Praktikum iz Biologije 1

TIPOVI MIKROSKOPA
U sljedećem tekstu dan je kratki pregled različitih tipova mikroskopa koji se danas koriste:
a) Svjetlosni mikroskop (pogledajte Poglavlje 1!).
b) Infracrveni mikroskop (Slika D1.1) je optički instrument u kojem slika nastaje
skupljanjem toplinskog zračenja s površine promatranog objekta. Najmanja veličina
promatranih objekata najčešće odgovara onoj svjetlosnog mikroskopa.

Slika D1.1. Slika mikročipa dobivena infracrvenim

mikroskopom. Granica razlučivosti na slici je 5 µm.

c) Ultraljubičasti mikroskop (Slika D1.2) je optički instrument u kojem slika nastaje

skupljanjem ultraljubičastog zračenja s površine promatranog objekta. Najmanja
veličina promatranih objekata je oko 0,1 µm.

Slika D1.2. Slika stanica Candida utilis dobivena

ultraljubičastim mikroskopom.

d) Rentgenski mikroskop (Slika D1.3) je optičko-elektronički uređaj u kojem slika

nastaje skupljanjem X-zraka pomoću difrakcijskih diskova. Može se koristiti i za
objekte nepropusne za vidljivu svjetlost (pr. metalni dijelovi). Najmanja veličina
promatranih objekata mjeri se u nanometrima.

Slika D1.3. Slika strukture mikroprocesora dobivena rentgenskim

mikroskopom.

e) Elektronski mikroskop (Slika D1.4) je elektronički uređaj u kojem slika

promatranog objekta nastaje pomoću zraka elektrona koje se skupljaju
elektromagnetskim lećama. Najmanja veličina promatranih objekata mjeri se u
nanometrima.

Poglavlje 1 Dodatak 1
Praktikum iz Biologije 1

Slika D1.4. Slika bakteriofaga dobivena elektronskim

mikroskopom, dužina virusne čestice 400 nm. Boja je
generirana računalno.

f) Ionski mikroskop (Slika D1.5) je elektronički uređaj u kojem slika promatranog

objekta nastaje pomoću zraka iona helija koje se skupljaju elektromagnetskim
lećama. Najmanja veličina promatranih objekata mjeri se u nanometrima.

Slika D1.5. Čestice zlata, veličina 0,1 nm. Slika dobivena

helij-ionskim mikrosopom.

g) Mikroskop sa masenom spektrometrijom sekundarnih iona (engl. Secondary Ion

Mass Spectrometry, SIMS, Slika D1.6) je uređaj u kojem primarna zraka iona u doticaju
s promatranim objektom stvara sekundarnu zraku iona prolazi kroz maseni
spektrometar te stvara sliku. Tako se može dobiti više slika u odnosu na to koji nas
elementi u promatranom objektu zanimaju, kao i odnosi izotopa u uzorku. Najmanja
veličina promatranih objekata mjeri se u nanometrima.

Slika D1.6. CHO stanice, slika dobivena SIMS

mikroskopom. Jasno se vide jezgrina ovojnica i
jezgrica.

h) Mikroskop sa pretražnom sondom (engl. Scanning Probe Microscope, SPM, Slika

D1.7) je elektronički uređaj u kojem vrlo tanka sonda (do nekoliko atoma) prelazi po
površini promatranog objekta. Podaci o objektu (veličina, oblik, električna
vodljivost, kemijski sastav i dr.) dobiju se iz međudjelovanja sonde i površine
promatranog objekta, te kombiniraju u računalno dobivenu sliku. Najmanja veličina
promatranih objekata mjeri se u angstremima (Å = 10-10 m). Najpoznatije tehnike su
STM (engl. Scanning Tunneling Microscopy) i AFM (engl. Atomic Force Microscopy).

Poglavlje 1 Dodatak 2
Praktikum iz Biologije 1

a) b) c)

Slika D1.7. Slike dobivene pomoću SPM, boja je generirana računalno; a) atomi silicija u kristalu,
STM slika; b) crveno obojani atomi željeza na pločici nikla, poredani da tvore japansku
riječ „genshi“, atom, STM slika; c) svijetle polumjesečaste tvorbe predstavljaju atomske
orbitale atoma na vrhu sonde, AFM slika.

i) Akustični mikroskop (Slika D1.8) je instrument u kojem slika nastaje prolaskom

ultrazvučnih valova kroz ili sa promatranog objekta. Podaci iz više ravnina objekta
mogu se računalno složiti u 3D sliku. Razlika u raspodjeli stanične gustoće ukazuje
na promjene u citoskeletu, primjerice u tumorskim stanicama. Najmanja veličina
promatranih objekata mjeri se u mikrometrima.

Slika D1.8. Slika stanice dobivena akustičnim mikroskopom. Vide se

zone različite gustoće stanice.

POBOLJŠANJA SVJETLOSNE MIKROSKOPIJE

Raznim tehnikama pokušalo se riješiti problem granice razlučivosti i slabog kontrasta
običnog svjetlosnog mikroskopa, te danas postoje mnoga poboljšanja svjetlosne mikroskopije
koja koriste različite optičke i računalne metode.
Pri mikroskopiranju u tamnom polju (Slika D1.9) ne koristi se svjetlost koja je prošla
izravno kroz preparat već svjetlost raspršena od promatranog objekta, dok se sam preparat
osvjetljava sa strane.

