Histoloka laboratorija prua mogunost izrade biljnih i

ivotinjskih

privremenih

trajnih

mikroskopskih

preparata primenom razliitih postupaka. Objekti mogu

biti obojeni klasinim bojama, koje se tradicionalno
primenjuju

svetlosnoj

mikroskopiji,

kao

fluorescentnim bojama, ime je mogue identifikovati

odreene grupe organskih jedinjenja kao i njihovu
lokalizaciju u pojedinim elijama i tkivima.

Histoloka

laboratorija

je

opremljena

aparatima:
-Tkivni procesor
-Parafinski dispanzer sa toplom ploom
-Centar za bojenje
-Hladna ploa

sa

sledeim

-Mikrotom
-Vodeno kupatilo
-Vibracioni mikrotom
-Analitika vaga

MIKROTOM
ANALITICKA VAGA

VODENO KUPATILO
Izrada

histolokih

preparata:
Promatranje

tkiva

mikroskopom

pod

zahtjeva

posebnu pripremu
Vitalno bojanje (vitalne boje) omoguavaju bojanje
ivih stanica i praenje nekih fiziolokihfunkcija:

litium

karmin

tripansko

plavo

prouavanje

fagocitoze
- Janus green B i neutralno crvenilo (neutral red)
boji mitohondrije i lizosome
Zbog debljine i neprozirnosti tkiva se ne mogu gledati
mikroskopom bez prethodne pripreme, u histologiji
postoji niz tehnika za izradu preparata:
1 PARAFINSKA TEHNIKA :
- najrairenija rutinska tehnika (primijenjena za izradu
preparata za vjebe iz histologije) kojase temelji na
uklapanju tkiva (organa) u parafinske blokove- kasnije
omoguuje primjenu velikog broja specifinih histolokih
boja (npr. Van Giesonbojanje za kolagena vlakna,
Feulgenova reakcija za nukleinske kiseline, Sudan Black
B

zalipide,

Periodic

Acid

Schiff

bojanje

za

ugljikohidrate...)
1.uzorkovanje organa ili tkiva (usmrena ivotinja ili
biopsija

ivog

organizma),

trebaobaviti

brzo

izbjegavajui mehanika oteenja tkiva, uzima se

uzorak priblineveliine 0,5 cm (vano zbog uspjene
fiksacije i dehidracije tkiva)
Histoloki uzorak za svjetlosnu mikroskopiju 1
predmetno staklo, 2 - pokrovno stakalce , 3 -

obojeni

isjeak

tkiva

izmeu

2. fiksiranje izbor fiksativa ovisi o vrsti tkiva i daljnjem

postupku bojenja, neka tkiva ineke histoloke boje
zahtijevaju odreene fiksative (u upotrebi su mnogi
jednostavnispojevi

ili

mjeavine

fiksativa),

uloge

fiksativa su : sprijeiti autolizu stanica, tkivu datitvrdou

kako bi se olakalo rezanje
i

bojanje,

oteenje

smanjiti

tkiva

tijekom

daljnjihpostupaka,
stabilizirati

meusobni

odnos staninih struktura

kako bi to vie sliileuvjetima u ivoj stanici ( in vivo
),

zatiti

histologa

od

mogue

infekcijemikroorganizmima iz tkiva
- fiksativi mogu djelovati na stanine strukture na dva
naina:
a)denaturacijom bjelanevina (npr. pikrinska kiselina)
b)bez denaturacije bjelanevina (npr. formalin, aceton i
etanol)
- od jednostavnih fiksativa najee je u upotrebi
otopina neutralnog formalina - 10dijelova komercijalnog
formalina (36%-tna otopina formaldehida) se pomijea s

90dijelova neutralnog fosfatnog pufera (PBS), fiksacija

najee traje 24 sata na sobnojtemperaturi, koristi se i
4%-tna ili 10%-tna vodena otopina formalina

sloeni

fiksativi

predstavljaju smjesu
razliitih
tvari,

kemijskih

najee
seupotrebljava
Bouenov

fiksativ

(pikrinska kiselina + formalin + octena kiselina +

voda),fiksacija traje 24 sata na sobnoj temperaturi
BOUENOV FIKSATIV

3 . ispiranje u tekuoj vodi

4
kako

dehidriranje (i prosvjetljivanje)
oko 70% ivih stanica ini voda

potrebno je ukloniti je kako bi se tkivo uklopilo u

bezvodni medij kao to je parafin
-voda

se

iz

fiksiranog

uranjanjem

(dehidracija),

uzorka

rastue

najee

se

uklanja

postupnim

koncentracijealkohola
upotrebljava

etanol

(ili

propanol) u koncentraciji od70%, a zatim slijedi 80%-tni,

96%-tni

na

kraju

100%-tni

alkohol

(tzv.

