SEMINARSKI RAD

UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

SEMINARSKI RAD

KORIŠĆENJE SVETLOSNE MIKROSKOPIJE U BIOLOŠKIM

ISTRAŽIVANJIMA

Student:
Milošević Aleksandra
br.indeksa:1229

2
 SEMINARSKI RAD

Sadržaj

Sadržaj..................................................................................................................................................1
Uvod.....................................................................................................................................................2
Istorijat mikroskopa..............................................................................................................................2
Svetlosni mikroskop.............................................................................................................................5
Mehanički delovi..................................................................................................................................5
Optički delovi.......................................................................................................................................5
Delovi za uvećavanje objekta...............................................................................................................6
Pravila mikroskopiranja.......................................................................................................................7
Najčešće greške mikroskopa................................................................................................................8
Zakljucak..............................................................................................................................................9
Literatura..............................................................................................................................................9

2
 SEMINARSKI RAD

Uvod

Mikroskop (grčki: micron = mali i scopos = ciljanje) je instrument za posmatranje predmeta

koji su previše mali da bi se mogli videti golim okom. Nauka istraživanja malih predmeta koristeći
ovakve instrumente se naziva mikroskopija, a termin „mikroskopski“ ima značenje „veoma mali“,
slabo vidljiv golim okom.
Najuobičajeni tip mikroskopa - ujedno i prvi koji je pronađen - je optički ili svetlosni mikroskop.
Ovo je optički instrument koji sadrži jedno ili više sočiva koja proizvode uvećanu sliku predmeta
postavljenog u žižnu ravan sočiva. Gornji sistem sočiva u cevi se naziva okular i kroz njega se
posmatra dati objekat. Ukoliko mikroskop ima dva okulara, tada je binokularni. Donji sistem sočiva
je objektiv i okrenut je prema objektu koji se posmatra. Ogledalo se nalazi ispod objekta i prima
svetlosne zrake. Neki mikroskopi u tu svrhu mogu imati lampicu. Svetlosni mikroskop uvećava do
4.000 puta.
Poseban tip je minerološki mikroskop koji se koristi za identifikaciju minerala i sličan je
prethodnom. Razlikuje se po nekim sastavnim delovima kao što su polarizacioni filteri. Od minerala
se iseče veoma tanka pločica i kroz nju se propusti svetlosni zrak. Taj propušteni zrak se polarizuje
po prolasku kroz filtere. Pošto svaki mineral poseduje različite polarizacione osobine, na ovaj način
je moguće identifikovati mineral u sklopu aglomerata ili stene.
Od ostalih mikroskopa treba pomenuti još i elektronski mikroskop čije uvećanje može biti i jedan i
po miliona puta. Ovakav mikroskop je veoma skup i koristi se u naučnim laboratorijama, a za
rukovanje njime potrebna je obuka.

Istorijat mikroskopa

Izum mikroskopa je jedno od najupečatljivijih otkrića u ljudskoj istoriji, instrumenta koji je

omogućio da se kombinacijom sočiva dobije uvećana slika sićušnih predmeta.Učinio je vidljivim
fascinatne detalje mikrosveta.
Pravog pronalazača mikroskopa je gotovo nemoguće otkriti ali u literaturi se obično pominju
Zacharias Jannsen (isti onaj koji se pominje kod teleskopa) i njegov sin Hans Jansen koji su bili
Holandski optičari.Oni su eksperimentisali sa više sočiva koja su bila postavljena u neku cev i
primjetili su da se objekti koji su se nalazili ispred cevi prilikom gledanje kroz cev pojavljuju
znatno uvećani.Ovo njihovo otkriće je svakako doprinelo daljem razvoju i pojavi sve složenijih
mikroskopa.
Smatra se da je Galileo 1610.godine koristio teleskop na veoma malim udaljenostima kako bi video
delove insekata.On je ustvari kasnije 1624.god prepravio svoj teleskop i tako dobio složeni
mikroskop, koji je kao i teleskop imao jedno konkavno i jedno konveksno koje je bilo smešteno u
cevi. Jedan od ovih instrumenata je poslao kardinalu Zollern-u te iste godine dok je još jedan takav
instrument poslao Federico Cesi-u.Tek je za Galileov instrument prvi put upotrebljen naziv
,,mikroskop“ termin koji je skovao Giovanni Faber (1574-1629), Galileo je svoj instrument zvao
,,occhialino“ ili u prevodu ,,malo oko“. Ilustracije insekata koje su napravljene pomoću Galilejvog
mikroskopa je najstarija zabeležena primena složenog mikroskopa.
Slava koju je poneo Galilejev optički instrument je podstakla druge istraživače, tako su se
ubrzo pojavili mikroskopi Keplervovkog tipa sa dva konveksna sočiva koji su davali obrnutu sliku.

