In vitro kultura viših biljaka

Tehnike kulture biljnih ćelija,

tkiva i organa in vitro
 DEFINICIJA

Kultura biljnih ćelija, tkiva i organa in vitro

predstavlja skup tehnika gajenja biljaka (celih
biljaka, semena, embriona) i biljnih delova (ćelija,
protoplasta, eksplantata, tkiva, organa) u
kontrolisanim, sterilnim uslovima i na
definisanim hranljivim podlogama.

Zasniva se na sposobnosti ćelija da se razvijaju van

organizma (in vitro, što znači “u staklu”, mada sudovi
za gajenje ne moraju biti od stakla). Osnova ove
sposobnosti biljaka je totipotencija skoro svih biljnih
ćelija u organizmu i na njoj zasnovana sposobnost
biljaka da se regenerišu, tj. vegeativno razmnožavaju.
 STRATEGIJE OPSTANKA BILJAKA

1. “OTVORENO” RASTENJE - meristemi; definicija termina

“rastenje” (“growth”); povećanje dimenzija ćelija i broja
ćelija.

2. PRISUSTVO ĆELIJSKOG ZIDA - omogućava odbranu od

biljojeda i rastenje u potrazi za vodom, mineralnim
materijama, svetlošću...

3. VEOMA PLASTIČNO RAZVIĆE - definicija termina

“diferencijacija”; uticaj spoljašnjih faktora na razviće
biljaka; primer: heterofilija.

4. “OTVORENA” DIFERENCIJACIJA - definicija termina

“dediferencijacija” i “rediferencijacija”; regeneracija organa;
morfogeneza.
DEFINICIJE
 RASTENJE – ireverzibilno povećanje mase, a kako
je masa povezana sa zapreminom, i ireverzibilno
povećanje veličine ćelija i njihovog broja. Deobe
ćelija, na osnovu kojih se povećava broj ćelija, nisu
dovoljne da dovedu do rastenja.
 DIFERENCIJACIJA – postizanje kvalitativnih
razlika među ćelijama poreklom od iste ćelije ili
grupe ćelija, odnosno specijalizacija za obavljenje
različitih funkcija.
 MORFOGENEZA – sticanje forme, oblika biljke ili
organa. Kod biljaka obavlja se na osnovu ravni
ćelijskih deoba i pravca rastenja ćelija, jer su
biljne ćelije fiksirane ćelijskim zidovima i
nepokretne, za razliku od životinjskih.
 ISTORIJAT

Osnove kulture biljnih ćelija i tkiva postavili su Šlajden (Matthias

Jakob Schleiden) i Švan (Theodor Schwann) 1838. godine
postavivši tzv. “teoriju totipotencije” (sastavni deo njihove ćelijske
teorije), koja kaže da su ćelije svih živih organizama autonomne i,
u osnovi, sposobne da regenerišu čitav organizam.

