja koji koristi ljudsko oko kao
detektor. Za svako koritenje instrumenta potrebni su standardi za usporeivanje.
Fotometar je instrument koji se moe primijeniti za apsorpcijska, emisijska ili
fluorescencijska mjerenja s ultraljubiastim, vidljivim ili infracrvenim zraenjem.
Spektrograf je instrument koji snima spektre na fotografsku plou ili na film smjeten
uzdu arine ravnine monokromatora. Spektri se tada pojavljuju kao niz crnih slika ulazne
pukotine.
Spektrometar je monokromator s pukotinom uvrenom u arinoj ravnini.
Spektrofotometar je spektrometar s fotopretvornikom. Koristi se za apsorpcijska,
emisijska i fluorescencijska mjerenja [3].
Imamo etiri osnovna spektroskopska instrumenta:
-

jednosnopni,

dvosnopni prostorno odijeljenih snopova,

dvosnopni vremenski odijeljenih snopova, i

viekanalni instrumenti.

Slijedea slika prikazuje prva tri instrumenta.

Slika 2.6. Prikaz fotometra i spektrofotometra: (a) jednosnopni instrument;

(b) dvosnopni instrument s prostorno razdvojenim snopovima;
(c) dvosnopni instrument s vremenski razdvojenim snopovima
Transmitancija otopine je dio upadnog zraenja proputenog uzorkom. Ona obuhvaa
tri osnovna koraka:
-

namjetanje (ugaanje) 0% T

namjetanje (ugaanje) 100% T

odreivanje (ugaanje) % T uzorka.

3

Ugaanje 0% T izvodi se pomou zaslona postavljenoga izmeu izvora i

fotodektetora. Ugaanje mjerila se vri mehaniki ili elektriki, dok se ne postigne vrijednost
0. Kad ugaanju 100% T stavljamo otapalo na put svjetlosti, otvaramo zaslon i mjenjamo
intezitet zraenja ili pojaavamo elektrini signal dok ne postigne vrijednost 100. Kod treeg
koraka posudicu s otapalom zamjenjujemo s onom koja sadri uzorak, a postotna
transmitancija se oita s ljestvice [14]. Jednosnoponi instrument zahtjeva stabilno napajanje
da bi se izbjegle pogreke nastale promjenama inteziteta snopa za vrijeme ugaanja 100% T i
mjerenja % T uzorka. Kod dvosnopnih instrumenata jedan snop zraenja prolazi kroz
referentnu otopinu prema fotodetektoru, a drugi snop istodobno prolazi kroz uzorak prema
drugom, sparenom fotodetektoru. Izlazni signali se pojaavaju, a njihov omjer ili logaritam
njihovih omjera odreuje se elektroniki i pokazuje na ureaju za oitavanje [2].
Optiki sustav tipinog spektrofotometra s dva snopa zraenja podijeljena u vremenu
je prikazan na slici 2.7.

Slika 2.7. Dvosnopni spektrofotometar s pisaem, za ultraljubiasto

i vidljivo podruje, serija Perkim-Elmer

Instrument se sastoji od deuterijskog ili volframovog izvora zraenja, koji se odabiru

prema potrebi, refleksijske reetke kao monokromatora te fotomultiplikatora kao detektora.
Okretanjem cirkularne ploice koja je podijeljena na 3 dijela, detektor dobiva tri signala, prvi
odgovora P0, drugi P, a trei tamnoj struji.
VJEBA
Sepktrofotometrijsko odreivanje nitrata
POTREBNE OTOPINE
- kiselina za nitrate
- otopina 2,6-dimetilfenola
- standardna otopina "A" (1000 mg N/I) - Stock otopina
- standardna otopina "B"
PRIPREMA OTOPINA
Kiselina za nitrate
Oprezno smijeati 500 mL koncentrirane H2SO4 i 500 mL koncentrirane ortofosforne kiseline
(H3PO4). Dodati 40 mg (0,04 g) amidosulfonske kiseline (NH4SO3H), otopiti i promijeati.
Otopina 2,6-dimetilfenola
Otopiti 1,2 grama 2,6-dimetilfenola u 1000 mL octene kiseline (CH3COOH).
Standardna otopina "A" (1000 mg N/I) - Stock otopina
Otopiti 7,218 grama KNO3 (prethodno dva sata suenog na 1050C) u odmjernoj tikvici od
1000 mL. To je otopina "A". 1mL otopine "A" sadri 1mg N-NO3.
Standardna otopina "B"
50 mL otopine "A" razrijediti s destiliranom vodom u odmjernoj tikvici od 500 mL. To je
otopina "B". 1mL otopine "B" sadri 0,1 mg N-NO3.
Serija radnih standarda priprema se tako da se u odmjerne tikvice od 100 mL pipetira 0,5; 1,0;
2,0; 3,0; 5,0; i 10 mL standardne otopine "B", a to odgovara 5,0; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; i 10,0 mg/L
N-NO3. Ove su otopine stabilne cca tjedan dana.