apsolutnialkohol)
- poeljno je da u svakom od alkohola tkivo stoji 24 sata
kako bi se sva voda postupnozamijenila 100%-tnim
alkoholom, postupna dehidracija smanjuje oteenje
tkiva
- etanol se na mijea s parafinom pa se nakon
dehidracije tkivo stavlja u otapalo zaparafin, najee
kloroform, tijekom 24 sata; to je tzv. prosvjetljivanje
5. uklapanje nakon prosvjetljivanja tkivo se prebacuje
u smjesu kloroforma i parafina(1:1) na pola sata, a
potom u rastue koncentracije parafina (tri puta po
jedan sat) tose provodi na temperaturi 50-60 C u
termostatu

(ili

parafinskoj

utekuem

stanju

(kloroform

zamjenjuje parafinom),

pei)
u

kada

tkivu

se

je

parafin

postupno

- parafin je smjesa zasienih ugljikovodika, a topi se u

benzolu, kloroformu i ksilolu
- uklop u 100%-tni parafin - parafin u fiksiranom tkivu
zauzme mjesto koje je nakondehidriranja imao apsolutni
alkohol,

naglim

ohlaivanjem

parafin

se

skrutne

uunutranjosti fiksiranog tkiva i oko njega toliko da se

moe rezati na vrlo tanke rezove6.
6 . rezanje parafinskih blokova blokovi se fiksiraju na
podloge

(drvene

ploice

ilimetalne

podloge

tzv.

patrone) i mikrotomom reu na tanke rezove debljine 510 m(najee 6-8 m)

- mikrotomi mogu biti klizni ili rotacijski (rotacijski
daju tanje rezove)

7. peglanje rezova izrezani isjeak je izguvan i ostaje

na nou, uzima se kistom istavlja u toplu vodenu kupelj
na tzv. peglanje, temperatura vode omeka parafin
pase rezovi izravnaju i potom se s povrine skupe

predmetnim

stakalcem

premazanimadhezivnim

sredstvom (npr. glicerin bjelanjak)

- stakalca s rezovima se osue u termostatu8.
8 . deparafiniranje i rehidriranje tkiva kako se najee
koriste vodene otopine boja(rjee alkoholne) tkivo je
potrebno deparafinirati i vratiti vodu u tkiva
- rezovi se stavljaju u ksilol (deparafinacija), potom u
padajui niz alkohola (obrnuto oddehidracije od
apsolutnog alkohola do 70%-tnog alkohola) i na
kraju u destiliranuvodu9.
9 . bojanje tkiva obavlja se mjeavinom boja , a svrha
je isticanje pojedinih staninihstruktura i opa bolja
vidljivost pod mikroskopom, izbor boja ovisi o tome to
elimovidjeti pojedinane boje ili njihove kombinacije
(nema kombinacije boja kojom bi se u jednom postupku
moglo vidjeti ba sve)
-

bojanje se obavlja mjeavinom boja koje selektivno

prikazuju sastojke tkiva, dijelimoih na kisele boje
koje boje bazine komponente u stanici (npr.
bjelanevine ucitoplazmi), to su boje eozin, kiseli
fuksin, orange G i na bazine boje koje bojekisele
komponente u stanici (npr. jezgra zbog prisustva

nukleinskih kiselina iglikozaminoglikani), to su boje

hemalaun i toluidin
- histoloke boje se stoga vladaju poput kiselih ili
bazinih

sastojaka

elektrostatskih

koji

vezova

imaju
s

afinitetza

ioniziranim

stvaranje

radikalima

tkivima
- najee primjenjivana rutinska metoda bojanja u
histologiji je hemalaun-eozinbojanje ; hemalaun boji
plavo-ljubiasto kisele (bazofilne) strukture u stanici
(kromatin jezgre i organele koje sadre RNA); eozin boji
crveno-ruiasto bazine (acidofilne)strukture u stanici
(citoplazmu i proteine npr. kolagen)
-bojanje u hemalaunu traje 3-5 minuta, potom se rezovi
ispiru jednu minutu udestiliranoj i 5-10 minuta u
vodovodnoj vodi, slijedi bojanje eozinom 3-5 minuta i
ponovno dehidriranje (provoenje rezova kroz alkohole
rastuih

koncentracija,

od70%-tnog

do

apsolutnog

alkohola) kako bi se iz rezova uklonila voda.

- kako bi se rezovi uinili prozirnim uranjaju se u ksilol,
a potom se uklapaju ukanadski balzam i prekrivaju
pokrovnim stakalcem
- rezovi se sue 24 sata i takav trajni preparat moe se
promatrati pod mikroskopom

2 SMRZAVANJE I REZANJE NA KRIOSTATU

- postupak je brz jer nema fiksacije niti ostalih hemijskih
postupaka, istovremena fiksacija idehidracija se postie
smrzavanjem na -170 C, pri tom su promjene na tkivu
minimalne- tehnika je pogodna kako za klasina bojanja
tako i za histokemijske i imunohistokemijsketehnike
bojanja- nedostatak metode su oteenja koja mogu
nastati kristalima leda.

SEMINARSKI RAD

PREDMET: PRAKSA
TEMA: HISTOLOKA LABORATORIJA I PRAVILNO
UZIMANJE MATERIJALA

RADILI:
ALEKSANDAR ZAGANOVI
MIRZA MUJKANOVI