Rodonačelnikom ove oblasti ipak se smatra austrijski botaničar

Gotlib Haberland (Gottlieb Haberlandt). 1902. godine Gotlib
Haberland, koji se bavio fiziološkom anatomijom biljaka, koncipirao
je ideju o kulturi ćelija. Oslanjajući se na teoriju totipotencije,
pretpostavio je da bi se mnogi korelativni odnosi kod biljaka,
odnosno faktori koji uslovljavaju razvoj, rastenje, diferencijaciju i
interakcije delova biljnog organizma, mogli razjasniti gajenjem
izolovanih biljnih delova. Posmatranje ćelija in situ je otežano jer
je ćelija deo tkiva i njeno razviće i diferenciranje je pod uticajem
okolnog tkiva. Haberland predviđa da bi mogli da se prouče faktori
razvića kad bi se ćelije izolovale iz organizma, tj. gajile na
određenoj podlozi. Tada bi se one razvijale i diferencirale u svim
mogućim pravcima.
 ISTORIJAT
Haberland je prvi pokušao da izoluje ćelije iz
biljke i odgaji ih u uslovima in vitro, van
organizma. Nije u tome uspeo. Ćelije su
preživljavale neko vreme, ali se nisu delile.
Haberland nije uspeo zato što je:
- izolovao prilično diferencirane ćelije koje je
mogao lako da izoluje, ali koje su izgubile moć
dediferencijacije (palisadne ćelije lista, filamenti
prašnika, korenske dlake, ćelije zatvaračice
stoma). Te ćelije su visoko diferencirane i ne dele
se ni u biljci, odnosno zahtevaju stimulatore
rastenja da bi se dediferencirale i delile.
- pravio je podloge za gajenje ćelija prema
tadašnjim znanjima o potrebama ćelije za
mineralnim solima. Dodavao je mineralnim
rastvorima neke organske materije, ali nije znao
ništa o vitaminima i fitohormonima.
Ovo je retka oblast nauke gde je prvo formulisana ideja, koncepcija i mogući rezultati, pa su
tek kasnije eksperimentalni rezultati to potvrdili. Obično je obrnuto. Ovo je paradoks. Drugi
paradoks je to što Haberland nije uspeo, a to ipak nije obezvredilo njegovu koncepciju.
Nekoliko godina kasnije Currel, Burrows i Harrison su uspeli da odgaje životinjske i ljudske
ćelije u kulturi (1907. – kultura fibroblasta). Fibroblastima su dodavali ekstrakt embriona
kokoške, što je moćna kompletna sredina, pa su dobili permanentne kulture fibroblasta.
Botaničari su pošli od toga da biljkama ne treba ništa kompleksno, pa nisu uspeli da dobiju
trajne kulture biljnih ćelija i tkiva.
 FAZE U RAZVOJU KULTURE BILJAKA IN VITRO

Za razliku od kulture animalnih ćelija, koja je doživela nagli razvoj 20-tih

i 30-tih godina XX veka, kultura biljnih ćelija je zaostajala u razvoju
zbog kasnog otkrića biljnih hormona (auksini otkriveni 30-tih, a citokinini
50-tih godina XX veka). Međutim, kasnije se ona naglo razvila i našla
primenu u veoma bitnim oblastima primenjene biologije. Istorijski razvoj
kulture biljnih čelija i tkiva in vitro, može se podeliti u tri faze:
1. 1922. – 1954.: kultura in vitro vrhova korena (Robbins, Kotte, 1922),
prva trajna kultura korenova paradajza (White, 1934), trajne kulture
kalusa (Gautheret, Nobecourt, White, 1939), kultura zigotskih embriona
Datura sp. – prva upotreba kokosovog mleka kao izvora regulatora
rastenja (van Overbeck, 1941), in vitro kultura tumorskog tkiva “crown-
gall” (Braun, 1941), prva upotreba in vitro kulture duvana u istraživanju
formiranja adventivnih pupoljaka (Skoog, 1944), formiranje adventivnih
izdanaka i korenova u kulturi in vitro duvana, variranjem odnosa
auksin/adenin (Skoog i Tsui, 1948), regeneracija organa u kulturi kalusa
Sequoia sempervirens (Ball, 1950), dobijanje prvih bezvirusnih dalija iz
kulture meristema (Morel & Martin, 1952), prva regeneracija cele biljke
iz jedne ćelije, tj. dobijanje ćelijske suspenzije (Muir et al., 1954).
 FAZE U RAZVOJU KULTURE BILJAKA IN VITRO