POSTUPAK
U ae od 100 mL otpipetirati 35 mL kiseline za nitrate. Zatim redom u svaku au otpipetirati po 5 mL
standardne otopine ili uzorka. U svaku au dodati 5 mL otopine dimetilfenola. Dobro promijeati i ostaviti da
stoji 30 minuta. Paralelno se radi slijepa proba. Mjeri se absorbancija kod 324 nm. Iz dobivenog badarnog
pravca oitaju se koncentracije nepoznatih uzoraka.

ODREIVANJE O-FOSFATA UZ KOSITAR (II) KLORID

Osnovni standard: Izvae se 0,4394 g KH2PO4 (suenog jedan sat na 1050C) i otopi u
odmjernoj tikvici od 1000 mL. To je otopina "A".
1 mL otopine "A" odgovara 0.100 mg P.
y (KH2PO4) = 0.4394 mg/mL
M (KH2PO4) = 136.09 mg/mmol
n (H2PO4) = n (KH2PO4) = 0.4394/136.09 = 0.00323 mmol
Ar (P) = M (P) = 30.9738 mg/mmol
y (P) = 0.00323 mmol 30.9738 mg/mmol = 0.1 mg/mL
1 mL otopine "A" sadri 0.100 mg P-H2PO4
Radni standard: 50 ml otopine "A" razrijedi se u odmjernoj tikvici od 500 mL.
1mL ovako dobivenog standarda "B" odgovara 0.010 mg P.
Serija radnih standarda priprema se tako da se u odmjerne tikvice od 50 mL pipetira 1.0; 3.0;
5.0; 7.0; 8.0; i 10.0 mL standardne otopine "B" to odgovara 0.2; 0.6; 1.0; 1.4; 1.6 i 2.0 mg/L
P-H2PO4. Mjerenjem absorbancije navedenih standarda , dobiva se badarni pravac.
Kemikalije.
- amonijev molibdat (NH4)6Mo7O24 4H2O
- kositrov (II) klorid SnCl2 2H2O
Otopina amonijevog molibdata:Otopi se 25 g amonijevog molibdata u 175 mL destilirane
vode. Oprezno se doda 280 mL 96%-tne sumporne kiseline u 400 mL destilirane

vode.Otopina se ohladi na sobnu temperaturu, a zatim se doda otopina molibdata i nadopuni

do 1000 mL destiliranom vodom.
Otopina kositrovog (II) klorida: Otopi se 0.25 g SnCl2 2H2O u 10 mL razrijeene HCl
( 1mL 36%-tne HCl + 9 mL H2O) otopina se profiltrira.
Uvijek se koristi svjee pripravljena otopina.
Postupak: Pipetira se 50 mL uzorka. Doda 2 mL reagensa za fosfate, amonijevog molibdata i
pet kapi otopine kositrovog (II) klorida. Razvije se plava boja.
Oitavanj se provodi na spektrofotometru kod valne duljine 690 nm ( maksimum
absorbancije). Paralelno se radi slijepa proba s destiliranom vodom (sve osim uzorka) kao i
korekcija na mutnou uzorka tako da se u uzorak dodaju sve kemikalije osim otopine
kositrovog (II) klorida. Korekcija na mutnou se radi zbog u vodi prisutnih koloidnih estica
koje djeluju kao obojeni kompleks pri mjerenju absorbancije.
Uzorci i standardi se tretiraju na isti nain, a iz badarnog pravca oitavaju se koncentracije
fosfata u uzorcima.