2
 SEMINARSKI RAD
U drugoj polovini veka značajan doprinos su dali italijanski optičari Eustachio Divini (1610-1685) i
Giuseppe Campani (1635-1715), dok je u Engleskoj izuzetan nivo dostigao Robert Hooke(1635-
1702). Ova sprava je postala glavna igračka bogate aristokratije u Evropi koji su je koristili samo
radi zabave. Međutim optičke karakteristike ovih instrumenata su ostale jako slabe sve do prve
polovine 19 veka pre svega zbog sferne i hromatske aberacije. Galilejeve ilustracije insekata
Otkriće mikroskopa i razvoj mikroskopije omogućilo je ulazak u svet mikroorganizama što će
svakako igrati ključnu ulogu u razvoju ostalih prirodnih nauka pogotovo biologije i medicine.
Robert Hooke je 1665.god posmatrao pod mikroskopom komadiće plute. Uočio je veliki broj
komorica koje su podsećale na pčelinje saće i koje su medjusobno odvojene tankim pregradama.
Komorice naziva ćelije(cells) i taj se naziv zadržao do danas. Hooke je napisao knjigu
Microcraphia(sitno crtanje) u kojoj je opisano miskroskopiranje koje je vršio kao i crteži onog što
je video i ta knjiga predstavlja prvu te vrste.
Mada složeni mikroskopi sadrže dva ili više sočiva i samim tim prirodno imaju složeniji princip
rada ipak su prva otkrića u mikrosvijetu ostvarena sa prostim mikroskopom koji se sastoji od samo
jednog sočiva zbog toga što su davali mnogo jasniju sliku dok su složeni bili opterećeni sfernim i
hromatskim aberacijama.

Holandjanin Antoni Van Levenhuk(1632-1723) je napravio oko 550 mikroskopa sastavljenih od

samo jednog sočiva i to bikonveksnog(dvostruko konveksnog).Od toga je 9 sačuvano do današnjeg
dana koji imaju povećanje od 270 puta, mada detalji sa njegovih skica ukazuju i na to da je imao i
mikroskope sa dosta većim većanjima.
Poznat je kao "otac mikrobiologije" i strastveni posmatrač misroskopski sitnog sveta. Rođen je kao
sin izrađivača korpi, a sa svojih 16 godina osigurao je šegrtovanje kod Škotskog trgovca robom u
Amsterdamu.
Koristeći ručno izrađene mikroskope, bio je prvi čovek koji je promatrao jednoćelijske organizme,
mišićno tkivo, bakterije, spermatozoide i protok krvi u kapilarima. Protozoe je izučavao u vezi sa
tropskim oboljenjima, uključujući malariju. Otkrio je je da su bakterije uzročnik kolere i tetanusa.
Godine 1648. u Amsterdamu van Levenhuk zamislio je svoj prvi jednostavni mikroskop, lupu, koje
bi koristili trgovci tekstilom, a omogućavalo bi im povećanje do 3 puta. Uskoro je izradio jednu za
vlastitu upotrebu. 1654., napustivši Amsterdam preselio se nazad u Delft započevši vlastiti posao
izrade tekstila i odeće, a kasnije, 1660., imenovan je kućepaziteljem Lorda Delfta. Veruje se da je
oko 1665. pročitao knjigu Roberta Huka, Mikrografiju, i da ga je upravo to podstaklo na pomisao
da bi se njegov izum mogao koristiti pri važnijim stvarima od izrade tekstila što mu je bila
prvobitna ideja. Počeo je da razmišlja o upotrebi mikroskopa u proučavanju sitnog sveta nevidljivog
ljudskom oku. Levenhuk je usavršio izradu sočiva i mikroskopa i počeo da ih primenjuje u