2. 1955.- 1970.: otkriće citokinina kinetina (Miller et al., 1955), otkriće

regulacije organogeneze (izdanaka i korenova) menjenjem odnosa
citokinin/auksin (Skoog & Miller, 1957), regeneracija somatskih embriona in
vitro iz nucelusa Citrus sp. – somatska embriogeneza (Maheshwari &
Rangaswamy, 1958), regeneracija proembriona iz kalusa i suspenzije ćelija
Daucus carota (Reinert, Steward, 1958), enzimska degradacija ćelijskog
zida u cilju dobijanja velikog broja protoplasta – kultura protoplasta
(Cocking, 1960), razvijanje čuvene MS podloge za kultivaciju biljaka in
vitro (Murashige & Skoog, 1962), prve haploidne biljke Datura sp. dobijene
iz polenovih zrna – androgeneza (Guha & Maheshwari, 1964), indukcija
cvetanja u kulturi duvana in vitro (Aghion-Prat, 1965), selekcija
biohemijskih mutanata in vitro (Carlson, 1970), prvi put dobijena fuzija
protoplasta (Power et al., 1970).
 FAZE U RAZVOJU KULTURE BILJAKA IN VITRO

3. 1971. – 1990.: prve biljke regenerisane iz protoplasta (Takebe et al.,

1971), interspecijska hibridizacija dobijena fuzijom protoplasta dve vrste
duvana – somatska hibridizacija (Carlson et al., 1972), fuzija haploidnih
protoplasta i stvaranje hibrida (Melchers & Labib, 1974),
biotransformacija u kulturama biljnih tkiva – metabolička transformacija
jednog sekundarnog metabolita u drugi (Reinhard, 1974), otkriće Ti-
plazmida kao uzročnika indukcije tumora od strane bakterija iz roda
Agrobacterium (Zaenen et al., Larebeke et al., 1974), inicijacija izdanaka
iz krioprezervisanih apeksa stabla karanfila (Seibert, 1976), otkriće da
sintezu i razgradnju oktopina i nopalina genetički kontroliše Ti-plazmid
bakterije Agrobacterium tmefaciens (Bomhoff et al., 1976), uspešna
integracija Ti-plazmidne DNK iz Agrobacterium tumefaciens u biljke -
genetička transformacija biljaka (Chilton et al., 1977), uvođenje termina
“somaklonalno variranje” (Larkin & Scowcroft, 1981), fuzija protoplasta
pomoću električnog stimulusa (Zimmermann, 1982), intergenerička
citoplazmatička hibridizacija – dobijanje cibrida rotkve i repe (Pelletier et
al., 1983), transformacija biljne ćelije plazmidnom DNK (Paszkowski et
al., 1984), infekcija i transformacija lisnih diskova bakterijom A.
tumefaciens i regeneracija transformisanih biljaka (Horsch et al., 1985).
 PRIMENA

Od 1990. god. pa do danas, razvoj kulture biljaka in vitro usmeren je

uglavnom na primenu:
1. u naučnim istraživanjima (u eksperimentalne svrhe) – omogućava dobijanje
genetički uniformnog i fiziološki homogenog biljnog materijala u velikim
količinama i gajenje u kontrolisanim uslovima (što je jedan od bitnih zahteva
eksperimenta), a uz minimalno ulaganje prostora i novca.
2. u poljoprivredi, hortikulturi i šumarstvu – omogućava masovnu proizvodnju
sadnog materijala, rezanog cveća i elitnih primeraka drveća, kao i očuvanje
genofonda (prezervaciju različitih genotipova, sorti, hibrida, vrsta).
3. u zaštiti sredine – omogućava očuvanje, razmnožavanje i reintrodukciju u
prirodna staništa endemičnih, ugroženih i retkih vrsta biljaka.
4. u biotehnologiji:

• “Green biotechnology” (ili biotehnologija biljaka) – primena biotehnologije u

poljoprivredi (proizvodnja hrane, selekcija i domestikacija biljaka putem
mikropropagacije, transgene biljke otporne na stresne faktore sredine, biljke
koje same produkuju pesticide)
• Korišćenje biljnih kultura za proizvodnju biorazgradive plastike, biodizela i
sličnih proizvoda
• Eksploatacija sekundarnog metabolizma biljaka (za potrebe farmacije i
medicine; bioreaktori)
• Reciklaža otpada, čišćenje zagađenih sredina – bioremedijacija i
biodegradacija)
• Dobijanje i upotreba genetički modifikovanih organizama (GMOs), tj.
upotreba tehnika kulture biljnih ćelija i tkiva in vitro u procedurama
dobijanja transgenih biljaka
 Uvođenje biljaka u kulturu in vitro
Deo koji se izoluje iz biljke i uvodi u kulturu naziva se “primarni eksplantat”. Primarni
eksplantati mogu biti pojedinačne ćelije, isečci iz tkiva ili celi organi. Oni ne moraju sadržati
meristemsko tkivo već mogu imati diferencirane ćelije ukoliko se nađe način da se ćelije
dediferenciraju, tj. vrate u stanje u kojem mogu da se dele. Parenhimske ćelije mogu da se vrate
u meristemsko stanje, ali pritom izgube inkluzije, skrobna zrna, vakuole itd. Znači, mogu se dobiti
trajne kulture iz potpuno diferenciranih ćelija ako ćelije imaju sposobnost dediferencijacije.
Dediferencijacija se može izazvati dodavanjem auksina i citokinina zajedno.
Terminom “eksplantat” označava se deo biljke koji se, u uslovima in vitro, prenosi na svežu
podlogu radi daljeg razmnožavanja ili održavanja kulture ili dobijanja novih struktura.
Jedna od osnovnih premisa kultivisanja biljaka u uslovima in vitro jeste sterilnost
(akseničnost). To znači da moraju biti sterilni:
• Biljni materijal (primarni eksplantati i
eksplantati)
• Hranljive podloge
• Prostor u kojem se obavljaju manipulacije
(laminar)
• Instrumenti, posuđe i voda sa kojima se radi
Akseničnost (sterilnost) kultura zanači oslobođenost ne samo od mikroorganizama, već od svih
živih organizama osim biljaka. Zagađivači biljnih kultura in vitro su: virusi, bakterije (obično ne
biljni patogeni), kvasci, gljivice, crvi i grinje. Grinje nisu same po sebi opasne po biljke (ne hrane
se njima), već unose mikroorganizme u kulture. Postoji niz procedura za uspostavljanje i održanje
akseničnosti, kao i za “lečenje” zagađenih kultura. Biljni materijal se steriliše hemijski, spolja,
jer se pretpostavlja da je zdrava biljka sterilna iznutra.
 TIPOVI KULTURA BILJAKA IN VITRO