Slika D1.9. Grinja promatrana pod običnim osvjetljenjem (lijevo), u tamnom polju (u sredini) i u
tamnom polju uz uporabu posebnog filtera (Rheinbergovo osvjetljenje, desno).

Fazno – kontrastni mikroskop (Slika D1.10) stvara dvije paralelne zrake svjetlosti od

Poglavlje 1 Dodatak 3
Praktikum iz Biologije 1

kojih je jedna pomaknuta u fazi prolaskom kroz preparat. Interferencijom te dvije zrake dobija se
slika bitno boljeg kontrasta.
Interferencijsko – kontrastni mikroskop (engl. Differential Interference Contrast; DIC)
stvara dvije polarizirane zrake svjetlosti od kojih ona koja prolazi kroz optički gušći dio preparata
bude pomaknuta u fazi. Njihovom interferencijom uz pomoć prizme stvara se slika bitno boljeg
kontrasta.

Slika D1.10. Stanica epitela promatrana pod običnim

(lijevo) i fazno – kontrastnim mikroskopom uz
zeleni filter (desno), povećanje 40×.

Fluorescencija je pojava da tvari emitiraju svjetlost određene valne duljine nakon izlaganja
zračenju više energije. Ta se pojava koristi u različitim tehnikama fluorescencijske mikroskopije.
U fluorescencijskom mikroskopu (Slike D1.11, D1.12 i D1.13) preparat je diferencijalno
obojan bojom koja fluorescira uslijed apsorpcije svjetlosti više energije (manje valne duljine).
Pobuđena fluorescentna svjetlost s preparata prolazi kroz filter specifičan za njenu valnu duljinu i
pada na objektiv.

Slika D1.11. Princip rada fluorescentne mikroskopije.

Poglavlje 1 Dodatak 4
Praktikum iz Biologije 1

Slika D1.12. Slika stanice dobivena

fluorescentnim mikroskopom; plavo –
jezgra, zeleno – citoskelet, crveno –
mitohondriji.

Konfokalna mikroskopija se temelji na istom principu, ali poseban filtar propušta

svjetlost pobuđenu u vrlo malom području samo jedne ravnine preparata, pa se dobije detaljna
slika vrlo tankog sloja promatranog objekta. Ukupna slika generira se računalno, sloj po sloj, u
trodimenzionalnu sliku promatranog objekta.
Fluorescencijska mikroskopija s totalnom refleksijom, TIRF (engl. Total Internal
Reflection Fluorescence) koristi, kao i konfokalna mikroskopija, pobuđenu svjetlost iz samo jedne
ravnine promatranog objekta. To se postiže filterima koji do objektiva dovode samo svjetlost
koja se u potpunosti reflektirala s granice medija u kojem se nalazi promatrani objekt i pokrovnog
stakla, dajući detaljnu sliku površine promatranog objekta.
MPEM mikroskop (engl. Multiphoton Excitation Microscopy) pobuđuje fluorescenciju
svjetlošću manje energije od fluorescentne svjetlosti, čime je fluorescencija omogućena samo u
jednoj ravnini preparata, slično konfokalnoj mikroskopiji.
NSOM mikroskop (engl. Near-Field Scanning Optical Microscopy) prelazi granicu
razlučivosti običnog svjetlosnog mikroskopa tako da se pobudna svjetlost na preparat dovodi vrlo
tankom optičkom niti (tanjom od 0,2 µm), te promatra nastala fluorescencija.
STED mikroskop (engl. Stimulated Emission Depletion) koristi jednu zraku svjetlosti za
pobuđivanje fluorescencije i drugu zraku svjetlosti u obliku prstena koja gasi fluorescenciju
posvuda u uzorku, osim u svom središtu. Rezolucija iznosi nekoliko desetina nm.
PALM (engl. Photo-Activated Localization Microscopy) i STORM (engl. Stochastic Optical
Reconstruction Microscopy) mikroskopi koriste seriju pulseva za pobuđivanje fluorescencije u
nasumično raspoređenim područjima preparata nakon čega računalo određuje točan položaj
flourescentne molekule. Ukupna slika stvara se računalno, molekulu po molekulu.
Mikroskopija strukturiranim osvjetljenjem, SIM (engl. Structured Illumination Microscopy,
Slika D1.13) koristi svjetlost propuštenu kroz posebne refrakcijske filtere prije no što dođe na

Poglavlje 1 Dodatak 5
Praktikum iz Biologije 1

preparat. Refrakcijski uzorak na preparatu u osnovi djeluje kao svjetlost manje valne duljine, čime
je omogućena veća oštrina detalja promatranog objekta.

Slika D1.13. Slika crijevne resice dobivena standardnim fluorescentnim

mikroskopom (gore lijevo) i SIM mikroskopom (dolje desno).

Kontrast i fluorescencija mogu se dodatno pojačati uporabom osjetljivih video kamera i

procesora za obradu slike, pa se takve metode nazivaju video mikroskopijom.

Poglavlje 1 Dodatak 6