2
 SEMINARSKI RAD
otkrivanju mikroskopskog sveta. Prvi je uspeo da vidi strukturu mišića, bakterije, spermatozoide.
Godine 1669. dobio je akademsku diplomu iz geografije.
Nakon što je razradio svoju metodu za izradu jakih sočiva i korištenja u istraživanju mikroskopskog
sveta, Levenhuk je pomoću veze dospeo u Kraljevsko društvo Londona za unapređenje prirodnih
znanja zahvaljujući poznatom Holandskom fizičaru Regnijer de Grafu. Uskoro je počeo slati kopije
svojih posmatranja Društvu, pa su njegova najranija izučavanja zabeležena u časopisu Kraljevskog
Društva, Filozofski izveštaji. U tim objavljenim radovima bili su i van Leeunjenhoekovi "Pčelinja
usta i žaoka".
Uprkos prvobitnom uspehu u saradnji Kraljevskog društva i Levenhuka, veza je uskoro ozbiljno
prekinuta. Godine 1676. njegovo poverenje je dovedeno u pitanje kada je Društvu poslao kopiju
svojih istraživanja o jednoćelijskim organizmima za čije se postojanje nije znalo. Tako su, uprkos
njegovoj stečenoj reputaciji u saradnji sa Društvom, njegovi radovi jako skeptično promatrani. Na
kraju je, zbog van Levehukove nepopustljivosti pri svojim tvrdnjama, Društvo poslalo Engleskog
vikara i grupu pravnika i doktora u Delft, kako bi utvrdili da li je van Levenhukova sposobnost
zapažanja bila zdrava, kao i njegov razum. Jer u protivnom, Društvo bi trebalo reformisati svoje
teorije o samom životu. Konačno, 1680. Van Levehukova istraživanja opravdana su u društvu što je
rezultovalo njegovim imenovanjem kao važnog člana i saradnika Kraljevskog Društva. Kasnije
tokom svoga života, napisao je oko 560 pisama Društvu i drugim naučnim institucijama u periodu
od 50 godina. Tu je objasnio svoja daljnja istraživanja.

Godine 1981., britanski mikroskopist Brajan Ford otkrio je da su Levenhukovi izvorni uzorci
preživeli u kolekciji Kraljevskog Društva Londona, i da su bili izvanrednog kvaliteta i dobro
očuvani. Ford je nastavio da proučavat nizom mikroskopa dajući nam na znanje važnost
Levenhukovog rada.
Umro je sa 90 godina, 26. avgusta 1723., u svom rodnom Delftu, ostavivši za sobom otkrića koja su
podigla naučna istraživanja na višo nivo.
Opšte je rasprostranjeno mišljenje da je on otkrio mikroskop, medjutim to nije tačno, ali je
nesumnjivo odigrao jako bitnu ulogu u razvoju mikroskopije.

Kasnija poboljšanja

Značajnijih poboljsanja nije bilo sve do sredine 19 vijeka:

Ernst Abbe(1840-1905), briljantni njemački matematičar i fizičar jedan je od najzaslužnijih za
dalje poboljšanje mikroskopa.On je 1872 formulisao svoju talasnu teoriju formiranja slike kod
mikroskopa koja ce postati poznata ka ,,Abbe-ov uslov sinusa“( Abbe sine condition).