Posle uvođenja eksplantata u kulturu in vitro razlikuju se dva tipa daljeg

rastenja i razvića tih eksplantata:
• organizovani (javlja se kada seu kulturu uvedu organizovani delovi biljke – napr.
vršni meristemi izdanaka i korena, lisni pupoljci, mladi cvetni pupoljci, mladi plodovi
– i oni nastave da se razvijaju očuvavši pritom početnu strukturu ILI kada se te
iste strukture formiraju iznova, de novo; ORGANOGENEZA ili MORFOGENEZA=
proces formiranja organa de novo)
KALUS = masa neorganizovanih ćelija koje
se stalno dele. Kalusi nisu baš nediferencirana već
neorganizovana tkiva. Sve ćelije kalusa nisu jednake
međusobno. Zadržavaju se meristemski centri u njemu i na
njihov račun kalus raste. Okolne ćelije se vakuoliziraju i
prestaju da se dele (liče na parenhimske ćelije). Ponekad se
ćelije kalusa diferenciraju u nešto što liči na provodne
elemente (lignifikovane su) iako nisu organizovane u snopiće.
Pojava takvih ćelija najavljuje uginuće tkiva. Znači, ćelije
kalusa se diferenciraju.
• neorganizovani (javlja se kad se u kulturi dobije tkivo koje, bez obzira na to šta
je bio primarni eksplantat, ne sadrži nijednu prepoznatljivu strukturu iz biljnog
organizma i ima samo ograničen broj diferenciranih, specijalizovanih ćelija koje
prepoznajemo; tkivo se može gajiti kao trajna kultura, tj. neograničeno dugo; čest
je u kulturi, ali se retko sreće u prirodi)
 TIPOVI KULTURA BILJAKA IN VITRO
Kulture koje karakteriše
organizovano rastenje:
• kulture celih, intaktnih biljaka
(sejanci; dobijaju se isklijavanjem
sterilisanih semena in vitro)
• kulture izolovanih embriona
(zigotskih ili somatskih, zrelih ili
nezrelih)
• kulture organa (korenova,
antera)
• kultura pojedinačnih nodusa
(“single node stem cuttings”)
• kultura meristema (izolovanih iz
vršnih ili bočnih pupoljaka)
• kultura vegetativnog apeksa
izdanaka
Kulture koje karakteriše
neorganizovano rastenje:
• kultura biljnog tkiva (sensu stricto
kultura kalusa)
• kultura ćelija u suspenziji (nastaje
razbijanjem kalusa; sastoji se od
pojedinačnih ćelija i malih ćelijskih
agregata koji rastu na tečnoj
podlozi)
• kultura pojedinačnih ćelija (kultura
polenovih zrna, tj. mikrospora)
• kultura protoplasta
Kulture in vitro mogu da sadrže
biljni materijal koji karakterišu i
neorganizovano i organizovano
rastenje (napr. kalusi na kojima se
stalno regenerišu izdanci i/ili
korenovi).
Hranljive podloge (medijumi)
Sastav hranjivih podloga varira u zavisnosti od
biljne vrste, biljnog materijala i cilja koji želimo
da postignemo (održavanje kulture, multiplikacija
ili indukcija novih struktura), ali postoje osnovni
zahtevi za pripremu hranljivih podloga. Podloga
mora da sadrži sledeće sastojke:
1. Vodu. Mora biti prečišćena jer obična
destilovana voda može da sadrži otrovne sastojke
(metale i dr.). Upotrebljava se voda destilovana
u staklu (bidestilovana voda) ili dejonizovana
voda.
2. Izvor mineralnih soli - ima više rastvora,
svaki se koristi za drugu svrhu. Najšire se
koristi MS rastvor (Murashige and Skoog, 1962).
MS sadrži makro i mikro elemente. Murašige i
Skug su ispitali na duvanu veliki broj kombinacija
raznih soli. Dobili su optimalne koncentracije za
svaku so i kombinovali dalje. Na kraju su došli do
odgovarajuće kombinacije katjona i anjona. MS
je komponovan prema zahtevima za gajenje tkiva
duvana, ali je optimalan za niz drugih vrsta.
Drugi rastvori se razlikuju po ukupnoj količini
drugih soli. Naročito je osetljiv odnos
amonijumovog i nitratnog jona. Mogu da variraju i
drugi elementi. U nekim slučajevima u toku
raznih faza kultivacije treba menjati mineralni
rastvor.
3. Izvor uglienika (izvor energije). Većina
kultura su heterotrofne in vitro. Najćešće se
dodaje 3 - 5% glukoza ili 2 - 4% saharoza.
 Hranljive podloge (medijumi)
4. Vitamine. Uvek se dodaju B1, B6 i nikotinska kiselina. Ponekad se dodaju biotin, pantotenska
kiselina, folna kiselina - prema potrebi. Teško je dokazati da li je neki vitamin neophodan
(ispituje se izostavljanjem tog vitamina). Obično biljke rastu bez tog vitamina, ali sporo
(potrebno je da prođe nekoliko subkultura da bi se pokazalo da tkivo propada bez tog vitamina).
Znači, tkiva proizvode male količine vitamina, ali su im potrebne veće količine.
5. Organska azotna jedinjenja. Nisu obavezna ali se često dodaju. Dodaje se hidrolizat kazeina
(dobijen iz mleka enzimskom hidrolizom) ili pojedine aminokiseline. Biljna tkiva bi mogla da rastu i
bez ovih organskih jedinjenja.
6. Organske dodatke. Najčešće se dodaje kokosovo mleko. Ono je kompleksnog sastava i može
da zameni zahteve za citokininima. Neki njegovi sastojci nisu poznati. lnozitol je sastojak
kokosovog mleka (posebno se dodaje onda kad kokosovo mleko nije u sastavu podloge; prekursor
je za sintezu vitamina C). Često se dodaje i adenin (prekursor citokinina). Ekstrakt kvasca je
izbalansirana sredina i često se dodaje. Aktivni ugalj, zeoliti i polivinil pirolidon se dodaju u one
podloge u koje tkivo prilikom rastenja izbacuje neke štetne produkte (uglavnom fenole koji mogu
inhibirati rastenje), kako bi se oni adsorpcijom uklonili.
8. Hormone. Svaki biljni deo i vrsta mogu imati specifiične zahteve. Za započinjanje kultura
citokinini i auksini su neophodni. Ostali hormoni se dodaju prema potrebi ali oni nisu neophodni za
održavanje trajnih kultura.
Svi prethodni sastojci se utope u agar koji učvršćuje podlogu i omogućava potporu za tkivo
(podloga se onda naziva čvrstom podlogom). Agar NIJE u potpunosti inertna podloga. Ako se ne
doda agar, stavlja se u tečnu podlogu neki drugi držač za tkivo – mostić od filterpapira, držač
od zubarske žice, ili komercijalni plastični držači. U tečnu podlogu se ne mora staviti potpora za
tkivo, ali onda je tkivo uronjeno sasvim u podlogu pa se mora obezbediti dobra aeracija (kulture
se drže na rotacionim mešalicama).
Podloge se sterilišu u autoklavu na 120° C, 20 minuta (u našoj laboratoriji na 114° C, 25
minuta).
 Pribor za filter-sterilizaciju rastvora supstanci koje su
termolabilne i ne dodaju se u podloge pre sterilizacije
autoklaviranjem (antibiotici, giberelini, zeatin...)
 Rad u sterilnim uslovima
Manipulisanje biljnim materijalom u kulturi in vitro
obavlja se u sterilnim uslovima, u laminaru.

LAMINAR = aparat za aseptičnu filtraciju vazduha

koji se sastoji iz snažnog motora i apsolutnog filtera. U
radni prostor laminara uduvava se sterilni vazduh, a
manipulacije se obavljaju u struji sterilnog vazduha.
Izvor svetlosti za rad u radnom prostoru su 1-2
fluorescentne sijalice.

Radni prostor laminara dezinfikuje se 96% etanolom. Instrumenti za rad u

sterilnim uslovima se sterilišu kuvanjem u vodi (najmanje 20 min.), a zatim
uranjanjem u teglu sa 96% etanolom i spaljivanjem alkohola na plamenu
špiritusne lampe ili Bunzenovog plamenika neposredno pred korišćenje ILI
suvom sterilizacijom (120° C, 20 minuta). Neke bakterije mogu da prežive
u alkoholu pa treba redovno menjati alkohol i dobro opaljivati instrumente.
Komercijalna proizvodnja (mikropropagacija) biljaka tehnikama kulture
biljaka in vitro može biti i automatizovana i robotizovana.
 Uslovi gajenja in vitro kultura

Kulture biljka in vitro gaje se određeni vremenski period (3

do 5 nedelja, zavisno od kulture), koji se naziva subkultura
(ili žar. “pasaž”), u klimatizovanoj prostoriji za gajenje
(soba za gajenje kultura) ili kontrolisanoj komori (fitotron).
Fizički uslovi koji se kontrolišu u ovim prostorima za gajenje
su:
 SVETLOST (dužina dana, kvalitet svetlosti – zavisi od
izbora izvora svetlosti - i gustina svetlosnog fluksa,
odnosno intenzitet svetlosti)
 TEMPERATURA (obično se održava konstantnom
temperatura od 24 do 26° C, ali ponekad specifični procesi
i kulture zahtevaju niže temperature; bitno je da je
temperatura kontrolisana)
 VLAŽNOST VAZDUHA (u sudovima sa biljnim kulturama
relativna vlažnost je skoro 100%; visoka vlažnost u komori
može da podstakne infekcije)
 PROVETRAVANJE, odnosno RAZMENA GASOVA (dobra
aeracija bitna je za gajenje kultura u tečnim medijumima
jer kiseonik utiče na disanje, a ovo na rastenje; visoke
koncentracije CO2 obezbeđuju se unutar sudova onda kada
želimo da kulturu prevedemo iz heterotrofnog u
fotoautotrofno stanje; dobro provetravanje sudova i
prostorije sprečava neželjene efekte etilena na biljke u
kulturi)
Šta sve utiče na rastenje i razvoj
kultura in vitro?