2
 SEMINARSKI RAD
Richard Zsigmondy(1865 - 1929) je 1903 razvio ultramikroskop koji je mogao posmatrati objekte
koji su manji od talasne dužine svjetlosti.Rad ovakvih mikroskopa se ne zasniva na refleksiji već na
rasipanju svetlosti.
Njemački fizičar Ernst Ruska(1906-1988) i elektro inžinjer Max Knoll(1897-1969) su konstruisali
prototip elektronskog mikroskopa 1931. Umjesto vidljive svjetlosti i optičkih sočiva, elektronski
mikroskop koristi zraku elektrona, koju usmjerava fokusirajući elektromagnetsko polje.Sa
elektronskim mikroskopom je kasnije postignuto uvećanje od jedan i po milion puta, i to iz razloga
sto je talasna dužina elektrona mnogo manja od talasne dužine fotona pa se zbog toga sa ovim
mikroskopom mogu posmatrati čestice mnogo manje od talasne dužine svjetlosti. Zbog niske
prodorne snage elektrona, uzorci koji se pripremaju za elektronsko mikroskopiranje moraju biti
iznimno tanki.

Svetlosni mikroskop

Svetlosni mikroskop je optički uređaj koji omogućava uvećanje objekta do oko 1000 puta.Na
svakom svetlosnom mikroskopu razlikujemo mehaničke i optičke delove.

Mehanički delovi

Postolje – obezbeđuje stabilnost mikroskopa i nosi ostale delove.

Stativ – omogućuje lakše rukovanje mikroskopom i zupčasto je zglobljen s postoljem.
Stočić mikroskopa – nalazi se na stativu i služi za postavljanje preparata. U središnjem delu ima
otvor za prolaz svetlosti, kao i specifičan mehanizam za učvršćivanje i pokretanje preparata
(okretanjem donjeg zavrtnja mehanizma levo/desno pomeramo preparat u istom pravcu, a
okretanjem gornjeg pomeramo preparat gore/dole).
Tubus – služi za nošenje optičkih delova mikroskopa. U gornjem delu izvučen je u cev koja nosi
okular, a u donjem delu čini koleno, koje omogućuje okretanje tubusa oko svoje ose. Na koleno se
nastavlja revolver. Revolver predstavlja noseći deo za objektive i može se okretati oko ose, pri
čemu se čuje pucanje kada objektiv zauzme odgovarajući položaj.
Makrometarski zavrtanj – smešten je na stativu i služi za grublje podešavanje slike pri upotrebi
objektiva suvog sistema. Njegovim okretanjem ka sebi tubus se pomera na gore, a okretanjem od
sebe na dole.
Mikrometarski zavrtanj – nalazi se ispod makrometarskog ili je u sklopu s njim i služi za finije
podešavanje slike pri upotrebi objektiva uljane imerzije.

Optički delovi

Optički delovi mikroskopa se mogu podeliti na delove za osvetljavanje objekta i delove za

uvećavanje objekta.

Delovi za osvetljavanje objekta

Izvor svetlosti – kod modernih mikroskopa izvor svetlosti je obično sijalica, a kod primitivnijih je
to sunčeva svetlost, koja se usmerava na objekat pomoću ogledala.
Kondenzator – nalazi se ispod stočića, a sastoji se od niza sočiva, koji služe da sakupe svetlosne
zrake i usmere ih na objekat, tj. preparat. Podizanjem (pomoću posebnog zavrtnja) povećavamo

2
 SEMINARSKI RAD
intenzitet osvetljenja.
Dijafragma – nalazi se između izvora svetlosti i kondenzatora. Sastoji se iz polukružnih ljuspica,
koje se pomeranjem odgovarajuće poluge skupljaju ili šire, praveći u centralnom delu manji ili veći
otvor za prolaz svetlosti.
Ram za svetlosni filtar – u njega se prema potrebi stavlja odgovarajući filtar.

Delovi za uvećavanje objekta

Objektiv je najbitniji deo mikroskopa i sastoji se od niza slepljenih sočiva smeštenih u

cilindrični okvir. Najbitnije je frontalno sočivo, koje je najbliže preparatu. Što je sočivo manjeg
dijametra, veća je moć uvećanja. Objektiv je pomoću navrtnja povezan sa revolverom i na njemu su
uvek upisane vrednosti numeričke aperture, žižna daljina i moć uvećavanja. Na mikroskopu postoji
obično 3-4 objektiva s različitom moći uveličavanja. Objektiv daje uvećan, stvaran i obrnut lik
objekta.Objektive prema načinu mikroskopiranja delimo na objektive suve imerzije (uvećavaju
obično 10, 40 ili 60x), kod kojih se prilikom mikroskopiranja između preparata i samog objektiva
nalazi vazduh i objektive uljane imerzije. Objektiv uljane imerzije označen je jednim ili dva crna
prstena pri vrhu i uvećava obično 90 do 100x. Prilikom upotrebe ovog objektiva stavlja se kap
imerzionogulja na preparat i frontalno sočivo se uranja u njega, čime se sprečava rasipanje svtlosnih
zraka pri upotrebi objektiva s velikim uvećanjem.
Okular se nalazi na gornjem kraju tubusa i ima ulogu da dodatno poveća lik predmeta koji potiče
od objektiva. Čine ga okularno (gornje) i sabirno (donje) sočivo, smešteni u metalnoj cevi. Na
svakom okularu piše moć uvećavanja, a obično se kreće od 5 do 20x. Kod monokularnih
mikroskopa postoji jedan, a kod binokularnih dva okulara.
Prilikom mikroskopiranja neophodno je znati s kolikim se uvećanjem posmatra preparat. Npr. kada
je uvećanje objektiva 90x, a okulara 10x, objekat se posmatra pri uvećanju od 900x.
Pored svetlosnih, postoje i faznokontrastni i fluorescentni mikroskopi.
Faznokontrastni mikroskopima specijalan objektiv i dijafragmu, koji omogućavaju da se stvori
znatno veći kontrast između objekta i okoline. Ovim mikroskopom omogućeno je posmatranje
živih, neobojenih objekata.
Fluorescentni mikroskopse koristi za vizuelizaciju objekata koji imaju mogućnost da odaju svetlost
određene boje tj. da fluoresciraju, kada se osvetle ultravioletnom svetlošću. Ako objekat nema
mogućnost fluorescencije, tretira se odgovarajućim fluorescentnim bojama, tzv. fluorohromina.
Ovaj vid mikroskopiranja ima veliku primenu u identifikaciji mikroorganzama, pri čemu se koriste
antitela obeležena fluorescentnim bojama, koja se vezuju za tražene antigene, tj. mikroorganizme.

2
 SEMINARSKI RAD

Pravila mikroskopiranja

Za posmatranje protozoa i plesni koristi se uglavnom objektiv suvog sistema, a za posmatranje

bakterija, kvasaca i sitnih protozoa objektiv uljane imerzije.
Pri mikroskopiranju nije potrebno nositi naočare, već treba podesiti sliku upotrebom
mikrometarskog ili makrometarskog zavrtnja.
Pri upotrebi objektiva sa manjim uvećanjem, otvor dijafragme treba smanjiti, dok ga pri upotrebi
objektiva velike moći uvećanja treba povećati, a kondenzator podići u najviši položaj. Pri
mikroskopiranju objektivom uljane imerzije neophodno je prvo naći lik objekta upotrebom
objektiva sa manjim povećanjem, a tek onda okrenuti revolver i staviti objektiv uljane imerzije.
Takođe je važno dobro postaviti preparat, a on se okreće tako da objekat bude sa gornje strane
predmetnog stakla, bliže objektivu. U suprotnom, lik se ne može pronaći, a posledica je lomljenje
predmetnog stakla objektivom i oštećenje sočiva objektiva.
Kada je mikroskopiranje završeno, neophodno je objektiv uljane imerzije očistiti vatom
natopljenom ksilolom, a potom obrisati suvom vatom ili finom hartijom. Mikroskop treba držati
prekriven plastičnom folijom ili najlonom do sledeće upotrebe, da se zaštiti od prašine.

2
 SEMINARSKI RAD
Najčešće greške mikroskopa

Hromatska aberacija: Leće mikroskopa deluju kao prizma i razlažu belu svetlost na njene
komponente. Kao posledica toga dolazi do rubne obojenosti slike u mikroskopu, tu pojavu
nazivamo hromatskom aberacijom. Svaka komponenta od crvene do ljubičaste boje različito se lomi
u bikonveksnoj leći, što zavisi o njenoj valnoj dužini. Svaka boja ima svoj fokus, koji je u različitoj
udaljenosti od leće. Na taj način bijela svjetlost, kad izlazi iz leće ne prolazi kroz jednu tačku-
fokus, a to deluje negativno na jasnoću slike.