Sastav hranljivih podloga

Fizički uslovi gajenja
Biljni materijal
 Fizički uslovi gajenja
Na razvoj kultura in vitro utiču:
1. Svetlost
• fotoperiod
• fluks fotona
• spektralna svojstva
2. Temperatura
• smena dnevne i noćna temperature
3. Vlažnost vazduha
4. Dostupnost vode
5. Aeracija podloga i sudova sa kulturama (dostupnost kiseonika)
6. „Provetravanje“ (nakupljanje etilena u sudovima sa kulturama)
7. Parcijalni pritisak CO2 u sudovima sa kulturama (heterotrofne,
miksotrofne i autotrofne kulture)
 Biljni materijal
Uspešnost kulture zavisi od:
1. Osobina biljke-davaoca primarnih eksplantata (regenerativni
kapacitet; juvenilna faza razvića)
• genotip (vrste, sorti, varijeteta i pojedinih biljaka)
• starost biljke i starost biljnih tkiva i organa
• fiziološko i zdravstveno stanje
2. Uslova u kojima je biljka-davalac rasla
• sezonski, klimatski i vremenski uticaji
• uslovi rastenja (staklara, intenzitet svetlosti)
• položaj eksplantata u biljci (fiziološka starost eksplantata)
3. Postupaka pre uvođenja primarnih eksplantata u kulturu in vitro
• povređivanje
• veličina eksplantata (količina rezervnih materija i gustina
eksplantata)
• način inokulacije (polarni, apolarni i horizontalni položaj
eksplantata; tkiva-hranioci; kondicionirana hranljiva podloga)
Kultura kalusa
Organogeneza de novo pod uticajem citokinina
i auksina
Mikropropagacija biljaka
Vegetativna propagacija biljaka metodom pojedinačnih
nodusa
 Vegetativna propagacija biljaka metodom
regeneracije adventivnih korenova/izdanaka
Dobijanje bezvirusnih biljaka tehnikom
kulture meristema
Ćelijska suspenzija i kultura protoplasta
Somatska hibridizacija
Somaklonalno variranje
 Somatski embrioni spanaća

od kasnog stadijuma srca do isklijalog somatskog embriona sa pravilno

formiranim kotiledonima i korenom

Milojević et al., Scientia Horticulturae (2011) 130:681-690

 Androgeneza u kulturi antera
Aesculus carnea

Embrion na kotiledonarnom
stupnju razvića

Embrioni na različitim
stupnjevima razvića
(globularni, torpedo,
kotiledonarni) regenerišu se
iz antere
Upotreba tehnika kulture biljnih ćelija i tkiva in vitro u
procedurama dobijanja transgenih biljaka
 Upotreba tehnika kulture biljnih ćelija i tkiva in vitro u
procedurama dobijanja transgenih biljaka

A = transformacija pomoću Agrobacterium-a; B = biolistička

transformacija; D = direktan unos DNK; E = elektroporacija
 Preporučena literatura

Pierik, R.L.M. (1997), In vitro Culture of Higher Plants,

Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London

Jelaska, S. (1994), Kultura biljnih stanica i tkiva, Školska

knjiga, Zagreb

Vinterhalter, D., Vinterhalter, B. (1996), Kultura in vitro i

mikropropagacija biljaka, Axial, Beograd

Нешковић, М., Коњевић, Р., Ћулафић, Љ. (2009),

Физиологија биљака, ННК-Интернационал, Београд