Zbog hromatske aberacije, različite boje se fokusiraju u različitim tačkama.

Sferna aberacija: Sve zrake svetlosti, koje izlaze iz jedne tačke na optičkoj osi, ne lome se
jednako u bikonveksnoj leći. One zrake koje su više udaljene od optičke ose lomiće se jače, dok one
bliže optičkoj osi lomiće se slabije, pa prema tome i tačke u kojima će se sastati zrake prilkom
izlaska iz leće biće različito udaljene od leće. Radi toga slika jedne svijetle tačke na optičkoj osi
leće neće biti jasna i oštra nego će izgledati kao jedna svetla mrlja, to se naziva sferna aberacija.

Sočivo sa perfektnim fokusiranjem, i fokusiranje sočiva usled efekta sferne aberacije

Ove greške mikroskopa se uklanjaju posebnim sistemom leća koje su ugrađene u optički deo
mikroskopa, tj. lećama od raznih vrsta stakala, pa i minerala (flint stakla sa velikom disperzionom
moći).

Zakljucak

2
 SEMINARSKI RAD
Mikroskop je optička sprava pomoću koje možemo vidjeti sliku predmeta kojeg posmatramo pod
mnogo većim vidnim uglom, nego što je onaj, pod kojim bi vidjeli isti taj predmet prostim okom u
normalnoj vidnoj daljini. U osnovi,
razlikujemo dva tipa mikroskopa: svjetlosni (optički) mikroskop i elektronski mikroskop.
Svetlosni mikroskopi (optički), najčešće mogu biti: mikroskopi sa svetlim vidnim poljem, sa
tamnim vidnim poljem, flourescentni i fazno-kontrasni instrumenti.
Zaccharias Jansen je zajedno sa bratom Fransisom, nastavljajući očev zanat, kombinovao dva
konveksna sočiva u unutrašnjosti jedne cevi, te je tako dobijen prvi mikroskop.Tokom XVIII
stoleća, a naročito na početku XIX, izgrađeni su vrlo složeni mikroskopi. Današnji klasični
mikroskopi mogu da uveličaju posmatrani objekat i preko 2000 puta, a sa nekim pridodatim
dijelovima i više. Svetlosni mikroskop je
građen od mehaničkog i optičkog dijela. Mehanički dio služi samo za uklapanje optičkih dijelova i
za namještanje preparata koji želimo posmatrati dok optički dijelovi služe za uvećanje i
osvetljavanje predmeta koji se posmatraju. Ukupno povećanje slike je proizvod pojedinačnih
povećanja objektiva i okulara. Mnogo važnija karakteristika od povećanja je rezolucija (najmanji
razmak koji se može vidjeti između dva vidno odvojena objekta). Najveća rezolucija svjetlosnog
mikroskopa je oko 0,2 μm, što omogućava dobijanje dobrih slika uz povećanje od 1000 do 1.500
puta. Najčešće greške mikroskopa su hromatska i sferna aberacija. Ove greške mikroskopa se
uklanjaju posebnim sistemom leća koje su ugrađene u optički deo mikroskopa. Raznim tehnikama
se pokušao rešiti problem granice razlučivosti i slabog kontrasta običnog svjetlosnog mikroskopa, te
danas postoje mnoga poboljšanja svetlosne mikroskopije koja koriste različite optičke i računalne
metode: metoda tamnog polja, faznokontrasna metoda, interfereciona mikroskopija, polarizaciona i
fluorescentna mikroskopija.

Literatura

 Biologija ćelije: Praktikum sa radnom sveskom, Perica Vasiljević i Stevo Najman

 Mikrobiologija: Radna sveska, prof. dr Tatjana Mahajilov Krstev
 Stanica: Molekularni pristup, Geoffrey Cooper i Robert Hausma
 http://veterina.info/ribarstvo/86-oblasti/mikrobiologija-/856-mikroskop
 https://sr.wikipedia.org/wiki/mikroskop
 ostali internet izvori